Name: Wizualizacja bakterii w nicieniach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji bakterii Xenorhabdus w nicieniach Steinernema za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji symbiontów wewnątrz organizmów żywicielskich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Eugenio Vivasowi, Kurtowi Heungensowi, Ericowi Martensowi, Charlesowi Cowlesowi, Darby Sugar, Ericowi Stabbowi oraz Toddowi Ciche za ich wkład w opracowanie niniejszego protokołu oraz wykorzystanych narzędzi. KEM i JMC otrzymali wsparcie w ramach National Research Service Award T32 (AI55397 „Microbes in Health and Disease”) przyznanego przez Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH). JMC otrzymał wsparcie w ramach Graduate Research Fellowship przyznanego przez Narodową Fundację Naukową (NSF). Praca ta została sfinansowana z grantów Narodowej Fundacji Naukowej (IOS-0920631 oraz IOS-0950873).

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li>
<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich-Blair%2C+H+%22Insect+Pathogens%2C+Molecular+Approaches+and+Techniques%22">Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques</a>. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).</li>
<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
<li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodring%2C+JL+%22Southern+Cooperative+Series+Bulletin+331%22">Southern Cooperative Series Bulletin 331</a>. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół przedstawia metodę optycznej detekcji bakterii wewnątrz gospodarza z grupy nicieni (Rysunek 1). Metoda ta wykorzystuje przejrzystość optyczną nicieni oraz możliwość fluorescencyjnego znakowania bakterii, co umożliwia analizę bakterii in vivo wewnątrz gospodarza (Rysunek 3). W szczególności podejście to pozwala zidentyfikować lokalizację bakterii w organizmie gospodarza. Poprzez przeliczenie populacji nicieni i ocenę obecności bakterii można określić często...

<table><tbody><tr><td>Agar lipidowy&lt;br/&gt; (sterylne)</td><td></td><td></td><td>8 g pożywki Nutrient Broth, 15 g agaru, 5 g ekstraktu drożdżowego, 890 ml wody, 10 ml MgCl2 o stężeniu 0,2 g/ml&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0, 96 ml roztworu syropu kukurydzianego*, 4 ml oleju kukurydzianego*&lt;br/&gt; Mieszać pożywkę podczas wylewania szalek&lt;br/&gt; *dodać sterylny składnik po autoklawowaniu </td></tr><tr><td>Roztwór syropu kukurydzianego&lt;br/&gt; (jałowe)</td><td></td><td></td><td>7 ml syropu kukurydzianego, 89 ml wody&lt;br/&gt; wymieszać i wysterylizować w autoklawie</td></tr><tr><td>Roztwór do jaj</td><td></td><td></td><td>16,6 ml 12% podchlorynu sodu, 5 ml 5M KOH, 80 ml wody</td></tr><tr><td>pożywka LB (Lysogeny Broth)&lt;br/&gt; (sterylne)</td><td></td><td></td><td>5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptony, 5 g soli, 1 l wody&lt;br/&gt; wymieszać i wysterylizować w autoklawie</td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna</td><td>Fisher</td><td>13-100-675</td><td>Można użyć dowolnej mikrowirówki przystosowanej do obsługi probówek do mikrowirówek.</td></tr><tr><td>Wirowanie</td><td>Beckman</td><td>366802</td><td>Duża wirówka nakładkowa mieszcząca probówki stożkowe o pojemności 15 ml i 50 ml</td></tr><tr><td>Sterylna płytka Petri 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>0875713</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Fisher</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Fisher</td><td>05-531-6</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>0875711Z</td><td>Głębsze niż standardowe szalki Petriego</td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662000-06</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td>Mikroskop musi posiadać funkcje fluorescencyjne kompatybilne z używanym fluoroforem </td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS&lt;br/&gt; (sterylne)</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl&lt;br/&gt; 0,2 g KCl&lt;br/&gt; 1,44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO (wysokie powiększenie)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &lt;br/&gt; 0,24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Wprowadzenie&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &lt;br/&gt; 1 l wody &lt;br/&gt;&lt;br/&gt; Dostosować pH do wartości 7,4, uzupełnić wodą do objętości 1 l i wysterylizować w autoklawie</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi</td><td>Fisher</td><td>05-408-138</td><td>probówki o pojemności 2 ml lub 1,5 ml</td></tr><tr><td>Inkubator wytrząsowy</td><td></td><td></td><td>Zastosować można dowolny inkubator wytrząsowy, który zapewni łagodne mieszanie cieczy.</td></tr><tr><td>Kwas diaminopimelinowy</td><td>Sigma</td><td>D-1377</td><td>W razie potrzeby uzupełnić pożywkę do stężenia 1 mM</td></tr></tbody></table>

wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbiozy, czyli wspólne bytowanie dwóch lub więcej organizmów, są rozpowszechnione we wszystkich królestwach życia. Jako jedne z najpowszechniejszych organizmów na ziemi, nicienie i bakterie tworzą szeroki wachlarz powiązań symbiotycznych, które wahają się od korzystnych do patogennych 1-3. Takim powiązaniem jest wzajemnie korzystna relacja między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, która stała się systemem modelowym symbiozy 4. Nicienie Steinernema są entomopatogenne i wykorzystują swojego bakteryjnego symbionta do zabijania owadów 5. W celu transmisji między gospodarzami owadami, bakterie kolonizują jelita nicieni w stadium zakaźnego młodego osobnika 6-8. Niedawno wykazano, że kilka innych gatunków nicieni również wykorzystuje bakterie do zabijania owadów 9-13, a badania zaczęły obejmować analizę interakcji między nicieniami a bakteriami w tych systemach 9.
Opisujemy metodę wizualizacji symbionta bakteryjnego wewnątrz lub na powierzchni organizmu gospodarza — nicienia, wykorzystując przezroczystość optyczną nicieni w badaniach mikroskopowych. Bakterie są modyfikowane genetycznie w celu ekspresji białka fluorescencyjnego, co umożliwia ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dostępnych jest wiele plazmidów niosących geny kodujące białka fluorescujące przy różnych długościach fal (t.j. zielonych lub czerwonych), a konjugacja plazmidów z donorowego szczepu Escherichia coli do biorcy w postaci symbionta bakteryjnego jest skuteczna dla szerokiego zakresu bakterii. Opisane metody zostały opracowane w celu zbadania powiązań między Steinernema carpocapsae a Xenorhabdus nematophila 14. Podobne metody były stosowane do badania innych powiązań między nicieniami a bakteriami 9,15-18, w związku z czym podejście to ma zastosowanie ogólne.
Metoda ta pozwala na charakterystykę obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni na różnych etapach rozwoju, dostarczając informacji na temat natury tej asocjacji oraz procesu kolonizacji 14,16,19. Analiza mikroskopowa ujawnia zarówno częstotliwość kolonizacji w obrębie populacji, jak i lokalizację bakterii w tkankach gospodarza 14,16,19-21. Stanowi to przewagę nad innymi metodami monitorowania bakterii w populacjach nicieni, takimi jak sonikacja 22 lub rozcieranie 23, które mogą dostarczyć średnich poziomów kolonizacji, ale nie potrafią na przykład odróżnić populacji o wysokiej częstotliwości niskiego obciążenia symbiontami od populacji o niskiej częstotliwości wysokiego obciążenia symbiontami. Rozróżnianie częstotliwości i obciążenia bakterii kolonizujących może być szczególnie istotne podczas przesiewania lub charakterystyki mutantów bakteryjnych pod kątem fenotypów kolonizacji 21,24. Rzeczywiście, mikroskopia fluorescencyjna była wykorzystywana w wysokoprzepustowym przesiewaniu mutantów bakteryjnych w celu wykrycia wad kolonizacji 17,18 i jest mniej pracochłonna niż inne metody, w tym sonikacja 22,25-27 oraz indywidualna sekcja nicieni 28,29.

