Name: Selektywne znakowanie białek powierzchniowych komórek przy użyciu barwników CyDye DIGE Fluor Minimal (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania białek powierzchniowych komórek za pomocą barwników CyDye DIGE Fluor Minimal. Technika ta umożliwia wykrywanie rzadkich białek bez frakcjonowania przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy profesorowi Dontscho Kerjaschki, Corinie Mayrhofer oraz Sigurdowi Kriegerowi z Instytutu Patologii Klinicznej Uniwersytetu Wiedeńskiego w Austrii za współpracę.

Hodowla komórkowa
<ol>
<li>Hodować komórki jajnika chomika chińskiego (CHO-K1) przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowej w pożywce F-12 Ham z GlutaMAX I zawierającej 10% płodowego surowicy cielęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 µg/ml siarczanu streptomycyny (Invitrogen).</li>
<li>Wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę bezsurowiczą. Znakować białka powierzchni komórkowych w różnych punktach czasowych za pomocą minimalnych barwników CyDye DIGE Fluor Cy3 lub Cy5 (patrz sekcja Znakowanie powierzchni komórkowej poniżej).</li>
<li>Połączyć równe liczby komórek z każdego punktu czasowego i znakować za pomocą CyDye DIGE Fluor Cy2. Wykorzystać&nbsp;je jako standard wewnętrzny dla każdego żelu 2-D.</li>
<li>Większość eksperymentów można przeprowadzić z komórkami CHO-K1, ale można również zastosować fibroblasty zarodkowe myszy (3T3 L1) oraz limfoblasty chłoniaka wodniczakowego myszy (EL4) (dane nie zostały przedstawione).</li>
<li>Hodować dwa ostatnie typy komórek w pożywce DMEM z GlutaMAX II, natomiast w pozostałych kwestiach stosować&nbsp;warunki identyczne z tymi zastosowanymi dla komórek CHO-K1.</li>
</ol>
Znakowanie powierzchni komórek
<ol>
<li>Ostrożnie oddziel adherentne komórki metodą nieenzymatyczną, policz je i podziel na alikwoty po 5–10 x106 komórek. W przypadku komórek rosnących w zawiesinie pomiń etap oddzielania.</li>
<li>Odwirowuj zawiesiny komórkowe przy ok. 800 x g przez 5 minut. Usuń&nbsp;nadnadłoża zawierające pożywkę.</li>
<li>Przemyj osady poprzez resuspensję w 1 ml lodowatego zrównoważonego roztworu soli Hank’a (HBSS) o pH 8.5.&nbsp;Odwirowuj przy 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.</li>
<li>Usuń&nbsp;nadnadłoż i resuspenduj osad komórkowy w 200 µl lodowatego buforu do znakowania (HBSS pH 8.5, 1 M mocznika).</li>
<li>Znakuj nienaruszone komórki przy użyciu 600 pmol barwników CyDye DIGE Fluor minimal przez 20 minut na lodzie w ciemności.</li>
<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 20 µl 10 mM lizyny. Inkubuj przez 10 minut.</li>
<li>Przemyj komórki znakowane powierzchniowo dwukrotnie poprzez resuspensję w 500 µl HBSS pH 7.4,&nbsp;a następnie odwirowuj przy 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.</li>
</ol>
Lizja i frakcjonowanie komórek
<ol>
<li>Zlizuj komórki z oznakowaną powierzchnią w 150 μl zimnego buforu do lizy (7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM octanu magnezu pH 8,5). Pozostaw w lodzie przez co najmniej 1 h, sporadycznie mieszając na wirówce typu vortex.</li>
<li>Odwiruj lizaty przy 10 000 x g w temperaturze 4°C przez 5 minut. Przenieś&nbsp;nadjad do nowej probówki. Próbka ta jest próbką niefrakcjonowaną, zawierającą wszystkie białka komórkowe.</li>
<li>Równolegle przemyj&nbsp;osady komórkowe, jak opisano powyżej, a następnie poddaj frakcjonowaniu (używając zestawu do frakcjonowania błonowego, Pierce) na frakcję błonową i cytozolową przed elektroforezą żelową 2-D. Frakcja błonowa zawiera białka błon wewnętrznych i powierzchniowych komórki.</li>
