Name: Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T18:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Odkryj metodę wizualizacji cytokinezy neuroblastów w embriogenezie Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala badać funkcje genów kontrolujących podział komórek w tkance rozwijającej się.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną potwierdzić, że ta praca była wspierana przez grant Kanadyjskiej Rady ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC).

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worming+secrets+from+the+C.+elegans+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Worming secrets from the C. elegans genome.</a> Science. 282, 1972-1974 (1998).</li>
<li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rde-1+gene%2C+RNA+interference%2C+and+transposon+silencing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99, 123-132 (1999).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChisholm%2C+AD+%22Epidermal+morphogenesis.+WormBook.+The+C.+elegans+Research+Community%22">Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community</a>. , 1-22 (2005).</li>
<li>Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+morphogenesis%3A+how+multiple+cells+cooperate+to+generate+a+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).</li>
<li>Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+the+power+of+the+purse+string%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing: the power of the purse string.</a> Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).</li>
<li>Ikegami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+and+Eph+receptor+signaling+guide+a+series+of+cell+movements+for+ventral+enclosure+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans.</a> Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ephrin+VAB-2%2FEFN-1+functions+in+neuronal+signaling+to+regulate+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).</li>
<li>Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Ephrins+Control+Cell+Organization+in+C.+elegans+Using+Kinase-Dependent+and+-Independent+Functions+of+the+VAB-1+Eph%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph.</a> Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+divergent+C.+elegans+ephrin+EFN-4+functions+in+embryonic+morphogenesis+in+a+pathway+independent+of+the+VAB-1+Eph+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor.</a> Development. 129, 5499-5510 (2002).</li>
<li>Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VAB-1+Eph+receptor+tyrosine+kinase+and+SAX-3%2FRobo+neuronal+receptors+function+together+during+C.+elegans+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Development. 132, 3679-3690 (2005).</li>
<li>Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-40%2FDCC%2C+SAX-3%2FRobo%2C+and+VAB-1%2FEph+polarize+F-actin+during+embryonic+morphogenesis+by+regulating+the+WAVE%2FSCAR+actin+nucleation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex.</a> PLoS Genet. 8, (2012).</li>
<li>Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis%3A+welcome+to+the+Rho+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis: welcome to the Rho zone.</a> Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).</li>
<li>Piekny, A. J., Maddox, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myriad+roles+of+Anillin+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The myriad roles of Anillin during cytokinesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).</li>
<li>Zhao, W. M., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+is+a+substrate+of+anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+%28APC%2FC%29+that+controls+spatial+contractility+of+myosin+during+late+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis.</a> J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).</li>
<li>Piekny, A. J., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+is+a+scaffold+protein+that+links+RhoA%2C+actin+and+myosin+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis.</a> Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).</li>
<li>Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+control+of+anillin+behavior+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).</li>
<li>Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22Immunohistochemistry.+WormBook%2C+The+C.+elegans+Research+Community%22">Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community</a>. , 1-61 (2006).</li>
<li>Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+two+C.+elegans+anillins+in+the+gonad+and+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo.</a> Development. 132, 2837-2848 (2005).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+of+the+worm%3A+genetics+of+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> Trends Genet. 16, 544-551 (2000).</li>
<li>Zhang, H., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+mechanical+inputs+%E2%80%93+a+coordinated+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling through mechanical inputs – a coordinated process.</a> J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).</li>
<li>Guenther, C., Garriga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+the+C.+elegans+HAM-1+protein+in+neuroblasts+enables+daughter+cells+to+adopt+distinct+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates.</a> Development. 122, 3509-3518 (1996).</li>
<li>Audhya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+containing+the+Sm+protein+CAR-1+and+the+RNA+helicase+CGH-1+is+required+for+embryonic+cytokinesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans.</a> J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+and+the+septins+promote+asymmetric+ingression+of+the+cytokinetic+furrow%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow.</a> Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).</li>
<li>Dorn, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tube+formation+in+polar+body+cytokinesis+requires+Anillin+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans.</a> Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).</li>
<li>Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje zastosowanie różnych rodzajów mikroskopii do obrazowania podziałów komórkowych podczas środkowej embriogenezy. W szczególności protokół ten podkreśla, w jaki sposób można obrazować podział neuroblastów, komórek, które mogą ułatwiać morfogenezę naskórka. Komunikacja komórka-komórka jest ważna dla tworzenia tkanek podczas rozwoju metazoan , a C. elegans jest doskonałym modelem do badania tworzenia tkanek in vivo. Jednym ze zdarzeń, które ładnie obrazuje wzajemne oddziaływanie tkanek, ...

