Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie zachowania komórek wewnątrz embrionalnej cewki neuralnej w wysokiej rozdzielczości przez dłuższy czas. Osiąga się to poprzez uprzednią transdukcję wczesnej cewki neuralnej konstruktem sterującym ekspresją wybranego białka fluorescencyjnego w celu znakowania pojedynczych komórek. Kolejnym krokiem jest wykonanie przekrojów wczesnego zarodka i ich zamocowanie na naczyniach z szklanym dnem.

Po regeneracji w inkubatorze, plastry embrionów są obrazowane za pomocą mikroskopu szerokopolowego w regularnych odstępach czasu. Ostatecznie technika ta może być wykorzystana do badania zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium przez długie okresy czasu z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami obrazowania żywych tkanek jest to, że pozwala ona obserwować zachowanie poszczególnych komórek przez długi czas przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Ta metoda pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwoju, takie jak rola orientacji wrzeciona podziałowego w wyborze siarczanów lub sposób, w jaki dynamika sygnalizacji może regulować zachowanie komórek przed elektroporacją plazmidów do cewy nerwowej. Igły szklane przygotowuje się za pomocą mikro-wyciągacza kapilar pod mikroskopem stereoskopowym. Należy użyć precyzyjnej pęsety, aby odłamać końcówkę igły.

Koniec igły powinien być wystarczająco ostry, aby przebić rurkę nerwową, ale nie może być zbyt wąski, by nie utrudniać wstrzykiwania roztworu DNA. Zarodki do tego eksperymentu były inkubowane w temperaturze 37 °C przez około 36 godzin, aby osiągnąć 10. stadium według tabeli Hamiltona.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy wykonać okienko w jajie, umieścić elektrody w odległości pięciu milimetrów od siebie po obu stronach zarodka, a następnie wstrzyknąć DNA do rurki neuralnej. DNA jest zabarwione niewielką ilością fast green w celu wizualizacji. Należy przyłożyć prąd o napięciu od 12 do 17 V z czasem trwania impulsu 50 ms, powtarzając ten proces trzy razy w odstępach 950 ms między impulsami.

W celu uzyskania ekspresji mozaikowej, umożliwiającej śledzenie pojedynczych komórek, stosuje się niskie stężenia DNA oraz niskie napięcia elektroporacji. Na koniec otwór w skorupce jaja zakleja się taśmą klejącą, upewniając się, że jest on szczelny. Zarodki pozostawia się do regeneracji przez trzy do czterech godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C.

Mieszaninę kolagenu i pożywkę do hodowli plastrów należy przygotować około godziny przed pokrojeniem zarodków. Aby przygotować mieszaninę kolagenu, należy dodać 100 µL 0,1% roztworu kwasu octowego do 300 µL kolagenu typu jeden i dokładnie wymieszać w wstrząsarku vortex, a następnie dodać 100 µL pożywki L 15 w stężeniu 5x i ponownie dokładnie wymieszać w wstrząsarku vortex. Roztwór powinien przybrać żółty kolor.

Następnie dodaj 15 do 20 µL 7,5% wodorowęglanu sodu i dokładnie wymieszaj w wortexie. Roztwór powinien stać się lekko różowy. Przechowuj w lodzie.

Tę mieszaninę kolagenu należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem. Aby przygotować pożywkę do hodowli skrawków, do 10 ml pożywki Neurobasal z dodatkiem suplementu B 27, Glutamax i roztworem gentamycyny, umieść pożywkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, buforowanym 5% dwutlenkiem węgla. Pozostaw korek naczynia lekko poluzowany, aby pożywka mogła osiągnąć równowagę z dwutlenkiem węgla przez co najmniej godzinę.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy za pomocą małych nożyczek wyciąć zarodek. Wyjąć zarodek z jaja pęsetą, płukząc go w medium L 15. Umieścić zarodek w naczyniu do hodowli tkankowej z warstwą sylgardu na dnie.

Przypnij embrion przez otaczające go błony pozazarodkowe w taki sposób, aby błony były mocno rozciągnięte. Za pomocą mikronnoża przetnij embrion jak najprościej w obrębie obszaru zainteresowania. W przypadku przekrojów rdzenia kręgowego grubość powinna wynosić od jednego do dwóch somitym; plastry tkanki należy przytwierdzić do bocznych tkanek embrionu, aby nie zgubić ich podczas krojenia pozostałych embrionów.

Do przenoszenia skrawków rdzenia kręgowego do szalki z szklanym dnem niezbędna jest dostosowana końcówka mikro-pipety. Aby ją przygotować, załóż końcówkę 200 µL na pipetę P2 lub P10, a następnie odetnij około 1 mm z końca końcówki. Pokryj wnętrze końcówki kolagenem, przygotowując 1 µL wcześniej opracowanej mieszaniny kolagenu.

Pozostawić na jedną do dwóch minut, a następnie wypłukać podłożem L 15. Zapobiegnie to przywieraniu tkanki do wewnętrznej ścianki końcówki. Następnie, za pomocą mikronoża, odciąć plaster z embrionu i przenieść go z naczynia, używając pipety P 2 lub P 10 wyposażonej w końcówkę 200 µL.

Należy pobrać jak najmniejszą ilość medium. Wymieszać kolagen w wibratorze Vortex i nanieść od pięciu do ośmiu µL mieszaniny na szalkę z dna szklanego powleczonego poli-L-lizyną, z nakrywką jako podstawą; natychmiast umieścić plaster zarodka w kolagenie i ustawić go za pomocą precyzyjnej pęsety. LICs powinny być ułożone tak, aby strona przeznaczona do obrazowania przylegała bezpośrednio do nakrywki.

Tkanka powinna przylegać do powłoki z poli-L-lizyny na szkiełku nakrytym. Powtarzaj tę czynność, aż na szkiełku znajdzie się kilka przekrojów. Zazwyczaj na jednym szkiełku umieszcza się od sześciu do dziewięciu przekrojów.

Gdy wszystkie plasterki znajdą się na swoim miejscu, dodać od dwóch do trzech mikrolitrów medium L 15 do najwcześniej umieszczonego kolagenu i przykryć naczynie. Pozostawić kolagen do zastygnięcia na 20 minut. Po zastygnięciu kolagenu ostrożnie dodać dwa mililitry medium do hodowli plasterków, które było równoważone przez co najmniej godzinę w 5% carbon dioxide i 37 degrees Celsius.

Należy zachować ostrożność, aby nie odkleić kolagenu od szkiełka podstawowego; następnie należy umieścić próbkę w inkubatorze z temperaturą 37 °C i 5% carbon dioxide, pozwalając skrawkom na regenerację przez co najmniej trzy godziny przed obrazowaniem. Obrazowanie zachowania komórek wewnątrz tkanki przez długie okresy czasu przy wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej jest dużym wyzwaniem. Połączenie optymalnych warunków hodowli i zastosowanie mikroskopii pola jasnego jest niezbędne do uzyskania dobrych wyników.

Do obrazowania skrawków wykorzystuje się mikroskop szerokopolowy Delta Vision Core wyposażony w komorę środowiskową Weather Station. W komorze stale utrzymuje się temperaturę 37°C, a za pomocą aparatury do perfuzji dwutlenkiem węgla zapewniane jest stężenie 5% CO₂ i 95% powietrza na stoliku mikroskopu. Obrazowanie zazwyczaj przeprowadza się przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego 40× o aperturze NA 1,30, a obrazy są rejestrowane kamerą CCD CoreSnap HQ2. Przekroje Z (Z-sections) są pobierane co 1,5 µm przez 45 µm grubości tkanki. Czas ekspozycji powinien być jak najkrótszy, na przykład od 5 do 50 ms.

Dla każdego wspomnianego przekroju obrazy są rejestrowane co siedem minut. Za pomocą systemów Delta vision można odwiedzić do dziewięciu warstw. Przedstawiona tutaj funkcja precyzyjnego odwiedzania punktów jest przykładem sekwencji time-lapse komórki progenitorowej rdzenia kręgowego transfekowanej konstruktem wykazującym ekspresję GFP alpha Tubulin; obrazowanie rozpoczęto na przekroju rdzenia kręgowego dwudniowego embrionu w stadium HH 12.

Na tym wczesnym etapie komórki progenitorowe neuronów ulegają głównie podziałom w trybie progenitor-progenitor, podczas których komórki dzielą się, aby wytworzyć dwie kolejne cykliczne komórki progenitorowe. Na tej ilustracji przedstawiono wybrane klatki z zaprezentowanego przed chwilą filmu time-lapse. Po dwóch godzinach i 20 minutach komórka dzieli się w płaszczyźnie podziału prostopadłej do powierzchni apikalnej, tworząc dwie komórki potomne.

Te dwie komórki dzielą się ponownie po 24 godzinach i 23 minutach oraz po 25 godzinach i 54 minutach. Kolejna sekwencja poklatkowa przedstawia komórkę transfektowaną GFP-GPI, która znakuje błonę komórkową. Komórka ta przechodzi podział, podczas którego wypustek bazalny rozdziela się na dwa, co wskazano białymi strzałkami, i zostaje równomiernie przejęty przez komórki potomne.

Wybrane klatki z tej sekwencji poklatkowej pokazują, że podział komórki następuje w czasie zero godzin i 49 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre wyobrażenie o tym, jak przygotowywać i obrazować skrawki rdzenia kręgowego. Pamiętaj, że jeśli jesteś nowym użytkownikiem tej techniki, możesz początkowo napotkać trudności, ponieważ procedura obejmuje szereg wymagających technicznie etapów, które muszą być precyzyjnie wykonane, aby uzyskać pożądany efekt.