<li>W celu porównania zastosuj standardową procedurę Ettan DIGE 3: zlizuj, oznakuj, a na koniec poddaj komórki frakcjonowaniu. Określ stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu 2- D Quant Kit (GE Healthcare).</li>
</ol>
Elektroforeza 2-D
<ol>
<li>Rehydratyzuj żele Immobiline DryStrip, pH 3–11NL (24 cm), używając kuwety do rehydratyzacji Immobiline DryStrip Reswelling tray, 24 cm, w 450 µl roztworu DeStreak Rehydration solution (0,5% IPG Buffer) przez noc.</li>
<li>Nanieś próbki znakowane CyDye (odpowiadające 50 µg całkowitego białka) na żele Immobiline DryStrip poprzez ładowanie do kubeczków anodowych w kolektorze i przeprowadź skupianie izoelektryczne (IEF) za pomocą systemu Ettan IPGphor II IEF System zgodnie z instrukcją.</li>
<li>Po IEF zrównoważ paski w dwóch krokach i umieść je na powierzchni dużych (26 x 20 cm) żeli poliakrylamidowych 12,5% (SDS-PAGE). Przykryj warstwą 0,5% agarozy (w buforze do elektroforezy zawierającym błękit bromofenolowy). Przeprowadź elektroforezę 2-D przy użyciu systemu Ettan DALTtwelve Large Vertical System przy 5 W/żel przez 30 min, a następnie przy 15 W/żel, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.</li>
</ol>
Obrazowanie i analiza danych
<ol>
<li>Po zakończeniu elektroforezy 2-D przeskanuj żele pod kątem obecności Cy2, Cy3 lub Cy5, używając obrazownika Typhoon 9410 Variable Mode Imager.</li>
<li>Porównaj mapy plamek&nbsp;z frakcji błonowych, frakcji cytozolowych oraz próbek niefrakcjonowanych, korzystając z oprogramowania DeCyder 2-D Differential Analysis Software 4.</li>
</ol>
Barwienie po elektroforezie
<ol>
<li>Po obrazowaniu poddaj żele barwieniu srebrem zgodnie ze standardową procedurą 5.</li>
</ol>
Identyfikacja białek
<ol>
<li>Hodować, zebrać, przemyć i poddać lizie preparatywne ilości komórek (około 1 mg białka całkowitego z 10 x106 komórek CHO), zgodnie z opisem powyżej dla próbki niefrakcjonowanej. Użyć&nbsp;próbki z oznakowanymi białkami powierzchniowymi Cy5 (patrz powyżej) jako standardu wewnętrznego (spike) i nanieść ją wraz z nieoznakowanymi preparatywnymi ilościami białka.</li>
<li>Przeprowadzić elektroforezę 2-D zgodnie z opisem powyżej, jednak tym razem nanieść 600 µg nieoznakowanego lizatu komórkowego wraz z 50 µg oznakowanego standardu białek powierzchniowych za pomocą aplikacji w kubku anodowym. Użyć markerów referencyjnych w celu umożliwienia prawidłowego wycinania plamek, umieszczając je pomiędzy szklanymi płytkami przed odlewaniem żelu zgodnie z zaleceniami 3.</li>
<li>Zeskanować żel w kanale Cy5, aby uzyskać mapę plamek białek powierzchniowych Cy5, a następnie przeprowadzić barwienie białek całkowitych przy użyciu barwnika do białek całkowitych Deep purple 3.</li>
<li>Zestawić obie mapy plamek za pomocą oprogramowania DeCyder 2-D i stworzyć listę wycinania dla wszystkich plamek odpowiadających oznakowanym Cy5 białkom powierzchniowym. Wyciąć białka powierzchniowe za pomocą stacji obsługi plamek Ettan, wyekstrahować je z fragmentów żelu i poddać trawieniu trypsyną w digesterze Ettan. Zidentyfikować białka za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.</li>
</ol>

Tabela 1. Przeprowadzono eksperyment Ettan DIGE z wykorzystaniem próbek z komórek z głodzenia seryjnego, znakowanych zgodnie z protokołem znakowania białek powierzchniowych komórek przedstawionym na rysunku 1.

