Name: Wysoka przepustowość Mikrokapsułkowanie pojedynczych i wielokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Poznaj metodę mikroenkapsulacji komórek z kontrolą liczby komórek na kroplę przy użyciu mikrofluidyki. Technika łączy uporządkowanie komórek z generowaniem kropel, osiągając wysoką wydajność w zakresu kilohercowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy firmie RainDance Technologies za próbkę surfaktantu PFPE-PEG wykorzystanego w niniejszym badaniu, a BioMEMS Resource Center (dyrektor Mehmet Toner) za formę z płytki krzemowej, która posłużyła do stworzenia replik kanałów z PDMS.

<ol><li>Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+mechanisms+of+microdroplets+using+localized+electric+fields+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).</li>
<li>Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdroplet+dilutor+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">A microdroplet dilutor for high-throughput screening.</a> Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).</li>
<li>Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+stochastic+confinement+enhances+analysis+of+rare+cells+by+isolating+cells+and+creating+high+density+environments+for+control+of+diffusible+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals.</a> Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).</li>
<li>Huebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chemical communications. , 1218-1220 (2007).</li>
<li>Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengraving+method+for+rapid+selection+of+single+cells+producing+antigen-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies.</a> Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).</li>
<li>Bradshaw, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+detection+of+secreted+products+from+human+lymphocytes+by+microengraving%3A+Cytokines+and+antigen-reactive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies.</a> Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).</li>
<li>Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+incubation%2C+and+parallel+functional+testing+and+identification+by+FISH+of+rare+microbial+single-copy+cells+from+multi-species+mixtures+using+the+combination+of+chemistrode+and+stochastic+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement.</a> Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drop-based+microfluidic+devices+for+encapsulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells.</a> Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).</li>
<li>Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilution-free+analysis+from+picoliter+droplets+by+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).</li>
<li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics%3A+control+of+cell+numbers+within+living+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+materials%22%5BJournal%5D)">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biomedical materials. 5, 21001(2010).</li>
<li>Edd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+encapsulation+of+single-cells+into+monodisperse+picolitre+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops.</a> Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82, 364(2003).</li>
<li>Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dripping+to+Jetting+Transitions+in+Coflowing+Liquid+Streams%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams.</a> Physical Review Letters. 99, (2007).</li>
<li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).</li>
<li>Segrí, G., Silberberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Particle+Displacements+in+Poiseuille+Flow+of+Suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions.</a> Nature. 189, 209-210 (1961).</li>
<li>Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics.</a> Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).</li>
<li>Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+Segregation+and+Dynamics+in+Confined+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows.</a> Physical Review Letters. 102, (2009).</li>
<li>Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+lateral+particle+ordering+in+finite+Reynolds+number+channel+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Fluids%22%5BJournal%5D)">Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows.</a> Physics of Fluids. 22, 081703(2010).</li>
<li>Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+self-assembly+and+control+of+microfluidic+particle+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane.</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+Device+Fabrication+and+Surface+Modification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">PDMS Device Fabrication and Surface Modification.</a> J. Vis. Exp. (8), e319(2007).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Hatch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).</li>
<li>Holtze, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).</li>
<li>Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+Flow-Rate+Controlled+Breakup+in+Confined+Geometries%3A+A+Route+to+Monodisperse+Emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions.</a> Physical Review Letters. 94, (2005).</li>
<li>Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+droplets+and+bubbles+in+a+microfluidic+T-junction-scaling+and+mechanism+of+break-up%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up.</a> Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).</li>
<li>Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsification+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%3A+effect+of+the+viscosities+of+the+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids.</a> Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorosurfactants+for+microdroplets%3A+interfacial+tension+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+and+interface+science%22%5BJournal%5D)">Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis.</a> Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+novel+fluorous+surfactants+for+microdroplet+stabilisation+in+fluorous+oil+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams.</a> Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).</li>
<li>Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+3D+droplet+self-assembly+for+ultra-high-density+digital+micro-reactor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays.</a> Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).</li>
</ol>

JE jest pomysłodawcą w oczekującym na rozpatrzenie patencie opartym na technologii wykorzystanej w niniejszym manuskrypcie.

