Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja dzielących się komórek w rozwijającej się tkance podczas embriogenezy Celegance. W celu zbadania genów kontrolujących podział komórki, osiąga się to poprzez stworzenie lub uzyskanie szczepu Célgana, który stabilnie eksprymuje markery transgeniczne znakujące interesujące komórki. W drugim kroku selektywnie powala się interesujący gen, karmiąc D-S-R-N-A larwy L Four przez 24 do 48 godzin.

Zarodki RNAI są pobierane z graficznych hermafrodytów i przenoszone do podkładki aros w celu obrazowania na żywo. Następnie, za pomocą mikroskopii szerokokątnej lub konfokalnej, zarodki są obrazowane w celu wizualizacji fenotypów podziału komórek. Wyniki pokażą, w jaki sposób neuroblasty dzielą się podczas embriogenezy elgina morskiego oraz jaka jest rola genów niezbędnych do ich podziału.

Metoda ta może pomóc w ujawnieniu kluczowych pytań w dziedzinie biologii rozwoju i biologii komórki. Na przykład metoda ta może ujawnić geny i mechanizmy, które są zaangażowane w regulację mitozy podczas rozwoju tkanek, komunikacji komórek komórkowych, migracji komórek lub polaryzacji komórek. Stosować transgeniczne robaki wykazujące ekspresję odpowiednich markerów trzymanych na płytkach kontrolnych lub RNAI przez 24 do 48 godzin.

Wybierz od czterech do sześciu grobowych dorosłych i przenieś je do 20 do 30 mikrolitrów buforu M nine na szkiełku depresyjnym Aby uwolnić zarodki, użyj sterylnego skalpela, przetnij robaki po obu stronach spermateki lub sromu. Następnie zbierz zarodki za pomocą wyciągniętej kapilary, która jest przymocowana do gruszki pipety i jest wystarczająco szeroka, aby przejść przez zarodki. Przenieś zarodki do świeżo przygotowanej podkładki aros za pomocą rzęsy przyklejonej do wykałaczki.

Twórz grupy od pięciu do 10 zarodków, popychając zarodki obok siebie. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i w razie potrzeby dodaj więcej buforu M nine, a następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe podgrzanym płynem valla. Użyj mikroskopu szerokokątnego epi fluorescencyjnego, który zawiera automatyczne filtry.

Obiektywy, kamera CCD o wysokiej rozdzielczości i wysoce zmotoryzowany stolik. Wszystko kontrolowane za pomocą oprogramowania. Chociaż ten system ich nie ma, za pomocą diod LED i E-M-C-C-D ograniczy fototoksyczność dla zarodka przy małym powiększeniu.

Ręcznie ustaw ostrość na zarodkach, aby zobrazować neuroblast. Zwiększ powiększenie i wybierz zarodki poddawane krzyżowaniu grzbietowemu lub wczesnemu zamknięciu brzusznemu pod mikroskopem szerokokątnym. Wybierz filtry GFP i czerwony Texas i określ optymalne płaszczyzny Z w systemie szerokokątnym.

Użycie mniejszej liczby Zacków i mniejszej liczby punktów czasowych zmniejszy fototoksyczność, a także zamknięcie przysłony do 30%i, jeśli to możliwe, zmniejszenie intensywności światła jeszcze bardziej zmniejszy fototoksyczność. Alternatywnie można użyć mikroskopu konfokalnego z polem skanowania na żywo lub z wirującym dyskiem z oprogramowaniem sterującym obiektywami laserów skanujących, kamerą E-M-C-C-D i wysoce zmotoryzowanym stolikiem. Teraz, gdy ustawienia akwizycji zostały zoptymalizowane, zobrazuj zarodki pod mikroskopem szerokokątnym.

Zaleca się filmowanie zarodków kontrolnych przed zarodkami RNAI. Z systemem zamiatanego pola. Ustaw 4 lasery 88 i 5 61 o mocy 100 miliwatów na 40% mocy ze szczeliną 50 i czasem naświetlania 300 milisekund.

Należy pamiętać, że te ustawienia będą różne dla innych mikroskopów. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu, a następnie użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby znaleźć zarodki. Następnie przełącz się na obiektyw 60 lub 100 x zanurzenie w olejku.

Po ustawieniu ostrości zbierz 20 stosów Z o wielkości 0,2 mikrona co dwie minuty, w sumie 10 minut. Czas naświetlania prawdopodobnie będzie wymagał dostosowania. Fototoksyczność należy wziąć pod uwagę podczas obrazowania żywych zarodków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zamykając aperturę, wybierając mniej Zacków lub punktów czasowych.

