Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się nabłonku nerwowym

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie zachowania komórek w embrionalnej cewie nerwowej w wysokiej rozdzielczości przez długi czas. Osiąga się to poprzez najpierw transekcję wczesnej cewy nerwowej za pomocą konstruktu sterującego ekspresją wybranego białka fluorescencyjnego do oznaczania pojedynczych komórek. Następnym krokiem jest zrobienie plastrów wczesnego zarodka i zamontowanie ich na naczyniach ze szklanym dnem.

Po odzyskaniu w inkubatorze wycinki zarodków są obrazowane pod mikroskopem szerokokątnym w regularnych odstępach czasu. Ostatecznie technika ta może być wykorzystana do badania zachowania komórek w rozwijającym się nabłonku nerwowym przez długi czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami obrazowania żywej tkanki jest to, że pozwala nam obserwować zachowanie poszczególnych komórek przez długi czas w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, takie jak rola orientacji wrzeciona mitotycznego w wyborze siarczanów lub w jaki sposób dynamika sygnalizacji może regulować zachowanie komórki przed elektroporacją plazmidów do cewy nerwowej. Igły szklane przygotowuje się za pomocą ściągacza mikrokapilarnego pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj cienkich kleszczy, aby odłamać końcówkę igły.

Koniec igły powinien być na tyle ostry, aby przebić cewę nerwową, a jednocześnie nie być na tyle wąski, aby utrudniać wstrzyknięcie roztworu DNA. X dla tego eksperymentu był inkubowany w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 36 godzin, aby hamburger Hamilton. Etap 10.

Aby rozpocząć tę procedurę, okienko i jajo oraz umieść elektrody w odległości pięciu milimetrów od siebie po obu stronach zarodka, wstrzyknij DNA do cewy nerwowej. DNA jest zabarwione niewielką ilością szybkiej zieleni w celu wizualizacji. Zastosuj prąd o napięciu od 12 do 17 woltów i długości impulsu 50 milisekund trzy razy z 950 milisekundami między impulsami.

Niskie stężenia DNA i niskie napięcia elektroporacji są wykorzystywane do uzyskania ekspresji mozaiki, dzięki czemu można śledzić poszczególne komórki. Na koniec przykryj okno w skorupce jajka taśmą piwniczną, upewniając się, że jest uszczelnione. Pozwól zarodkom zregenerować się przez trzy do czterech godzin lub przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Mieszaninę kolagenu i pożywkę do hodowli plastrów należy przygotować na około godzinę przed pokrojeniem zarodków. Aby przygotować mieszaninę kolagenu w 100 mikrolitrach 0,1% roztworu kwasu octowego do 300 mikrolitrów kolagenu typu pierwszego i dokładnie odwirować, dodać 100 mikrolitrów pięciokrotności L 15, pożywkę i dokładnie odwirować. Ponownie roztwór powinien zmienić kolor na żółty.

Następnie dodaj 15 do 20 mikrolitrów 7,5% wodorowęglanu sodu i dokładnie wymieszaj. Roztwór powinien stać się lekko różowy. Trzymaj na lodzie.

Ta mieszanka kolagenowa powinna być za każdym razem przygotowywana na świeżo. Aby przygotować pożywkę do hodowli plastrów w następujących do 10 mililitrach pożywki neuro podstawowej, B 27 suplement glut max i roztwór Gentamycyny, umieść pożywkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, buforowanym 5% dwutlenkiem węgla. Pozostaw górną część pojemnika luźną, aby mogła zrównoważyć się z dwutlenkiem węgla przez co najmniej godzinę.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj małych nożyczek, aby wyciąć zarodek. Usuń zarodek z jaja za pomocą pęsety do przemywania L 15 podłoża. Umieść zarodek w naczyniu do hodowli tkankowej z warstwą osłony syl guard na dnie.

Przypnij zarodek przez otaczające dodatkowe błony embrionalne, tak aby błony były napięte. Za pomocą mikronoża przekrój zarodek tak prosto, jak to możliwe, przez obszar zainteresowania. W przypadku rdzenia kręgowego plastry powinny składać się z jednego do dwóch grubych plasterków liści somitów przyczepionych do bocznej tkanki zarodka, aby nie zostały utracone podczas krojenia innych zarodków.

Do przenoszenia plastrów rdzenia kręgowego do naczynia ze szklanym dnem potrzebna jest niestandardowa końcówka z mikro rdzeniem. Aby to przygotować, przymocuj końcówkę o pojemności 200 mikrolitrów do permana P two lub P 10 i odetnij około jednego milimetra od końca końcówki. Zakoduj wnętrze końcówki kolagenem, przygotowując jeden mikrolitr mieszanki kolagenowej, która została przygotowana wcześniej.