Mimo stosunkowo wysokiego stopnia uporządkowania, nie wszystkie krople będą zawierać odpowiednią liczbę cząsteczek lub komórek. Wydajność enkapsulacji można obliczyć jako liczbę komórek lub cząsteczek, które zostały zamknięte w kroplach o pożądanej liczności, podzieloną przez ich liczbę całkowitą. Te surowe dane można uzyskać za pomocą zautomatyzowanego algorytmu analizy wideo o wysokiej prędkości lub poprzez obrazowanie próbki zebranej emulsji. Można to porównać do frakcji cząsteczek Pk zamkniętych w...

<table><tbody><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maska przezroczystości</td><td>Fineline Imaging Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotorezyst SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>2050</td><td></td></tr><tr><td>Profilometr Dektak</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>BD Biosciences</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomeru silikonowego PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184, numer materiału (240)4019862</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka próżniowa</td><td>Jencons</td><td>250-030</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Technologia próżniowa Alcatel</td><td>2010 C2</td><td></td></tr><tr><td>Regulator próżni</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-00910-10</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik (suszarka)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Lindberg Blue M, OV800F</td><td></td></tr><tr><td>wyciśnik do biopsji, 0,75 mm</td><td>Harris</td><td>Uni-Core 15072</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjne urządzenie do traktowania koronowego</td><td>Electro-Technic Products Inc.</td><td>BD-20AC, SKU 12051A</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki szklane</td><td>Złota Pieczęć</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel</td><td>PPG Industries</td><td></td><td>Strategia alternatywna</td></tr><tr><td>Mikrosfery polistyrenowe, 9,9 &amp;mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>G1000</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Nie wykazano</td></tr><tr><td>Strzykawki Luer-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>1 ml: 309628 3 ml: 309585</td><td></td></tr><tr><td>Olej fluorowęglowy FC-40</td><td>3M Inc.</td><td>Sigma Aldrich, F9755</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosurfaktant PFPE-PEG</td><td>RainDance Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lekki olej mineralny</td><td>Odczynniki chemiczne PTI Process Chemicals</td><td>08042-47-5</td><td>Strategia alternatywna</td></tr><tr><td>Surfaktant do oleju mineralnego</td><td>Evonik Goldschmidt Corporation</td><td>ABIL EM 90</td><td>Strategia alternatywna</td></tr><tr><td>Przewody PVC Tygon</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>TGY-010</td><td></td></tr><tr><td>igła do strzykawki Luer-Lok 30 G, 1/2 cala&quot;</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>NE-301PL-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Obrazowanie Carl Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Kamera wysokich prędkości</td><td>Badania nad wzrokiem</td><td>Phantom V310</td><td></td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe (2)</td><td>Chemyx Inc.</td><td>Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>Olej silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td>200 płynu, 10 cSt</td><td>Opcjonalne dla przechowywania emulsji</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Metody enkapsulacji mikrofluidycznej były wcześniej wykorzystywane do przechwytywania komórek w wodnych, monodyspersyjnych kroplach o skali pikolitra, zapewniając izolację od środowiska cieczy objętościowej, z zastosowaniami w wysokoprzepustowym przesiewaniu, cytometrii i spektrometrii mas. Opisujemy metodę, która pozwala nie tylko na enkapsulację pojedynczych komórek, ale także na powtarzalne przechwytywanie określonej liczby komórek (w niniejszej pracy demonstrujemy enkapsulację jednej i dwóch komórek), aby badać zarówno izolację, jak i interakcje między komórkami w grupach o kontrolowanych rozmiarach. Poprzez połączenie technik generowania kropli z uporządkowaniem komórek i cząstek, demonstrujemy kontrolowaną