Chociaż istnieją protokoły opisujące, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku C. elegans, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórki w tkance podczas środkowej embriogenezy. Jednym z głównych wyzwań związanych z obrazowaniem organizmów w trakcie opracowywania była ich wrażliwość na fototoksyczność. Jednak zwiększona dostępność mikroskopów konfokalnych z wirującym dyskiem lub mikroskopów pola przemiatającego pozwoliła na szersze zastosowania obrazowania. Oba systemy wykorzystują lasery na ciele stałym i światło rozproszone, ograniczając poziomy promieniowania UV, na które narażone są organizmy. Jednak statywy szerokokątne mogą być nadal używane do obrazowania in vivo, zwłaszcza jeśli są wyposażone w kamery o wysokiej czułości (np. EMCCD), kontroli przysłony i sterowania oświetleniem (np. diody LED lub regulowane żarówki rtęciowe). Protokół ten opisuje, w jaki sposób można użyć systemu konfokalnego lub systemu szerokokątnego do obrazowania podziału komórek w rozwijających się zarodkach C. elegans. Jako przykład opisujemy, jak obrazować podział komórek neuroblastów. Neuroblasty mogą ułatwiać morfogenezę naskórka, dostarczając chemicznych lub mechanicznych wskazówek do leżących nad nim komórek naskórka i stanowią doskonały przykład znaczenia komunikacji międzykomórkowej w tworzeniu tkanek.
Caenorhabditis elegans jest idealnym organizmem modelowym do badań mikroskopowych ze względu na jego przezroczystość i prostą organizację tkanek1. Co więcej, C. elegans jest podatny na metody genetyczne i RNAi, a ponieważ wiele jego genów ma ludzkie homologi, może być wykorzystany do identyfikacji konserwatywnych mechanizmów tworzenia tkanek2-5. U C. elegans tworzenie się naskórka następuje w połowie embriogenezy, kiedy zarodek ma >300 komórek. Morfogeneza naskórka składa się z kilku głównych faz, podczas których zarodek jest zamknięty w warstwie komórek naskórka, które zwężają się i rozciągają, przekształcając zarodek z jajowatej formy w wydłużony kształt robaka6. Zamknięcie brzuszne opisuje jedno z tych zdarzeń morfogenetycznych, kiedy komórki naskórka brzusznego migrują w kierunku brzusznej linii środkowej, aby pokryć brzuszną powierzchnię zarodka (ryc. 1). Po pierwsze, dwie pary komórek położonych z przodu krawędzi natarcia migrują w kierunku brzusznej linii środkowej, gdzie przylegają i łączą się ze swoimi przeciwległymi sąsiadami6. Po tym następuje migracja komórek kieszonek znajdujących się z tyłu, które tworzą kształty przypominające klin, tworząc kieszeń brzuszną6-7. Mechanizm zamykający kieszeń nie jest dobrze poznany. Jedną z możliwości jest to, że nadkomórkowa struktura skurczowa miozyny aktyny wiąże komórki kieszonkowe w sposób podobny do sznurka torebki, podobnie jak w przypadku gojenia się ran8. Co ciekawe, w migracji niektórych komórek kieszonkowych pośredniczą określone podzbiory leżących u ich podstaw neuroblastów9 (prekursorów neuronalnych, które znajdują się pod naskórkiem; Rysunek 1B).
Poprzednie badania wykazały, że neuroblasty regulują migrację komórek naskórka i obudowę brzuszną. VAB-1 (receptor efryny) i VAB-2 (ligand efryny) są wysoko eksprymowane w neuroblastach i ułatwiają sortowanie neuroblastów przednich i tylnych od siebie, a mutacje w vab-1 lub vab-2 powodują fenotypy brzusznejobudowy 10-13. Jednak eksperymenty ratunkowe z promotorem wykazały, że vab-1 jest również wymagany w leżących nad nimi brzusznych komórkach naskórka, a receptory dla innych wskazówek wydzielanych przez neuroblasty ulegają ekspresji w komórkach naskórkabrzusznego 9. Chociaż mutacje w którymkolwiek z tych receptorów powodują fenotypy zamknięcia brzusznego, nie jest jasne, czy defekty powstają z powodu problemów z pozycjonowaniem neuroblastów, czy z powodu niezdolności komórek naskórka brzusznego do reagowania na sygnały naprowadzające14. Zmiana podziału neuroblastów bez wpływu na ich zdolność do wydzielania sygnałów naprowadzających może rzucić światło na rolę neuroblastów i ich zdolność do dostarczania bodźców mechanicznych podczas morfogenezy naskórka. Niedawno odkryto, że gen podziału komórek, ani-1 (anilina) jest silnie eksprymowany w neuroblastach (ryc. 2A), a jego wyczerpanie powoduje defekty podziału neuroblastów. Co ciekawe, zarodki te wykazują fenotypy brzusznego zamknięcia (Fotopoulos, Wernike i Piekny, obserwacje niepublikowane).
