Name: Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę FLIM do obrazowania agregacji białek w żywych organizmach C. elegans. Technika ta pozwala nieinwazyjnie rozróżniać struktury amyloidowe od białek rozpuszczalnych w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczep mięśniowo-Q40-mRFP dostarczony przez CGC, który jest finansowany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Neuronal-Q40-CFP był miłym darem od Laboratorium Morimoto. Dziękujemy DFG (KI-1988/5-1 do JK, stypendium doktoranckie NeuroCure przyznawane przez NeuroCure Cluster of Excellence dla MLP), EMBO (krótkoterminowe stypendium dla MLP) oraz Company of Biologists (stypendia na podróże do CG i MLP) za finansowanie. Dziękujemy również ośrodku obrazowania Advanced Light Microscopy w Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrücka w Berlinie za dostarczenie zestawu do obrazowania konstruktów YFP.

1. Synchronizacja C. elegans
<ol>
	<li>Synchronizuj C. elegans albo poprzez alkaliczną obróbkę roztworem podchlorynu, albo przez proste składanie jaj przez 4 godziny w temperaturze 20 °C8.</li>
	<li>Hoduj i utrzymuj nicienie w temperaturze 20 °C na płytkach pożywki wzrostu nicieni (NGM) wysianych OP50 E. coli zgodnie ze standardowymi procedurami9. Nicienie należy starzeć do pożądanego etapu rozwoju lub dnia. 
	UWAGA: W tym protokole młodzi dorośli są obrazowani w 4 dniu, a stare nicienie są obrazowane w 8 dniu życia.</li>
</ol>
2. Za pośrednictwem RNAi powalanie maszynerii opiekuńczej poprzez karmienie
UWAGA: Wykonaj knockdown białka opiekuńczego szoku cieplnego 1 (hsp-1), podając odpowiedni wektor RNAi do nicieni10. Plazmid hsp-1 RNAi uzyskano z biblioteki Ahringer (identyfikator klonu: F26D10.3).
<ol>
	<li>Hoduj HT115 (DE3) E. coli z ekspresją plazmidu RNAi hsp-1 przez 6 godzin do nocy w pożywce Luria Bertani (LB) zawierającej 50 μg/ml ampicyliny.</li>
	<li>Przygotować świeże płytki agarowe NGM zawierające β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG; 1 mM) i ampicylinę (25 μg/ml) oraz nasiona z bakteriami RNAi hsp-1. Pozostaw płytki do wyschnięcia i indukuj w temperaturze pokojowej przez 1-3 dni.</li>
	<li>Umieścić zsynchronizowane jaja na płytce siRNA i pozostawić do wyklucia lub umieścić nicienie grawitacyjne i pozostawić do złożenia jaj na 4 godziny w temperaturze 20 °C przed wyjęciem. Hoduj nicienie do pożądanego wieku lub etapu. 
	UWAGA: Drugie pokolenie nicieni może wykazywać silniejszy fenotyp nokdaunu. Opisany tutaj protokół siRNA i warunki są ogólne i dostosowane do hsp1. Interferencja RNA poprzez siRNA określonego klonu/genu musi zostać ustalona i zoptymalizowana przez użytkownika końcowego. Ważne jest, aby pamiętać, że nie wszystkie siRNA mają taką samą wydajność i dlatego zaleca się przetestowanie skuteczności knockdownu poprzez kwantyfikację za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) lub Western blot.</li>
</ol>
3. Przygotowanie preparatów mikroskopowych
<ol>
	<li>W dniu badania obrazowego należy rozpocząć od przygotowania preparatów obrazowych. Rozpuść agarozę w ddH2O w stężeniu 3% (w/v) i lekko ostudzić.</li>
	<li>Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml i weź około 200 μl stopionej agarozy. Odpipetuj agarozę na czyste szklane szkiełko i natychmiast umieść drugą na wierzchu, unikając tworzenia się pęcherzyków. Pozostaw do wyschnięcia i delikatnie wyjmij górne szkiełko podstawowe. Rezultatem jest szklane szkiełko o równej powierzchni agarozy, na którym zostaną umieszczone nicienie. 