enkapsulację cząstek o rozmiarach komórek w celu uzyskania wydajnej, ciągłej enkapsulacji. Wykorzystując wodną zawiesinę cząstek i niemieszalny olej fluorowęglowy, generujemy krople wodne w oleju za pomocą dyszy skupiającej przepływ. Natężenie przepływu fazy wodnej jest wystarczająco wysokie, aby stworzyć uporządkowanie cząstek, które docierają do dyszy z częstotliwościami będącymi wielokrotnościami całkowitymi częstotliwości generowania kropli, co pozwala na enkapsulację kontrolowanej liczby komórek w każdej kropli. W celu uzyskania reprezentatywnych wyników, jako zamienniki komórek wykorzystano cząstki polistyrenu o rozmiarze 9,9 μm. Badanie to wykazuje wydajność enkapsulacji pojedynczych cząstek Pk=1 na poziomie 83,7% oraz wydajność enkapsulacji podwójnych cząstek Pk=2 na poziomie 79,5%, w porównaniu do ich odpowiednich wydajności Poissona wynoszących odpowiednio 39,3% i 33,3%. Wykazano, że efekt stałego stężenia komórek i cząstek ma kluczowe znaczenie dla wydajnej enkapsulacji; omówiono również przejścia z trybu kroplowania do trybu strumieniowania. 
Wstęp
Ciągłe zawiesiny komórek w środowisku wodnym dzielą wspólne środowisko płynne, co umożliwia równoległe oddziaływanie komórek oraz homogenizuje wpływ poszczególnych komórek na pomiary z medium. Wysokoprzepustowa enkapsulacja komórek w kroplach o skali pikolitrowej ogranicza próbki, chroniąc krople przed kontaminacją krzyżową, umożliwiając pomiar różnorodności komórkowej w obrębie próbek, zapobiegając rozcieńczaniu reagentów i ekspresjonowanych biomarkerów oraz wzmacniając sygnały z produktów bioreaktora. Krople zapewniają również możliwość ponownego łączenia kropel w większe próbki wodne lub z innymi kroplami w celu badania sygnalizacji międzykomórkowej.1,2 Zmniejszenie rozcieńczenia oznacza silniejsze sygnały detekcji dla pomiarów o wyższej dokładności, a także możliwość ograniczenia potencjalnie kosztownych objętości próbek i reagentów.3 Enkapsulację komórek w kroplach wykorzystywano w celu poprawy detekcji ekspresji białek,4 przeciwciał,5,6 enzymów,7 oraz aktywności metabolicznej8 w badaniach wysokoprzepustowych; może ona również służyć do usprawnienia wysokoprzepustowej cytometrii.9 Dodatkowe badania przedstawiają zastosowania w bio-elektrosprayingu kropel zawierających komórki dla spektrometrii mas10 oraz w ukierunkowanych powłokach komórkowych powierzchni.11 Niektóre zastosowania były jednak ograniczone przez brak możliwości kontrolowania liczby komórek enkapsulowanych w kroplach. Przedstawiamy tutaj metodę uporządkowanej enkapsulacji12, która zwiększa wykazaną wydajność enkapsulacji dla jednej i dwóch komórek i może zostać ekstrapolowana na enkapsulację większej liczby komórek.
Aby uzyskać monodyspersyjną generację kropli, mikrofluidyczne „ogniskowanie przepływu” (flow focusing) umożliwia tworzenie kropli o kontrolowanej wielkości jednego płynu (wodnej mieszaniny komórek) wewnątrz innego (ciągłej fazy olejowej) przy użyciu dyszy, w której strumienie zbiegają się.13 Dla danej geometrii dyszy częstotliwość generowania kropli f oraz ich rozmiar można zmieniać poprzez regulację przepływów fazy olejowej i wodnej Qoil oraz Qaq. Wraz ze wzrostem szybkości przepływu może nastąpić przejście z generowania kropli do niestabilnego strumieniowania cieczy wodnej z dyszy.14 
Gdy roztwór wodny zawiera zawieszone cząsteczki, zostają one zamknięte w kropelkach i odizolowane od siebie na dyszy. W przypadku generowania kropelek z losowo rozłożonej wodnej zawiesiny komórek, średnia frakcja kropelek Dk zawierających k komórek jest określana przez statystykę Poissona, gdzie Dk = λk exp(-λ)/(k!) oraz λ jest średnią liczbą komórek na kropelkę. Frakcja komórek, które trafią do „poprawnie” zamkniętych kropelek, jest obliczana za pomocą wzoru Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). Subtelna różnica między tymi dwoma miernikami polega na tym, że Dk odnosi się do wykorzystania cieczy wodnej i ilości sortowania kropelek, które musi zostać przeprowadzone po enkapsulacji, natomiast Pk odnosi się do wykorzystania próbki komórek. Przykładowo, można użyć rozcieńczonej zawiesiny komórek (niskie λ), aby tworzyć kropelki, w których większość kropelek zawierających komórki posiadałaby tylko jedną komórkę. Choć wskaźnik wydajności Pk byłby wysoki, większość kropelek byłaby pusta (niskie Dk), co wymagałoby zastosowania mechanizmu sortującego w celu usunięcia pustych kropelek, co z kolei obniżałoby przepustowość.15