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Symbiozy, czyli wspólne bytowanie dwóch lub więcej organizmów, są rozpowszechnione we wszystkich królestwach życia. Jako dwa z najpowszechniejszych organizmów na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja fluorescencyjnie znakowanej symbiozy bakteryjnej wewnątrz gospodarza z rodzaju nicieni. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie bakterii białkiem fluorescencyjnym za pomocą konjugacji. Drugim krokiem jest izolacja nicieni AIC poprzez zbieranie jaj.Następnie nicienie AIC są hodowane wraz z ich fluorescencyjnie znakowanym symbiontem bakteryjnym, aby umożliwić naturalną asocjację, a w konsekwencji lokalizację symbionta bakteryjnego wewnątrz organizmu gospodarza. Częstość tej asocjacji w populacji nicieni można określić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu symbiozy, takie jak: gdzie bakterie lokalizują się wewnątrz gospodarza oraz jaki jest rozkład kolonizacji bakteryjnej w populacji gospodarzy?Po nocnej inkubacji szczepów bakteryjnych, przenieś subkultury szczepu donora, biorcy oraz pomocniczego do bogatego pożywki wzrostowej pozbawionej antybiotyków w stosunku 1:100 kultury do pożywki, a następnie inkubuj kultury w temperaturze odpowiedniej dla każdego szczepu, aż osiągną fazę wzrostu logarytmicznego. Następnie połącz szczepy w jednej probówce do mikrocentryfugi i wiruj zmieszane kultury przez dwie minuty przy 17 900 Gs, odlej nadosad i resuspenderuj osad w 30 µL świeżej pożywki. Potem nanieś zawiesinę w formie plamki na płytkę z bogatą pożywką bez antybiotyków i odczekaj, aż plamka wyschnie.Inkubuj płytkę w pozycji odwróconej przez noc w temperaturze optymalnej dla bakterii biorącej oraz dopuszczalnej dla dawcy i pomocnika, jeśli dotyczy. Następnie zeskrob zawartość plamki i wykonaj posiew smugowy na selektywnej płytce z antybiotykiem w celu uzyskania czystej kultury bakterii, izolując pojedyncze kolonie. Na koniec upewnij się, że uzyskane kolonie są symbiontem biorącym, a nie szczepem dawcy.Poprzez przesiewową weryfikację obecności fenotypów specyficznych dla biorcy. Na przykład bakterie cino abdi można odróżnić od e coli, wykonując test katalazy, lub sprawdzić obecność plazmidu, potwierdzając fluorescencję przy długości fali odpowiadającej fluorescencyjnemu białku plazmidowemu. Po nocnej hodowli naturalnego symbionta bakteryjnego, nanieś 600 µL kultury bakteryjnej na 8–10 płytek agarowych o średnicy 10 mm, a następnie inkubuj płytki w ciemności, bez dostępu wilgoci, w temperaturze 25 °C.Po dwóch dniach należy dodać 5 000 zakaźnychstadiów młodzieńczych nicieni w 500 µL pożywki na lawns bakterii. Po inkubacji płytek w temperaturze 25 °C przez kolejne trzy dni, należy nanieść 20 µL wody na szkiełko przedmiotowe. Następnie za pomocą sterylnego patyczka należy zebrać niewielką ilość nicieni z lawnu bakterii.Zanurz patyczek w wodzie, aby umożliwić nicieniom wypłynięcie. Obejrzy preparat pod małym powiększeniem. Jeśli widoczne są jaja i samice, kontynuuj procedurę w momencie, gdy samice zawierają jaja; nalej kilka mililitrów wody na powierzchnię płytek, delikatnie nimi zakręć, a następnie przelej wodę do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.Nematody powinny oderwać się od płytek i nie być już widoczne na ich powierzchni. Należy poczekać, aż nematody opadną na dno probówki, a następnie odpipetować nadmiar wody z górnej części probówki i ponownie napełnić ją czystą wodą. Po ponownym opadnięciu dorosłych nematod na dno i ponownym odpipetowaniu nadmiaru wody, należy napełnić probówki stożkowe roztworem do pozyskiwania jaj.Następnie wymieszaj zawartość probówek poprzez delikatne odwracanie przez dokładnie 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wymieszaniu natychmiast odwiruj probówki stożkowe przez dokładnie 10 minut przy 1 250 Gs w temperaturze pokojowej z włączonym hamulcem. Następnie szybko odlej supernatant, resuspenduj osad w roztworze jajek poprzez pipetowanie i napełnij probówkę stożkową świeżym roztworem jajek.Dobrze wymieszaj zawiesinę jaj, odwracając probówkę od trzech do pięciu razy, a następnie natychmiast odwiruj jaja i odlej nadsącz, tak jak właśnie pokazano. Resuspenduj osad w bulionie misogyny lub LB, pipetując, a następnie przenieś zawiesinę jaj do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. Teraz