	UWAGA: Każdy slajd zostanie wykorzystany do zobrazowania od 5 do 10 nicieni. Szkiełka można przygotować i przechowywać przez kilka godzin w humifikowanym pudełku, aby zapobiec wysychaniu agarozy.</li>
</ol>
4. Montaż nicieni na szkiełkach mikroskopowych
UWAGA: FLIM wymaga unieruchomienia nicieni. Wykonaj ten krok, gdy konfiguracja obrazowania (np. mikroskopy, lasery, detektory) jest gotowa do użycia.
<ol>
	<li>Za pomocą platynowego drucianego szpikulca umieść nicienie w pożądanym wieku na świeżej nieobsianej płytce i pozwól im się czołgać, aby usunąć nadmiar bakterii OP50 z ich ciał.</li>
	<li>Przygotuj związek znieczulający (azydek sodu lub lewamizol) w celu unieruchomienia nicienia. Przechowywać zapas o stężeniu 500 mM NaN3 w ciemności w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć w świeżym ddH2O do końcowego stężenia 250 mM. W przypadku stosowania lewamizolu należy rozcieńczyć roztwór roboczy o stężeniu 20 mM do 2 mM w ddH2O. 
	UWAGA: Azydek sodu (NaN3) jest wysoce toksyczny. Używaj rękawic i okularów ochronnych i pracuj pod wentylowanym kapturem.</li>
	<li>Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, umieść 10 μl kropli związku znieczulającego na waciku agarozowym i delikatnie przenieś do niego 5-10 nicieni. Użyj końcówki rzęs, aby oddzielić nicienie. Trzymaj je blisko siebie, ale nie dotykaj, aby umożliwić łatwiejszą lokalizację nicieni podczas pozyskiwania obrazu.</li>
	<li>Ostrożnie przykryj nicienie szkiełkiem nakrywkowym. Pomiary należy wykonywać w ciągu 1 godziny po zamontowaniu. 
	UWAGA: Oba środki znieczulające ostatecznie zabiją C. elegans. Nicienie muszą być całkowicie nieruchome podczas obrazowania, ponieważ mapa życia jest rejestrowana z każdego piksela. Każdy ruch parametrów x,y uniemożliwia odczyt czasu życia w tym samym wzbudzonym pikselu.</li>
</ol>
5. Akwizycja danych FLIM
UWAGA: W tym protokole czas życia fluoroforu jest uzyskiwany za pomocą metody TCSPC w dziedzinie czasu. FLIM wymaga, aby impuls światła był generowany przez laser z ustaloną i stałą częstotliwością powtarzania. Częstotliwość powtarzania różni się w zależności od typu lasera i musi być znana użytkownikowi. Pomiary żywotności są osiągane za pomocą detektorów i sprzętu elektronicznego zainstalowanego wraz z konwencjonalnym mikroskopem. W tym protokole pomiary są wykonywane na trzech różnych laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych z detektorami i oprogramowaniem dostarczonym przez dwie różne firmy (Tabela materiałów) do pozyskiwania odpowiednio czasów życia mRFP, CFP i YFP. Przed rozpoczęciem sprawdź, czy zainstalowane są odpowiednie filtry emisji/wzbudzenia i zminimalizuj podświetlenie tła lub monitora. Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu należy ustalić fotostabilność wybranego fluoroforu. Jeśli fluorofor bieleje w krótkim czasie w tkankach nicienia, nie nadaje się do pomiarów FLIM u C. elegans.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji FLIM. Oprogramowanie FLIM umożliwia również sterowanie mikroskopem konfokalnym. Znajdź zakładkę/przycisk, aby umożliwić włączenie wyjść czujnika i naciśnij Włącz wyjścia.</li>
	<li>Zapoznaj się z funkcją odpowiedzi instrumentu (IRF), która opisuje precyzję pomiaru czasu konfiguracji instrumentalnej. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać najlepiej przed zamontowaniem nicieni.
	<ol>
		<li>Jeśli to możliwe, wyjmij filtry wzbudzenia/emisji.</li>
		<li>Umieść puste szkiełko nakrywkowe nad obiektywem i znajdź jego powierzchnię. Zapisać sygnał punktowy uzyskany ze szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 s. 