Połączenie generowania kropel z uporządkowaniem bezwładnościowym umożliwia enkapsulację kropel z bardziej przewidywalną liczbą komórek na kroplę oraz wyższą przepustowością niż w przypadku enkapsulacji losowej. Fokuzowanie bezwładnościowe zostało po raz pierwszy odkryte przez Segre i Silberberga16 i odnosi się do tendencji cząstek o skończonej wielkości do migrowania do bocznych pozycji równowagi w przepływie w kanale. Uporządkowanie bezwładnościowe odnosi się do tendencji cząstek i komórek do pasywnej organizacji w równomiernie rozstawione, przesunięte, pociągi o stałej prędkości. Zarówno fokuzowanie, jak i uporządkowanie wymagają wystarczająco wysokich szybkości przepływu (wysoka liczba Reynoldsa) oraz rozmiarów cząstek (wysoka liczba Reynoldsa dla cząstek).17,18 Tutaj liczba Reynoldsa Re =uDh/ν oraz liczba Reynoldsa dla cząstek Rep =Re(a/Dh)2, gdzie u jest charakterystyczną prędkością przepływu, Dh [=2wh/(w+h)] jest średnicą hydrauliczną, ν jest lepkością kinematyczną, a to średnica cząstki, w to szerokość kanału, a h to wysokość kanału. Empirycznie długość wymagana do uzyskania w pełni uporządkowanych pociągów maleje wraz ze wzrostem Re i Rep. Należy zauważyć, że wysokie wymagania dotyczące Re i Rep (w niniejszym badaniu odpowiednio rzędu 5 i 0,5) mogą kolidować z potrzebą utrzymania niskich szybkości przepływu fazy wodnej, aby uniknąć przejścia w tryb strumieniowy przy dyszy generującej krople. Ponadto wysokie szybkości przepływu prowadzą do wyższych naprężeń ścinających działających na komórki, czego nie omówiono w niniejszym protokole. Poprzednie badanie nad uporządkowaną enkapsulacją wykazało, że ponad 90% pojedynczo enkapsulowanych komórek HL60 w warunkach przepływu podobnych do tych w niniejszym badaniu zachowało integralność błony komórkowej.12 Jednak wpływ wartości i skal czasowych naprężeń ścinających będzie musiał zostać starannie rozważony przy ekstrapolacji na inne typy komórek i parametry przepływu. Nakładanie się ograniczeń szybkości przepływu fazy wodnej dla uporządkowania komórek, generowania kropel i żywotności komórek zapewnia idealny reżim operacyjny dla kontrolowanej enkapsulacji pojedynczych i wielu komórek.
Ponieważ bardzo niewiele badań dotyczy odstępów między rzędami cząstek,19,20 określenie tych odstępów najłatwiej przeprowadzić empirycznie, a wynik będzie zależał od geometrii kanału, szybkości przepływu, wielkości cząstek i ich stężenia. Niemniej jednak równomierne odstępy boczne między rzędami oznaczają, że komórki docierają w przewidywalnych, stałych odstępach czasu. Gdy generowanie kropel odbywa się z taką samą częstotliwością, z jaką uporządkowane komórki docierają do dyszy, komórki zostają zamknięte w kropli w sposób kontrolowany. Technika ta została wykorzystana do enkapsulacji pojedynczych komórek z wydajnością rzędu 15 kHz,12 co stanowi znaczną poprawę w stosunku do wcześniejszych badań, w których zgłaszano szybkości enkapsulacji rzędu 60-160 Hz.4,15 W badaniach nad kontrolowaną enkapsulacją ponad 80% kropel zawierało dokładnie jedną komórkę, co stanowi znaczną poprawę wydajności w porównaniu ze statystyką Poissona (losową), która przewiduje średnią wydajność poniżej 40%.12
W poprzednich badaniach nad kontrolowaną enkapsulacją,12 średnia liczba cząstek na kroplę λ była dostrajana w celu zapewnienia enkapsulacji pojedynczych komórek. Hipotezyzujemy, że poprzez regulację szybkości przepływu możemy efektywnie enkapsulować dowolną liczbę komórek na kroplę, gdy λ jest równa lub bliska pożądanej liczbie komórek na kroplę. Podczas gdy enkapsulacja pojedynczych komórek jest cenna przy określaniu indywidualnych reakcji komórkowych na bodźce, enkapsulacja wielu komórek dostarcza informacji dotyczących interakcji kontrolowanej liczby i rodzajów komórek. Przedstawiamy tutaj protokół, reprezentatywne wyniki z wykorzystaniem mikrosfer polistyrenowych oraz dyskusję dotyczącą kontrolowanej enkapsulacji wielu komórek przy użyciu pasywnego kanału uporządkowania inercyjnego i dyszy do generowania kropli.

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Metody enkapsulacji mikroprzepływowej były wcześniej wykorzystywane do wychwytywania komórek w wodnych, monodyspersyjnych kroplach o skali pikolitrów, zapewniając ograniczenie...

Zastosowania wykorzystujące komórki zamknięte w niewielkich kroplach o objętości piko-litrów były często ograniczone przez brak możliwości kontrolowania liczby komórek w pojedynczej kropli. Niniejszy protokół przedstawia metodę kontroli enkapsulacji komórek poprzez połączenie dwóch odrębnych zjawisk mikrofluidycznych: hydrodynamicznego uporządkowania komórek oraz generowania kropel w mikro-dyszy z ogniskowaniem przepływu. W kanale dopływowym zapewniono odpowiednio wysoką szybkość przepływu roztworu wodnego z zawies진ymi komórkami lub cząstkami, co prowadzi do powstania szeregów o równomiernych odstępach w kierunku przepływu w dół strumienia.Dysza do generowania kropel z ogniskowaniem przepływu jest wykorzystywana do tworzenia kropel wodnych z częstotliwością rzędu kilohertz w dopuszczalnym olejowym płynie nośnym stabilizowanym surfaktantem. Uporządkowane pociągi cząsteczek w komórkach są następnie łączone z generowaniem kropel poprzez dostrojenie szybkości przepływu fazy wodnej i olejowej, aby zapewnić szybkość generowania kropel zsynchronizowaną z docieraniem podłużnie uporządkowanych komórek lub cząsteczek do dyszy generującej krople, przy czym cząsteczki są wykorzystywane jako su

high-throughput-single-cell-and-multiple-cell-micro-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wysoka wydajność mikroenkapsulacji jednokomórkowej i wielokomorkowej

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Ten artykuł przedstawia protokół do zasiewania rzadkiej populacji komórek za pomocą końcówek pipet do kropelkowych urządzeń mikroprzepływowych w celu zapewnienia wyższej efektywności enkapsulacji komórek w kropelkach.

Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

Prezentowany tutaj jest protokół użycia alginianu jako polimeru w mikrokapsułkowaniu unieśmiertelnionych komórek w celu długoterminowego dostarczania leków biologicznych do oczu gryzoni.

Technologia komórek kapsułkowanych do dostarczania leków biologicznych do oka myszy

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Ten artykuł opisuje enkapsulację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) za pomocą urządzenia do ogniskowania przepływu współosiowego. Wykazaliśmy, że ta technologia enkapsulacji mikroprzepływowej umożliwia efektywne tworzenie sferoid hPSC.

Mikroprzepływowe wytwarzanie mikrokapsułek typu core-shell zawierających sferoidy ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Poznaj metodę mikroenkapsulacji komórek z kontrolą liczby komórek na kroplę przy użyciu mikrofluidyki. Technika łączy uporządkowanie komórek z generowaniem kropel, osiągając wysoką wydajność w zakresu kilohercowym.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Przeglądaj więcej filmów