Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni transdukowanych przez adenowirusa

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja szlaków sygnałowych, które regulują zmiany funkcjonalnej masy komórek beta. Osiąga się to w izolowanych oczach szczurów poprzez nadmierną ekspresję lub tłumienie ekspresji genu za pomocą wektorów adenowirusowych. Po tej manipulacji funkcję komórek beta ocenia się za pomocą wydzielania insuliny i replikacji oczek mierzonych przez trytiowane włączenie tymidyny.

Ostatecznie testy te mogą wykazać, czy interesujący nas gen reguluje proliferację komórek beta i/lub funkcję in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii powiek, takie jak to, czy określony składnik szlaku sygnałowego wpływa na wzrost i funkcję komórek beta? Przygotować sześciodołkową płytkę pokrytą kulturą tkankową, dodając dwa mililitry zmodyfikowanej pożywki do wymaganej liczby dołków.

Na przykład typowy eksperyment może wymagać trzech studzienek, po jednej dla kontroli bez wirusa, kontroli wirusa, a grupa eksperymentalna podgrzewa płytkę do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez co najmniej 30 minut. Bezpośrednio po wyizolowaniu oczek szczura umieść od jednego do 200 oczek w każdym dołku przygotowanej płytki. 60 oczek zostanie użytych do testów biochemicznych, a pozostałe oczka mogą być wykorzystane do badań nad ekspresją genów lub immunoblottingu, delikatnie pęczniejąc płytkę, aby doprowadzić oczka do środka każdego z nich.

Cóż, natychmiast odpipetuj adenowirusa bezpośrednio na oczka. W środku naczynia. Użyj od jednej do 500 wielokrotności infekcji w zależności od skuteczności adenowirusa w nadmiernej ekspresji lub obniżaniu interesującego Cię białka.

Skuteczna penetracja adenowirusa do rdzenia powieki zwiększa spójność wyników. Przenoszenie powiek bezpośrednio po powiece. Izolacja jest niezbędna.

Nie należy naruszać płytki przez pięć minut, a następnie przenieść ją do inkubatora na 24 godziny. Następnego dnia wyjmij płytkę z inkubatora i delikatnie napęcznij oczka do środków studzienek. Przenieść oczka do nowej studzienki zawierającej świeżą pożywkę za pomocą mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Jeśli oczka przylgną do płytki, można je delikatnie przemieścić za pomocą końcówki pipety. Pomocne jest użycie wirusa kontrolnego eksprymującego GFP w celu sprawdzenia odpowiedniej skuteczności transdukcji za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu wizualizacji penetracji adenowirusa do hodowli rdzenia wysp trzustkowych. Wysepki jeszcze przez jeden do trzech dni, zmieniając media codziennie.

Czas hodowli musi być zoptymalizowany przez badania pilotażowe i różni się w zależności od celów eksperymentalnych. Przez ostatnie 24 godziny należy wprowadzać do pożywki tritiowaną tymidynę w stężeniu jednego mikrokiurów na milimetr pożywki. Najpierw przygotuj na świeżo 50 mililitrów działającego SAB w 50-mililitrowej stożkowej rurce i podgrzej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odpipetuj 10 mililitrów działającego SAB do 15-mililitrowej stożkowej rurki i dodaj 66,8 mikrolitrów 2,5 molowej glukozy D. Aby przygotować SAB o wysokiej zawartości glukozy, dodaj 44,8 mikrolitrów 2,5 monolo D glukozy do pozostałych 40 mililitrów działającego SAB. Aby przygotować SAB o niskim poziomie glukozy, oznacz trzy mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,7 mililitra.

Dla każdej studzienki z sześciodołkowej płytki i dodać jeden mililitr PBS do każdej probówki. Nie należy zapominać o przestrzeganiu instytucjonalnych protokołów dotyczących obchodzenia się z radioaktywnymi oczkami i ich usuwania. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub standardowego wybierz i przenieś 20 oczek o porównywalnej wielkości do każdej probówki mikrowirówkowej.

