Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Koncentrujemy się na opracowywaniu wysokowydajnych metod izolacji i analizy CTC, aby przyspieszyć precyzyjną onkologię poprzez biopsję cieczy. Obecne komercyjne platformy izolacji CTC mają niską przepustowość i wydajność. Są również niekompatybilne z platformami analitycznymi w dalszej fazie rozwoju, co ogranicza odzyskiwanie informacji biologicznych.

Badanie to wykorzystuje mikrofluidyczną platformę izolacji CTC, aby znacznie poprawić wskaźniki wykrywania. Stosujemy również rzadki chip sekwencjonowania pojedynczych komórek do głębszej analizy biopsji cieczy. Na początek pipetować 25 mikrolitrów przemytych i ponownie zawiesowanych zmodyfikowanych magnetycznych kulek streptawidyny do rurki zawierającej jeden mikrogram biotinylowanego przeciwciała EpCAM.

Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej, obracając się z prędkością 20 obrotów na minutę przez 40 minut, aby przygotować kulki magnetyczne immuno. Za pomocą magnetycznego stojaka oddziel kulki od supernatantu. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesij kulki w 25 mikrolitrach buforu izolacyjnego.

Pipeta 20 mikrolitrów zawieszenia kulek magnetycznych w ciągu jednej do dwóch sekund, zapewniając brak powstawania pęcherzyków powietrza. Natychmiast umieść chip pionowo na magnesie i pozwól kulkom osadnąć przez pięć minut bez zakłóceń. Pobierz cztery mililitry próbki krwi do strzykawki, upewniając się, że pęcherzyki powietrza zostaną usunięte.

Uszczelnij wlot i wylot układu cieczą, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza, a następnie włóż wlot i wylot próbki do układu. Za pomocą pompy strzykawkowej wstrzyknij próbkę z przepływem 1,5 mililitra na godzinę. Po załadowaniu próbki wstrzyknąć 60 mikrolitrów DPBS do układu HB z przepływem 0,2 mililitra na godzinę, aby zmyć niezwiązane komórki.

Usuń magnes i ręcznie wstrzykni 1,5 mililitra 5% BSA, aby przemyć chip i uwolnić przechwycone komórki nowotworowe. Przygotuj roztwór 10% MPTS w etanolu. Natychmiast wprowadź 20 mikrolitrów roztworu do układu HB i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Opłucz chip HB raz bezwodnym etanolem, a następnie susz w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie przygotuj roztwór GMBS w etanolu w stężeniu 0,5 miligrama na mililitr. Po schłodzeniu chipu do 37 stopni Celsjusza należy wprowadzić roztwór GMBS i inkubować.

Przepłucz chip HB dwa razy podwójnie destylowaną wodą, a następnie dwa razy płukaj DPBS. Natychmiast dodaj 15 mikrogramów na mililitr streptawidyny do chipa HB i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przepłucz chip HB dwa razy solą fizjologiczną DPBS.

Teraz przygotuj bufor przeciwciał CD45, dodając 0,2% BSA oraz 20 mikrogramów na mililitr biotinylowanego przeciwciała CD45 do DPBS i dostosowując do końcowej objętości. Wstrzyknąć 20 mikrolitrów buforu przeciwciał CD45 do chipa HB w celu negatywnego selekcji białych krwinek. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej przepłucz chip DPBS.

Do układu HB dodaj roztwór blokujący zawierający 3% BSA i 0,05%Tween 20. Wssysaj przygotowaną próbkę do strzykawki, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie uszczelnić wlot i wylot układu cieczą i podłączyć rurki wlotowe i wylotowe do układu.

Za pomocą pompy strzykawkowej wstrzyknij próbkę z przepływem 0,6 mililitra na godzinę. Zbieraj oczyszczone komórki nowotworowe z gniazdka chipowego do liczenia i sekwencjonowania pojedynczych komórek. Pipeta włóż 200 mikrolitrów roztworu 0,5% F-68 przygotowanego w DPBS do wlotu chipa.