napełnij probówkę 15 ml bulionem LB, przemyj jaja trzy razy w bulionie, stosując tę samą technikę szybkich kroków, która została właśnie zaprezentowana, a następnie rozcieńcz resuspendowane jaja nicieni P do stężenia co najmniej 10 jaj na µL.Przenieś jaja do sześciocentymetrowej szalki Petri zawierającej 5 mL pożywki LB i antybiotyki przeciwko bakteriom kolonizującym. Płytkę można przechowywać zawiniętą w folię przez maksymalnie cztery dni po nocnym namnożeniu i selekcji bakterii fluorescencyjnych. Za pomocą sterylnego rozpylacza nanieś 600 µL kultury bakteryjnej na 10 mm lipidowe aeraty i inkubuj kulturę w temperaturze 25 °C.Po dwóch dniach nanieś od 500 do 5 000 jaj nicieni na każdą płytkę lipidową. Jeśli płytka była przechowywana, przed zaszczepieniem jaj na wcześniej przygotowane lawns bakterii należy co najmniej raz przemyć jaja w 15 mililitrach LB, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie inkubuj kokultury nicieni i bakterii w ciemności, bez dostępu wilgoci, w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż do pojawienia się infekcyjnych stadiów młodzieńczych w postaci puszystego białego pierścienia na krawędzi płytki.Po zaobserwowaniu zakaźnych stadiów młodzieńczych należy zdjąć pokrywkę z płytki z agarem lipidowym i umieścić dno płytki na dnie pustego zestawu Petriego o wymiarach 100 mm na 20 mm. Następnie należy napełnić naczynie Petriego wodą do poziomu około połowy wysokości mniejszej płytki i inkubować pułapkę wodną do momentu, aż potomne zakaźne stadia młodzieńczyche wydostaną się do wody.Po zebraniu nicieni z wody lub w pożądanym stadium rozwojowym z odpowiedniego trawnika bakteryjnego, rozpuść kilka ziaren ole w 30 µL wody, a następnie dodaj od 1 do 2 µL tego środka paraliżującego na każde 50 µL próbki nicieni. Następnie przenieś około 20 do 30 µL sparaliżowanej próbki nicieni na szkiełko mikroskopowe i przykryj próbkę szkiełkiem nakrywką. Obejrzyj nicienie pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że znajdują się one w polu widzenia.Aby zidentyfikować lokalizację bakterii, należy sfotografować nicienie przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii świetlnej, a następnie nałożyć obrazy na siebie. Może być konieczne przetestowanie kilku powiększeń i różnych ujęć nicienia w celu zlokalizowania bakterii.Zliczono populacje nicieni z dwóch środowisk i oceniono stopień kolonizacji przez symbiotyczne bakterie. W celu uzyskania wiarygodnych statystyk najlepiej zliczyć co najmniej 100 nicieni na próbkę, tak aby co najmniej 30 osobników znalazło się w każdej z kategorii przedstawionych w tabeli. Nicienie te są skolonizowane na poziomie około 14,6% przy hodowli na agarze lipidowym oraz 68,6% przy hodowli na agarze wątrobowo-nerkowym.Wykazano, że inne gatunki nicieni i bakterii wykazują różny stopień kolonizacji. Ten schemat ilustruje ogólny wygląd samic Steiner NEMA. Wstawka przedstawia obraz kontrastu interferencyjnego różnicowego samicy S fot przy 20-krotnym powiększeniu.Czarna strzałka na powiększeniu wskazuje srom, natomiast białe strzałki wskazują widoczne jaja. Ten obraz przedstawia rozwinięte, ale niewyklute jajo nicienia z rodzaju Volta przy powiększeniu 40x, a jaja wyizolowane z nicieni Volta zostały zobrazowane przy powiększeniu 10x. Na tym pierwszym obrazie przedstawiono reprezentatywne zdjęcia mikroskopowe nicieni Steiner Nima związanych z bakteriami Xeno aptus.Nematody Alvina zostały powiązane z ich bakteryjnym symbiontem wykazującym ekspresję GFP w celu stworzenia tego obrazu kompozytowego. Obraz kontrastowy fazowy został nałożony na obraz fluorescencyjny. Strzałka wskazuje bakterie obecne wewnątrz infekcyjnego stadium młodzieńczego nematody.Na tym obrazie przedstawiono młodego nicienia S carpa capsi z GFP wykazującym X nla. Obraz został przygotowany w podobny sposób jak poprzedni i przedstawia młodego nicienia z bakteriami znakowanymi zielonym białkiem fluorescencyjnym, widocznymi jako zielone pręciki zlokalizowane w całym świetle jelita nicienia. Poza opisaną procedurą można zastosować inne metody, takie jak manipulacje genetyczne symbionta bakteryjnego przed związaniem z organizmem gospodarza, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące molekularnych mechanizmów niezbędnych do nawiązania związku między gospodarzem a mikrobem.