		UWAGA: W przypadku czasów życia wynoszących kilka nanosekund oprogramowanie do akwizycji może automatycznie oszacować przesunięcie IRF. Uzyskanie IRF jest zawsze zalecane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zjeżdżalnię z zamontowanymi C. elegans na scenie. Za pomocą soczewki z 10-krotnym powiększeniem w trybie transmisji i zlokalizuj położenie nicieni na szkiełku.</li>
	<li>Zdejmij szkiełko, zmień obiektyw na soczewkę o powiększeniu 63x i nałóż wymagane medium immersyjne (np. olej). Załóż szkiełko na stoliku i zlokalizuj nicienie.</li>
	<li>Znajdź Pinhole Manager w oprogramowaniu do akwizycji i otwórz go do maksimum. Rozpocznij skanowanie próbki, wybierz obszar zainteresowania (np. głowa, górna część ciała) i skup się na jego maksymalnej płaszczyźnie projekcji.</li>
	<li>Monitoruj częstotliwość impulsów lasera i trzy inne wartości obecne w interfejsie oprogramowania: dyskryminator stałej frakcji (CFD), czas do amplitudy (TAC) i przetwornik analogowo-cyfrowy (ADC). 
	UWAGA: Laser powinien mieć maksymalną bramkę 1 x 108 pojedynczych fotonów. Liczba ta reprezentuje maksymalną liczbę fotonów dostarczanych przez laser. CFD dostarcza informacji o odbiorze impulsu pojedynczego fotonu w odniesieniu do impulsu laserowego przez detektor. Ta wartość powinna wynosić w przybliżeniu 1 x 105. TAC rozróżnia czas wykrycia jednego fotonu od następnego impulsu laserowego. Na koniec przetwornik ADC przekształca napięcie TAC na sygnał pamięci, który można przechowywać11. CFD, TAC i ADC powinny mieć podobne wartości, aby zapewnić, że fotony emitowane przez fluorofor nie zostaną utracone. Prawidłowa ocena tych parametrów zapewnia, że zbierana jest wystarczająca ilość fotonów, aby stworzyć dokładną mapę czasu życia.</li>
	<li>W interfejsie oprogramowania FLIM wyświetl podgląd liczby wykrytych fotonów: wartość ADC powinna mieścić się w przedziale od 1 x 104 do 1 x 105. W razie potrzeby przenieś ostrość na inną płaszczyznę lub zwiększ moc lasera, aby zebrać więcej fotonów. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, liczba rejestrowanych fotonów na sekundę nie powinna przekraczać 1% częstotliwości powtarzania lasera.</li>
	<li>Na pasku menu wybierz kartę, aby ustawić parametry pozyskiwania. Wybierz opcję Skanuj synchronizację, aby umożliwić wykrywanie pojedynczych fotonów.</li>
	<li>Ustaw akwizycję na określony czas lub ustaloną liczbę fotonów. Na przykład uzyskaj krzywą rozpadu czasu życia przez 2 minuty lub do momentu, gdy pojedynczy piksel osiągnie liczbę fotonów wynoszącą 2 000 pojedynczych zdarzeń. Naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie. 
	UWAGA: Różne fluorofory będą wymagały różnych laserów i filtrów wzbudzających i emisyjnych. W zależności od jasności próbki moc lasera można również regulować, co nie będzie kolidować z żywotnością. Protokoły te używają następujących ustawień wzbudzenia/emisji: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Do pomiarów CFP przy użyciu ex800/em440 nm wykorzystano impulsowy laser dwufotonowy. Ilość czasu i liczba fotonów wymagane do uzyskania mapy FLIM będzie musiała zostać empirycznie ustalona dla każdej konfiguracji i każdego celu eksperymentalnego.</li>
</ol>
6. Analiza danych FLIM za pomocą oprogramowania FLIMfit
UWAGA: Przeprowadź analizę danych za pomocą narzędzia FLIMfit opracowanego w Imperial College London12 (zobacz Rysunek 1).
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie i zaimportuj pliki danych FLIM za pomocą opcji Plik | Załaduj dane FLIM. Załaduj wszystkie próbki z jednego warunku, nawet jeśli zostały uzyskane w różnych sesjach i z różnych powtórzeń biologicznych.</li>
	<li>W razie potrzeby podziel pojedynczy nicień na segmenty z dowolnego obrazu FLIM za pomocą segmentacji | Menedżer segmentacji. Przeciągnij narzędzie do przycinania wokół obszaru zainteresowania, aż zostanie podświetlone. Po zakończeniu naciśnij OK. 
