Name: Selektywne znakowanie białek powierzchniowych komórek przy użyciu barwników CyDye DIGE Fluor Minimal (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania białek powierzchniowych komórek za pomocą barwników CyDye DIGE Fluor Minimal. Technika ta umożliwia wykrywanie rzadkich białek bez frakcjonowania przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy profesorowi Dontscho Kerjaschki, Corinie Mayrhofer oraz Sigurdowi Kriegerowi z Instytutu Patologii Klinicznej Uniwersytetu Wiedeńskiego w Austrii za współpracę.

Hodowla komórkowa
<ol>
<li>Hodować komórki jajnika chomika chińskiego (CHO-K1) przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowej w pożywce F-12 Ham z GlutaMAX I zawierającej 10% płodowego surowicy cielęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 µg/ml siarczanu streptomycyny (Invitrogen).</li>
<li>Wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę bezsurowiczą. Znakować białka powierzchni komórkowych w różnych punktach czasowych za pomocą minimalnych barwników CyDye DIGE Fluor Cy3 lub Cy5 (patrz sekcja Znakowanie powierzchni komórkowej poniżej).</li>
<li>Połączyć równe liczby komórek z każdego punktu czasowego i znakować za pomocą CyDye DIGE Fluor Cy2. Wykorzystać&nbsp;je jako standard wewnętrzny dla każdego żelu 2-D.</li>
<li>Większość eksperymentów można przeprowadzić z komórkami CHO-K1, ale można również zastosować fibroblasty zarodkowe myszy (3T3 L1) oraz limfoblasty chłoniaka wodniczakowego myszy (EL4) (dane nie zostały przedstawione).</li>
<li>Hodować dwa ostatnie typy komórek w pożywce DMEM z GlutaMAX II, natomiast w pozostałych kwestiach stosować&nbsp;warunki identyczne z tymi zastosowanymi dla komórek CHO-K1.</li>
</ol>
Znakowanie powierzchni komórek
<ol>
<li>Ostrożnie oddziel adherentne komórki metodą nieenzymatyczną, policz je i podziel na alikwoty po 5–10 x106 komórek. W przypadku komórek rosnących w zawiesinie pomiń etap oddzielania.</li>
<li>Odwirowuj zawiesiny komórkowe przy ok. 800 x g przez 5 minut. Usuń&nbsp;nadnadłoża zawierające pożywkę.</li>
<li>Przemyj osady poprzez resuspensję w 1 ml lodowatego zrównoważonego roztworu soli Hank’a (HBSS) o pH 8.5.&nbsp;Odwirowuj przy 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.</li>
<li>Usuń&nbsp;nadnadłoż i resuspenduj osad komórkowy w 200 µl lodowatego buforu do znakowania (HBSS pH 8.5, 1 M mocznika).</li>
<li>Znakuj nienaruszone komórki przy użyciu 600 pmol barwników CyDye DIGE Fluor minimal przez 20 minut na lodzie w ciemności.</li>
<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 20 µl 10 mM lizyny. Inkubuj przez 10 minut.</li>
<li>Przemyj komórki znakowane powierzchniowo dwukrotnie poprzez resuspensję w 500 µl HBSS pH 7.4,&nbsp;a następnie odwirowuj przy 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.</li>
</ol>
Lizja i frakcjonowanie komórek
<ol>
<li>Zlizuj komórki z oznakowaną powierzchnią w 150 μl zimnego buforu do lizy (7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM octanu magnezu pH 8,5). Pozostaw w lodzie przez co najmniej 1 h, sporadycznie mieszając na wirówce typu vortex.</li>
<li>Odwiruj lizaty przy 10 000 x g w temperaturze 4°C przez 5 minut. Przenieś&nbsp;nadjad do nowej probówki. Próbka ta jest próbką niefrakcjonowaną, zawierającą wszystkie białka komórkowe.</li>
<li>Równolegle przemyj&nbsp;osady komórkowe, jak opisano powyżej, a następnie poddaj frakcjonowaniu (używając zestawu do frakcjonowania błonowego, Pierce) na frakcję błonową i cytozolową przed elektroforezą żelową 2-D. Frakcja błonowa zawiera białka błon wewnętrznych i powierzchniowych komórki.</li>
