Name: Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni transdukowanych przez adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę oceny replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura z wykorzystaniem wektorów adenowirusowych. Technika ta pozwala identyfikować szlaki sygnałowe regulujące masę komórek beta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant DK078732 z NIH (dla P.T.F.).

1. Transdukcja adenowirusowa i hodowla wysepek szczura
<ol>
 <li>Przygotuj płytkę 6-dołkową bez powłoki do hodowli tkanek, dodając 2 ml pożywki (pożywka RPMI 1640 zawierająca 8 mM glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 jednostek/ml penicyliny oraz 50 μg/ml streptomycyny) do odpowiedniej liczby dołków. Na przykład typowy eksperyment może wymagać trzech dołków – po jednym dla kontroli bez wirusa, kontroli z wirusem (np. adenowirusem wykazującym ekspresję GFP) oraz grupy eksperymentalnej.</li>
 <li>Ogrzej płytkę do 37 °C, umieszczając ją w inkubatorze do hodowli tkanek na co najmniej 30 min.</li>
 <li>Bezpośrednio po izolacji wysepek trzustkowych szczura 18,19, umieść 100-200 wysepek w poszczególnych dołkach płytki 6-dołkowej bez powłoki do hodowli tkanek. Sześćdziesiąt wysepek jest wymaganych do analiz wydzielania insuliny i wbudowywania tymidyny. Pozostałe wysepki można wykorzystać do izolacji RNA na potrzeby badań ekspresji genów lub izolacji białek do immunoblottingu.
 </li>
</ol>
 [Uwaga: Od tego momentu prosimy o stosowanie się do protokołów instytucjonalnych dotyczących obchodzenia się z materiałami biologicznymi stwarzającymi zagrożenie, ich użytkowania oraz utylizacji.]
 <ol start="4">
 <li>Delikatnie zakręć płytką, aby skupić wyspy w centrum dołka.</li>
 <li>Nanieś adenowirusa pipetą bezpośrednio na wyspy znajdujące się w centrum naczynia. Zastosuj 100-500 wielokrotności infekcji (MOI, stosunek komórek docelowych do wirusowych jednostek tworzących plaques).</li>
 <li>Pozostaw wyspy na 5 min.</li>
 <li>Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C, 5% CO2).</li>
 <li>Po 24 h delikatnie zakręć płytką, aby skupić wyspy w centrach dołków, a następnie przenieś wyspy za pomocą mikropipety P200 do nowego dołka zawierającego świeże medium. Jeśli wyspy przywrą do płytki, można je delikatnie odczepić końcówką pipety.
 </li>
 </ol>
 [Uwaga: Aby zweryfikować odpowiednią wydajność transdukcji, korzystne jest zastosowanie wirusa kontrolnego wykazującego ekspresję GFP, co pozwala na obrazowanie wysepek za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu potwierdzenia penetracji adenowirusa do rdzenia wysepki.]
 <ol start="9"> 
 <li>Kultywować wyspy przez dodatkowe 24-72 h, w zależności od pożądanego czasu trwania eksperymentu ustalonego w pilotażowych badaniach optymalizacyjnych. Na przykład indukowanie odpowiedzi proliferacyjnej może wymagać czasu od 24-72 h, a wyciszenie interesującego genu może wymagać 48 lub 72 godzin. Codziennie przenosić wyspy do świeżej pożywki.</li>
 <li>W ciągu ostatnich 24 h eksperymentu kultywować wyspy w pożywce zawierającej 1 μCi [methyl-3H]-tymidyny/ml pożywki (zazwyczaj 1 μl tymidyny/ml pożywki).
 </li>
</ol>
[Uwaga: Od tego momentu prosimy o stosowanie protokołów instytucjonalnych dotyczących obchodzenia, użytkowania i utylizacji materiałów promieniotwórczych.]
2. Analiza wydzielania insuliny
<ol>
 <li>Przygotować 10X roztwór stokowy buforu do analizy sekrecji (SAB) (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM KH2PO4, 11,6 mM MgSO4) oraz 100X roztwór stokowy CaCl2 (0,25 M CaCl2). Roztwory stokowe te można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować na świeżo 50 ml roboczego buforu SAB (5 mL 10X SAB, 1 ml 1 M HEPES, 0,5 ml 100X CaCl2, 0,28 ml 35% BSA, 0,11 g NaHCO3 oraz sterylna woda do objętości 50 ml) w probówce stożkowej 50-ml i ogrzać do 37 °C, umieszczając ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Do probówki stożkowej 15-ml odpipetować 10 ml roboczego buforu SAB i dodać 66,8 μl 2,5 M D-glukozy, aby przygotować SAB z wysokim stężeniem glukozy (16,7 mM).</li>
 <li>Do pozostałych 40 ml roboczego buforu SAB dodać 44,8 μl 2,5 M D-glukozy, aby przygotować SAB z niskim stężeniem glukozy (2,8 mM).</li>
 <li>Oznakować trzy probówki do mikrowirówki 1,7-ml dla każdej studni płytki 6-dołkowej i dodać 1 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
 </li>
</ol>
 [Uwaga: Ponieważ wysepki są radioaktywne, należy przestrzegać instytucjonalnych protokołów dotyczących obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi, ich wykorzystania oraz utylizacji.]
 <ol start="6">
 <li>Do każdej probówki do mikrocentryfugi przenieś 20 wysepek. Należy dołożyć wszelkich starań, aby do każdej probówki trafiły wysepki o porównywalnych rozmiarach. Przykładowo, każda probówka może zawierać 5 małych, 10 średnich i 5 dużych wysepek (patrz: Rysunek 1).
 </li>
</ol>
 [Uwaga: Wyspy można wizualizować, używając stereomikroskopu sekcyjnego lub standardowego mikroskopu.]
