Selektywne znakowanie białek powierzchniowych komórek przy użyciu barwników CyDye DIGE Fluor Minimal

Mam na imię Maria i pracuję w Y Healthcare w NOS w Szwecji. Białka powierzchniowe komórek są często zaangażowane w komunikację między komórkami a ich środowiskiem i dlatego są szczególnie interesujące w badaniach, mających na celu uzyskanie lepszego wglądu w choroby, a także inne zmiany biologiczne wywołane zmianami w środowisku komórkowym. W tym filmie pokażę Ci prosty protokół znakowania powierzchni komórek z bocznym okiem, dzięki któremu będziesz w stanie wizualnie wzbogacić te nisko obfite białka bez fizycznego ulepszania i badać różnice między tymi białkami na powierzchni komórki za pomocą tej technologii.

Jeśli uważasz, że ta technologia jest interesująca, możesz znaleźć więcej informacji w podręczniku 2D. Co więcej, mamy notę aplikacyjną na ten konkretny temat, którą można pobrać z oferty pracy W protokole etykietowania powierzchni komórki widocznym na górze, oznaczasz komórki, gdy są jeszcze nienaruszone. Podczas procesu znakowania barwnik będzie miał dostęp tylko do białek powierzchniowych komórki.

Po etapie etykietowania komórki są analizowane w celu zweryfikowania etykietowania specyficznego dla powierzchni komórki. Próbka znakowana została podzielona na białka błonowe i cytozolowe. Równolegle przygotowano próbkę niefrakcjonowaną.

Dla porównania, ta analiza frakcjonowania nie jest konieczna, ale została przeprowadzona tutaj tylko po to, aby pokazać, że protokół powierzchni komórki jest specyficzny dla profesjonalnych końcówek dotyczących powierzchni komórek. Przeprowadziliśmy również standardowy protokół znakowania ETH bez diety, który widać poniżej, komórki są kłamstwami przed znakowaniem, w ten sposób wszystkie białka komórkowe są dostępne do znakowania. Po etapie etykietowania próbki poddawane są elektroforezie 2D.

Przylegające komórki są odłączane przy użyciu procedury nieenzymatycznej, aby uniknąć trawienia docelowych białek powierzchniowych komórki. W tym protokole używamy gumowego policjanta, ale użycie enzymu trzy media dysocjacyjne komórek jest również opcją liczenia i dzielenia zawiesin komórkowych na quas od pięciu do 10 milionów komórek na probówkę. Komórki są następnie granulowane i myte w H-P-S-S-P-H 7,4 w celu usunięcia śladów hodowli komórkowej.

Zanieczyszczenie podłoża białkami surowicy i składnikami fluorescencyjnymi może zakłócać znakowanie i wykrywanie. Komórki rosnące w zawiesinie są bezpośrednio granulowane i myte przed etapem etykietowania po myciu. Paleta komórek jest ponownie zawieszana w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do znakowania zawierającego HPSS pH 8,5 i jeden molowy mocz.

Aby uzyskać optymalne warunki znakowania białek na powierzchni komórki, zawsze sprawdzaj pH. Przed etykietowaniem użyliśmy 600 bocznych oczu formy na 10 milionów komórek CHO. Optymalny stosunek oka bocznego do liczby komórek będzie się różnić w zależności od typu komórki.

Ponieważ nie znamy dokładnych stężeń białek na powierzchni komórki. Sposób określenia optymalnych warunków znakowania białek oczami bocznymi opisano w podręczniku zasad i metod elektroforezy 2D. Komórki są inkubowane z bocznym okiem D, minimalną kostką do kostki przez 20 minut na lodzie w ciemności.

Po reakcji znakowania niereaktywny barwnik jest gaszony przez dodanie 20 mikrolitrów 10-milimolowej lizyny. Komórki etykiety są teraz dwukrotnie myte w zimnym buforze HPSS pH 7,4 w celu usunięcia nadmiaru bocznego oka. W związku z tym nie będzie już wolnego barwnika do niepożądanego znakowania wewnątrzkomórkowego lub białek w następnym etapie, którym jest liza komórek.

Białka na powierzchni komórki są teraz znakowane, a komórki są myte i gotowe do krojenia. Osad z utraconego etapu płukania jest ponownie zawieszany w 150 mikrolitrowym buforze do lizy na zimno zawierającym siedem molowych moczu, dwa molowe mocz, 4% chapy 30 milimolowych drzew pięciomilimolowy octan magnezu pH 8,5 i pozostawiany na lodzie na co najmniej godzinę z okazjonalnym wirowaniem taktowania. Próbki są teraz gotowe do separacji 2D.

Pierwszym krokiem do elektrolizy jest przygotowanie pasków IPD do ponownego nawodnienia. Przygotować miejscowy roztwór do nawadniania, dodając bufor IPG odpowiadający przedziałowi pH użytych pasków, a następnie dodać roztwór do soczewki tacki do nawadniania. Usuń folię ochronną z paska IPG i ostrożnie umieść paski z wysuszonym żelem skierowanym w dół na tacce nawadniającej zawierającej roztwór nawadniający.

Zamknij pokrywę pudełka IPG i nawodnij paski przez noc. W pierwszym wymiarze, ogniskowaniu izoelektrycznym, białka są rozdzielane zgodnie z ich liczbą pi. Odbywa się to za pomocą IPG cztery trzy.