<li>W celu porównania zastosuj standardową procedurę Ettan DIGE 3: zlizuj, oznakuj, a na koniec poddaj komórki frakcjonowaniu. Określ stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu 2- D Quant Kit (GE Healthcare).</li>
</ol>
Elektroforeza 2-D
<ol>
<li>Rehydratyzuj żele Immobiline DryStrip, pH 3–11NL (24 cm), używając kuwety do rehydratyzacji Immobiline DryStrip Reswelling tray, 24 cm, w 450 µl roztworu DeStreak Rehydration solution (0,5% IPG Buffer) przez noc.</li>
<li>Nanieś próbki znakowane CyDye (odpowiadające 50 µg całkowitego białka) na żele Immobiline DryStrip poprzez ładowanie do kubeczków anodowych w kolektorze i przeprowadź skupianie izoelektryczne (IEF) za pomocą systemu Ettan IPGphor II IEF System zgodnie z instrukcją.</li>
<li>Po IEF zrównoważ paski w dwóch krokach i umieść je na powierzchni dużych (26 x 20 cm) żeli poliakrylamidowych 12,5% (SDS-PAGE). Przykryj warstwą 0,5% agarozy (w buforze do elektroforezy zawierającym błękit bromofenolowy). Przeprowadź elektroforezę 2-D przy użyciu systemu Ettan DALTtwelve Large Vertical System przy 5 W/żel przez 30 min, a następnie przy 15 W/żel, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.</li>
</ol>
Obrazowanie i analiza danych
<ol>
<li>Po zakończeniu elektroforezy 2-D przeskanuj żele pod kątem obecności Cy2, Cy3 lub Cy5, używając obrazownika Typhoon 9410 Variable Mode Imager.</li>
<li>Porównaj mapy plamek&nbsp;z frakcji błonowych, frakcji cytozolowych oraz próbek niefrakcjonowanych, korzystając z oprogramowania DeCyder 2-D Differential Analysis Software 4.</li>
</ol>
Barwienie po elektroforezie
<ol>
<li>Po obrazowaniu poddaj żele barwieniu srebrem zgodnie ze standardową procedurą 5.</li>
</ol>
Identyfikacja białek
<ol>
<li>Hodować, zebrać, przemyć i poddać lizie preparatywne ilości komórek (około 1 mg białka całkowitego z 10 x106 komórek CHO), zgodnie z opisem powyżej dla próbki niefrakcjonowanej. Użyć&nbsp;próbki z oznakowanymi białkami powierzchniowymi Cy5 (patrz powyżej) jako standardu wewnętrznego (spike) i nanieść ją wraz z nieoznakowanymi preparatywnymi ilościami białka.</li>
<li>Przeprowadzić elektroforezę 2-D zgodnie z opisem powyżej, jednak tym razem nanieść 600 µg nieoznakowanego lizatu komórkowego wraz z 50 µg oznakowanego standardu białek powierzchniowych za pomocą aplikacji w kubku anodowym. Użyć markerów referencyjnych w celu umożliwienia prawidłowego wycinania plamek, umieszczając je pomiędzy szklanymi płytkami przed odlewaniem żelu zgodnie z zaleceniami 3.</li>
<li>Zeskanować żel w kanale Cy5, aby uzyskać mapę plamek białek powierzchniowych Cy5, a następnie przeprowadzić barwienie białek całkowitych przy użyciu barwnika do białek całkowitych Deep purple 3.</li>
<li>Zestawić obie mapy plamek za pomocą oprogramowania DeCyder 2-D i stworzyć listę wycinania dla wszystkich plamek odpowiadających oznakowanym Cy5 białkom powierzchniowym. Wyciąć białka powierzchniowe za pomocą stacji obsługi plamek Ettan, wyekstrahować je z fragmentów żelu i poddać trawieniu trypsyną w digesterze Ettan. Zidentyfikować białka za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.</li>
</ol>

Tabela 1. Przeprowadzono eksperyment Ettan DIGE z wykorzystaniem próbek z komórek z głodzenia seryjnego, znakowanych zgodnie z protokołem znakowania białek powierzchniowych komórek przedstawionym na rysunku 1.