 <ol start="7">
 <li>Po opadnięciu wysepek na dno probówki pod wpływem grawitacji (~2 min), odessać PBS za pomocą mikropipety i usunąć.
 </li>
</ol>
 [Uwaga: Alternatywnie do sedymentacji grawitacyjnej, probówki można wirować przy 300 x g przez 1 min.]
 <ol start="8">
 <li>W celu preinkubacji dodać 400 μl SAB z niską zawartością glukozy, umieścić probówki (z otwartymi nakrętkami) w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) i preinkubować przez 60 min. Odessać SAB z niską zawartością glukozy z preinkubacji i usunąć.</li>
 <li>W celu oznaczenia podstawowego wydzielania insuliny dodać 400 μl SAB z niską zawartością glukozy, umieścić probówki (z otwartymi nakrętkami) w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) i inkubować przez 60 min. Zebrać SAB z niską zawartością glukozy i zachować do radiometrycznego testu immunologicznego insuliny.</li>
 <li>W celu oznaczenia stymulowanego wydzielania insuliny dodać 400 μl SAB z wysoką zawartością glukozy, umieścić probówki (z otwartymi nakrętkami) w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) i inkubować przez 60 min. Zebrać SAB z wysoką zawartością glukozy i zachować do radiometrycznego testu immunologicznego insuliny.</li>
</ol>
3. Test wbudowywania tymidyny
<ol>
 <li>Dodać 1 ml PBS; po opadnięciu wysp na dno probówki pod wpływem grawitacji, odessać PBS za pomocą mikropipety, usunąć i powtórzyć ten krok raz.</li>
 <li>Dodać 500 μl schłodzonego do temperatury lodu kwasu trójchlorooctowego (TCA, 10% w/v) i inkubować na lodzie przez 30 min.</li>
 <li>Wirzyć probówki przy 16 000 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Odessać TCA, dodać 80 μl 0,3 N NaOH i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. W tym czasie co 10 min intensywnie mieszać próbki na vortexie przez 5-10 s.</li>
 <li>Dodać 4 ml koktajlu do zliczania Econo-safe do probówek do c ciekłego scyntylograficznego o pojemności 7 ml.</li>
 <li>Przenieść 50 μl próbki do probówki scyntylacyjnej, zakręcić probówkę, krótko wstrząsnąć i zmierzyć w ciekłym liczniku scyntylacyjnym.</li>
 <li>Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), wykorzystując 10 μl próbki zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
 <li>Przeprowadź radiometryczny test immunoologiczny (RIA) insuliny zgodnie z protokołem producenta.</li>
 <li>Znormalizuj dane dotyczące wydzielania insuliny oraz wbudowywania tymidyny względem stężenia białka.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład eksperymentu służącego do oceny replikacji wysepek oraz funkcji komórek beta w wysepkach szczura przedstawiono na Rysunku 2. Ten przykład pokazuje, że adenowiralna nadekspresja hipotetycznego „Genu #6” silnie stymuluje replikację wysepek, nie zmieniając przy tym funkcji komórek beta. W górnym panelu wyniki testu wbudowywania tymydyny wykazują, że zwiększenie ekspresji „Genu #6” prowadzi do wzrostu syntezy DNA, mierzonego poprzez wbudowywanie tymydyny. Ponieważ większość komórek w wysepce szczura to komórki beta, prawdopodobne jest, że ten wzrost wbudowywania tymydyny wskazuje na zwiększoną replikację komórek beta. Należy jednak przeprowadzić eksperymenty potwierdzające, aby jednoznacznie to ustalić. W dolnym panelu wyniki testu wydzielania insuliny wykazują, że nadekspresja „Genu #6” nie zmieniła jednej z głównych funkcji komórek beta, tzn. wydzielania insuliny przy niskim i wysokim stężeniu glukozy. Jakość izolacji oraz stan zdrowia wysepek po traktowaniu adenowirusami są wskazane przez krotność wzrostu wydzielania insuliny przy niskich i wysokich stężeniach glukozy. Gdyby zwiększenie ekspresji „Genu #6” upośledzało funkcję komórek beta, prawdopodobnie objawiłoby się to spadkiem ilości wydzielanej insuliny przy wysokich, stymulujących stężeniach glukozy (16,7 mM). Można również wyznaczyć krzywą odpowiedź-dawka dla różnych stężeń glukozy.
<img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig1.jpg" alt="Schemat procesu izolacji wysepek i traktowania adenowirusami; sekrecja insuliny, wbudowywanie tymidyny." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd protokołu oceny replikacji wysepek i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura po zmianach w ekspresji genów indukowanych przez adenowirusy. Świeżo izolowane wysepki szczura są poddawane działaniu adenowirusów przez 24 h, a następnie hodowane do 96 h. Wbudowywanie tymidyny jest oceniane w ciągu ostatnich 24 h, po czym następuje pomiar sekrecji insuliny przy niskim i wysokim stężeniu glukozy.
<img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig2.jpg" alt="Nadekspresja akceleratora wzrostu i funkcji komórek beta w wysepek; wykres słupkowy, porównanie kontroli genu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wyniki eksperymentu z użyciem kontrolnego adenowirusa oraz adenowirusa nadekspresującego hipotetyczny gen oznaczony jako „Gene #6”. Górny panel przedstawia wbudowywanie tymidyny, a dolny panel wydzielanie insuliny.

