Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji
March 27th, 2020
Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.
Metoda ta pozwala na wyraźne odróżnienie zintegrowanych struktur białek amyloidowych od rozpuszczalnych, a nawet skumulowanych odpowiedników. Technika jest wykonywana in vivo w sposób nieinwazyjny z niewielkimi lub żadnymi toksycznymi skutkami ubocznymi. Ponieważ zależy to od właściwości fluorescencyjnych samego fluoroforu, jest on bardzo wytrzymały i powtarzalny w czasie.
FLIM został wykorzystany w diagnostyce nowotworów. Wykorzystujemy go jednak do badania podstawowych mechanizmów agregacji białek, które są rzeczywiście istotne w chorobach neurodegeneracyjnych. Metodologia ta może być stosowana w dziedzinie agregacji białek.
Tak długo, jak białko związane z chorobą jest znakowane sondą fluorescencyjną, można je śledzić i monitorować w czasie. Związki i strategie, które albo promują, albo zapobiegają agregacji, mogą być z powodzeniem badane. Każdy system biologiczny, który pozwala na wizualizację za pomocą mikroskopii świetlnej, nadaje się do FLIM zarówno in vivo, jak i ex vivo, na przykład w hodowli komórkowej, w próbkach utrwalonych lub przepuszczalnych oraz w dowolnym niezbędnym pożywce.
Upewnij się, że przetestowałeś właściwości wybranego fluoroforu w nicieniu przed uzyskaniem danych eksperymentalnych i przetestuj, czy konfiguracja jest w pełni funkcjonalna przed uzyskaniem pomiarów. Na początek hoduj i utrzymuj nicienie w temperaturze 20 stopni Celsjusza na płytkach NGM. Nicienie starzeją się do czwartego dnia życia jako młodzi dorośli i ósmego dnia życia jako starsi dorośli.
W dniu badania obrazowego należy rozpocząć od przygotowania preparatów obrazowych. Umieścić agarozę i podwójnie destylowaną wodę o stężeniu 3% wagowo. Przenieś go do kuchenki mikrofalowej, aby się rozpuścił, a następnie pozwól mu lekko ostygnąć.
Odetnij końcówkę jednomililitrowej końcówki pipety i weź około 200 mikrolitrów stopionej agarozy. Odpipetuj agarozę na czyste szklane szkiełko i natychmiast umieść drugą na wierzchu, unikając tworzenia się pęcherzyków. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia i delikatnie zdejmij górną szklaną szkiełko.
Rezultatem jest szklane szkiełko z równą powierzchnią agarozy, na której zostaną umieszczone nicienie. Gdy zestaw do obrazowania jest gotowy do użycia, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, umieść 10-mikrolitrową kroplę związku znieczulającego na waciku agarozowym i delikatnie przenieś do niego od pięciu do 10 nicieni. Użyj końcówki rzęs, aby oddzielić nicienie.
Trzymaj je blisko siebie, ale nie dotykaj, aby umożliwić łatwiejszą lokalizację nicieni podczas pozyskiwania obrazu. Ostrożnie przykryj nicienie szkiełkiem nakrywkowym. W ciągu godziny po zamontowaniu wykonaj pomiary.
Upewnij się, że nicienie są całkowicie nieruchome. Otwórz oprogramowanie do akwizycji FLIM. Znajdź przycisk zakładki i naciśnij włącz wyjścia.
Umieść szkiełko z zamontowanymi C.elegans na scenie i za pomocą soczewki o powiększeniu 10X w trybie transmisyjnym zlokalizuj położenie nicieni na szkiełku. Zdejmij szkiełko, zmień obiektyw na soczewkę o powiększeniu 63x i nałóż wymagane medium zanurzeniowe. Umieść szkiełko na scenie i zlokalizuj nicienie.
Rozpocznij skanowanie próbki. Wybierz obszar zainteresowania i skoncentruj się na jego maksymalnej płaszczyźnie rzutowania. W interfejsie oprogramowania FLIM wyświetl podgląd liczby wykrytych fotonów.
Wartość ADC powinna wynosić od jednego razy 10 do czwartego i od jednego razy 10 do piątego. W razie potrzeby przenieś ostrość na inną płaszczyznę lub zwiększ moc lasera, aby zebrać więcej fotonów. Upewnij się, że unikasz nawarstwiania się fotonów, ale zbierasz wystarczającą ilość fotonów, aby uzyskać dobre dopasowanie i pomiar w całym okresie użytkowania.
Na pasku menu wybierz kartę, aby ustawić parametry pozyskiwania. Wybierz opcję Skanuj synchronizację, aby umożliwić wykrywanie pojedynczych fotonów. Ustaw akwizycję na określony czas lub ustaloną liczbę fotonów.
Naciśnij start, aby rozpocząć pobieranie. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj pliki danych FLIM za pomocą pliku, załaduj dane FLIM. Załaduj wszystkie próbki z jednego stanu, nawet jeśli zostały uzyskane w różnych sesjach i z różnych powtórzeń biologicznych.
W razie potrzeby segmentuj, aby zasygnalizować nicienie dla wielu obrazów FLIM za pomocą segmentacji, menedżera segmentacji. Przeciągnij narzędzie do przycinania wokół obszaru zainteresowania, aż zostanie podświetlone. Po zakończeniu naciśnij OK. Wybierz mały obszar, w którym pojawia się obraz C.elegans oparty na intensywności.
Krzywa zaniku tego obszaru pojawia się w dużym oknie zaniku po prawej stronie interfejsu. Aby ekstrapolować okres istnienia, na karcie Dane ustaw dowolną zintegrowaną wartość minimalną z zakresu od 40 do 300, aby wykluczyć wszystkie piksele, które są zbyt ciemne, aby uzyskać dobre dopasowanie. Wybierz minimalną i maksymalną liczbę czasu, aby ograniczyć sygnał FLIM do tych wartości.
Nie zmieniaj wstępnie ustawionego fotonu zliczającego jeden. Wprowadź częstotliwość powtarzania w megahercach lasera używanego podczas akwizycji. Wprowadź maksymalną wartość bramki, aby wykluczyć wszystkie nasycone piksele.
Na karcie okresu istnienia wybierz łącznik globalny, który ma zostać użyty. Nie zmieniaj żadnego innego parametru poza liczbą wyboru wykładniczego, jeśli wiadomo, że wybrany rozpad fluorescencji jest wielowykładniczy i wykazuje więcej niż jeden czas życia. Prześlij plik IRF za pomocą menu IRF.
Aby oszacować przesunięcie IRF, wybierz IRF, oszacuj przesunięcie IRF. Zestaw wartości zostanie automatycznie wyświetlony na karcie IRF. Po ustaleniu tego nie zmieniaj żadnych innych parametrów tej zakładki.
Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij zestaw danych dopasowania. Wynikowe dopasowanie zaznaczone niebieską linią powinno nakładać się na wszystkie zdarzenia. Dobre dopasowanie uzyskuje się, gdy wszystkie zdarzenia są wyrównane wzdłuż dopasowania.
Kliknij zakładkę parametrów znajdującą się w prawym górnym menu interfejsu oprogramowania i wybierz statystykę, średnią ważoną i sprawdź, czy wartość chi-kwadrat jest jak najbardziej zbliżona do jednego. Wartość życiowa wybranego obrazu jest zatem ujawniana jako wartość tau jeden. Eksportuj dowolne interesujące Cię informacje za pomocą pliku, eksportuj obrazy intensywności, tabelę wyników dopasowania, obrazy, histogramy.
Reprezentatywne mapy C.elegans wyrażających muskularne Q40 RFP w czwartym lub ósmym dniu życia są pokazane tutaj. Dłuższy odcinek Q IQ85 był bardziej podatny na agregację i wykazywał przesunięcie czasu życia fluorescencji w histogramie już w czwartym dniu życia. W rzeczywistości w czwartym dniu zaobserwowano tworzenie ognisk dla IQ85, podczas gdy nadal nie było ich w IQ44.
Jednak po starzeniu się IQ44 wykazywał również tworzenie ognisk, a tym samym skróconą żywotność fluorescencji. Wreszcie, nie wykryto tworzenia ognisk ani nie stwierdzono skrócenia czasu życia fluorescencji w NQ40CFP szczepie. W przypadku tego szczepu wystąpiły tylko subtelne, nieistotne zmiany w średnim czasie życia fluorescencji po starzeniu.
Po ustaleniu modelu nicieni ilość zebranych fotonów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrego dopasowania w ciągu całego życia. Metodę tę można dodatkowo połączyć z różnymi technikami, takimi jak transfer energii rezonansu Forstera, FRET, odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu, FRAP lub pomiar. Wszystkie te adaptacje dostarczają dodatkowych informacji na temat właściwości badań białka i jego zagregowanej formy.
W dziedzinie agregacji białek i homeostazy białek technika ta pozwoliła na zbadanie wszelkich zakłóceń nałożonych na system, rozmieszczenia różnych gatunków białek oraz transportu i ogólnie różnic i znaczenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji białkowych w organizmie żywym. Znieczulający azydek sodu jest toksyczny i należy go obchodzić w rękawiczkach i okularach ochronnych oraz rozcieńczać pod wyciągiem. Ponieważ technika ta opiera się na mikroskopii, ważne jest, aby przestrzegać wszystkich ostrzeżeń związanych z pracą z laserami.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie wykorzystuje obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do monitorowania i ilościowego określania agregacji białek w żywych modelach C. elegans. Technika ta pozwala na nieinwazyjne obserwowanie struktur białkowych istotnych dla chorób neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biologia komórki
Tło
- Agregacja białek jest kluczową cechą chorób neurodegeneracyjnych.
- FLIM zapewnia metodę rozróżniania różnych stanów białek.
- Technika jest wykonywana in vivo z minimalną toksycznością.
- FLIM ma zastosowania poza neuronauką, w tym w diagnostyce raka.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów agregacji białek.
- Rozróżnienie struktur amyloidowych i rozpuszczalnych białek.
- Zastosowanie FLIM w kontekście starzenia się i stresu w modelach C. elegans.
Zastosowane metody
- Fluorescencyjne obrazowanie czasu życia (FLIM)
- In vivo obrazowanie C. elegans
- Nieinwazyjne techniki obserwacji
- Analiza dynamiki agregacji białek
Główne wyniki
- Udana różnica między strukturami białek amyloidowych a ich rozpuszczalnymi odpowiednikami.
- Zadokumentowana stabilność i powtarzalność FLIM w czasie.
- Podkreślenie znaczenia agregacji białek w chorobach neurodegeneracyjnych.
- Wykazanie minimalnych toksycznych skutków ubocznych techniki obrazowania.
Wnioski
- FLIM jest cennym narzędziem do badania agregacji białek w żywych organizmach.
- Metoda ta może zwiększyć zrozumienie mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych.
- Przyszłe zastosowania mogą rozciągać się na inne dziedziny, w tym badania nad rakiem.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Fluorescence lifetime imaging (FLIM) enables noninvasive, quantitative monitoring of amyloid fibrilization in living models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. By distinguishing integrated amyloid structures from soluble species without staining, FLIM provides predictive confidence in early discovery workflows. The method’s robustness and reproducibility facilitate cross-functional collaboration and scalable assay development for protein homeostasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing amyloid fibrils from soluble and accumulated protein species in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, fluorescence-lifetime-based readouts that correlate directly with aggregation levels.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparison of fibrilization across genetic backgrounds, environmental stimuli, or amyloid variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling label-free, longitudinal tracking of protein aggregation in specific cells such as neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through FLIM’s independence from fluorophore expression levels and resistance to photobleaching.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by detecting aggregation-promoting or -preventing strategies in any light-microscopy-compatible biological system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by monitoring aggregation dynamics across aging and proteostasis network perturbations in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by quantifying soluble versus insoluble protein fractions in living organisms over time.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when studying protein homeostasis, enabling comparison of trafficking and distribution of protein species without further staining.
Pipeline & Workflow Integration
FLIM integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, noninvasive readouts of protein aggregation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of amyloid structures in specific cells such as neurons during aging.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through photon collection and lifetime fitting that exclude dim pixels and saturated signals for robust measurements.
- Analytics: Provides statistical outputs such as chi-square values near one and weighted mean lifetime (tau one) to compare conditions and assess fit quality.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling observation of aggregation in aging models and upon proteostasis network perturbation, relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for comparing fibrilization across different amyloid proteins, genetic backgrounds, or environmental stimuli in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein aggregation studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of amyloid detection in vivo without staining or bleaching.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of aggregation propensity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, longitudinal aggregation data in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence lifetime imaging and laser safety protocols.
- Needs FLIM-capable microscopy setup with appropriate objectives (e.g., 63X immersion) and photon detection capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters such as scan sync, repetition rate, gate max, and photon collection thresholds (10⁴–10⁵ ADC).
- Involves adaptation considerations across model systems, including agarose pad preparation, anesthetic use (e.g., sodium azide), and immobilization protocols.
- Includes practical limitations such as the need to pre-test fluorophore properties in the nematode model and avoid photon pileup during acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:25
Synchronization of C. elegans and Mounting Nematodes onto Microscopy Slides
2:58
Acquisition of FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) Data
4:32
Analysis of FLIM Data Using FLIMfit Software
7:15
Results: Fluorescence Lifetimes
8:15
Conclusion
