Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie zhumanizowanych myszy zmodyfikowanych za pomocą chimerycznego receptora antygenowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie HIV i immunologii w zakresie testowania skuteczności inżynierii odporności opartej na komórkach macierzystych przeciwko zakażeniu HIV oraz innym przewlekłym infekcjom i nowotworom. Przykładowo, w badaniu mechanizmów niewydolności odpornościowej oraz sposobów wzmacniania układu odpornościowego i opracowywania terapii w celu stworzenia lepszej odporności przeciwwirusowej lub przeciwnowotworowej.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia szerokiego zakresu manipulacji eksperymentalnych. Humanizowany model myszy BLT naśladuje odporność ludzką i w tym przypadku pozwala na testy przedkliniczne terapii genowych opartych na komórkach przeciwko zakażeniu HIV. Procedurę zaprezentują Valerie Rezek i Brianna Lam, które są technikami z mojego laboratorium.

Rozpocznij od pocięcia grasicy skalpelami na małe fragmenty o wielkości około jednego milimetra sześciennego w naczyniu zawierającym uzupełnione pożywkę RPMI. Następnie, używając zakrzywionej pęsety tępej, umieść każdy pojedynczy fragment grasicy w osobnej studzience płytki 96-dołkowej. Do wszystkich studzienek dodaj 100-200 µL pożywki, aby zapobiec wysychaniu tkanki.

Obejrzyj tkankę pod mikroskopem, aby wyeliminować wszelkie fragmenty, które nie są grasicą lub mają przytwierdzoną tkankę łączną. Następnie wyjmij potwierdzone fragmenty grasicy i umieść je w kolbie hodowlanej T25. Do kolby dodaj siedem mililitrów pożywki RPMI z dodatkiem antybiotyku i delikatnie potrząśnij, aby wymieszać zawartość.

Następnie umieść kolbę w inkubatorze do hodowli tkanek. Ten krok zapobiega kontaminacji bakteriami tkanki. Rozpocznij izolację CD34-dodatnich HSC z wątroby płodowej, używając dwóch skalpeli do pocięcia wątroby na małe kawałki o wielkości około trzech milimetrów sześciennych w naczyniu zawierającym IMDM.

Usunąć i wyrzucić wszelką białą tkankę łączną. Następnie, używając strzykawki 10 ml z założoną tępą igłą o rozmiarze 16G, pobrać fragmenty wątroby wraz z medium i przenieść je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie zasysać i wypuszczać zawartość od pięciu do siedmiu razy, aby całkowicie zhomogenizować tkankę.

Po przygotowaniu 10 mililitrów pożywki IMDM, uzupełnij ją o kolagenazę, hialuronidazę, antybiotyki, DNazę oraz środek przeciwgrzybiczy. Przefiltruj pożywkę przez filtr o rozmiarze porów 0,22 mikrona. Następnie dodaj przefiltrowaną pożywkę do zawiesiny wątroby.

Po zamknięciu 50 mililitrowej probówki stożkowej zawierającej zawiesinę wątroby, szczelnie zabezpiecz ją folią samoprzylepną, taką jak parafilm, aby zapobiec wyciekom. Inkubuj w rotatorze do probówek w temperaturze 37 stopni celsius przez 90 minut. Po inkubacji przefiltruj trawioną zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o oczkach 100 micron do nowej 50 mililitrowej probówki.

Dodać PBS do zawiesiny, aby zwiększyć całkowitą objętość do 50 mililitrów. Przenieść zawiesinę do dwóch probówek o pojemności 50 mililitrów, tak aby każda zawierała 25 mililitrów zawiesiny komórkowej. Powoli i ostrożnie nałożyć pod komórki w każdej probówce 10 mililitrów medium do wirowania gradientowego, takiego jak Ficoll.

Wiruj przy 1200 ×g przez 20 minut bez przerwy. Po wirowaniu ostrożnie pobierz interfejs z każdej probówki i przenieś go do dwóch osobnych probówek o pojemności 50 ml. Dobierz objętość interfejsu w każdej probówce do 50 ml za pomocą PBS.

Następnie odwiruj próbki przy 300 ×g przez 7 do 10 minut. Połącz i przemyj osady komórkowe trzykrotnie 50 ml buforu PBS zawierającego 2% FBS, wirując przy 300 ×g przez 7 do 10 minut w każdym cyklu. Po ostatnim wirowaniu ponownie zawieś osad w 50 ml pożywki RPMI z dodatkiem 10% FBS.

Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie niezwłocznie wyselekcjonuj komórki CD34-dodatnie, używając zestawu do sortowania CD34 zgodnie z protokołem producenta, i zachowaj frakcję CD34-dodatnią oraz CD34-ujemną. Przelej fragmenty grasicy i medium z kolby do szalki o średnicy 60 milimetrów.

Schłodzić końcówki do pipet wyporowych, umieszczając je w otwartych, sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Na lodzie należy również umieścić osady komórkowe oraz objętość żelowej mieszaniny białek, takiej jak matrigel. Znieczulić myszy biorców za pomocą znieczulenia dożylnego zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt.

Sprawdź poziom znieczulenia myszy, ściskając łapę. Brak reakcji na uszczypnięcie świadczy o osiągnięciu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia. Wygol lewą stronę każdej myszy od biodra do barku, na obszarze między środkiem grzbietu a brzuchiem.