<ol><li>Ferrannini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+function+in+subjects+spanning+the+range+from+normal+glucose+tolerance+to+overt+diabetes%3A+a+new+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).</li>
<li>Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+insulin+secretory+dysfunction+and+insulin+resistance+in+the+pathogenesis+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus.</a> J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).</li>
<li>Keenan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+insulin+production+and+pancreatic+ss-cell+turnover+after+50+years+of+diabetes%3A+Joslin+Medalist+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study.</a> Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).</li>
<li>Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adenovirus+vector+for+efficient+RNA+interference-mediated+suppression+of+target+genes+in+insulinoma+cells+and+pancreatic+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans.</a> Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trefoil+factor+3+stimulates+human+and+rodent+pancreatic+islet+beta-cell+replication+with+retention+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function.</a> Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).</li>
<li>Schisler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).</li>
<li>Chan, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+uncoupling+protein+2+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+rat+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets.</a> Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53, 149-159 (2004).</li>
<li>Icyuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+infection+activates+akt1+and+induces+cell+proliferation+in+pancreatic+islets1%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1.</a> Transplantation. 87, 821-824 (2009).</li>
<li>Kaneto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hexosamine+pathway+leads+to+deterioration+of+pancreatic+beta-cell+function+through+the+induction+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress.</a> J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).</li>
<li>Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering with recombinant adenoviruses.</a> Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).</li>
<li>Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+overexpressed+hexokinases+in+liver+and+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells.</a> Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).</li>
<li>Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hexokinase+I+in+isolated+islets+of+Langerhans+via+recombinant+adenovirus.+Enhancement+of+glucose+metabolism+and+insulin+secretion+at+basal+but+not+stimulatory+glucose+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels.</a> J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+to+pancreatic+islets+does+not+alter+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function.</a> Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+to+pancreatic+islets+mediated+by+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors.</a> Transplantation. 59, 263-268 (1995).</li>
<li>Meng, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver+X+receptors+inhibits+pancreatic+islet+beta+cell+proliferation+through+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest.</a> Diabetologia. 52, 125-135 (2009).</li>
<li>Ronnebaum, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyruvate+cycling+pathway+involving+cytosolic+NADP-dependent+isocitrate+dehydrogenase+regulates+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion.</a> J. Biol. Chem. , (2006).</li>
<li>Milburn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cells+in+obesity.+Evidence+for+induction+of+functional%2C+morphologic%2C+and+metabolic+abnormalities+by+increased+long+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids.</a> J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).</li>
<li>Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Islet+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Islet Isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Ustalenie szlaków, które można modulować w celu stymulacji replikacji i poprawy funkcji komórek beta, ma istotne znaczenie dla obu głównych postaci cukrzycy. Ponieważ funkcjonalna masa komórek beta zależy od obecności i funkcji komórek wydzielających insulinę, jednoczesna ocena tych czynników determnujących niesie ze sobą pewne korzyści. Niniejszy protokół opisuje uproszczoną procedurę identyfikacji tego, czy nadekspresja lub supresja białka prowadzi do zmian w funkcjonalnej masie komórek beta in vitro, co nastę...