Skrócenie czasu ekspozycji może ograniczyć fototoksyczność, jeśli to możliwe. Korzystanie z pola SW lub mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem może pomóc w rozwiązaniu tego problemu. Określ swój czas, punkty i płaszczyzny Z za pomocą oprogramowania do akwizycji.

Eksportuj żądane obrazy jako wiele plików tiff. Otwórz żądane płaszczyzny Z dla każdego punktu czasowego i kanału zainteresowania w oprogramowaniu do przetwarzania, takim jak Image J, i utwórz stos neuroblastów, często obejmujący tylko kilka płaszczyzn. Ułóż płaszczyzny Z dla każdego punktu czasowego i utwórz rzuty stosu Z.

Powtórz tę czynność dla dodatkowych kanałów. Po zakończeniu wszystkich projekcji Zacka dla żądanych punktów czasowych otwórz projekcje, aby utworzyć sekwencję czasową. Zrób to dla każdego kanału osobno.

Dla każdego kanału dostosuj jasność i kontrast zgodnie z potrzebami. W razie potrzeby obróć obrazy. Następnie wybierz interesujący Cię obszar i przytnij obrazy.

Teraz utwórz scalony obraz za pomocą funkcji scalonych kanałów. Wybieranie innego koloru dla każdego kanału. Zapisz scalony obraz jako plik RGB, aby wyraźniej zobrazować obrazy.

Użyj 16-bitowych obrazów TIFF i wybierz funkcję odwrócenia w obszarze edycji, aby utworzyć obrazy w skali szarości dla każdego kanału. Aby określić rozmiar obiektu interesującego mikrony, narysuj linię i pomnóż jej długość przez rozmiar pikseli, który jest określany przez parametry obrazowania. Teraz utwórz pasek skali, który reprezentuje proporcję obliczonej długości w mikronach.

Ostatecznie zapisz końcowe obrazy jako ośmiobitowe tiffy. W razie potrzeby przekonwertuj pliki TIFF na filmy, używając obrazu naskórkowego J. Morfogeneza elegancji C zachodzi w wyniku połączenia zmian kształtu komórek naskórka, migracji i adhezji z pomocą leżącego u podstaw proliferacyjnego neuroblastu.

Komórki naskórka migrują do brzusznej linii środkowej i tworzą pojedynczą warstwę komórek do badania zarodków podziału neuroblastów, stabilnie wyrażających coex i markera specyficznego dla neuroblastów oznaczonego GFP oraz markera błonowego napędzanego przez matkę oznaczonego wiśnią m zostały zobrazowane podczas obudowy brzusznej w zwiększonym powiększeniu. Neuroblasty zostały uwidocznione w trakcie podziału, jądra neuroblastów są pokazane na zielono, a otaczające błony są pokazane na czerwonych obrazach poklatkowych dzielącego się neuroblastu zarysowanych sondą błonową mCherry w zarodku kontrolnym, które zostały uchwycone za pomocą mikroskopu szerokokątnego, aby lepiej uwidocznić podział neuroblastów w zarodkach kontrolnych. Każdy kanał utrzymywano w skali szarości, a obrazy odwracano za pomocą zarodków kontrolnych z mikroskopii konfokalnej w polu przemiatania.

Szynka z ekspresją Coex o jednym GFP i pH wiśni M zostały zobrazowane w regionie z dzielącym się neuroblastem. Te same zarodki, którym podano RNAI w celu złagodzenia chorego wyrazu, zostały uwidocznione za pomocą mikroskopii szerokokątnej. W przeciwieństwie do zarodków kontrolnych, wiele neuroblastów utknęło lub cofnęło się podczas podziału i stało się wielojądrowymi przy użyciu mikroskopii pola zamiatania.

Było również jasne, że wiele neuroblastów utknęło w martwym punkcie lub cofnęło się podczas podziału i stało się wielojądrowymi. Technika ta może być również wykorzystana do obrazowania migrujących komórek podczas tworzenia tkanek. Ponadto, jeśli twoje Zacks są używane do szybszego obrazowania, można uzyskać więcej informacji na temat dynamiki subkomórkowej.

Ponadto, przy odpowiednim sprzęcie, technika ta może być wykorzystana do aktywacji fotodostrajalnych sond w celu przeprowadzenia optogenetyki. Techniki mikroskopowe, takie jak fret lub fret, mogą być również stosowane do badania białek, interakcji białek lub dynamiki białek.