Na przykład każda tuba może zawierać pięć małych, 10 średnich i pięć dużych oczek. Chociaż wyniki są znormalizowane do całkowitej zawartości białka na końcu eksperymentu, bardzo ważne jest, aby dopasować oczka między grupami. Po pozostawieniu oczek na dnie probówki grawitacyjnie lub przez odwirowanie, należy zdążyć na inspirator, zważyć PBS za pomocą mikropipety, a następnie przystąpić do przygotowania oczek do testów biochemicznych.

Aby przygotować oczka do testu wydzielania insuliny, należy je najpierw wstępnie inkubować z SAB o niskiej stężeniu glukozy. Aby to zrobić, dodaj 400 mikrolitrów SAB o niskiej glikemii do probówek i umieść je z nakrętkami w inkubatorze do hodowli tkankowych Przez 60 minut po godzinie odessać SAB przed inkubacją Aby zmierzyć podstawowe wydzielanie insuliny. Powtórzyć procedurę wstępnej inkubacji.

Jednak, aby zmierzyć stymulowane wydzielanie insuliny, użyj 400 mikrolitrów SAB o wysokiej glukozie zamiast SAB o niskiej glukozie i tak jak poprzednio, inkubuj oczka przez 60 minut po inkubacji w aspiracie SAB o wysokiej lub niskiej glukozie i SAB do testu radioimmunologicznego insuliny, który zostanie wykonany zgodnie z protokołem producenta. Następnie przystąp do testu inkorporacji tymidyny, używając tej samej kolekcji oczek. Zacznij od oczek używanych właśnie do testu wydzielania insuliny.

Dodaj jeden mililitr PBS i pozwól oczkom osiąść grawitacyjnie. Następnie odessać PBS za pomocą mikropipety. Odrzuć i powtórz ten krok jeszcze raz.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego kwasu trichlorooctowego do oczek i inkubuj je na lodzie przez 30 minut. Odwirować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie aspiracja wyrzuć TCA.

Następnie dodaj 80 mikrolitrów 0,3 normalnego wodorotlenku sodu i inkubuj oczka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas tej inkubacji energicznie wiruj próbki przez pięć do 10 sekund co 10 minut. Równolegle dodaj cztery mililitry bezpiecznego koktajlu do liczenia płynów do siedmiu mililitrów płynnych probówek do liczenia scyntylacji.

Po zakończeniu inkubacji oczek dodaj 50 mikrolitrów oczek do rurki scyntylacyjnej. Krótko wstrząśnij zaślepioną probówką i zmierz radioaktywność próbek w liczniku scyntylacyjnym cieczy. Również, aby zmierzyć stężenie białka, przenieś 10 mikrolitrów vilas do komercyjnego testu kwasu bionicznego i postępuj zgodnie z protokołem producenta.

Później podczas analizy danych znormalizuj wyniki do stężenia białka za pomocą opisanych protokołów. Replikacja oczek i funkcja komórek beta. W oczkach szczurów oceniano adenowirusową nadekspresję hipotetycznego genu szóstego, silnie stymulowaną replikację oczek bez zmiany funkcji komórek beta.

Zwiększona ekspresja genu szóstego, zwiększona synteza DNA mierzona włączeniem tymidyny, ponieważ większość komórek w oku szczura to komórki beta. Dalsze eksperymenty mogą wykazać, że ten wzrost inkorporacji tymidyny jest spowodowany wzrostem replikacji komórek beta. Test wydzielania insuliny wykazał, że nadekspresja genu szóstego nie zmieniła jednej z podstawowych funkcji komórek beta: wydzielania insuliny przy niskim i wysokim poziomie glukozy.

Wzrost wydzielania insuliny przy niskich i wysokich stężeniach glukozy odzwierciedla stan zdrowia oczek po leczeniu adenowirusem. Jeśli zwiększenie ekspresji genu szóstego upośledza funkcję komórek beta, prawdopodobnie zostanie to odzwierciedlone jako spadek insuliny wydzielanej przy wysokich stężeniach glukozy w bodźcu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć replikację komórek beta i wydzielanie insuliny, aby określić, czy dany gen wpływa na wzrost lub funkcję komórek beta.