<table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody >
<tr >
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Próbka</td>
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Czas deplecji serum</td>
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Znakowanie CyDye</td>
<td style="text-align:center; font-weight:bold">Numer żelu&nbsp;</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">1</td>
<td style="text-align:center;">-</td>
<td style="text-align:center;">Cy 3, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">1</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">2</td>
<td style="text-align:center;">30 minut</td>
<td style="text-align:center;">Cy 5, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">1</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">3</td>
<td style="text-align:center;">2 godziny</td>
<td style="text-align:center;">Cy 3, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">2</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">4</td>
<td style="text-align:center;">4 godziny</td>
<td style="text-align:center;">Cy 5, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">2</td>
</tr >
<tr >
<td style="text-align:center;">5</td>
<td style="text-align:center;">16 godzin</td>
<td style="text-align:center;">Cy 5, Cy 2</td>
<td style="text-align:center;">3</td>
</tr >
</tbody >
</table >

&nbsp;

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

Stężenie białka
Przegląd dwóch schematów znakowania przedstawiono na Rysunku 1. Ponieważ komórki pozostają nienaruszone podczas znakowania zgodnie z protokołem znakowania białek powierzchniowych, barwnik ma dostęp jedynie do białek powierzchni komórki. W standardowym protokole Ettan DIGE komórki są lizowane przed znakowaniem, przez co znakowane są białka zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki (Rys 1). Względna ilość barwnika w stosunku do białka w protokole znakowania białek powierzchniowyc...

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>Bufor IPG pH 3-11NL</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>Narzędzie</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw IPGbox</td><td>Narzędzie</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór rehydratacyjny DeStreak</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do pokrywania Immobiline DryStrip</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie IEF Ettan IPGphor 3</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz Ettan IPGphor</td><td>Komponent instrumentu</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Odlewarka żeli Ettan DALTtwelve</td><td>Narzędzie</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie rozdzielcze i zasilacz/jednostka sterująca Ettan DALTtwelve</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>Urządzenie 230 V: 80-6466-27</td></tr><tr><td>Skaner obrazujący Typhoon 9410 Variable Mode</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spot Picker</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Digester</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spotter</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy różnicowej 2-D DeCyder</td><td>Inne</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne ImageQuant</td><td>Inne</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ditiotreitol (DTT)</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylsiarczan sodu (SDS)</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne glicerol 87%</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne TEMED</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne wersenian amonu</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne glicyna</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>2-D Sample Prep dla białek błonowych</td><td>Odczynnik</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych cydye dige fluor

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Białka powierzchniowe są kluczowe dla zdolności komórki do reagowania na otoczenie oraz do oddziaływania z sąsiednimi komórkami. Wiadomo, że indukują one niemal wszystkie sygnały wewnątrzkomórkowe. Ponadto odgrywają istotną rolę w adaptacji do środowiska i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, a często są zaangażowane w patogenezę i patologię chorób (1). Oddziaływania białko-białko są immanentną cechą szlaków sygnałowych, a aby uzyskać głębszy wgląd w te złożone procesy biologiczne, niezbędne są czułe i niezawodne metody badania białek powierzchniowych komórek. Elektroforeza dwuwymiarowa (2-D) jest szeroko stosowana do detekcji biomarkerów i innych celów w złożonych próbkach białek w celu badania zmian różnicowych. Białka powierzchniowe komórek, częściowo ze względu na ich niską zawartość (1–2% białek komórkowych), są trudne do wykrycia w żelu 2-D bez frakcjonowania lub innego rodzaju wzbogacania. Ze względu na ich hydrofobową naturę i wysoką masę cząsteczkową są one również często słabo reprezentowane w żelach 2-D (2). W niniejszym badaniu przedstawiamy nowy protokół dla całych komórek, wykorzystujący minimalne barwniki CyDye DIGE Fluor do specyficznego znakowania i detekcji tej ważnej grupy białek. Wyniki wykazały specyficzne znakowanie licznych białek powierzchniowych komórek przy minimalnym znakowaniu białek wewnątrzkomórkowych. Protokół ten jest szybki, prosty w użyciu, a wszystkie trzy minimalne barwniki CyDye DIGE Fluor (Cy2, Cy3 i Cy5) mogą być stosowane do znakowania białek powierzchniowych komórek. Cechy te umożliwiają multipleksowanie z wykorzystaniem dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej z fluorescencją (2-D DIGE) przy użyciu technologii Ettan DIGE oraz analizę zmian w ekspresji białek za pomocą oprogramowania DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Poziom białek powierzchniowych komórek monitorowano podczas deprywacji surowicy w komórkach CHO przez różne okresy czasu (patrz. Tabela 1). Niewielkie zmiany w zawartości białek wykryto z wysoką dokładnością, a wyniki zostały potwierdzone określonymi metodami statystycznymi.

