Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie humanizowanej myszy zmodyfikowanej chimerycznym receptorem antygenowym. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie HIV i immunologii w odniesieniu do testowania skuteczności odporności inżynieryjnej opartej na komórkach macierzystych przeciwko zakażeniu wirusem HIV oraz innym przewlekłym infekcjom i nowotworom złośliwym. Takich jak mechanizm niewydolności immunologicznej i sposoby wzmocnienia układu odpornościowego i opracowania terapii w celu stworzenia lepszej odporności przeciwwirusowej lub przeciwnowotworowej.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona zdolna do dużej liczby manipulacji eksperymentalnych. Humanizowany model myszy BLT naśladuje ludzką odporność i w tym przypadku pozwala na badania przedkliniczne terapii genowych opartych na komórkach przeciwko zakażeniu wirusem HIV. Procedurę zademonstrują Valerie Rezek i Brianna Lam, są technikami z mojego laboratorium.

Zacznij od użycia skalpeli, aby pokroić grasicę na małe kawałki o długości około jednego milimetra w kostce w naczyniu zawierającym uzupełnioną pożywkę RPMI. Następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby umieścić każdy pojedynczy kawałek grasicy w jednym dołku na 96-dołkowej płytce. Dodaj 100-200 mikrolitrów pożywki do wszystkich dołków, aby tkanka nie wyschła.

Wizualizuj tkankę pod mikroskopem, aby wyeliminować wszelkie tkanki, które mogą nie być grasicą lub mają przyczepioną tkankę łączną. Następnie usuń potwierdzone kawałki grasicy, połącz je w kolbie do hodowli komórek T25. Dodaj siedem mililitrów pożywki RPMI uzupełnionej antybiotykiem do kolby i delikatnie wstrząsnij, aby wymieszać.

Następnie umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli tkankowych. Ten krok zapobiega skażeniu bakteryjnemu tkanki. Rozpocznij izolację CD34-dodatnich HSC z wątroby płodu, używając dwóch skalpeli do pokrojenia wątroby na małe kawałki o długości około trzech milimetrów w naczyniu zawierającym IMDM.

Usuń i wyrzuć białą tkankę łączną. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 16, aby wyjąć kawałki wątroby i pożywkę i przenieść do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Delikatnie podnieś i wydal jeszcze pięć do siedmiu razy, aby całkowicie zhomogenizować tkankę.

Po przygotowaniu 10 mililitrów pożywki IMDM uzupełnij ją kolagenazą, hialuronidazą, antybiotykami, Dnazą i środkiem przeciwgrzybiczym. Przepuść media przez filtr 0,22 mikrona. Następnie dodać przefiltrowane podłoże do zawiesiny wątroby.

Po zamknięciu 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej zawiesinę wątroby, szczelnie uszczelnij folią samouszczelniającą, taką jak parafilm, aby zapobiec wyciekom. Obracaj w rotatorze probówek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po inkubacji przefiltruj strawioną zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 100 mikronów do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj PBS do zawiesiny, aby zwiększyć całkowitą objętość do 50 mililitrów. Podziel to na dwie 50-mililitrowe probówki, z których każda zawiera 25 mililitrów zawiesiny komórek. Spowolnienie i delikatne podłożenie komórek w każdej probówce 10 mililitrami pożywki wirowej o gęstości, takiej jak Ficoll.

Wirować 1200 razy g przez 20 minut bez przerwy. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij interfejs z każdej probówki i przenieś go do dwóch oddzielnych probówek o pojemności 50 mililitrów. Zwiększ objętość każdej rurki interfejsu do 50 mililitrów za pomocą PBS.

A następnie odwirować przy 300 razy g przez siedem do 10 minut. Połącz i umyj granulki komórek trzy razy z 50 mililitrami PBS zawierającymi dwa procent FBS, wirując z prędkością 300 razy g przez siedem do 10 minut za każdym razem. Po ostatnim wirowaniu ponownie zawieś granulkę w 50 mililitrach nośnika RPMI plus 10 procent FBS.

Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie natychmiast posortuj komórki dodatnie CD34 za pomocą zestawu do sortowania CD34 zgodnie z protokołem producenta i zapisz zarówno frakcję dodatnią, jak i ujemną CD34. Wlej kawałki grasicy i podłoże z kolby do naczynia o średnicy 60 milimetrów.

Schłodź niektóre końcówki do pipet wyporowych, umieszczając je w otwartych sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Umieść również na lodzie granulki komórek i objętość galaretowatej mieszanki białek, takiej jak matrigel. Znieczulić myszy biorcę środkiem znieczulającym do wstrzykiwań zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt.

Sprawdź poziom znieczulenia myszy, ściskając łapę. Brak reakcji na uszczypnięcie wskazuje na chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Ogol lewą stronę każdej myszy od biodra do ramienia między środkiem pleców a brzuchem.