Uwodnione paski umieszcza się w kolektorze, a elektrodę montuje się na górze. Nanoszono 50 mikrogramów z każdej próbki za pomocą nasadek do aplikacji próbki. Albo bezpośrednio zastosowaliśmy próbki niefrakcjonowane bez wcześniejszego frakcjonowania, albo frakcjonowaliśmy próbki na frakcje błonowe i cytozolowe przed ich zastosowaniem.

Przewód jest zamknięty w celu ochrony próbek fluorescencyjnych przed światłem. Przyrząd został zaprogramowany zgodnie z zaleceniami i uruchomiony w nocy. Duże żele 12% lamby kosztowały przy użyciu żelu dla dorosłych 12.

Dodano roztwór wypierający Costera, aby uniknąć polimeryzowanych żeli acry w rurkach. Żele pozostawiono do polimeryzacji przez noc w temperaturze pokojowej przed użyciem. Po ogniskowaniu izoelektrycznym paski są usuwane i równoważone w buforze zawierającym SDS w dwóch etapach przy użyciu DTT w celu redukcji wiązań siarczkowych di reszt cysteiny, a następnie alkilowania acetamidem, aby uniknąć modyfikacji przez akrylamid.

Paski IPG są zanurzane w buforze roboczym i ostrożnie umieszczane na dużych żelach z dwoma kopnięciami. Unikaj zatrzymywania powietrza między paskami a uszczelnionym żelem, dodając stopiony 2% roztwór agro z błękitem bromo-anol na wierzchu. Żele są teraz gotowe do separacji stron SDS w drugim wymiarze Na stronie SDS w drugim wymiarze.

Białka zostaną rozdzielone według masy cząsteczkowej i odbywa się to za pomocą systemu tonal six. Napełnij komorę elektroforezy anodowym buforem roboczym, włóż żele i napełnij górną komorę katodowym programem buforowym. Zasilanie zgodnie z zaleceniami i uruchomić drugi wymiar chroniony przed światłem przez około cztery do pięciu godzin lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dna żelu.

Po elektroforezie drugiego wymiaru, kasety żelowe są umieszczane za pomocą chwytaków w obrazie fluorescencyjnym tajfunu. Dwa żele i trzy kanały mogą być skanowane jednocześnie. Wynik z tych dwóch DL pokazuje wysoką rozdzielczość białek błonowych w próbce, nawet jeśli istnieją pewne znane ograniczenia dotyczące wykrywania białek hydrofobowych w A dwóch DL. Wyniki pokazują wiele nowych plamek etykiet na powierzchni komórek pokazanych tutaj na czerwono, które nie są wykrywane przy użyciu standardowego protokołu znakowania pokazanego tutaj na zielono.

Wyniki te pokazują, że protokół znakowania powierzchni komórki jest wysoce specyficzny dla znakowania białek na powierzchni komórki. Ponieważ białka powierzchniowe komórek są znakowane wyłącznie, łatwiej je uwidocznić i unika się tłumienia przez obfite białka cytozolowe. Obraz fluorescencyjny żeli z niefrakcjonowaną frakcją błonową lub frakcją cytozolową jest pokazany na górze.

Poniżej znajduje się zdjęcie tej samej żelowej bejcy po słupku ze srebrem. Wyniki nie wykazują znakowania fluorescencyjnego białek cytozolowych, ale barwienie srebrem pokazuje, że w żelach znajdują się białka. Wyniki pokazują również podobne wzorce map punktowych z frakcji niefrakcjonowanych i membranowych, co pokazuje, że nie ma potrzeby frakcjonowania przed elektroforezą 2D, co sprawia, że protokół ten jest zarówno prosty, jak i wygodny.

SI dwa, SI trzy i SCI pięć wykazują podobne wzorce etykietowania i wszystkie są kompatybilne z protokołem powierzchni komórek. Eksperyment dietetyczny przeprowadzono przy użyciu wszystkich trzech bocznych komórek DI floor minimal dy w celu zbadania zróżnicowanej ekspresji białek powierzchniowych komórek w komórkach CHO głodu surowicy przez różny okres czasu. CY dwie próbki powierzchni komórek ze wszystkich próbek w eksperymencie zostały połączone i użyte jako wzorzec wewnętrzny.

Zróżnicowane zmiany kilku białek powierzchniowych komórek można było obserwować w okresie głodu. Za pomocą protokołu powierzchni komórki wykryto ponad 18 nowych białek błonowych, które nie zostały wykryte za pomocą standardowego protokołu znajdowania tożsamości białek w żelu preparatywnym. Konieczne było nakłucie próbki z powierzchni komórki, aby ułatwić dopasowanie z powrotem do plam w zestawie danych analitycznych.

To jest tego efekt. Wyniki wskazują na wysoką rozdzielczość dużej liczby białek powierzchniowych komórek. Protokół ten jest bardzo specyficzny dla białek powierzchniowych komórek i nie zaobserwowano znakowania białek wewnątrzkomórkowych.

Dzięki tej metodzie jesteś w stanie wykryć więcej białka na powierzchni komórki w porównaniu ze standardowym protokołem, a jak już zauważyłeś, jest to bardzo prosty protokół do uruchomienia. Po prostu oznaczasz białka na powierzchni komórki, gdy są jeszcze nienaruszone, i uruchamiasz je bezpośrednio w elektroforezie 2D bez frakcjonowania błonowego. Jest to więc bardzo dobry protokół do badania białek powierzchniowych komórek i różnic między tymi z technologią D.