Wizualizacja bakterii w nicieniach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja znakowanej fluorescencyjnie symbii bakteryjnej w ich nicieniowym gospodarzu. Osiąga się to poprzez najpierw znakowanie bakterii białkiem fluorescencyjnym poprzez koniugację. Drugim krokiem jest wyizolowanie nicieni AIC poprzez zebranie jaj.

Następnie nicienie AIC są hodowane w połączeniu z ich fluorescencyjnie znakowanym symbiantem bakteryjnym, aby umożliwić naturalne skojarzenie ostatecznie lokalizacji symbiantu bakteryjnego w gospodarzu nicienia. Częstość tego związku w populacji nicieni można określić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie symbiozy, takie jak to, gdzie bakterie lokalizują się w swoim gospodarzu i jaki jest rozkład przenoszenia bakterii w populacji gospodarza?

Po nocnym wzroście szczepów bakteryjnych, subkultura, dawca, biorca i pomocnik szczepują się na bogate w składniki odżywcze pożywki pozbawione antybiotyków w stosunku 1 do 100 hodowli do pożywki, a następnie hodują kultury w temperaturze odpowiedniej dla każdego szczepu, aż osiągną średni etap wzrostu. Następnie połącz szczepy w jednej mikroprobówce wirówkowej i odwiruj zmieszane kultury przez dwie minuty Przy 17 900 G zdekantować supernatant i zalać osad w 30 mikrolitrach świeżej pożywki. Następnie naniec zawiesinę na płytce z podłożem bogatym w składniki odżywcze bez żadnych antybiotyków i pozostawić miejsce do wyschnięcia, gdy zawiesina wyschnie.

Inkubować odwróconą płytkę przez noc w temperaturze optymalnej dla bakterii biorcy i dopuszczalnej dla dawcy i osoby pomagającej, jeśli ma to zastosowanie. Teraz zeskrob miejsce i smugę dla pojedynczych kolonii na selektywnej płytce z antybiotykiem, aby uzyskać czystą smugę kultury bakterii, pojedynczą kolonię do izolacji. Na koniec upewnij się, że powstałe kolonie są symbiantem biorcy, a nie szczepem dawcy.

Poprzez badania przesiewowe pod kątem obecności fenotypów specyficznych dla biorcy. Na przykład bakterie cino abdi można odróżnić od bakterii E. coli, wykonując test katalizatora przesiewowy na obecność plazmidu, potwierdzając fluorescencję pod długością fali odpowiadającą fluorescencyjnemu białku plazmidowemu. Po wyhodowaniu naturalnego symbiotu bakteryjnego przez noc rozprowadź 600 mikrolitrów kultury bakteryjnej na ośmiu do 10, 10 milimetrowych napowietrzaczach lipidów, a następnie inkubuj płytki w ciemności bez wilgoci w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Po dwóch dniach dodaj do trawników bakteryjnych 5 000 zakaźnych młodych nicieni w 500 mikrolitrach pożywki. Po inkubacji płytek w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez kolejne trzy dni, umieść 20 mikrolitrów wody na szkiełku mikroskopowym. Następnie użyj sterylnego patyczka, aby zeskrobać niewielką ilość nicieni z trawnika bakteryjnego.

Umieść kij w wodzie, aby nicienie mogły odpłynąć. Spójrz na ten slajd w małym powiększeniu. Jeśli jaja i samice są widoczne, kontynuuj, gdy samice zawierają jaja, umieść kilka mililitrów wody na powierzchni talerzy, delikatnie zakręć płytkami, a następnie wlej wodę do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Nicienie powinny schodzić z płytek i nie być już widoczne na powierzchni płytki. Pozwól nicieniom osiądnąć na dnie rurki, a następnie wyciśnij nadmiar wody z górnej części rurki i napełnij rurkę czystą wodą. Po pozostawieniu dorosłym nicieniom na spokojne uspokojenie się i ponownym odpipetowaniu nadmiaru wody, napełnij stożkowe rurki roztworem jaj.

Następnie mieszaj probówki przez delikatne odwrócenie przez dokładnie 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wstrząśnięciu natychmiast odwirować stożkowe probówki dokładnie przez 10 minut w temperaturze 1 250 G i temperaturze pokojowej z włączoną przerwami. Następnie szybko zdekantować supernatant, ponownie zawiesić osad roztworem jaj przez pipetowanie i napełnić stożkową rurkę świeżym roztworem jaj.

Dobrze wymieszać zawiesinę jajową, odwracając probówkę trzy do pięciu razy, a następnie po natychmiastowym granulowaniu jaj i dekantacji supernatantu, jak pokazano. Ponownie zawiesić granulkę w mizoginii, bulionie lub LB przez pipetowanie, a następnie przenieść zawiesinę jaj do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Teraz napełnij 15-mililitrową rurkę funtami, umyj jajka trzy razy w bulionie, stosując tę samą technikę szybkiego kroku, jak właśnie pokazano, a następnie rozcieńczyć zawieszone jaja nicieni P do co najmniej 10 jaj na mikrolitr.

