Name: Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się nabłonku nerwowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo komórek w rozwijającym się nabłonku nerwowym kurczaka z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technika umożliwia długoterminową obserwację zachowań pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie naczynia
<ol>
 <li>Szalki używane do hodowli skrawków są szklonne (z zakryweczką jako podstawą) (szalki WillCo). Są one umieszczane na chusteczkach do soczewek w szalce hodowlanej o średnicy 6 cm, aby utrzymać szklane dno w czystości.</li>
 <li>W dniu poprzedzającym eksperyment należy dodać 2 ml 0,1% roztworu poli-L-lizyny do szalki z szklanym dnem i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby poli-L-lizyna pokryła szklane dno.</li>
 <li>Usunąć roztwór poli-L-lizyny i wypłukać trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie raz w 70% etanolu.</li>
 <li>Pozostawić do wyschnięcia na noc. Szalki można również wysuszyć, delikatnie podgrzewając je w mikrofalówce na niskiej mocy przez 30-45 sekund.</li>
</ol>
2. Elektroporacja zarodków
<ol>
 <li>Inkubować jaja w temperaturze 37 °C do stadium 10 według skali Hamburgera-Hamiltona (HH) (~36 godzin) (lub innego pożądanego stadium).</li>
 <li>Przed rozpoczęciem przygotować szklane igły (stosujemy wyciągacz mikrokapilar Flaming/Brown model p87) i odłamać końcówkę igły za pomocą precyzyjnej pęsety pod mikroskopem stereoskopowym. Końcówka igły powinna być wystarczająco ostra, aby przebić zarodek, ale nie może być zbyt wąska, by nie utrudniać wstrzykiwania roztworu DNA.</li>
 <li>Wyciąć okno w skorupce jaj oraz umieścić elektrody (w odstępie 5mm) po obu stronach zarodka.</li>
 <li>Wstrzyknąć DNA (~0,025 - 0,5 μg/μl w wodzie dejonizowanej zabarwionej niewielką ilością barwnika fast green) do rurki neuralnej.</li>
 <li>Przyłożyć prąd - 12-17 V trzykrotnie, przy długości impulsu 50ms i odstępie 950 ms między impulsami.</li>
 <li>Stosujemy niskie stężenia DNA i niskie napięcia elektroporacji, aby uzyskać ekspresję mozaikową, co pozwala na śledzenie pojedynczych komórek.</li>
 <li>Zakleić okno w skorupce jaja taśmą klejącą i upewnić się, że jest ono szczelne.</li>
 <li>Pozostawić zarodki do regeneracji przez 3-4 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kolagenu i pożywki do hodowli skrawków
<ol>
 <li>Przygotować mieszaninę kolagenu oraz pożywkę do hodowli plastrów na około godzinę przed etapem krojenia.</li>
 <li>Do 300 μl kolagenu typu 1 dodać 100 μl 0,1% roztworu kwasu octowego oraz 100 μl pożywki 5 x L15. Po każdym dodaniu dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. Roztwór powinien zmienić kolor na żółty.</li>
 <li>Następnie dodać 15-20 μl 7,5% wodorowęglanu sodu i dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. Roztwór powinien stać się lekko różowy; objętość wodorowęglanu sodu wymagana do osiągnięcia tego efektu może się różnić. Przechowywać w lodzie i przygotowywać świeżą porcję przed każdym użyciem.</li>
 <li>Do 10 ml pożywki neurobasal dodać suplement B-27 oraz Glutamax do stężenia końcowego 1 x oraz 10 μl roztworu gentamycyny.</li>
 <li>Umieścić pożywkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z buforowaniem 5% CO2. Pozostawić górną część pojemnika niezabezpieczoną, aby umożliwić wyrównanie poziomu CO2.</li>
</ol>
4. Hodowla plastrów tkankowych
<ol>
 <li>Wyjąć zarodki z jaj i przemyć w medium L15.</li>
 <li>Umieścić je w naczyniu do hodowli tkankowej z warstwą sylgardu na dnie i rozpiąć poprzez otaczające błony pozazarodkowe tak, aby były mocno naciągnięte.</li>
 <li>Za pomocą mikronoża przeciąć zarodek tak prosto, jak to możliwe, przez obszar zainteresowania. W przypadku rdzenia kręgowego przekroje powinny mieć grubość od 1 do 2 somytów. Pozostawić przekroje przyczepione do zarodka podczas krojenia pozostałych embrionów, aby ich nie zgubić.</li>