Zaprezentowano prostą i specyficzną metodę fluorescencyjnego znakowania oraz zwiększonej detekcji białek powierzchniowych komórek bez konieczności przeprowadzenia etapu frakcjonowania. Różnice w zawartości białek powierzchniowych komórek analizowano przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej (2-D) oraz technologii Ettan™ DIGE.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Białka powierzchniowe są kluczowe dla zdolności komórki do reagowania na środowisko oraz do oddziaływania z sąsiednimi komórkami. Wiadomo, że są one induktorami...

Nazywam się Maria i pracuję w Y Healthcare w NOS w Szwecji. Białka powierzchni komórkowych często uczestniczą w komunikacji między komórkami a ich otoczeniem, dlatego stanowią one szczególne zainteresowanie badaczy dążących do lepszego zrozumienia chorób, jak i innych wariancji biologicznych wywołanych zmianami w środowisku komórkowym. W tym filmie zaprezentuję prosty protokół znakowania białek powierzchni komórkowych metodą „side-eye dodge”, dzięki któremu będziecie mogli wizualnie wzbogacić te białka o niskiej liczebności bez konieczności wzmacniania fizycznego oraz badać różnice między tymi białkami powierzchni komórkowych przy użyciu tej technologii.Jeśli ta technologia wydaje się interesująca, więcej informacji można znaleźć w podręczniku 2D. Ponadto przygotowaliśmy notatkę aplikacyjną dotyczącą tego konkretnego zagadnienia, którą można pobrać z job. W przedstawionym powyżej protokole znakowania powierzchni komórek znakowanie odbywa się, gdy komórki są jeszcze nienaruszone. Podczas procesu znakowania barwnik będzie miał dostęp wyłącznie do białek powierzchniowych komórek.Po etapie znakowania analizowane są komórki w celu weryfikacji specyficzności znakowania powierzchni komórkowych. Próbka oznakowana została poddana frakcjonowaniu na białka błonowe i cytozolowe. Równolegle przygotowano próbkę niefrakcjonowaną.Dla porównania, analiza frakcjonowania nie jest konieczna, lecz została tutaj przeprowadzona jedynie po to, aby wykazać, że protokół powierzchni komórkowych jest specyficzny dla białek powierzchniowych. Przeprowadziliśmy również standardowy protokół znakowania ETH bez diety, przedstawiony poniżej; w tej metodzie komórki są lizeowane przed znakowaniem, dzięki czemu wszystkie białka komórkowe są dostępne do znakowania. Po etapie znakowania próbki poddawane są elektroforezie 2D.Adherentne komórki są odrywane za pomocą procedury nieenzymatycznej, aby uniknąć trawienia białek powierzchniowych komórek, które są celem badania. W niniejszym protokole wykorzystujemy gumowy „policeman” (rubber policeman), jednak opcją jest również zastosowanie medium do dysocjacji komórek Enzyme Three. Należy policzyć i podzielić zawiesiny komórkowe na aliquoty zawierające od 5 do 10 milionów komórek na probówkę. Następnie komórki są wirowane w celu uzyskania osadu i przemywane w H-P-S-S-P-H 7.4, aby usunąć pozostałości pożywki hodowlanej.Zanieczyszczenia pożywki białkami surowiczymi i komponentami fluorescencyjnymi mogą zakłócać znakowanie i detekcję. Komórki hodowane w zawiesinie są bezpośrednio wirowane i płukane przed etapem znakowania następującym po płukaniu. Osad komórkowy jest resuspendsowany w 200 µl lodowatego buforu do znakowania zawierającego HPSS pH 8.5 oraz jednomolowy mocznik.W celu zapewnienia optymalnych warunków znakowania białek powierzchniowych komórek należy zawsze sprawdzać pH. Przed znakowaniem zastosowano 600 pmol side-eye na 10 milionów komórek CHO. Optymalny stosunek side-eye do liczby komórek będzie różnić się w zależności od typu komórek.Ponieważ dokładne stężenia białek na powierzchni komórek nie są znane, sposób wyznaczania optymalnych warunków dla znakowania białek