Wstrzyknij podskórnie zwierzęciu w okolicy barku lub trójkąta pachwinowego 6 mg/kg rozcieńczonego Carprofenu. Przepłucz kaniulę trokara roztworem PBS w szalce o średnicy 60 mm. Za pomocą tępych zakrzywionych pincek umieść fragment grasicy z szalki 60 mm tuż przy otworze kaniuli, a następnie wycofaj trokar, aby zassać tkankę do wnętrza kaniuli.

Następnie, używając pipety wypierającej i schłodzonego końcówki, dodaj 5 µL zimnej żelowej mieszaniny białek do probówki z osadem komórkowym. Delikatnie wymieszaj, aby przygotować zawiesinę komórkową. Pipetuj zawiesinę komórkową do otworu kaniuli i powoli wycofaj trokar, aby napełnić igłę.

Przetrzyj ogoloną część ciała myszy jodkiem powidonowym, a następnie izopropenolem, powtarzając tę czynność trzy razy. Zlokalizuj pod skórą najciemniejszy obszar, który wskazuje miejsce położenia śledziony. Nerka znajduje się w odległości około pięciu milimetrów grzbietowo w stosunku do śledziony.

Po upewnieniu się, że osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia poprzez brak reakcji na uciśnięcie łapy, należy za pomocą zakrzywionej pęsety unieść skórę i użyć nożyczek chirurgicznych, aby wykonać 15 milimetrowe nacięcie skóry równolegle do śledziony. Następnie należy wykonać podobne cięcie w warstwie otrzewnej znajdującej się poniżej. U samców nerka jest łatwo widoczna i może zostać wysunięta poprzez proste uciśnięcie brzucha.

Podtrzymaj nerkę za pomocą kleszczyków hemostatycznych lub zakrzywionych pęsety tępych. U samic jajniki mogą utrudniać łatwe wyjęcie nerki. Chwyć jajnik kleszczykami hemostatycznymi i ostrożnie odsłoń nerkę.

Za pomocą pęsety z igłowatymi końcówkami wykonaj niewielki otwór na tylnym końcu torebki nerkowej. Wsuń trokar w ten otwór i przesuń go wzdłuż nerki, aż otwór kaniuli zostanie całkowicie przykryty przez torebkę nerkową. Delikatnie wysuń tkankę spod torebki nerkowej, a następnie wyciągnij trokar.

Używając zakrzywionej pęsety, upewnij się, że fragment grasicy nie wysuwa się wraz z igłą. Następnie unieś otrzewną pęsetą i delikatnie użyj kleszczyków hemostatycznych, aby przesunąć nerkę z powrotem na miejsce. Wykonaj jeden szew z podwójnym węzłem w otrzewnej, używając nici chirurgicznej.

Należy również założyć dwa klipy do ran Autoclips, aby zamknąć skórę. Następnie wymieszać przetransdukowane komórki CD34-dodatnie i pobrać 0,5 × 10⁶ komórek w objętości 100 µL do strzykawki insulinowej. Wstrzyknąć te komórki myszy poprzez wstrzyknięcie do splotu żylnego zaocznego.

Po wstrzyknięciu nanieś za pomocą patyczka małą kroplę środka nawilżającego do każdego oka, a następnie połóż mysz na boku z powrotem w klatce. Po implantacji u wszystkich myszy upewnij się, że zwierzęta odzyskały przytomność i mogą się poruszać przed przeniesieniem ich z powrotem do pomieszczenia hodowlanego. Myszy uśpiono 10 tygodni po operacji, a następnie pobrano krew, śledzionę, grasicę i szpik kostny.

Otrzymane komórki barwiono przeciwciałami anty-ludzkimi CD45 i CD4, a następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej. Jak tu widać, komórki zmodyfikowane chimerycznym receptorem antygenowym CD4 mogą być wykrywane w wielu tkankach limfatycznych za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki zmodyfikowane chimerycznym receptorem antygenowym CD4 mogą różnicować się w wiele linii komórkowych.

W tym przypadku pobrano splenocyty od myszy z zmodyfikowanym chimerycznym receptorem antygenowym CD4 i przeprowadzono barwienie na markery limfocytów T oraz B. Komórki negatywne pod kątem markerów limfocytów T i B były pozytywne pod kątem markerów monocytów i makrofagów oraz komórek natural killer. Splenocyty od zakażonych HIV myszy z chimerycznym receptorem antygenowym CD4 stymulowano za pomocą zakażonych HIV lub niezakażonych komórek T1, a następnie przedstawiono ich wewnątrzkomórkową produkcję cytokin.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak tworzyć humanizowane myszy BLT zmodyfikowane chimerycznymi receptorami antygenowymi. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu 48 godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować w stałym tempie i uważnie monitorować stan operowanej myszy.

Dla osób początkujących ważne jest przećwiczenie zabiegów chirurgicznych i iniekcji do oka przed pracą z cenniejszymi tkankami i komórkami macierzystymi. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie HIV i innych chorób zakaźnych do badania patogenezy chorób oraz terapii opartych na układzie odpornościowym w modelu humanizowanych myszy.