Anilina jest niezbędna do podziału komórek, a szczególnie do cytokinezy, która opisuje proces, w którym komórka macierzysta fizycznie dzieli się na dwie komórki potomne. Cytokineza jest napędzana przez tworzenie pierścienia kurczliwego aktomiozyny, który musi być ściśle kontrolowany w czasie i przestrzeni, aby zapewnić prawidłowe sprzężenie z segregacją chromatyd siostrzanych. Głównym regulatorem cytokinezy metazoan jest RhoA (RHO-1 w C. elegans), mała GTPaza, która jest aktywna w swojej postaci związanej z GTP. GEF Ect2/ECT-2 aktywuje RhoA, po czym RhoA-GTP oddziałuje z dalszymi efektorami, które tworzą pierścień skurczowy i pośredniczą w jego wnikaniu15. Anilina jest białkiem wielodomenowym, które wiąże się z RhoA poprzez swój C-koniec oraz z aktyną i miozyną poprzez N-koniec. Anilina jest wymagana do ustabilizowania położenia pierścienia kurczliwego w komórkach S2 ssaków lub Drosophila16. Wyczerpanie aniliny powoduje, że pierścienie skurczowe ulegają oscylacjom bocznym, a cytokineza ostatecznie zawodzi, tworząc komórki wielojądrowe17-19. Co ciekawe, chociaż C. elegans ani-1 koordynuje kurczliwość aktomiozyny we wczesnym zarodku, nie jest ona niezbędna do cytokinezy. Jednak, jak opisano powyżej, ani-1 jest niezbędny do cytokinezy neuroblastów podczas środkowej embriogenezy (Fotopoulos, Wernike i Piekny, obserwacje niepublikowane). Niepowodzenie cytokinezy zmieniłoby liczbę i położenie neuroblastów i mogłoby wpłynąć na lokalizację chemicznych wskazówek naprowadzających lub mogłoby zmienić właściwości mechaniczne tkanki. Oba modele podkreślają nieautonomiczną rolę neuroblastów w zamykaniu układu brzusznego oraz znaczenie komunikacji tkankowo-tkankowej podczas rozwoju embrionalnego.
Ten eksperymentalny protokół opisuje, jak obrazować podział komórek podczas środkowej embriogenezy C. elegans za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Większość doświadczeń badających mechanizmy podziału komórek przeprowadzono w pojedynczych komórkach w obrębie szalek hodowlanych (np. HeLa lub komórki S2) lub we wczesnych zarodkach z ograniczoną liczbą komórek (np. zarodki jednokomórkowe C. elegans, zarodki Xenopus lub szkarłupnie). Jednak ważne jest, aby badać również podział komórek w tkankach, ponieważ istnieją zewnętrzne sygnały, które mogą wpływać na czas i umiejscowienie płaszczyzny podziału. Co więcej, komórki mogą dostarczać chemicznych lub mechanicznych wskazówek, aby wpływać na rozwój sąsiednich tkanek i ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób komunikacja międzykomórkowa pomaga w tworzeniu się tkanek podczas rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>BioShop Kanada Inc.</td><td>#AGR001.1</td><td>Do wytwarzania płytek C. elegans NGM i RNAi</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#9002-18-0</td><td>Do produkcji bakteryjnych płytek agarowych LB</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen</td><td>#A11029</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie anty-GFP</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11814460001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw królikowi Alexa Fluor 568</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen#A11011</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ampicillin</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AMP201.5</td><td>Przechowuj proszek w temperaturze 4 stopni; C i rozpuszczoną ampicylinę w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Bactopetone&nbsp; (pepton-A)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>#G213</tr><tr><td>CaCl2 (chlorek wapnia)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#C302.1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>BioShop Kanada Inc.