metodą side-eye opisano w podręczniku zasad i metod elektroforezy 2D. Komórki inkubuje się z side eye D floor, minimal dice przez 20 minut na lodzie w ciemności.Po reakcji znakowania nieprzereagowany barwnik jest gasić poprzez dodanie 20 µL 10 mM lizyny. Znakowane komórki są następnie dwukrotnie płukane w zimnym buforze HPSS pH 7.4, aby usunąć nadmiar barwnika. Dzięki temu w kolejnym kroku, którym jest liza komórek, nie pozostanie wolny barwnik mogący spowodować niepożądane znakowanie wewnątrzkomórkowe lub białek.Białka na powierzchni komórek są już znakowane, a komórki zostały przemyte i są gotowe do lizy. Osad z ostatniego etapu przemywania resuspenduje się w 150 µL zimnego buforu do lizy zawierającego 7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM octanu magnezu o pH 8,5 i pozostawia na lodzie przez co najmniej jedną godzinę, okazjonalnie mieszając na wirówce vortex. Próbki są teraz gotowe do rozdziału 2D.Pierwszym krokiem w procesie elektroforezy jest przygotowanie pasków IPD do rehydratacji. Przygotuj odpowiedni roztwór do rehydratacji, dodając bufor IPG odpowiadający zakresowi pH stosowanych pasków, a następnie wlej roztwór do komór tacki do rehydratacji. Usuń folię ochronną z paska IPG i ostrożnie umieść paski wysuszonym żelem do dołu w tacki do rehydratacji zawierającej roztwór do rehydratacji.Zamknij pokrywę kasety IPG i pozostaw paski do rehydratacji przez noc. W pierwszym wymiarze, czyli w ogniskowaniu izoelektrycznym, białka są rozdzielane zgodnie z ich pI. Proces ten jest przeprowadzany przy użyciu urządzenia IPG four three.Rehydratowane paski umieszczono w kolektorze i zamontowano na nich elektrodę. Za pomocą nakrywek do aplikacji próbek naniesiono 50 µg z każdej próbki. Zastosowano albo bezpośrednio próbki niefrakcjonowane, bez wcześniejszego frakcjonowania, albo próbki uprzednio rozdzielone na frakcje błonowe i cytozolowe przed ich naniesieniem.Osłonę zamknięto, aby chronić fluorescencyjne próbki przed światłem. Instrument zaprogramowano zgodnie z zaleceniami i uruchomiono na noc. Duże żele 12% lamby zostały przygotowane przy użyciu żelu 12 dla osobników dorosłych.Dodano roztwór wypierający Costera, aby zapobiec polimeryzacji żeli akrylamidowych w przewodach. Przed użyciem żele pozostawiono do polimeryzacji przez noc w temperaturze pokojowej. Po ogniskowaniu izoelektrycznym paski są usuwane i poddawane równoważeniu w buforze zawierającym SDS w dwóch etapach: najpierw z użyciem DTT w celu redukcji mostków dwusiarczkowych reszt cysteiny, a następnie poprzez alkilację jodOAc, aby zapobiec modyfikacji przez akrylamid.Paski IPG zanurza się w buforze do elektroforezy, a następnie ostrożnie układa na powierzchni dużych żeli dwukierunkowych. Aby zapobiec powstaniu pęcherzyków powietrza między paskami a żelem, na górę nanosi się roztopiony 2% roztwór agro z błękitem bromofenolowym. Żele są teraz gotowe do rozdziału w drugiej wymiarowości za pomocą elektroforezy SDS-PAGE.Białka zostaną rozdzielone zgodnie z masą cząsteczkową przy użyciu systemu tonal six. Należy wypełnić komorę elektroforetyczną anodowym buforem do elektroforezy, włożyć żele i wypełnić górną komorę katodowym buforem do elektroforezy. Zaprogramuj zasilacz zgodnie z zaleceniami i przeprowadź drugą wymiarowość w ciemności przez około cztery do pięciu godzin lub do momentu, aż czoło barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.Po elektroforezie w drugim wymiarze kasety żelowe są umieszczane za pomocą chwytaków w fluorescencyjnym skanerze Typhoon. Dwa żele i trzy kanały mogą być skanowane jednocześnie. Wynik tej dwuwymiarowej elektroforezy (2D-PAGE) wykazuje wysoką rozdzielczość białek błonowych w próbce, mimo znanych ograniczeń w wykrywaniu