<table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody >
<tr >
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Próbka</td>
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Czas deplecji serum</td>
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Znakowanie CyDye</td>
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Numer żelu&nbsp;</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">1</td>
<td style="text-align:center;">-</td>
<td style="text-align:center;">Cy 3, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">1</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">2</td>
<td style="text-align:center;">30 minut</td>
<td style="text-align:center;">Cy 5, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">1</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">3</td>
<td style="text-align:center;">2 godziny</td>
<td style="text-align:center;">Cy 3, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">2</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">4</td>
<td style="text-align:center;">4 godziny</td>
<td style="text-align:center;">Cy 5, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">2</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">5</td>
<td style="text-align:center;">16 godzin</td>
<td style="text-align:center;">Cy 5, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">3</td>
</tr >
</tbody >
</table >

&nbsp;

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

Stężenie białka
Przegląd dwóch schematów znakowania przedstawiono na Rysunku 1. Ponieważ komórki pozostają nienaruszone podczas znakowania zgodnie z protokołem znakowania białek powierzchniowych, barwnik ma dostęp jedynie do białek powierzchni komórki. W standardowym protokole Ettan DIGE komórki są lizowane przed znakowaniem, przez co znakowane są białka zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki (Rys 1). Względna ilość barwnika w stosunku do białka w protokole znakowania białek powierzchniowyc...

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>Bufor IPG pH 3-11NL</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>Narzędzie</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw IPGbox</td><td>Narzędzie</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór rehydratacyjny DeStreak</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do pokrywania Immobiline DryStrip</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie IEF Ettan IPGphor 3</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz Ettan IPGphor</td><td>Komponent instrumentu</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Odlewarka żeli Ettan DALTtwelve</td><td>Narzędzie</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie rozdzielcze i zasilacz/jednostka sterująca Ettan DALTtwelve</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>Urządzenie 230 V: 80-6466-27</td></tr><tr><td>Skaner obrazujący Typhoon 9410 Variable Mode</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spot Picker</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Digester</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spotter</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy różnicowej 2-D DeCyder</td><td>Inne</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne ImageQuant</td><td>Inne</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ditiotreitol (DTT)</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylsiarczan sodu (SDS)</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne glicerol 87%</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne TEMED</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne wersenian amonu</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne glicyna</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>2-D Sample Prep dla białek błonowych</td><td>Odczynnik</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych cydye dige fluor

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Białka powierzchniowe są kluczowe dla zdolności komórki do reagowania na otoczenie oraz do oddziaływania z sąsiednimi komórkami. Wiadomo, że indukują one niemal wszystkie sygnały wewnątrzkomórkowe. Ponadto odgrywają istotną rolę w adaptacji do środowiska i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, a często są zaangażowane w patogenezę i patologię chorób (1). Oddziaływania białko-białko są immanentną cechą szlaków sygnałowych, a aby uzyskać głębszy wgląd w te złożone procesy biologiczne, niezbędne są czułe i niezawodne metody badania białek powierzchniowych komórek. Elektroforeza dwuwymiarowa (2-D) jest szeroko stosowana do detekcji biomarkerów i innych celów w złożonych próbkach białek w celu badania zmian różnicowych. Białka powierzchniowe komórek, częściowo ze względu na ich niską zawartość (1–2% białek komórkowych), są trudne do wykrycia w żelu 2-D bez frakcjonowania lub innego rodzaju wzbogacania. Ze względu na ich hydrofobową naturę i wysoką masę cząsteczkową są one również często słabo reprezentowane w żelach 2-D (2). W niniejszym badaniu przedstawiamy nowy protokół dla całych komórek, wykorzystujący minimalne barwniki CyDye DIGE Fluor do specyficznego znakowania i detekcji tej ważnej grupy białek. Wyniki wykazały specyficzne znakowanie licznych białek powierzchniowych komórek przy minimalnym znakowaniu białek wewnątrzkomórkowych. Protokół ten jest szybki, prosty w użyciu, a wszystkie trzy minimalne barwniki CyDye DIGE Fluor (Cy2, Cy3 i Cy5) mogą być stosowane do znakowania białek powierzchniowych komórek. Cechy te umożliwiają multipleksowanie z wykorzystaniem dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej z fluorescencją (2-D DIGE) przy użyciu technologii Ettan DIGE oraz analizę zmian w ekspresji białek za pomocą oprogramowania DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Poziom białek powierzchniowych komórek monitorowano podczas deprywacji surowicy w komórkach CHO przez różne okresy czasu (patrz. Tabela 1). Niewielkie zmiany w zawartości białek wykryto z wysoką dokładnością, a wyniki zostały potwierdzone określonymi metodami statystycznymi.