 <li>Przygotować końcówkę do mikropipety 200 μl, odcinając ok. 1 mm jej wierzchołka i mocując ją do pipety p2 lub p10. Końcówka ta posłuży do przeniesienia przekrojów rdzenia kręgowego do naczynia z dnem szklanym. Końcówka 10 μl nie jest wystarczająco szeroka, aby pobrać przekroje.</li>
 <li>Pokryć wnętrze końcówki kolagenem, pipetując 1 μl wcześniej przygotowanej mieszaniny kolagenowej. Pozostawić na 1-2 min, a następnie przepłukać medium L15. Zapobiegnie to przywieraniu tkanki do wewnętrznej strony końcówki.</li>
 <li>Oddzielić przekrój od zarodka za pomocą mikronoża i usunąć z naczynia, używając pipety p2 lub p10 z założoną końcówką 200 μl ustawionej na 1 μl. Należy starać się pobrać jak najmniej medium.</li>
 <li>Wymieszać mieszaninę kolagenową na vortexie i nanieść 5-8 μl na naczynie pokryte poli-L-lizyną.</li>
 <li>Natychmiast umieścić przekrój zarodka w kolagenie i ustawić go za pomocą precyzyjnej pęsety. Przekroje powinny być ustawione tak, aby strona przeznaczona do obrazowania przylegała do szkiełka nakrywki. Tkanka powinna przylgnąć do powłoki z poli-L-lizyny na szkiełku nakrywce.</li>
 <li>Powtarzać czynność, aż na szkiełku znajdzie się kilka przekrojów. Zazwyczaj na jednym naczyniu można umieścić od 6 do 9 przekrojów.</li>
 <li>Po rozmieszczeniu wszystkich przekrojów przykryć naczynie i pozwolić kolagenowi stężeć przez 20 minut. Część z pierwszych naniesionych porcji kolagenu mogła już zacząć wysychać. Aby temu zapobiec, przed przykryciem dodać do nich niewielką ilość L15.</li>
 <li>Po stężeniu ostrożnie dodać 2 ml medium do hodowli przekrojów, które było równoważone w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej godzinę. Należy zachować ostrożność, aby nie oderwać kolagenu od szkiełka nakrywki.</li>
 <li>Umieścić w inkubatorze 37 ° / 5% CO2 i pozwolić przekrojom na regenerację przez co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem. W przypadku braku wilgoci umieścić naczynie w pudełku z pleksiglasu z niewielką ilością wilgotnego ręcznika papierowego w jednym z rogów.</li>
</ol>
5. Obrazowanie przekrojów zarodka
<ol>
 <li>Do obrazowania skrawków wykorzystujemy mikroskop szerokopolowy DeltaVision Core wyposażony w komorę środowiskową WeatherStation. W komorze stale utrzymywana jest temperatura 37 °C, a aparat do perfuzji CO2 zapewnia utrzymanie na stoliku mikroskopu atmosfery składającej się z 5% CO2 / 95% powietrza.</li>
 <li>Obrazowanie jest zazwyczaj przeprowadzane przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego 40 x / 1.30 NA, a obrazy są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD CoolSnap HQ2.</li>
 <li>Przekroje Z-stack są rejestrowane co 1.5 μm w obrębie tkanki o grubości 45 μm. Czas ekspozycji powinien być tak krótki, jak to możliwe. Zazwyczaj stosujemy ekspozycję od 5-50 ms dla każdego przekroju Z. Obrazy są rejestrowane co 7 minut, a dzięki funkcji precyzyjnego odwiedzania punktów w systemie DeltaVision można monitorować do 9 skrawków.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykładowa sekwencja poklatkowa komórki progenitorowej rdzenia kręgowego jest przedstawiona na Ryc. 2a oraz w odpowiadającym jej Filmie 1. Obrazowanie rozpoczęto na skrawku rdzenia kręgowego z dwudniowego zarodka (stadium HH 12). Komórka ta została przetransfekowana konstruktem wykazującym ekspresję GFP-αTubulin. Na tym wczesnym etapie komórki progenitorowe neuronów ulegają głównie podziałom w trybie progenitor-progenitor, podczas których komórki dzielą się, tworząc dwie kolejne cykliczne komórki progenitorowe. Ryc. 2b oraz odpowiadający jej Film 2 przedstawiają komórkę przetransfekowaną GFP-GPI (GFP zakotwiczone przez GPI), która znakuje błonę komórkową. Komórka ta ulega podziałowi, podczas którego wypustka podstawna rozdziela się na dwie i jest równomiernie dziedziczona przez komórki córki.