</td><td>#CHL380.25</td><td>Rozpuścić w etanolu</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D9542</td><td>Służy do barwienia kwasów nukleinowych (DNA)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropylotio-&beta;-galaktozyd)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#367-93-1</td><td>Przechowywać proszek i rozpuszczony IPTG w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>KH2PO4 (fosforan potasu, monozasadowy)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPM666.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosforan potasu, dwuzasadowy)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPD303.1</td><td></td></tr><tr><td>L4440&nbsp; (wektor karmienia)</td><td>Addgene</td><td>#1654</td><td>Utrzymuj zapas glicerolu na poziomie -80 &deg; C</td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; &nbsp; (siarczan magnezu)</td><td>BioShop Kanada Inc.</td><td>#MAG511.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (chlorek sodu)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (fosforan sodu, dwuzasadowy)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Bioprodukty żubra</td><td>#035-110</td><td></td></tr><tr><td>n-propylo-3,4,5-trihydroksybenzoesan (galusan propylu)</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A10877</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8920</td><td>Dla uzyskania optymalnych rezultatów trzykrotnie pokryj szkiełka mikroskopowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>BioShop Kanada Inc.</td><td>#STP101.50</td><td>Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni; C i rozpuszczona streptomycyna w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>BioShop Kanada Inc.</td><td>#TET701.10</td><td>Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni C i rozpuszczoną tetracyklinę w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CAS#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BioShop Kanada Inc.</td><td>#TRP402.500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#8013-01-2</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy c. elegans

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania dzielących się komórek w rozwijających się zarodkach Caenorhabditis elegans. W szczególności protokół ten koncentruje się na obrazowaniu dzielących się neuroblastów, które znajdują się pod komórkami naskórka i mogą być ważne dla morfogenezy naskórka. Tworzenie tkanek ma kluczowe znaczenie dla rozwoju metazoanów i opiera się na zewnętrznych sygnałach z sąsiednich tkanek. C. elegans jest doskonałym organizmem modelowym do badania morfogenezy tkanek in vivo ze względu na swoją przezroczystość i prostą organizację, dzięki czemu jego tkanki są łatwe do zbadania za pomocą mikroskopii. Obudowa brzuszna to proces, w którym brzuszna powierzchnia zarodka jest pokryta pojedynczą warstwą komórek nabłonkowych. Uważa się, że zdarzenie to jest ułatwione przez leżące u jego podstaw neuroblasty, które dostarczają chemicznych wskazówek pośredniczących w migracji leżących nad nimi komórek nabłonkowych. Jednak neuroblasty są wysoce proliferacyjne, a także mogą działać jako mechaniczne podłoże dla brzusznych komórek naskórka. Badania z wykorzystaniem tego eksperymentalnego protokołu mogą odkryć znaczenie komunikacji międzykomórkowej podczas tworzenia tkanek i mogą zostać wykorzystane do ujawnienia ról genów zaangażowanych w podział komórek w rozwijających się tkankach.

Niniejszy protokół eksperymentalny opisuje sposób obrazowania podziału komórkowego w embrionach C. elegans podczas środkowej fazy embriogenezy. W szczególności opisuje on obrazowanie neuroblastów, które mogą wspomagać morfogenezę epidermy. Morfogeneza epidermy zachodzi w wyniku kombinacji zmian kształtu komórek epidermalnych, ich migracji i adhezji, ale opiera się również na sygnałach chemicznych lub mechanicznych pochodzących z leżących poniżej neuroblastów (Rysunek 1B). Neuroblasty wydzielają ...

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja dzielących się komórek w rozwijającej się tkance podczas embriogenezy C. elegans. Aby badać geny kontrolujące podziały komórkowe, cel ten osiąga się poprzez stworzenie lub pozyskanie szczepu C. elegans, który stabilnie ekspresuje markery transgeniczne znakujące interesujące komórki. W drugim kroku przeprowadzono selektywne wyciszenie wybranego genu poprzez podawanie dsRNA larwom w stadium L4 przez 24 do 48 godzin.Zarodki RNAI są pobierane od hermafrodyt graficznych i przenoszone na podkładkę agarową do obrazowania na żywo. Następnie, przy użyciu mikroskopii szerokopolowej lub konfokalnej, wykonuje się obrazowanie zarodków w celu wizualizacji fenotypów podziału komórek. Wyniki pokażą, w jaki sposób neuroblasty dzielą się podczas embriogenezy sea elgin oraz rolę genów niezbędnych do ich podziału.Ta metoda może pomóc w wyjaśnieniu kluczowych pytań w dziedzinie biologii rozwoju i biologii komórki. Na przykład metoda ta może ujawnić geny i mechanizmy biorące udział w regulacji mitozy podczas rozwoju tkanek, komunikacji międzykomórkowej, migracji komórek lub polarności komórkowej. Należy użyć transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję odpowiednich markerów, utrzymywanych na płytkach kontrolnych lub płytkach RNAi przez okres od 24 do 48 godzin.Wybierz od czterech do sześciu dorosłych osobników w stadium grave i przenieś je do 20 do 30 µL buforu M9 na szkiełko z zagłębieniem. Aby uwolnić embriony, za pomocą sterylnego skalpela przetnij robaki po obu stronach spermateki lub vulvy. Następnie zbierz embriony, używając dociąganej kapilary przymocowanej do gruszki pipetowej, która jest wystarczająco szeroka, aby przepuścić embriony. Przenieś embriony na świeżo przygotowaną poduszkę agarową, używając rzęsy przyklejonej do wykałaczką.Utwórz grupy od pięciu do 10 embrionów, przesuwając je obok siebie. Przykryj szkiełko szkiełkiem podstawowym i w razie potrzeby dodaj więcej buforu M nine, a następnie uszczelnij szkiełko podstawowe uprzednio podgrzanym płynnym valla. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego o szerokim polu widzenia z automatycznymi filtrami.Obiektywy, kamera CCD o wysokiej rozdzielczości oraz wysoko zmotoryzowany stół. Wszystkie elementy są sterowane programowo. Choć system ten ich nie posiada, zastosowanie diod LED oraz kamery E-M-C-C-D przy niskim powiększeniu ograniczy fototoksyczność dla embrionu.Ręcznie ustaw ostrość na embriony, aby zobrazować neuroblasty. Zwiększ powiększenie i wybierz na mikroskopie szerokopolowym embriony przechodzące proces domykania grzbietowego lub wczesnego domykania brzusznego. Wybierz filtry GFP oraz Texas red i wyznacz optymalne płaszczyzny Z w systemie szerokopolowym.Zastosowanie mniejszej liczby szybkich osi Z (Z-stacks) oraz mniejszej liczby punktów czasowych ograniczy fototoksyczność; przymknięcie przysłony do 30% a, jeśli to możliwe, zmniejszenie natężenia światła dodatkowo zredukuje fototoksyczność. Alternatywnie można zastosować konfokalny mikroskop z systemem skanowania live scan swept field lub spinning disc, wyposażony w oprogramowanie sterujące laserami skanującymi, obiektywami, kamerą E-M-C-C-D oraz w pełni zautomatyzowanym stolikiem. Po zoptymalizowaniu ustawień akwizycji można przystąpić do obrazowania embrionów za pomocą mikroskopu w szerokim polu.Zaleca się, aby przed embrionami RNAI najpierw filmować embriony kontrolne. W systemie z przesunięciem pola (swept field) ustaw lasery 4 88 oraz 5 61 100 milliwatt na 40% mocy, z szerokością szczeliny 50 i czasem ekspozycji 300 milisekund.Należy pamiętać, że ustawienia te będą różnić się w zależności od zastosowanego mikroskopu. Umieść preparat na stoliku mikroskopu, a następnie użyj obiektywu o niskim powiększeniu, aby zlokalizować zarodki. Następnie przełącz na obiektyw immersyjny 60 lub 100 x.Po ustawieniu ostrości należy zebrać 20 stosów Z w odstępach 0,2 mikrona co dwie minuty przez łącznie 10 minut. Czas naświetlania prawdopodobnie będzie wymagał dostrojenia. Podczas obrazowania żywych embrionów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej należy uwzględnić fototoksyczność, przymykając przysłonę lub wybierając mniejszą liczbę stosów Z lub punktów czasowych.Jeśli to możliwe, skrócenie czasu ekspozycji może ograniczyć fototoksyczność. W rozwiązaniu tego problemu pomocne może być zastosowanie pola SW lub konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym. Wyznacz czas, punkty oraz płaszczyzny Z, które Cię interesują, korzystając z oprogramowania do akwizycji.Eksportuj wybrane obrazy jako wiele plików TIFF. Otwórz wybrane płaszczyzny Z dla każdego punktu czasowego i interesującego kanału w oprogramowaniu do przetwarzania, takim jak ImageJ, i utwórz stos; neuroblasty często obejmują tylko kilka płaszczyzn. Połącz płaszczyzny Z dla każdego punktu czasowego i utwórz projekcje stosu Z.Powtórz tę czynność dla pozostałych kanałów. Po zakończeniu wszystkich projekcji Zacka dla wybranych punktów czasowych, otwórz projekcje w celu utworzenia sekwencji czasowej. Wykonaj to oddzielnie dla każdego kanału.Dla każdego kanału należy dostosować jasność i kontrast w razie potrzeby. Jeśli jest to konieczne, obróć obrazy. Następnie wybierz obszar zainteresowania (ROI) i przytnij obrazy.Teraz utwórz obraz scalony za pomocą funkcji scalania kanałów (merged channels), wybierając inny kolor dla każdego kanału. Zapisz scalony obraz jako plik RGB, aby wyraźniej zwizualizować obrazy.Użyj 16-bitowych obrazów TIFF i wybierz funkcję odwrócenia (invert) w menu edycji, aby utworzyć obrazy w skali szarości dla każdego kanału. Aby określić rozmiar interesującego obiektu w mikronach, narysuj linię i pomnóż jej długość przez rozmiar pikseli, który jest określony przez parametry obrazowania. Następnie utwórz pasek skali reprezentujący proporcję obliczonej długości w mikronach.Ostatecznie zapisz końcowe obrazy jako ośmiobitowe pliki TIFF. W razie potrzeby przekonwertuj pliki TIFF na filmy za pomocą programu ImageJ. Morfogeneza naskórka u C. elegans zachodzi w wyniku połączenia zmian kształtu komórek naskórka, ich migracji oraz adhezji przy udziale znajdujących się pod nimi proliferujących neuroblastów.Komórki epidermy migrują do brzusznej linii środkowej i tworzą pojedynczą warstwę komórek; aby zbadać podziały neuroblastów w embrionach, obrazowano podczas zamknięcia brzusznego przy zwiększeniu obraz neuroblastów stabilnie koekspresujących marker specyficzny dla neuroblastów znakowany GFP oraz marker błonowy sterowany przez czynnik matczyny znakowany mCherry. Wizualizowano neuroblasty w trakcie podziału, gdzie jądra neuroblastów przedstawiono na zielono, a otaczające je błony na czerwono. Obrazy time-lapse dzielących się neuroblastów, obrysowanych sondą błonową mCherry w embrionie kontrolnym, zostały zarejestrowane za pomocą mikroskopu szerokopolowego, aby lepiej uwidocznić dzielące się neuroblasty w embrionach kontrolnych. Każdy kanał pozostawiono w skali szarości, a obrazy odwrócono, stosując konfokalną mikroskopię z przesunięciem wiązki w embrionach kontrolnych.Obrazowano komórki Coex wykazujące ekspresję ham one GFP oraz M cherry pH w obszarze z dzielącym się neuroblastem. Te same embriony, poddane działaniu RNAi w celu wyciszenia ekspresji ill, wizualizowano przy użyciu mikroskopii szerokopolowej. W przeciwieństwie do embrionów kontrolnych, wiele neuroblastów uległo zatrzymaniu lub regresji podczas podziału i stało się wielojądrowych w obrazowaniu mikroskopem szerokopolowym.Jasne stało się również, że wiele neuroblastów uległo zahamowaniu lub regresji podczas podziału i stało się wielojądrowych. Technikę tę można również wykorzystać do obrazowania migrujących komórek podczas formowania się tkanki. Ponadto, jeśli zastosuje się Zacks w celu przyspieszenia obrazowania, można uzyskać więcej informacji na temat dynamiki wewnątrzkomórkowej.Ponadto, przy użyciu odpowiedniego sprzętu, technika ta mogłaby zostać wykorzystana do aktywacji sond fotostrojonych w celu przeprowadzenia optogenetyki. Można również zastosować techniki mikroskopowe, takie jak FRET, aby badać białka, oddziaływania białko-białko lub dynamikę białek.

visualizing-neuroblast-cytokinesis-during-c-elegans-embryogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja cytokinezi neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Źródło: Williams, A. L., et al. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia protokół obrazowania poklatkowego wielofotonowego w celu wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Odkryj metodę wizualizacji cytokinezy neuroblastów w embriogenezie Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala badać funkcje genów kontrolujących podział komórek w tkance rozwijającej się.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Przeglądaj więcej filmów