Zaprezentowano prostą i specyficzną metodę fluorescencyjnego znakowania oraz zwiększonej detekcji białek powierzchniowych komórek bez konieczności przeprowadzenia etapu frakcjonowania. Różnice w zawartości białek powierzchniowych komórek analizowano przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej (2-D) oraz technologii Ettan™ DIGE.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Białka powierzchniowe są kluczowe dla zdolności komórki do reagowania na środowisko oraz do oddziaływania z sąsiednimi komórkami. Wiadomo, że są one induktorami...

Nazywam się Maria i pracuję w Y Healthcare w NOS w Szwecji. Białka powierzchni komórkowych często uczestniczą w komunikacji między komórkami a ich otoczeniem, dlatego stanowią one szczególne zainteresowanie badaczy dążących do lepszego zrozumienia chorób, jak i innych wariancji biologicznych wywołanych zmianami w środowisku komórkowym. W tym filmie zaprezentuję prosty protokół znakowania białek powierzchni komórkowych metodą „side-eye dodge”, dzięki któremu będziecie mogli wizualnie wzbogacić te białka o niskiej liczebności bez konieczności wzmacniania fizycznego oraz badać różnice między tymi białkami powierzchni komórkowych przy użyciu tej technologii.Jeśli ta technologia wydaje się interesująca, więcej informacji można znaleźć w podręczniku 2D. Ponadto przygotowaliśmy notatkę aplikacyjną dotyczącą tego konkretnego zagadnienia, którą można pobrać z job. W przedstawionym powyżej protokole znakowania powierzchni komórek znakowanie odbywa się, gdy komórki są jeszcze nienaruszone. Podczas procesu znakowania barwnik będzie miał dostęp wyłącznie do białek powierzchniowych komórek.Po etapie znakowania analizowane są komórki w celu weryfikacji specyficzności znakowania powierzchni komórk

selective-labelling-cell-surface-proteins-using-cydye-dige-fluor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wszechstronne znakowanie białek powierzchni komórkowych przy użyciu minimalnych barwników CyDye DIGE Fluor

CFSE kowalencyjnie znakuje długożyjące cząsteczki wewnątrzkomórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, karboksyfluoresceiną. W związku z tym, gdy komórka znakowana CFSE dzieli się, jej potomstwo posiada połowę ilości fluorescencji, co może być wykorzystane do oceny podziałów komórkowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury zazwyczaj stosowane do znakowania limfocytów mysich przy użyciu CFSE.

Zastosowanie estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Obrazowanie żywych komórek krwi oznaczonych krwinek w krążeniu ocznym może dostarczyć informacji o stanie zapalnym i niedokrwieniu w retinopatii cukrzycowej oraz zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Opisano protokół oznaczania komórek krwi i obrazowania znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym.

Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania białek powierzchniowych komórek za pomocą barwników CyDye DIGE Fluor Minimal. Technika ta umożliwia wykrywanie rzadkich białek bez frakcjonowania przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Przeglądaj więcej filmów