białek hydrofobowych w tej metodzie. Wyniki pokazują wiele nowych plamek znakowania powierzchni komórkowych, przedstawionych tutaj na czerwono, które nie zostały wykryte przy użyciu standardowego protokołu znakowania, przedstawionego tutaj na zielono.Wyniki te wskazują, że protokół znakowania powierzchni komórki jest wysoce specyficzny dla białek powierzchniowych. Dzięki temu, że znakowane są wyłącznie białki powierzchniowe, są one łatwiejsze do wizualizacji, a uniknięto tłumienia sygnału przez liczne białka cytozolowe. Na górze przedstawiono obraz fluorescencyjny żeli z niefrakcjonowaną frakcją błonową lub frakcją cytozolową.Poniżej znajduje się obraz tego samego żelu po barwieniu srebrem. Wyniki nie wykazują znakowania fluorescencyjnego białek cytozolowych, natomiast barwienie srebrem potwierdza obecność białek w żelach. Wyniki wykazują również podobne wzory rozmieszczenia plamek dla frakcji niefrakcjonowanej oraz błonowej, co dowodzi, że frakcjonowanie przed elektroforezą 2D nie jest konieczne, co czyni ten protokół prostym i wygodnym.SI dwa, SI trzy oraz SCI pięć wykazują podobne wzorce znakowania i są zgodne z protokołem badania powierzchni komórek. Przeprowadzono eksperyment dietetyczny z wykorzystaniem wszystkich trzech wariantów side eye DI floor minimal dy w celu zbadania różnicowej ekspresji białek powierzchni komórkowych w komórkach CHO poddanych głodzeniu seryjnemu przez różne okresy czasu. Próbki powierzchni komórkowych CY dwa ze wszystkich próbek w eksperymencie zostały połączone i wykorzystane jako standard wewnętrzny.W okresie głodzenia można było śledzić różnicowe zmiany kilku białek powierzchniowych komórki. Z zastosowaniem protokołu izolacji białek powierzchniowych wykryto ponad 18 nowych białek błonowych, których nie zidentyfikowano przy użyciu standardowego protokołu identyfikacji białek w żelu preparatywnym. Konieczne było wzbogacenie próbki powierzchniowej (spike), aby ułatwić przypisanie wyników do plamek w zbiorze danych analitycznych.Oto wyniki. Wyniki wykazują wysoką rozdzielczość dla dużej liczby białek powierzchniowych komórek. Protokół ten jest bardzo specyficzny dla białek powierzchniowych komórek i nie zaobserwowano znakowania białek wewnątrzkomórkowych.Dzięki tej metodzie można wykryć więcej białek powierzchni komórki w porównaniu do standardowego protokołu, a jak już zauważono, jest to procedura bardzo prosta do przeprowadzenia. Białka powierzchni komórki są po prostu znakowane, gdy są jeszcze nienaruszone, a następnie poddawane bezpośrednio elektroforezie 2D bez frakcjonowania błon. Jest to zatem bardzo dobra metoda do badania białek powierzchni komórki oraz różnic między nimi z wykorzystaniem technologii D.

selective-labelling-cell-surface-proteins-using-cydye-dige-fluor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wszechstronne znakowanie białek powierzchni komórkowych przy użyciu minimalnych barwników CyDye DIGE Fluor

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

CFSE kowalencyjnie znakuje długożyjące cząsteczki wewnątrzkomórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, karboksyfluoresceiną. W związku z tym, gdy komórka znakowana CFSE dzieli się, jej potomstwo posiada połowę ilości fluorescencji, co może być wykorzystane do oceny podziałów komórkowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury zazwyczaj stosowane do znakowania limfocytów mysich przy użyciu CFSE.

Zastosowanie estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania białek powierzchniowych komórek za pomocą barwników CyDye DIGE Fluor Minimal. Technika ta umożliwia wykrywanie rzadkich białek bez frakcjonowania przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Przeglądaj więcej filmów