Przenieś jaja na sześciocentymetrową szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów LB i antybiotyki przeciwko kolonizującym bakteriom. Płytka może być przechowywana owinięta w perfil przez okres do czterech dni po nocnym wzroście i selekcji bakterii fluorescencyjnych. Za pomocą sterylnego patyczka rozprowadź 600 mikrolitrów kultury bakteryjnej na 10-milimetrowych napowietrzaczach lipidowych i inkubuj kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Po dwóch dniach nałóż od 500 do 5 000 jaj nicieni na każdą płytkę lipidową. Jeśli szalka była przechowywana, umyj jaja w 15 mililitrach LB, jak właśnie wykazano, co najmniej raz przed zaszczepieniem jaj na wcześniej przygotowanych trawnikach bakteryjnych. Następnie inkubuj bakterie nicienia w ciemności bez wilgoci w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż zakaźne młode osobniki pojawią się jako rozmyty biały pierścień na krawędzi płytki.

Gdy zaobserwowano zakaźne młode osobniki. Zdjąć pokrywkę płytki z agarem lipidowym i umieścić spód płytki na dnie pustej szalki Petriego o wymiarach 100 milimetrów na 20 milimetrów. Następnie napełnij szalkę Petriego taką ilością wody, aby osiągnęła około połowy wysokości mniejszej płytki i inkubuj pułapkę wodną, aż potomstwo zakaźne młode osobniki pojawią się w wodzie.

Po zebraniu nicieni z wody lub na pożądanym etapie życia z odpowiedniego trawnika bakteryjnego należy rozpuścić kilka ziaren ole w 30 mikrolitrach wody, a na każde 50 mikrolitrów próbki nicieni od jednego do dwóch mikrolitrów tego środka paraliżującego. Następnie przenieś około 20 do 30 mikrolitrów sparaliżowanej próbki nicieni na szkiełko mikroskopowe i umieść szkiełko nakrywkowe na próbce. Zobacz nicienie za pomocą mikroskopii świetlnej, aby upewnić się, że nicienie znajdują się w polu widzenia.

Aby zidentyfikować lokalizację bakterii. Sfotografuj nicienie pod mikroskopią fluorescencyjną oprócz ustawienia mikroskopii świetlnej, a następnie nałoż obrazy. Może być konieczne wypróbowanie kilku powiększeń i widoków nicienia, aby znaleźć bakterie.

Populację nicieni z dwóch pożywek policzono i oceniono pod kątem kolonizacji przez symbiant bakteryjny. Aby uzyskać wiarygodne statystyki, najlepiej jest policzyć co najmniej 100 nicieni na próbkę, przy czym co najmniej 30 należy do każdej kategorii, jak pokazano w tabeli. Nicienie te są skolonizowane na poziomie około 14,6%, gdy są hodowane na agarze lipidowym i 68,6%, gdy są hodowane na agarze wątrobowym, nerkowym.

Wykazano, że inne gatunki nicieni i bakterii mają różne poziomy kolonizacji. Schemat ten ilustruje ogólny wygląd samic Steiner NEMA. Wstawka przedstawia obraz kontrastu interferencyjnego S dla graficznej kobiety w powiększeniu 20x.

strzałka we wstawce wskazuje srom, natomiast białe strzałki wskazują widoczne jaja. To zdjęcie pokazuje rozwinięte, ale niewyklute jajo nicienia volt w powiększeniu 40x, a jaja te wyizolowane z nicieni Volta zostały sfotografowane w powiększeniu 10x. Na tym pierwszym zdjęciu pokazano reprezentatywne obrazy mikroskopowe nicieni Steiner Nima związanych z bakteriami Xeno aptus.

Nicienie Alvina były związane z ich ekspozycją symbiantów bakteryjnych eksprymujących GFP, aby stworzyć ten złożony obraz. Obraz kontrastu fazowego został nałożony na obraz fluorescencyjny. Strzałka wskazuje bakterie obecne w zakaźnym młodocianym nicieniu.

Zdjęcie przedstawia młodocianego nicienia S carpa capsi z GFP wyrażającym X nla. Obraz został skonstruowany w podobny sposób jak poprzedni obraz i przedstawia młodego nicienia z bakteriami znakowanymi zielonym białkiem fluorescencyjnym, uwidocznionymi jako zielone pręciki zlokalizowane w świetle jelita nicienia. Oprócz opisanej procedury, inne metody, takie jak manipulacja genetyczna symbiantu bakteryjnego przed asocjacją z gospodarzem nicieni, mogą być włączone w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak jakie są mechanizmy molekularne niezbędne do asocjacji drobnoustrojów gospodarza.