	UWAGA: Segmentacja musi być wykonana dla wszystkich obrazów.</li>
	<li>Wybierz mały obszar, w którym pojawia się oparty na intensywności obraz C. elegans (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, Strzałki 1). Krzywa rozpadu tego obszaru pojawi się w dużym oknie zaniku po prawej stronie interfejsu (Rysunek 1, strzałka 2). 
	UWAGA: Rozkład może być wyświetlany liniowo lub logarytmicznie.</li>
	<li>Ustaw prawidłowe parametry, aby ekstrapolować okres eksploatacji za pomocą algorytmu oprogramowania, zgodnie z opisem w krokach 6.5-6.8.</li>
	<li>Na karcie Dane (Rysunek 1, strzałka 3):
	<ol>
		<li>Ustaw dowolną wartość Zintegrowane minimum, aby wykluczyć wszystkie piksele, które są zbyt ciemne, aby uzyskać dobre dopasowanie. W zależności od próbki C. elegans wartość ta waha się od 40 do 300. Wprowadzaj różne wartości, aż do uzyskania zadowalającego podglądu.</li>
		<li>Wybierz liczbę Time Min i Time Max, aby ograniczyć sygnał FLIM do tych wartości. Wszystkie zdarzenia, które pojawiają się przed i po tym progu, zostaną wykluczone. 
		UWAGA: Na przykład na potrzeby analizy mRFP wykluczono zdarzenia przed 800 ps i po 4 000 ps. Wartości te zależą od żywotności fluoroforu i muszą być określone przez użytkownika końcowego.</li>
		<li>Nie zmieniaj wstępnie ustawionej liczby zliczeń/fotonów na 1.</li>
		<li>Wprowadź częstotliwość powtarzania w MHz lasera używanego podczas akwizycji. 
		UWAGA: W obecnym protokole zastosowano różne lasery o różnej częstotliwości powtarzania. Laser dwufotonowy używany do akwizycji czasów życia CFP ma częstotliwość powtarzania 80 MHz, dla YFP laser powtarza się z częstotliwością 40 MHz, a dla mRFP wartość ta wynosi 78,01 MHz. Wartości te zostały wprowadzone do FLIMfit zgodnie z analizowaną próbką.</li>
		<li>Wprowadź wartość Gate Max, aby wykluczyć wszystkie nasycone piksele. 
		UWAGA: W przypadku pomiarów żywotności C. elegans wartość ta jest ustawiana na dowolną dużą liczbę (np. 1 x 108).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na karcie Okres istnienia wybierz dopasowanie globalne, które ma zostać użyte (np. dopasowanie pikselowe). Zobacz Rysunek 1, strzałka 4. 
	UWAGA: Dopasowanie pikselowe spowoduje powstanie zaniku dopasowanego do każdego pojedynczego piksela. Dopasowanie obrazu spowoduje utworzenie globalnego dopasowania każdego pojedynczego obrazu i wyświetlenie pojedynczej wartości okresu istnienia dla każdego obrazu. Dopasowanie globalne spowoduje utworzenie pojedynczego dopasowania w całym zestawie danych. Dla wszystkich obrazów podawana jest jedna wartość okresu istnienia.</li>
	<li>Nie zmieniaj żadnego innego parametru z wyjątkiem Nie. Wybór exp, jeśli wiadomo, że wybrany rozpad fluorescencji jest wielowykładniczy i wykazuje więcej niż jeden czas życia. 
	UWAGA: W niniejszym protokole funkcja ta została wykorzystana do obliczenia czasu życia dwuwykładniczego fluoroforu CFP.</li>
	<li>Prześlij IRF za pomocą menu IRF: IRF | Załaduj IRF. Aby oszacować przesunięcie IRF, wybierz IRF | Oszacuj przesunięcie IRF. Zestaw wartości pojawi się automatycznie na karcie IRF. Po ustaleniu tego nie zmieniaj żadnych innych parametrów tej zakładki.</li>
	<li>Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij Dopasuj zestaw danych (Rysunek 1, strzałka 5). Algorytm określi dopasowanie do krzywej zaniku i ustali wartość czasu życia dla każdego obrazu. 