<img alt="Iniekcja DNA do rurki neuralnej, krojenie, montaż, obrazowanie; konfiguracja mikroskopii szerokopolowej Deltavision." src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Protokół hodowli skrawków do obrazowania time-lapse.
<img alt="Mikroskopia time-lapse GFP-Tubuliny i GFP-GPI w komórkach; analiza fluorescencji w czasie." src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zachowanie komórek podczas prawidłowego rozwoju rdzenia kręgowego. (a) Wybrane klatki z Filmu 1. Komórka wykazująca ekspresję GFP-tubuliny dzieli się w płaszczyźnie podziału prostopadłej do powierzchni apikalnej (2 h 20 min), generując dwie komórki potomne, które dzielą się ponownie (24 h 23 min i 25 h 54 min). (b) Wybrane klatki z Filmu 2. Komórka przetransfekowana GFP-GPI przechodzi podział komórkowy, podczas którego wypustka basalna zostaje rozdzielona (białe strzałki) i równomiernie przejęta przez komórki potomne.
Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
Film 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
<li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning%2C+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li>
<li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37(2011).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58(2011).</li>
<li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bios+Scientific+Publishers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li>
<li>Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Fundamental+Limits+in+Confocal+Microscopy+Handbook+Of+Biological+Confocal%22">Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal</a>. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).</li>
<li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii%3A+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li>
<li>Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggs%2C+DSC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy nowatorski test obrazowania time-lapse służący do monitorowania zachowania komórek w kulturze skrawków embrionu kurczaka. Test ten umożliwia obrazowanie żywej tkanki w wysokiej rozdzielczości przez okres do 70 godzin, przy czym łatwiej jest rejestrować ramy czasowe między 24 a 48 godzinami. Zastosowanie obiektywu olejowego o wysokiej aperturze numerycznej (NA) oraz stosunkowo krótkich odstępów między punktami czasowymi pozwala na akwizycję obrazów w wysokiej rozdzielczości, a także na monitorowanie zachowań komórkowych, które często przebiegają szybko i mogą zostać przeoczone podczas konwencjonalnego obrazowania time-lapse z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
Główną zaletą tego testu jest możliwość obrazowania komórek przez długi czas. Kluczowe znaczenie ma tutaj zastosowanie mikroskopii szerokopolowej6 zamiast konfokalnej mikroskopii skaningowej7. Mikroskopia konfokalna tradycyjnie oferowała kilka zalet nad mikroskopią szerokopolową, w tym możliwość wykonywania przekrojów optycznych i bezpośredniego eliminowania informacji poza ogniskową7, jednak zastosowanie otworu przesłony (pinhole) prowadzi do utraty światła docierającego do detektora8, co wyklucza znaczną ilość informacji i wymusza dłuższy czas ekspozycji. Z kolei mikroskopia szerokopolowa wykorzystuje oświetlenie pełnego pola, a całe światło przechodzące przez obiektyw trafia do detektora. W połączeniu z chłodzoną kamerą o wysokiej wydajności kwantowej (CCD) zapewnia to obrazowanie z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w