visualizing-bacteria-in-nematodes-using-fluorescent-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja bakterii u nicieni za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na działanie czynników zewnętrznych. Dzięki temu zoptymalizowanemu protokołowi alae oraz pierścieniowe struktury kutykularne zostają zabarwione przez DiI i poddane obserwacji przy użyciu mikroskopu złożonego.

Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego DiI

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Ten film demonstruje ocenę neurodegeneracyjnego wpływu badanej substancji chemicznej na Caenorhabditis elegans z fluorescencyjnie oznaczonymi neuronami. Normalne neurony wykazują jasną fluorescencję nienaruszonej somy i procesów, podczas gdy zmniejszona fluorescencja, obrzęk somy i przerywane procesy wskazują na neurodegenerację.

Badanie wpływu pestycydów na neurony Caenorhabditis elegans

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Prezentowany tutaj jest protokół monitorowania degradacji białka huntingtyny połączonego z fotokonwertowalnym fluoroforem Dendra2.

Kwantyfikacja in vivo obrotu białek w starzejących się C. elegans przy użyciu fotokonwertowalnego Dendra2

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Młode dorosłe nicienie Caenorhabditis elegans są narażone na różne stężenia komercyjnych pestycydów lub innych substancji toksycznych przez 2-24 godziny. Następnie można wizualizować różne neurony za pomocą szczepów wykazujących ekspresję fluorescencyjną. W artykule pokazano, w jaki sposób można wystawić nicienie na działanie pestycydów i ocenić uszkodzenia neuronów.

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę wizualizacji bakterii Xenorhabdus w nicieniach Steinernema za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji symbiontów wewnątrz organizmów żywicielskich.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów