Wysoka przepustowość Mikrokapsułkowanie pojedynczych i wielokomórkowych

Aplikacje wykorzystujące komórki zamknięte w małych kroplach o rozmiarze pikolitrów były często ograniczone przez brak możliwości kontrolowania liczby komórek w kropli. Protokół ten demonstruje metodę kontrolowania enkapsulacji komórek poprzez połączenie dwóch odrębnych zjawisk mikroprzepływowych, dynamicznego porządkowania komórek płynów i generowania kropli w mikrodyszy skupiającej przepływ. W górnym kanale zapewnione jest wystarczająco wysokie natężenie przepływu roztworu wodnego z zawieszonymi komórkami lub cząstkami, aby spowodować tworzenie się pociągów o równych odstępach w kierunku przepływu za strumieniem.

Dysza do generowania kropli skupiająca przepływ służy do tworzenia wodnych kropli z szybkością kiloherców w stabilizowanym środkiem powierzchniowo czynnym dopuszczalnym płynie nośnikowym oleju. Uporządkowane ciągi cząstek komórkowych są następnie łączone z generowaniem kropli poprzez dostrajanie natężeń przepływu wody i oleju, aby zapewnić szybkość generowania kropli, która jest zsynchronizowana z przybyciem podłużnie uporządkowanych komórek lub cząstek do dyszy generującej krople, podczas gdy cząstki są używane jako substytuty komórek. Aby zademonstrować ten protokół, natężenie przepływu musi być wystarczająco małe, aby ograniczyć płyn.

Czysty stres na komórkach biologicznych, nakładanie się komórek porządkujących wytwarzanie kropli i żywotność komórek. Ograniczenia natężenia przepływu wody zapewniają idealny reżim operacyjny dla kontrolowanej hermetyzacji pojedynczych i wielu komórek. Analiza danych z mikroskopii wideo pokazuje, że zarówno jedno-, jak i dwukomórkowa lub cząsteczkowa skuteczność enkapsulacji przewyższa skuteczność losowej enkapsulacji i znacznie zmniejsza liczbę kropli, które nie zawierają pożądanej liczby komórek lub cząstek.

Uwięzienie komórek i kropli ogranicza rozcieńczanie wydzielin komórkowych, podkreśla niejednorodność komórek, a także kontroluje sygnały międzykomórkowe w porównaniu z zawiesiną masową. Skuteczne środki do zamykania tych komórek w kroplach stanowią cenne narzędzie dla badaczy biologii, aby rozpocząć tę procedurę. Zaprojektuj wzorzec mikrokanałów, jak pokazano na tym rysunku, w oprogramowaniu AutoCAD.

Długa sekcja kanału reprezentuje kanał porządkujący przepływ wodny o szerokości 27 mikronów. Schemat powiększonej dyszy pokazuje równe szerokości kanałów 27 mikronów dla wodnego kanału porządkującego i kanału olejowego, po których następuje skurczenie dyszy o 22 mikrony i nagłe rozszerzenie do szerszego kanału o długości 61 mikronów. Wysokość urządzenia wynosi 52 mikrony.

Zarówno wloty wodne, jak i olejowe mają duże filtry zanieczyszczeń ze szczelinami w kolejności szerokości kanału zamawiającego, jak pokazano na tym powiększonym schemacie wlotu oleju. Pokazano. Oto prawdziwy obraz kanału zamawiania i dyszy wtryskiwanej barwnikiem. Zatrudnij zewnętrznego producenta, aby wydrukować maskę przezroczystości o wysokiej rozdzielczości na folii Mylar lub kwarcu, gdzie kanały są przezroczyste na ciemnym tle.

Następnie utwórz krzem i SU osiem fotorezystu do formowania replik. Przyklej formę wzorcową do dna szalki Petriego w celu formowania replik PDMS. Po zakończeniu formowania repliki i wycięciu konturu urządzenia, użyj stempla do biopsji o średnicy zewnętrznej 0,75 milimetra, aby przebić porty płynów w trzech okrągłych obszarach pokazanych na tym rysunku drogą taśmą klejącą po stronie wzoru PDMS i oderwij, aby usunąć kurz po klejeniu plazmowym.

PDMS do czystego szklanego szkiełka mikroskopowego. Całe urządzenie wstawiamy do piekarnika i stopniowo rozgrzewamy piekarnik do 120 stopni Celsjusza. Pozostaw urządzenie na noc w piekarniku o temperaturze 120 stopni Celsjusza, aby zakończyć klejenie i przywrócić PDMS do pierwotnego stanu hydrofobowego.

Alternatywną metodą nadania szklanej powierzchni kanału hydrofobowości jest wstrzyknięcie powłoki, takiej jak aquae, do portów fluidycznych, a następnie przedmuchiwanie powietrzem. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki i igły strzykawkowej wciągnij kilkaset mikrolitrów powietrza, a następnie niewielką ilość orliku wystarczającą do wypełnienia tylko metalowej końcówki strzykawki, ale mocno wstrzyknij wodę, a następnie powietrze przedmuchujące do portów płynu. Bez agresywnego zrywania PDMS ze szkłem.

Powtórz przedmuchiwanie powietrzem na wszystkich portach wlotowych i wylotowych, jednocześnie wycierając nadmiar wody, aby uniknąć osadów, które mogą zatkać kanały po wysuszeniu. Kontrolowanie stężenia komórek jest niezbędne do osiągnięcia odpowiedniej liczby komórek do odpowiedniej liczby kropli. Składa się to z dwóch trudnych elementów.

Pierwszym z nich jest wcześniejsze oszacowanie właściwego stężenia, a drugim utrzymanie tego stężenia podczas eksperymentu W przypadku konkretnego urządzenia użytego w tym badaniu, komórki lub cząstki o wielkości od ośmiu do 15 mikronów powinny być odpowiednio uporządkowane do kontrolowanej enkapsulacji. W tej demonstracji mikrosfery wielokwiatowe o grubości 9,9 mikrona zostaną wykorzystane jako substytuty komórek do przygotowania stężenia zawiesiny cząstek wodnych w celu uzyskania idealnej enkapsulacji audytu, zaczynając od stężenia zapasów mikrosfery wynoszącego 1% wagowo ciał stałych, korzystając z poprzednich danych do pełnego uporządkowania. Jako wskazówkę, zwiększ stężenie do 1,5% ciał stałych poprzez delikatną centryfuzję jednego mililitra próbki podstawowej, usuwając 250 mikrolitrów cieczy supinacyjnej i Resus zawieszając cząstki przez mieszanie wirowe lub łagodniejsze mieszanie.

Podczas korzystania z ogniw zarówno ogniwa, jak i cząstki polistyrenu mają ciężar właściwy większy niż jeden, chociaż nie jest to pokazane w tym filmie. W przypadku długotrwałych eksperymentów trwających od wielu minut do godzin, roztwór może być dopasowany do wyporności, dodając substancję rozpuszczoną, taką jak chlorek wapnia dla cząstek lub opti prep dla komórek. Po przygotowaniu zawiesiny ogniwa lub cząstek przygotuj 10-mililitrową próbkę ciągłej fazy oleju fluorowęglowego w 15-mililitrowym wirówce wirówkowej.

Wymieszaj środek powierzchniowo czynny i olej fluorowęglowy do około 2,5% wagowych. Tutaj otrzymujemy mieszaninę o masie 2,4, która jest dopuszczalna do przeprowadzenia eksperymentu z mikrokapsułkowaniem. Najpierw włącz zasilanie odwróconego mikroskopu optycznego i szybkiej kamery.

Skoncentruj się na warstwie mikrokanalików i sprawdź kanały pod kątem zatorów i wszelkich zanieczyszczeń, które mogłyby zostać usunięte. Wybierz kanał wolny od dużych zanieczyszczeń lub widocznych zatkań. Wytnij trzy odcinki półprzezroczystej rurki PVC tigon do wlotu i wylotu oleju wodnego, aby zminimalizować martwą objętość.

Wytnij tylko tyle rurek, aby sięgały od pomp strzykawkowych do mikroskopu. Etap przyciąć końcówki rurki pod kątem 45 stopni Aby ułatwić wkładanie do portów fluidycznych, użyj pęsety, aby wcisnąć końce rurki do portów fluidycznych. Następnie wciśnij igłę strzykawki ze stali nierdzewnej o grubości 30 mm z końcówką do wolnego końca wodnej rurki wlotowej.

Powtórz tę czynność dla rurki wlotowej oleju. Przesuń urządzenie i przymocuj rurkę do stolika mikroskopu, używając 20-krotnego wyrównania obiektywu i skup się na dyszy urządzenia. Ręcznie dostosuj mikroskop do oświetlenia Kohlera, aby zapewnić optymalne oświetlenie w płaszczyźnie ogniskowej.

Korzystając z oprogramowania kamery o dużej szybkości, przycinaj pole widzenia wokół dyszy, aby umożliwić większą liczbę klatek na sekundę, a następnie ustaw liczbę klatek na sekundę, czas ekspozycji i inne ustawienia kamery zgodnie z wymaganiami w celu optymalnego nagrywania. Następnie napełnij jednomililitrową strzykawkę wcześniej przygotowanym, dobrze wymieszanym roztworem fazy wodnej. Napełnij trzymililitrową strzykawkę roztworem fazy olejowej.

Przechylić jedną z napełnionych strzykawek w pionie i przesunąć pęcherzyki powietrza do wylotu strzykawki. Powoli wcisnąć tłok na tyle długo, aby powietrze dotarło do końcówki strzykawki, przytrzymując strzykawkę pionowo. Podłączyć strzykawkę do odpowiedniej igły strzykawkowej już podłączonej do urządzenia.

Wcisnąć tłok, aby przepchnąć powietrze przez martwą objętość igły strzykawki, aż płyn zostanie przepchnięty przez rurkę prawie do urządzenia, bezpiecznie zamocować strzykawkę do pompy strzykawkowej i zatrzasnąć blok tłoka. Powtórzyć połączenia dla drugiej strzykawki i zamontować ją do zasilania drugiej pompy strzykawkowej na każdej pompie strzykawkowej i zaprogramować każdą pompę. Korzystając z protokołów producenta, ustaw początkowe natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na minutę dla fazy olejowej i pięć mikrolitrów na minutę.

Do rozruchu fazy wodnej pompy czekają, aż każdy płyn dostanie się do urządzenia i wypełniają kanały wypychając pozostałe martwe powietrze. Może to potrwać kilka minut przy początkowych natężeniach przepływu. Obserwuj tworzenie się kropli na dyszy.

Powoli zwiększaj natężenie przepływu wody, aby obserwować kolejność cząstek w długim kanale roztworu wodnego. Ponieważ wzrost natężenia przepływu nie zwiększa natężenia przepływu do punktu, w którym natryskiwanie strumienia cieczy wodnej jest wyzwalane na dyszy, jak pokazano w tym example, przy użyciu innej dyszy generacji kropli Uwaga, niestabilny przepływ i niespójny spadek są tutaj. Jeśli stężenie cząstek jest zbyt niskie, aby zapewnić naprzemiennym ciągom stosunkowo niewiele brakujących cząstek, a próbka nie była dopasowana pod względem wyporności, należy fizycznie przechylić pompę strzykawki w kierunku wylotu strzykawki, aby zapewnić stopniowe osiadanie cząstek w kierunku wylotów strzykawki.

Po odpowiednim uporządkowaniu dostosuj natężenie przepływu oleju, aby dostroić częstotliwość generowania i wielkość kropli. Iteracyjnie dostosowuj oba natężenia przepływu, aby osiągnąć pożądane szybkości enkapsulacji i objętości kropli. Po potwierdzeniu stabilnej uporządkowanej hermetyzacji należy przenieść rurkę wylotową ze zbiornika na odpady do zbiornika zbiorczego do wykorzystania w przyszłości.

Hermetyzacja pojedynczych i podwójnych cząstek lub komórek może być osiągnięta z wysoką wydajnością. Korzystając z tego protokołu, pokazany tutaj jest reprezentatywny wynik enkapsulacji pojedynczych cząstek o natężeniu przepływu oleju 60 mikrolitrów na minutę i natężeniu przepływu wody wynoszącym dziewięć mikrolitrów na minutę. Lambda, średnia liczba cząstek do kropli wynosi 0,95.

Odstępy między cząstkami w kierunku przepływu wynoszą około 17 do 18 mikronów dla w pełni uporządkowanych cząstek naprzemiennych. Szybkość generowania kropli w tym przykładzie wynosi 6,1 kiloherca, a średnia wielkość kropli wynosi 24,4 pikolitra. Histogram porównuje skuteczność enkapsulacji kropli w kolejności enkapsulacji pojedynczej cząstki z plusem.

Na podstawie statystyk zaobserwowano, że losowa enkapsulacja dla próbki o wielkości 517 kropli, średnia frakcja kropli zawierających jedną cząstkę wynosi 79,5%, w przeciwieństwie do przewidywanej frakcji losowej kapsułkowania wynoszącej 36,7%Frakcja cząstek, które trafiają do prawidłowo zamkniętych kropli, wyniosła 83,7% dla próbki o wielkości 491 cząstek, podczas gdy losowa frakcja enkapsulacji wynosiła 37,3%Kapsułkowanie podwójnych cząstek osiąga się po prostu poprzez zmniejszenie natężenia przepływu oleju do 30 mikrolitrów na minutę przy jednoczesnym utrzymaniu natężenia przepływu wody na poziomie dziewięciu mikrolitrów na minutę. Tutaj lambda, średnia liczba cząstek na kroplę wynosi 1,8. Podobnie jak w przypadku enkapsulacji pojedynczych cząstek.

Odstępy między cząstkami w kierunku przepływu wynoszą około 17 do 18 mikronów dla w pełni uporządkowanych cząstek naprzemiennych. Większe krople mają średnią wielkość kropli 39,8 pikolitra i uformowały się z szybkością 3,8 kiloherca w porównaniu do losowej enkapsulacji. Dla próbki o wielkości 383 kropli średnia frakcja uporządkowanych kropli do kapsułkowania zawierających dwie cząstki wynosi 71,5%, w przeciwieństwie do przewidywanej frakcji losowej enkapsulacji wynoszącej 26,8%Zaobserwowano, że frakcja cząstek, które znalazły się w prawidłowo zamkniętych kroplach, wynosi 79,5% dla próbki o wielkości 689 cząstek, podczas gdy frakcja losowej enkapsulacji wynosiła 33,4%Pobrane.

Łącznie wyniki te pokazują, że zarówno skuteczność enkapsulacji pojedynczych, jak i podwójnych cząstek przewyższa ponad dwukrotnie skuteczność enkapsulacji losowej i znacznie zmniejsza liczbę kropli, które nie zawierają pożądanej liczby komórek lub cząstek. Znaczenie odpowiednich stężeń cząstek lub komórek dla wysokiej skuteczności enkapsulacji zostało zilustrowane w tym przebiegu eksperymentalnym. Podczas gdy natężenia przepływu oleju i wody są takie same, jak w pokazanym wcześniej przebiegu enkapsulacji podwójnych cząstek, średnia liczba komórek na kroplę lambda jest zmniejszona do 1,57.

W związku z tym nie dochodzi do pełnego uporządkowania, a co za tym idzie, w pociągach pojawiają się, które pozostawiają krople słońca z mniejszą ilością cząstek niż przewidywano. Ten histogram pokazuje zmniejszoną skuteczność dla enkapsulacji dwóch cząstek ze względu na niższą wartość Lambda. Dla próbki o wielkości 324 kropli, średnia frakcja kropli zawierających dwie cząstki wynosiła 55,9%, przy prawie takiej samej liczbie kropli pojedynczych cząstek, jak kropli podwójnych cząstek.

Oznacza to, że Lambda powinna być równa lub zbliżona do liczby pożądanych komórek na kroplę, aby zmaksymalizować prawidłowo zamknięte cząstki lub komórki z dokładną wybraną wartością lambda, w zależności od tego, czy tolerowana jest mniej, czy więcej komórek na kroplę. W tej demonstracji wykorzystujemy niedopasowania wyporu, aby umożliwić kontrolę stężenia w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu. Jednak w przypadku długoterminowych eksperymentów może być wskazane dopasowanie wyporu w celu uzyskania bardziej spójnych wyników po enkapsulacji komórek w wodnych kroplach.

Eksperymenty zależne od czasu można przeprowadzać w probówce wirówkowej lub pod mikroskopem poprzez ponowne wstrzykiwanie kropli do układów mikroprzepływowych.