Wykonaj sonikację w kąpieli wodnej, trzymając chip. Gdy bąbelki są widoczne w obszarze mikroporowatym, kontynuuj sonację przez 30 sekund, aby usunąć pęcherzyki z podwójnych dołków. Następnie wstrzyknij 200 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych do chipu zawierającego 60 000 podwójnych dołków.

Delikatnie pipetuj zawiesinę ogniwową w chipie dwukrotnie w górę i w dół. Następnie ponownie załóż na shaker decoloring na pięć minut, aby zawiesił nieprzejęte komórki i pozwolić im się ustabilizować. Teraz dodaj 200 mikrolitrów DPBS i 0,5% roztworu F-68 przez wlot i zasysaj z wylotu.

Po ponownym zawieszeniu zawieszenia kulek z kodem kreskowym natychmiast wstrzyknij 200 mikrolitrów zawieszenia do wlotu chipa i potrząsaj z prędkością 10 obrotów na minutę przez 20 sekund. Delikatnie zawiesz kulki dwukrotnie, zanim ponownie założysz je na shakerze. Następnie wyjmij zawiesina kulek z kodem kreskowym z wylotu, a następnie podaj pipetę 200 mikrolitrów roztworu 20X Tris-EDTA i 50 milimolarnych ditiotreitolu.

Wycofaj płyn z wylotu. Do lizy komórek i wychwytywania MRNA stopniowo dodawaj 200 mikrolitrów buforu do lizy komórek do wlotu chipa. Natychmiast dodaj 200 mikrolitrów oleju mineralnego, aby uszczelnić podwójne odwierty.

Usuń roztwór płynący z wylotu chipu do zbiornika odpadów. Następnie ułóż chips poziomo i odstaw do pracy w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powoli dodaj 200 mikrolitrów 6x roztworu cytrynianu soli sodu do wlotu.

Usuń ciecz odpadową i zasysaj pozostały roztwór z wylotu chipu. Powoli dodaj 200 mikrolitrów 6x soli sodu, aby napełnić chip. Trzymaj magnes blisko powierzchni chipu i powoli przesuwaj go od wlotu do wyjścia, aby zebrać kulki z kodem kreskowym.

Szybko wdysaj roztwór i koraliki do rurki wirówki zawierającej 6x cytrynian soli sodu. Przemyj koraliki z kodem kreskowym trzy razy 200 mikrolitrami 6-krotnej soli sodu, a następnie raz buforem transkrypcyjnym odwróconym. Zaobserwowano równomierny rozkład kulek immunomagnetycznych pod wpływem pola magnetycznego, podczas gdy minimalne pozostałości po usunięciu magnetycznym potwierdzały uwalnianie efektu.

Chip izolacyjny CTC skutecznie wychwytywał komórki nowotworowe zarówno z próbek 1 mililitra, jak i 10 mililitrów. Dodanie chipa oczyszczającego dodatkowo zwiększyło czystość komórek nowotworowych. W próbkach krwi obwodowej z minimalną ilością komórek LNCaP, system sortowania CTC utrzymywał wysoką efektywność i czystość wychwytu.

Układ kodowania kreskowego z pojedynczą komórką osiągał 85,6% obsadzenia komórek i 95,7% opartych na kulkach, co skutkowało współczynnikiem parowania na poziomie 81,9%. Zwiększenie liczby załadowanych komórek poprawiło współczynnik zajętości mikrootworów bez obniżenia efektywności przechwytywania. Zintegrowany proces izolacji CTC i sekwencjonowania pojedynczych komórek pozwolił uzyskać wysoce czyste komórki nowotworowe i dokładnie zachować pierwotne proporcje komórek nowotworowych. Analiza TSNE wyraźnie rozdzieliła komórki PC3, LNCaP i Jurkata na trzy klastry, z których każda charakteryzuje się unikalną ekspresją markerów.

Klaster komórek Jurkat został zidentyfikowany przez silną ekspresję TRBC1, IGLL1, CD1E i CD3D, potwierdzoną wzbogaceniem szlaków dla aktywacji limfocytów T. Klastry PC3 i LNCaP wyróżniano genami różnicowo ekspresyjnymi, przy czym PC3 wykazywał wysoką ekspresję mikroseminoprotein, a LNCaP ekspresję NEDD4.