porównaniu z mikroskopią konfokalną9, przy bardzo krótkich czasach ekspozycji. W naszej aplikacji musimy prowadzić obrazowanie przez długi czas, rejestrować stosy 3D i ostatecznie rozdzielić małe struktury, bliskie granicy dyfrakcyjnej. Choć mikroskopia konfokalna zapobiega docieraniu światła poza ogniskową do detektora, a tym samym znacząco redukuje tło w grubych, gęsto znakowanych próbkach7, 8, użyteczny stosunek sygnału do szumu osiąga ona dopiero przy znacznie większym dopływie światła niż w mikroskopii szerokopolowej10. Dlatego w przypadku próbek bardzo światłoczułych i rzadko znakowanych, takich jak nasze elektroporowane skrawki rdzenia kręgowego, mikroskopia szerokopolowa sprawdza się lepiej niż mikroskopia konfokalna. W połączeniu z rekonstrukcją obrazu metodą dekonwolucji, która usuwa informacje poza ogniskową i poprawia kontrast, mikroskopia szerokopolowa jest szczególnie skuteczna w detekcji małych, słabo świecących obiektów11. Choć podejście to nie jest odpowiednie dla każdego eksperymentu obrazowania tkanek, okazało się ono bardzo efektywne w naszej aplikacji obrazowania żywych komórek.
Wybór białka fluorescencyjnego jest istotnym czynnikiem, który może wpływać na przeżywalność komórek. Ustaliliśmy, że najlepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu konstruktów wykorzystujących zielone białko fluorescencyjne (GFP)12 jako marker. Obecnie oceniamy szereg czerwonych białek fluorescencyjnych, które mogą być skutecznie stosowane w połączeniu z GFP do obrazowania time-lapse w dwóch kanałach. Dostępnych jest wiele takich białek13. Chociaż wiele białek zachowuje stabilność jako fuzje z białkiem fluorescencyjnym, niektóre z nich mogą stać się niestabilne w wyniku fuzji, co prowadzi do obniżenia żywotności komórek. W takich przypadkach użyteczne jest zastosowanie konstruktów zawierających wewnętrzny miejsce wejścia rybosomu (IRES), aby oddzielić białko docelowe od białka fluorescencyjnego.
Podczas obrazowania skrawków rdzenia kręgowego należy zachować ostrożność, aby zminimalizować ekspozycję na światło fluorescencyjne. Okularów mikroskopu należy używać wyłącznie przy świetle przechodzącym (w polu jasnym) w celu zlokalizowania i odpowiedniego ustawienia skrawków. Obrazy fluorescencyjne powinny być zawsze pozyskiwane za pomocą oprogramowania mikroskopu przy minimalnym czasie ekspozycji. Czas ten powinien mieścić się w zakresie 5-50 ms; zaleca się również eksperymentowanie z użyciem filtrów neutralnych. Choć dłuższe czasy ekspozycji mogą początkowo dawać wyraźniejsze obrazy, fototoksyczne działanie światła fluorescencyjnego może prowadzić do śmierci komórek. Nie należy obrazować pierwszych 5-10 μm tkanki znajdującej się najbliżej szkiełka podstawowego, ponieważ obszar ten może zawierać tkankę uszkodzoną podczas krojenia.
Chociaż przedstawione tutaj przykłady dotyczą embrionów poddanych elektroporacji w stadium HH 10 i obrazowaniu 6-7 godzin później, metodę tę można stosować dla embrionów do stadium HH 18. W późniejszych stadiach tkanka rdzenia kręgowego jest znacznie większa, co utrudnia ręczne wykonywanie przekrojów. W takich przypadkach lepsze wyniki może przynieść zatopienie embrionów w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i sekcjonowanie za pomocą wibratomu. Mimo że przedstawiamy ten test jako metodę obrazowania komórek w rozwijającym się rdzeniu kręgowym, podejście to zostało również zmodyfikowane w celu obrazowania innych tkanek embrionalnych, w tym placod sensorycznych3.

obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Zarodkowy rdzeń kręgowy składa się z cyklicznych neuralnych komórek progenitorowych, z których powstaje znaczny odsetek neuronów i komórek glejowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Chociaż wiele wiadomo o mechanizmach molekularnych, które kształtują wzorzec rdzenia kręgowego i wywołują różnicowanie neuronalne1, 2, brakuje nam głębokiego zrozumienia tych wczesnych zdarzeń na poziomie zachowania komórek. Krytyczne jest zatem badanie zachowania progenitorów neuralnych w czasie rzeczywistym podczas gdy przechodzą one proces neurogenezy.
W przeszłości obrazowanie tkanek wczesnego embrionu w czasie rzeczywistym było ograniczone żywotnością komórek i tkanek w kulturze, a także fototoksycznymi efektami obrazowania fluorescencyjnego. Przedstawiamy tutaj nowatorski test do obrazowania takich tkanek przez długi czas, wykorzystujący nowy protokół hodowli skrawków ex vivo oraz szerokopolową mikroskopię fluorescencyjną (Rys. 1). Podejście to umożliwia długoterminowy monitoring z lapsem czasowym komórek progenitorowych rdzenia kręgowego embrionu kurczaka z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
Ten test można zmodyfikować w celu obrazowania różnych tkanek embrionalnych3, 4 Oprócz obserwacji zachowań komórkowych i podkomórkowych, opracowanie nowych i wysoce czułych reporterów aktywności genów (na przykład sygnalizacji Notch5) sprawia, że test ten jest potężnym narzędziem pozwalającym zrozumieć, w jaki sposób sygnalizacja reguluje zachowanie komórek podczas rozwoju embrionalnego.

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Zarodekowy rdzeń kręgowy składa się z cyklicznie dzielących się komórek progenitorowych neuronów, z których powstaje znaczny odsetek komórek neuronalnych i glejowych ośrodkowego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie zachowania komórek wewnątrz embrionalnej cewki neuralnej w wysokiej rozdzielczości przez dłuższy czas. Osiąga się to poprzez uprzednią transdukcję wczesnej cewki neuralnej konstruktem sterującym ekspresją wybranego białka fluorescencyjnego w celu znakowania pojedynczych komórek. Kolejnym krokiem jest wykonanie przekrojów wczesnego zarodka i ich zamocowanie na naczyniach z szklanym dnem.Po regeneracji w inkubatorze, plastry embrionów są obrazowane za pomocą mikroskopu szerokopolowego w regularnych odstępach czasu. Ostatecznie technika ta może być wykorzystana do badania zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium przez długie okresy czasu z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami obrazowania żywych tkanek jest to, że pozwala ona obserwować zachowanie poszczególnych komórek przez długi czas przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.Ta metoda pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwoju, takie jak rola orientacji wrzeciona podziałowego w wyborze siarczanów lub sposób, w jaki dynamika sygnalizacji może regulować zachowanie komórek przed elektroporacją plazmidów do cewy nerwowej. Igły szklane przygotowuje się za pomocą mikro-wyciągacza kapilar pod mikroskopem stereoskopowym. Należy użyć precyzyjnej pęsety, aby odłamać końcówkę igły.Koniec igły powinien być wystarczająco ostry, aby przebić rurkę nerwową, ale nie może być zbyt wąski, by nie utrudniać wstrzykiwania roztworu DNA. Zarodki do tego eksperymentu były inkubowane w temperaturze 37 °C przez około 36 godzin, aby osiągnąć 10. stadium według tabeli Hamiltona.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wykonać okienko w jajie, umieścić elektrody w odległości pięciu milimetrów od siebie po obu stronach zarodka, a następnie wstrzyknąć DNA do rurki neuralnej. DNA jest zabarwione niewielką ilością fast green w celu wizualizacji. Należy przyłożyć prąd o napięciu od 12 do 17 V z czasem trwania impulsu 50 ms, powtarzając ten proces trzy razy w odstępach 950 ms między impulsami.W celu uzyskania ekspresji mozaikowej, umożliwiającej śledzenie pojedynczych komórek, stosuje się niskie stężenia DNA oraz niskie napięcia elektroporacji. Na koniec otwór w skorupce jaja zakleja się taśmą klejącą, upewniając się, że jest on szczelny. Zarodki pozostawia się do regeneracji przez trzy do czterech godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C.Mieszaninę kolagenu i pożywkę do hodowli plastrów należy przygotować około godziny przed pokrojeniem zarodków. Aby przygotować mieszaninę kolagenu, należy dodać 100 µL 0,1% roztworu kwasu octowego do 300 µL kolagenu typu jeden i dokładnie wymieszać w wstrząsarku vortex, a następnie dodać 100 µL pożywki L 15 w stężeniu 5x i ponownie dokładnie wymieszać w wstrząsarku vortex. Roztwór powinien przybrać żółty kolor.Następnie dodaj 15 do 20 µL 7,5% wodorowęglanu sodu i dokładnie wymieszaj w wortexie. Roztwór powinien stać się lekko różowy. Przechowuj w lodzie.Tę mieszaninę kolagenu należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem. Aby przygotować pożywkę do hodowli skrawków, do 10 ml pożywki Neurobasal z dodatkiem suplementu B 27, Glutamax i roztworem gentamycyny, umieść pożywkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, buforowanym 5% dwutlenkiem węgla. Pozostaw korek naczynia lekko poluzowany, aby pożywka mogła osiągnąć równowagę z dwutlenkiem węgla przez co najmniej godzinę.Aby rozpocząć tę procedurę, należy za pomocą małych nożyczek wyciąć zarodek. Wyjąć zarodek z jaja pęsetą, płukząc go w medium L 15. Umieścić zarodek w naczyniu do hodowli tkankowej z warstwą sylgardu na dnie.Przypnij embrion przez otaczające go błony pozazarodkowe w taki sposób, aby błony były mocno rozciągnięte. Za pomocą mikronnoża przetnij embrion jak najprościej w obrębie obszaru zainteresowania. W przypadku przekrojów rdzenia kręgowego grubość powinna wynosić od jednego do dwóch somitym; plastry tkanki należy przytwierdzić do bocznych tkanek embrionu, aby nie zgubić ich podczas krojenia pozostałych embrionów.Do przenoszenia skrawków rdzenia kręgowego do szalki z szklanym dnem niezbędna jest dostosowana końcówka mikro-pipety. Aby ją przygotować, załóż końcówkę 200 µL na pipetę P2 lub P10, a następnie odetnij około 1 mm z końca końcówki. Pokryj wnętrze końcówki kolagenem, przygotowując 1 µL wcześniej opracowanej mieszaniny kolagenu.Pozostawić na jedną do dwóch minut, a następnie wypłukać podłożem L 15. Zapobiegnie to przywieraniu tkanki do wewnętrznej ścianki końcówki. Następnie, za pomocą mikronoża, odciąć plaster z embrionu i przenieść go z naczynia, używając pipety P 2 lub P 10 wyposażonej w końcówkę 200 µL.Należy pobrać jak najmniejszą ilość medium. Wymieszać kolagen w wibratorze Vortex i nanieść od pięciu do ośmiu µL mieszaniny na szalkę z dna szklanego powleczonego poli-L-lizyną, z nakrywką jako podstawą; natychmiast umieścić plaster zarodka w kolagenie i ustawić go za pomocą precyzyjnej pęsety. LICs powinny być ułożone tak, aby strona przeznaczona do obrazowania przylegała bezpośrednio do nakrywki.Tkanka powinna przylegać do powłoki z poli-L-lizyny na szkiełku nakrytym. Powtarzaj tę czynność, aż na szkiełku znajdzie się kilka przekrojów. Zazwyczaj na jednym szkiełku umieszcza się od sześciu do dziewięciu przekrojów.Gdy wszystkie plasterki znajdą się na swoim miejscu, dodać od dwóch do trzech mikrolitrów medium L 15 do najwcześniej umieszczonego kolagenu i przykryć naczynie. Pozostawić kolagen do zastygnięcia na 20 minut. Po zastygnięciu kolagenu ostrożnie dodać dwa mililitry medium do hodowli plasterków, które było równoważone przez co najmniej godzinę w 5% carbon dioxide i 37 degrees Celsius.Należy zachować ostrożność, aby nie odkleić kolagenu od szkiełka podstawowego; następnie należy umieścić próbkę w inkubatorze z temperaturą 37 °C i 5% carbon dioxide, pozwalając skrawkom na regenerację przez co najmniej trzy godziny przed obrazowaniem. Obrazowanie zachowania komórek wewnątrz tkanki przez długie okresy czasu przy wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej jest dużym wyzwaniem. Połączenie optymalnych warunków hodowli i zastosowanie mikroskopii pola jasnego jest niezbędne do uzyskania dobrych wyników.Do obrazowania skrawków wykorzystuje się mikroskop szerokopolowy Delta Vision Core wyposażony w komorę środowiskową Weather Station. W komorze stale utrzymuje się temperaturę 37°C, a za pomocą aparatury do perfuzji dwutlenkiem węgla zapewniane jest stężenie 5% CO₂ i 95% powietrza na stoliku mikroskopu. Obrazowanie zazwyczaj przeprowadza się przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego 40× o aperturze NA 1,30, a obrazy są rejestrowane kamerą CCD CoreSnap HQ2. Przekroje Z (Z-sections) są pobierane co 1,5 µm przez 45 µm grubości tkanki. Czas ekspozycji powinien być jak najkrótszy, na przykład od 5 do 50 ms.Dla każdego wspomnianego przekroju obrazy są rejestrowane co siedem minut. Za pomocą systemów Delta vision można odwiedzić do dziewięciu warstw. Przedstawiona tutaj funkcja precyzyjnego odwiedzania punktów jest przykładem sekwencji time-lapse komórki progenitorowej rdzenia kręgowego transfekowanej konstruktem wykazującym ekspresję GFP alpha Tubulin; obrazowanie rozpoczęto na przekroju rdzenia kręgowego dwudniowego embrionu w stadium HH 12.Na tym wczesnym etapie komórki progenitorowe neuronów ulegają głównie podziałom w trybie progenitor-progenitor, podczas których komórki dzielą się, aby wytworzyć dwie kolejne cykliczne komórki progenitorowe. Na tej ilustracji przedstawiono wybrane klatki z zaprezentowanego przed chwilą filmu time-lapse. Po dwóch godzinach i 20 minutach komórka dzieli się w płaszczyźnie podziału prostopadłej do powierzchni apikalnej, tworząc dwie komórki potomne.Te dwie komórki dzielą się ponownie po 24 godzinach i 23 minutach oraz po 25 godzinach i 54 minutach. Kolejna sekwencja poklatkowa przedstawia komórkę transfektowaną GFP-GPI, która znakuje błonę komórkową. Komórka ta przechodzi podział, podczas którego wypustek bazalny rozdziela się na dwa, co wskazano białymi strzałkami, i zostaje równomiernie przejęty przez komórki potomne.Wybrane klatki z tej sekwencji poklatkowej pokazują, że podział komórki następuje w czasie zero godzin i 49 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre wyobrażenie o tym, jak przygotowywać i obrazować skrawki rdzenia kręgowego. Pamiętaj, że jeśli jesteś nowym użytkownikiem tej techniki, możesz początkowo napotkać trudności, ponieważ procedura obejmuje szereg wymagających technicznie etapów, które muszą być precyzyjnie wykonane, aby uzyskać pożądany efekt.

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wysokiej rozdzielczości obserwacje na żywo zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę obrazowania na żywo komórek w rozwijającym się nabłonku nerwowym kurczaka z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technika umożliwia długoterminową obserwację zachowań pojedynczych komórek.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Przeglądaj więcej filmów