<table><tbody><tr><td>Pożywka RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11879</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>BD-Falcon</td><td>35-1146</td><td>Nietraktowana TC</td></tr><tr><td>[metyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-tymidyna</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET027Z001MC</td><td>1 mCi/ml</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>1.7 ml</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros</td><td>42409</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros</td><td>20592</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros</td><td>41348</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Acros</td><td>34961</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td>roztwór 1 M</td></tr><tr><td>35% BSA</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Acros</td><td>42427</td><td></td></tr><tr><td>d-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>TCA</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA9410-1</td><td>10% w/v</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Acros</td><td>12426</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do liczenia scyntylacyjnego</td><td>Sarstedt</td><td>58.536</td><td>7 ml, PP</td></tr><tr><td>Nakrętka do probówki do liczenia scyntylacyjnego</td><td>Sarstedt</td><td>65.816</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl do liczenia Econo-Safe</td><td>RPI</td><td>111175</td><td></td></tr><tr><td>RIA insuliny</td><td>Siemens</td><td>TKIN2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Statyw na probówki do liczenia scyntylacyjnego</td><td>Sarstedt</td><td>93.1431.001</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny do cieczy</td><td>Perkin Elmer</td><td>Tri-Carb 2910TR</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Homeostaza glukozy jest kontrolowana przede wszystkim przez hormony endokrynne – insulinę i glukagon, wydzielane odpowiednio przez komórki beta i alfa trzustki. Funkcjonalna masa komórek beta jest określana przez anatomiczną masę komórek beta, a także zdolność komórek beta do odpowiedzi na obciążenie składnikami odżywczymi. Utrata funkcjonalnej masy komórek beta ma kluczowe znaczenie dla obu głównych postaci cukrzycy 1-3. Podczas gdy spadek funkcjonalnej masy komórek beta jest wynikiem ataku autoimmunologicznego w cukrzycy typu 1, w cukrzycy typu 2 ubytek ten rozwija się zarówno w wyniku niezdolności komórek beta do prawidłowego wydzielania insuliny, jak i niszczenia komórek beta przez szereg mechanizmów. Zatem wysiłki zmierzające do przywrócenia funkcjonalnej masy komórek beta są najważniejsze dla lepszego leczenia i potencjalnego wyleczenia cukrzycy.
Podejmowane są wysiłki w celu zidentyfikowania szlaków molekularnych, które można wykorzystać do stymulacji replikacji i poprawy funkcji komórek beta. W idealnym przypadku cele terapeutyczne powinny poprawiać zarówno wzrost, jak i funkcję komórek beta. Być może ważniejsze jest jednak ustalenie, czy strategia stymulująca wzrost komórek beta odbywa się kosztem upośledzenia ich funkcji (jak ma to miejsce w przypadku niektórych onkogenów) i odwrotnie.
Poprzez systematyczne wyciszanie lub nadekspresję genów docelowych w izolowanych wysepkach szczura można zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne w celu zwiększenia funkcjonalnej masy komórek beta 4-6. Wektory adenowirusowe mogą być wykorzystywane do wydajnej nadekspresji lub knockdownu białek w izolowanych wysepkach szczura 4,7-15. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę manipulacji ekspresją genów z wykorzystaniem transdukcji adenowirusowej oraz ocenę replikacji wysepek i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura (Rycina 1). Metoda ta była wcześniej stosowana do identyfikacji nowych celów modulujących replikację lub funkcję komórek beta 5,6,8,9,16,17.

Niniejszy protokół umożliwia identyfikację czynników modulujących funkcjonalną masę komórek beta w celu znalezienia potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu cukrzycy. Protokół składa się z usprawnionej metody oceny replikacji wysepek oraz funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura po manipulacji ekspresją genów za pomocą adenowirusów.

Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Homeostaza glukozy jest kontrolowana przede wszystkim przez hormony endokrynne – insulinę i glukagon, wydzielane przez komórki beta i alfa trzustki, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie szlaków sygnalizacyjnych regulujących zmiany w funkcjonalnej masie komórek beta. Jest to realizowane w izolowanych wywojowniczkach szczura poprzez nadekspresję lub supresję ekspresji genu z wykorzystaniem wektorów adenowirusowych. Po tej manipulacji funkcję komórek beta ocenia się na podstawie wydzielania insuliny, a replikację wywojowniczek poprzez pomiar wbudowywania trytyzowanej tymydyny.W ostateczności testy te mogą wykazać, czy badany gen reguluje proliferację i/lub funkcję komórek beta in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii powiek, takie jak: czy konkretny składnik szlaku sygnalizacyjnego wpływa na wzrost i funkcję komórek beta? Przygotuj sześciodołkową płytkę bez powłoki do hodowli tkankowej, dodając 2 mL zmodyfikowanego medium do wymaganej liczby dołków.Na przykład typowy eksperyment może wymagać trzech dołków: jednego dla kontroli bez wirusa, jednego dla kontroli z wirusem oraz jednego dla grupy eksperymentalnej; ogrzewaj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej przez co najmniej 30 minut. Bezpośrednio po izolacji soczewek szczurzych umieść od 1 do 200 soczewek w każdym dołku przygotowanej płytki. 60 soczewek zostanie wykorzystanych do analiz biochemicznych, a pozostałe soczewki można wykorzystać do badań ekspresji genów lub immunoblotingu; delikatnie zakołysz płytką, aby przenieść soczewki na środek każdego dołka.Następnie niezwłocznie nanieś pipetą adenowirusa bezpośrednio na oczka, na środku szalki. Zastosuj wielokrotność infekcji (MOI) od 1 do 500, w zależności od skuteczności adenowirusa w nadekspresji lub wyciszaniu badanego białka.Efektywna penetracja adenowirusa do rdzenia powieki zwiększa powtarzalność wyników. Kluczowe jest przeprowadzenie transdukcji powiek bezpośrednio po ich izolacji.Nie niepokoić płytki przez pięć minut, a następnie przenieść ją do inkubatora na 24 godziny. Następnego dnia wyjąć płytkę z inkubatora i delikatnie przesunąć wycinki tkanek (eyelets) do centrów studni. Przenieść wycinki do nowej studni zawierającej świeżą pożywkę, używając mikropipety o objętości 200 µL.Jeśli oczka przykleją się do płytki, można je delikatnie odczepić za pomocą końcówki pipety. Pomocne jest użycie wirusa kontrolnego wykazującego GFP w celu weryfikacji odpowiedniej wydajności transdukcji poprzez zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji penetracji adenowirusa do wnętrza hodowli wysepek. Przechowywać wyspki przez jeden do trzech kolejnych dni, codziennie wymieniając pożywkę.Czas hodowli musi zostać zoptymalizowany w badaniach pilotażowych i różni się w zależności od celów eksperymentalnych. W ciągu ostatnich 24 godzin należy dodać do pożywki tymidynę trytowaną w stężeniu 1 µCi/ml pożywki. Najpierw należy przygotować 50 ml świeżego SAB roboczego w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i ogrzać go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.Pipetować 10 mililitrów roboczego SAB do 15 mililitrowej probówki stożkowej i dodać 66,8 mikrolitrów 2,5 molarnej D-glukozy. Aby przygotować SAB o wysokiej zawartości glukozy, dodać 44,8 mikrolitrów 2,5 molarnej D-glukozy do pozostałych 40 mililitrów roboczego SAB. Aby przygotować SAB o niskiej zawartości glukozy, należy następnie oznakować trzy 1,7 mililitrowe probówki do mikrocentryfugi.Do każdej studzienki płytki 6-dołkowej dodaj 1 ml PBS. Pamiętaj o przestrzeganiu protokołów instytucjonalnych dotyczących obchodzenia się z radioaktywnymi gałkami ocznymi i ich utylizacji. Używając stereomikroskopu lub standardowego mikroskopu, wybierz i przenieś 20 gałek ocznych o zbliżonej wielkości do każdej probówki do mikrocentryfugi.Na przykład każda probówka może zawierać pięć małych, 10 średnich i pięć dużych oczek. Chociaż wyniki są normalizowane do całkowitej zawartości białka na koniec eksperymentu, kluczowe jest dopasowanie wielkości oczek pomiędzy grupami. Po pozwoleniu oczkom na osadzenie się na dnie probówki pod wpływem grawitacji lub wirowania, należy odessać i zważyć PBS za pomocą mikropipety, a następnie przystąpić do przygotowania oczek do analiz biochemicznych.Aby przygotować wysepki do analizy wydzielania insuliny, należy je najpierw poddać preinkubacji w pożywce SAB z niską zawartością glukozy. W tym celu do probówek należy dodać 400 µL pożywki SAB z niską zawartością glukozy, a następnie umieścić je z zakrętkami w inkubatorze do hodowli tkankowych na 60 minut. Po godzinie należy odessać pożywkę SAB z niską zawartością glukozy użytą do preinkubacji. Aby zmierzyć podstawowe wydzielanie insuliny, należy powtórzyć procedurę preinkubacji.Aby jednak zmierzyć stymulowaną sekrecję insuliny, należy użyć 400 µL SAB z wysoką zawartością glukozy zamiast SAB z niską zawartością glukozy i, podobnie jak wcześniej, inkubować wysepki przez 60 minut. Po inkubacji w SAB z wysoką lub niską zawartością glukozy należy odessać SAB i pobrać próbkę do radioimmunologicznego testu insuliny, który zostanie przeprowadzony zgodnie z protokołem producenta. Następnie należy przejść do testu wbudowywania tymidyny, wykorzystując ten sam zestaw wysepek. Rozpocząć należy od wysepek, które zostały właśnie użyte do testu sekrecji insuliny.Dodaj 1 ml PBS i pozwól oczkom opaść pod wpływem grawitacji. Następnie odessij PBS za pomocą mikropipety. Wylej roztwór i powtórz ten krok jeszcze raz.Następnie do oczków dodaj 500 µL schłodzonego w lodzie kwasu trójchlorooctowego i inkubuj je w lodzie przez 30 minut. Odwiruj próbki w wirowce w temperaturze 4 °C. Następnie odessij i usuń TCA.Następnie należy dodać 80 µL 0,3 N wodorotlenku sodu i inkubować wycinki oka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji próbki należy energicznie mieszać w wstrząsarku wirówkowym przez 5 do 10 sekund co 10 minut. Równolegle do probówek do cieczoscintylacyjnego zliczania o pojemności 7 mL należy dodać 4 mL koktajlu zliczającego Conno Safe.Po zakończeniu inkubacji oczek, przenieś 50 µL zawiesiny oczek do probówki scyntylacyjnej. Krótko wstrząśnij zamkniętą probówką, a następnie zmierz radioaktywność próbek w cieczowym liczniku scyntylacyjnym. Aby zmierzyć stężenie białka, przenieś 10 µL zawiesiny do komercyjnego zestawu do oznaczania kwasu bionicznego i postępuj zgodnie z protokołem producenta.Następnie, podczas analizy danych, znormalizuj wyniki względem stężenia białek, korzystając z opisanych protokołów. Replikacja wysepek i funkcja komórek beta. W wysepkach szczurzych oceniono, że adenowirusowa nadekspresja hipotetycznego genu six silnie stymulowała replikację wysepek, nie zmieniając funkcji komórek beta.Zwiększona ekspresja genu six spowodowała wzrost syntezy DNA, zmierzony poprzez wbudowywanie tymidyny, ponieważ większość komórek w wyspach trzustki szczura to komórki beta. Dalsze eksperymenty mogłyby wykazać, że ten wzrost wbudowywania tymidyny wynika ze zwiększonej replikacji komórek beta. Test wydzielania insuliny wykazał, że nadekspresja genu six nie zmieniła jednej z głównych funkcji komórek beta, jaką jest wydzielanie insuliny przy niskim i wysokim stężeniu glukozy.Wzrost wydzielania insuliny przy niskich i wysokich stężeniach glukozy odzwierciedla stan wysp trzustkowych po leczeniu adenowirusem. Gdyby zwiększenie ekspresji genu sześć upośledzało funkcję komórek beta, prawdopodobnie objawiłoby się to spadkiem poziomu insuliny wydzielanej przy wysokich, stymulujących stężeniach glukozy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób pomiaru replikacji komórek beta oraz wydzielania insuliny w celu ustalenia, czy konkretny gen wpływa na wzrost lub funkcję komórek beta.

