Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Zacznij od probówki zawierającej zarodki Drosophila w późnym stadium 16 w pożywce montażowej.

Neurony ruchowe Drosophila są znakowane immunologicznie.

Przenieść zarodek na szkiełko podstawowe i usunąć go z podłoża mocującego.

Następnie umieść zarodek brzuszną stroną do góry i wypreparuj go.

Zorientuj przedni odcinek zawierający neurony ruchowe grzbietową stroną do góry.

Za pomocą igły wolframowej przetnij wzdłuż grzbietowej linii środkowej i rozłóż ścianę ciała. Przenieść zarodek do podłoża mocującego. Następnie usuń narządy wewnętrzne, aby odsłonić oznaczone

neurony.

Przenieś zarodek na nowe szkiełko, a następnie zamontuj go i zapieczętuj.

Obserwuj pod mikroskopem kontrastowym z interferencją różnicową, jak światło przechodzi przez zarodek, generując obraz o wysokiej rozdzielczości.

Oznaczone neurony z aksonalnymi wzorcami projekcji wydają się ciemnobrązowe na jasnym tle.

Neurony ruchowe rozgałęziają się na dwa główne nerwy: nerwy międzysegmentowe i segmentowe oraz mniejszą gałąź, nerw poprzeczny, który unerwia mięśnie.

Aby filetować zarodki, umieść je na szklanym szkiełku

Najpierw przenieś je do kropli glicerolu brzuszną stroną do góry. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym odetnij przednią część na 1/4 długości ciała. I usuń najbardziej tylny obszar, który jest wolny od aksonów motorycznych.

Teraz za pomocą sondy igłowej wyjmij preparat z glicerolu, zorientowany grzbietowo do góry i umieść go poziomo w polu widzenia. Następny krok wymaga cienkiej igły wolframowej, która została włożona w pusty obszar sondy igłowej, a następnie wygięta na końcu. Za pomocą igły wolframowej wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu zarodka i kontynuuj cięcie grzbietowej linii środkowej.

Upewnij się, że końcówka igły wolframowej nie dotyka powierzchni szkiełka podczas sekcji, ponieważ igła łatwo zgina się na szkle.

Następnie za pomocą sondy przywróć preparat z powrotem do kropli glicerolu i umieść go grzbietową stroną do góry. Tam odłącz jelito od ściany ciała, rozkładając każdą ścianę ciała w brzusznym kierunku bocznym. Dwie ściany korpusu powinny się od siebie rozejść. Teraz za pomocą sondy ostrożnie przesuń klapy ścianki korpusu na szklane szkiełko. Na szkiełku użyj igły wolframowej, aby usunąć narządy wewnętrzne, popychając je na boki.

Aby ustabilizować igłę wolframową i zapobiec jej uszkodzeniu, należy trzymać puste sondy igłowe, które utrzymują igłę wolframową, usztywnione o powierzchnię szkiełka podczas manipulowania igłą wolframową.

Teraz zamontuj preparaty i 8 mikrolitrów roztworu montażowego na nowym szkiełku podstawowym. Przymocuj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie zwykłym lakierem do paznokci. Następnie rejestruj obrazy w wysokiej rozdzielczości za pomocą optyki DIC.