Podskórnie wstrzyknąć sześć miligramów na kilogram rozcieńczonego karprofenu w ramię lub trójkąt pachwinowy zwierzęcia. Przepłucz kaniulę trokaru za pomocą PBS w naczyniu o średnicy 60 milimetrów. Za pomocą pary zakrzywionych kleszczy umieść kawałek grasicy z 60-milimetrowej szalki tuż w otworze kaniuli, a następnie pociągnij do tyłu trokar, aby zassać tkankę do kaniuli.

Następnie użyj pipety wyporowej i schłodzonej końcówki, aby dodać pięć mikrolitrów zimnej galaretowatej mieszanki białek do probówki z osadem komórkowym. I delikatnie wymieszaj, aby wytworzyć zawiesinę komórkową. Odpipetować zawiesinę komórek do otworu kaniuli i powoli pociągnąć za trokar, aby załadować igłę.

Przetrzyj ogolony obszar myszy jodem powidonu, a następnie trzykrotnie izopropenylem. Określ najciemniejsze miejsce pod skórą, które wskazuje lokalizację śledziony. Nerka znajduje się około pięciu milimetrów grzbietowo od śledziony.

Po zapewnieniu odpowiedniego poziomu znieczulenia przy braku reakcji uszczypnięcia łapy, użyj zakrzywionych kleszczy, aby podnieść skórę i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać 15-milimetrowe nacięcie w skórze równolegle do śledziony. Następnie wykonaj podobne cięcie w warstwie otrzewnej poniżej. U mężczyzn nerka jest łatwo widoczna, a więc wytłaczana po prostu przez naciśnięcie na brzuch.

Podeprzyj nerkę hemostatem lub parą zakrzywionych kleszczy. U kobiet jajniki mają tendencję do blokowania nerki przed łatwym usunięciem. Za pomocą hemostatu podnieś jajnik i ostrożnie odsłoń nerkę.

Użyj kleszczyków zakończonych igłą, aby wyrwać mały otwór na tylnym końcu torebki nerkowej. Wsuń trokar do tego otworu i wzdłuż nerki, aż otwór kaniuli zostanie całkowicie zakryty przez torebkę nerkową. Delikatnie wyciśnij tkankę pod torebkę nerkową i wyciągnij trokar z powrotem.

Użyj zakrzywionych kleszczy, aby upewnić się, że kawałek grasicy nie wyjdzie z powrotem z igłą. Następnie podnieś otrzewną za pomocą kleszczy i delikatnie użyj hemostatu, aby wepchnąć nerkę z powrotem na miejsce. Zawiąż jeden podwójnie zawiązany ścieg ze szwem chirurgicznym w otrzewnej.

Umieść również dwa klipsy Autoclips Wound, aby zamknąć skórę. Teraz wymieszaj transdukowane komórki CD34-dodatnie i odessaj 0,5 razy 10 do sześciu komórek w objętości 100 mikrolitrów do strzykawki insulinowej. Wstrzyknij te komórki myszy poprzez wstrzyknięcie żyły oczodołowej.

Po wstrzyknięciu należy nanieść niewielką kroplę smaru do oczu na każde oko i położyć mysz na boku z powrotem w klatce. Po wszczepieniu wszystkim myszom upewnij się, że zwierzęta odzyskały sumienność i są w stanie chodzić przed powrotem do pomieszczenia socjalnego. Myszy uśmiercono 10 tygodni po operacji i pobrano krew, śledzionę, grasicę i szpik kostny.

Powstałe komórki wybarwiono przeciwciałami anty-ludzkimi CD45 i anty-ludzkimi CD4 i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Jak widać tutaj, komórki zmodyfikowane receptorem chimerycznego antygenu CD4 można wykryć w wielu tkankach limfatycznych za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki zmodyfikowane receptorem chimerycznego antygenu CD4 mogą różnicować się w wiele linii.

Tutaj zebrano splenocyty z myszy zmodyfikowanych chimerycznym receptorem antygenowym CD4 i wybarwiono je pod kątem markerów limfocytów T i B. Komórki ujemne dla markerów limfocytów T i B były dodatnie dla markerów monocytów i makrofagów oraz dla komórek NK . Splenocyty z myszy z chimerycznym receptorem antygenowym CD4 zakażonych wirusem HIV stymulowano komórkami T one zakażonymi wirusem HIV lub niezakażonymi i wykazano ich wewnątrzkomórkową produkcję cytokin.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konstruować humanizowane myszy BLT zmodyfikowane chimerycznymi receptorami antygenowymi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 48 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o pracy w stałym tempie i zwracać szczególną uwagę na stan operowanej myszy.

Dla początkujących ważne jest, aby ćwiczyć chirurgię i zastrzyki do oczu przed rozpoczęciem pracy z tkankami i komórkami macierzystymi, które są cenniejsze. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się HIV i innymi chorobami zakaźnymi do badania patogenezy chorób i terapii immunologicznych w humanizowanym modelu myszy.