assessing-replication-beta-cell-function-adenovirally-transduced

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ocena replikacji i funkcji komórek beta w przeszczepowanych izolowanych wyspach gryzoni przeszczepowych adenowirusowych

Opisujemy tworzenie wątrobowych neo-wysepek u myszy z cukrzycą indukowaną STZ (streptozotocyną) poprzez transfer genów Neurogenin3 (Ngn3) i Betacellulin (Btc) z wykorzystaniem zależnego od helpera wektora adenowirusowego (HDAd) oraz odwrócenie hiperglikemii. Nasza metoda wykorzystuje zależne od helpera wektory adenowirusowe, które charakteryzują się wysoką wydajnością transdukcji in vivo oraz długotrwałą ekspresją genów.

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Tutaj prezentujemy metodologię generowania i podawania mikrosfer z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) do nienaruszonych mysich wysp trzustkowych w hodowli, a następnie analizy immunofluorescencyjnej proliferacji komórek β. Metoda ta jest odpowiednia do określania skuteczności kandydujących mitogenów β-komórkowych.

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Przedstawiono protokół tworzenia zmodyfikowanych genowo ludzkich pseudowysp trzustkowych z rozproszonych ludzkich komórek wysp trzustkowych, które są transdukowane przez lentiwirusa niosącego krótkie RNA spinki do włosów (shRNA). Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępne naczynia enzymatyczne i hodowlane, może być łatwo wykonywany i wytwarza genetycznie zmodyfikowane ludzkie pseudowysepki odpowiednie do badań funkcjonalnych i morfologicznych.

Wyciszanie genów za pośrednictwem lentiwirusa w ludzkiej pseudowysepce przygotowanej na płytkach o niskim przyłączeniu

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę oceny replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura z wykorzystaniem wektorów adenowirusowych. Technika ta pozwala identyfikować szlaki sygnałowe regulujące masę komórek beta.

Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Przeglądaj więcej filmów