Pozostawić na jedną do dwóch minut, a następnie spłukać pożywką L 15. Zapobiegnie to przywieraniu tkanki do wnętrza końcówki. Teraz odłącz plasterek od zarodka za pomocą mikronoża i wyjmij plasterek z naczynia za pomocą P dwa lub P 10 wyposażonego w końcówkę o pojemności 200 mikrolitrów.

Staraj się zajmować jak najmniej podłoża. Zwiruj mieszankę kolagenu i upuść jej pięć do ośmiu mikrolitrów na szklane naczynie pokryte poliolem z lizyną z szkiełkiem nakrywkowym jako podstawą, natychmiast włóż plasterek zarodka do kolagenu i umieść go za pomocą cienkich kleszczyków. Lic powinny być ustawione w taki sposób, aby strona, która ma być zobrazowana, była zlicowana z szkiełkiem nakrywkowym.

Tkanka powinna przylegać do powłoki poliolowej z lizyny na szkiełku nakrywkowym. Powtarzaj tę czynność, aż na szkiełku nakrywkowym pojawi się kilka plasterków. Zwykle na jednym naczyniu umieszcza się od sześciu do dziewięciu plasterków.

Gdy wszystkie plastry są na swoim miejscu, dodaj dwa do trzech mikrolitrów L 15, średniego do najwcześniejszego miejsca kolagenu i przykryj naczynie. Pozostaw kolagen do zastygnięcia na 20 minut. Po związaniu kolagenu ostrożnie dodaj dwa mililitry pożywki do hodowli plastrów, która była zrównoważona przez co najmniej godzinę w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza.

Należy uważać, aby nie usunąć kolagenu z szkiełka nakrywkowego w inkubatorze z dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostawić plastry do wyzdrowienia przez co najmniej trzy godziny przed obrazowaniem. Obrazowanie zachowania komórek w tkance przez długi czas przy wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej jest wyzwaniem. Połączenie optymalnych warunków hodowli i zastosowania mikroskopii pola białego jest niezbędne do uzyskania dobrych wyników.

Do obrazowania wycinków używany jest mikroskop szerokokątny z rdzeniem delta vision wyposażony w komorę środowiskową stacji pogodowej. Komora jest stale utrzymywana w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą aparatu do perfuzji dwutlenku węgla, aby utrzymać stolik mikroskopu na poziomie 5% dwutlenku węgla i 95% Obrazowanie powietrza jest zwykle przeprowadzane przy użyciu 40-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju 1,30 NA, a obrazy są rejestrowane za pomocą rdzenia HQ dwa zwane kamerą CCD Sekcje Z są rejestrowane co 1,5 mikrona do 45 mikronów ekspozycji na tkankę. Czas powinien być utrzymywany na jak najniższym poziomie, na przykład od pięciu do 50 milisekund.

Dla każdej z tych sekcji obrazy są rejestrowane co siedem minut. Za pomocą systemów wizyjnych Delta można odwiedzić do dziewięciu wycinków. Pokazana tutaj precyzyjna funkcja wizyty punktowej jest przykładową sekwencją poklatkową komórki progenitorowej rdzenia kręgowego transfekowanej konstruktem wyrażającym GFP alfa Obrazowanie tubuliny rozpoczęto na wycinku rdzenia kręgowego z dwudniowego zarodka HH w stadium 12.

Na tym wczesnym etapie nerwowe komórki progenitorowe przechodzą głównie podziały w trybie progenitorowym, podczas których komórki dzielą się, aby wytworzyć dwie kolejne cykliczne komórki progenitorowe. Ten rysunek przedstawia wybrane klatki z pokazanej właśnie sekwencji poklatkowej. Po dwóch godzinach i 20 minutach komórka dzieli się płaszczyzną rozszczepienia, która jest prostopadła do powierzchni wierzchołkowej, tworząc dwie komórki potomne.

Te dwie komórki dzielą się ponownie po 24 godzinach i 23 minutach oraz 25 godzinach i 54 minutach. Ta następna sekwencja poklatkowa przedstawia komórkę transfekowaną G-F-P-G-P-I oznaczającą błonę komórkową. Komórka ta ulega podziałowi, podczas którego wyrostek podstawowy dzieli się na dwie części wskazane białymi strzałkami i jest w równym stopniu dziedziczony przez komórki potomne.

Wybrane klatki z tej sekwencji poklatkowej pokazują, że podział komórki następuje po godzinie zero i 49 minutach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak przygotować i zobrazować plasterki rdzenia kręgowego. Pamiętaj, że jeśli jesteś nowy w tej technice, możesz początkowo mieć trudności, ponieważ istnieje wiele technicznie trudnych kroków, które muszą się spotkać, aby to zadziałało.