	UWAGA: Wynikowe dopasowanie, zaznaczone niebieską linią, powinno nakładać się na wszystkie zdarzenia. Dobre dopasowanie uzyskuje się, gdy wszystkie zdarzenia są wyrównane wzdłuż dopasowania.</li>
	<li>Kliknij zakładkę Parametry (Rysunek 1, Strzałka 6), znajdującą się w prawym górnym menu interfejsu oprogramowania, a następnie wybierz Statystyka: w_mean (średnia ważona) i sprawdź, czy wartość chi2 jest jak najbardziej zbliżona do 1, 
	UWAGA: Złącze chi2 bliskie jedności zapewnia dokładność dopasowania. W ten sposób wartość życiowa wybranego obrazu jest ujawniana jako tau_1.</li>
	<li>Eksportuj dowolne informacje, które Cię interesują: Plik | Eksportuj obrazy intensywności/tabelę wyników dopasowania/obrazy/histogramy. Zapisz ustawienia danych używane do obliczenia okresu istnienia: Plik | Zapisz ustawienia danych. 
	UWAGA: Zastosowane parametry zostaną zapisane do przyszłej analizy wybranych próbek.</li>
</ol>
7. Graficzne reprezentacje danych FLIM
UWAGA: Czasy życia zebrane z różnych próbek mogą być wizualnie reprezentowane na różne sposoby. Wybierz, aby oznaczać wartości okresu istnienia w nanosekundach lub pikosekundach.
<ol>
	<li>Pokaż jakość dopasowania i dokładność krzywej, eksportując krzywą zaniku bezpośrednio z FLIMfit.</li>
	<li>Przedstaw rozkład fotonów, wykreślając częstotliwość liczby fotonów w funkcji wartości czasu życia na histogramie.</li>
	<li>Na koniec, w celu porównania statystycznego, w przypadku porównywania dwóch lub więcej próbek, umieść wartości czasu życia oraz odchylenie standardowe średniej na wykresie słupkowym wykresu punktowego. Wykonaj dowolną analizę statystyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58(2016).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. New York, NY. (2006).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li>
<li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+Synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li>
<li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li>
<li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687(2013).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-nanoimaging%3A+Protein+Misfolding+and+Aggregation%22%5BJournal%5D)">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+%CE%B1-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li>
<li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells%3A+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li>
<li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes%3A+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li>
<li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje technikę opartą na mikroskopii do identyfikacji zagregowanych gatunków w systemie modelowym C. elegans . FLIM może dokładnie scharakteryzować obecność zarówno zagregowanych, jak i rozpuszczalnych gatunków połączonych z fluoroforem poprzez pomiar ich rozpadów czasu życia fluorescencji. Gdy białko fuzyjne zacznie agregować, jego zarejestrowany średni czas życia zmieni się z wyższej na niższą wartość16. Skłonność do agregacji można następnie wywnioskować ...

Agregacja białek występuje zarówno w procesie starzenia się, jak i choroby. Szlaki prowadzące do powstawania i odkładania się dużych amyloidów lub amorficznych inkluzji są trudne do prześledzenia, a ich kinetyka jest podobnie trudna do rozwikłania. Białka mogą ulegać nieprawidłowemu fałdowaniu z powodu wewnętrznych mutacji w ich sekwencjach kodujących, jak w przypadku chorób genetycznych. Białka również ulegają nieprawidłowemu fałdowaniu, ponieważ sieć proteostazy (PN), która utrzymuje je rozpuszczalne i prawidłowo pofałdowane, jest upośledzona, jak to ma miejsce podczas starzenia. PN obejmuje molekularne białka opiekuńcze i maszynerię degradacji i jest odpowiedzialny za biogenezę, fałdowanie, transport i degradację białek1.
C. elegans pojawił się jako model do badania starzenia się i chorób ze względu na swoją krótką żywotność, izogeniczną naturę i łatwość manipulacji genetycznych. Stworzono kilka transgenicznych szczepów C. elegans, które eksprymują ludzkie białka chorobotwórcze we wrażliwych tkankach. Co ważne, wiele szczepów zawierających białka podatne na agregację podsumowuje cechę charakterystyczną zaburzeń amyloidowych, czyli tworzenie dużych inkluzji. Dzięki przezroczystemu ciału C. elegans, agregaty te mogą być wizualizowane in vivo, nieinwazyjnie i niedestrukcyjnie2. Generowanie dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) w fuzji z fluoroforem pozwala na zbadanie jego lokalizacji, transportu, sieci interakcji i ogólnego losu.
Przedstawiamy protokół monitorowania agregacji białek chorobotwórczych u żyjących i starzejących się C. elegans za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM). FLIM to potężna technika oparta na czasie życia fluoroforu, a nie na jego widmach emisyjnych. Czas życia (tau, τ) definiuje się jako średni czas potrzebny fotonowi do rozpadu ze stanu wzbudzonego z powrotem do stanu podstawowego. Czas życia danej cząsteczki oblicza się za pomocą techniki czasowo-dziedzinowej zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC). W TCSPC-FLIM funkcję rozpadu fluorescencyjnego uzyskuje się poprzez wzbudzenie fluoroforu krótkimi impulsami laserowymi o wysokiej częstotliwości i zmierzenie czasu dotarcia emitowanego fotonu do detektora w odniesieniu do impulsów. Podczas skanowania próbki dla każdego piksela tworzona jest trójwymiarowa tablica danych: tablica zawiera informacje o rozkładzie fotonów w ich współrzędnych przestrzennych x,y i ich krzywej zaniku czasowego. Dana próbka staje się zatem mapą życiorysów, ujawniającą informacje o strukturze białka, wiązaniu i środowisku3,4. Każde białko fluorescencyjne ma wewnętrzny i precyzyjnie określony czas życia, zwykle wynoszący kilka nanosekund (ns), w zależności od jego właściwości fizykochemicznych. Co ważne, czas życia fluoroforu jest niezależny od jego stężenia, intensywności fluorescencji i metodologii obrazowania. Jednak w systemie biologicznym mogą na niego wpływać czynniki środowiskowe, takie jak pH, temperatura, stężenie jonów, nasycenie tlenem i jego partnerzy interakcji. Okresy życia są również wrażliwe na wewnętrzne zmiany strukturalne i orientację. Fuzja fluoroforu z punktem POI powoduje zmianę jego żywotności, a co za tym idzie, informację o zachowaniu skondensowanego białka. Kiedy fluorofor jest otoczony lub zamknięty w ściśle związanym środowisku, takim jak antyrównoległe arkusze beta struktury amyloidowej, traci energię nieradiacyjnie, proces znany jako wygaszanie5. Wygaszenie fluoroforu powoduje skrócenie jego pozornej żywotności. Po rozpuszczeniu czas życia białka pozostanie bliższy jego pierwotnej, wyższej wartości. W przeciwieństwie do tego, gdy białko zaczyna agregować, jego czas życia nieuchronnie zmieni się na niższą wartość6,7. W związku z tym możliwe staje się monitorowanie skłonności do agregacji dowolnego białka tworzącego amyloid w różnym wieku u żyjących C. elegans.
Tutaj opisujemy protokół do analizy agregacji białka fuzyjnego składającego się z różnych odcinków poliglutaminy (CAG, Q) (Q40, Q44 i Q85). Pokazujemy, w jaki sposób technika ta może być stosowana w równym stopniu do różnych fluoroforów, takich jak białko cyjanowo-fluorescencyjne (CFP), żółte białko fluorescencyjne (YFP) i monomeryczne białko czerwonej fluorescencji (mRFP); oraz we wszystkich tkankach C. elegans, w tym w neuronach, mięśniach i jelicie. Co więcej, w kontekście proteostazy, FLIM jest bardzo przydatnym narzędziem do obserwacji zmian po wyczerpaniu molekularnych białek opiekuńczych. Zniszczenie jednego z kluczowych molekularnych białek opiekuńczych, białka szoku cieplnego 1 (hsp-1), poprzez interferencję RNA, powoduje przedwczesne nieprawidłowe fałdowanie białek. Wzrost obciążenia agregacyjnego w wyniku starzenia się, choroby lub niedoboru białek opiekuńczych jest następnie mierzony jako skrócenie czasu życia fluorescencji.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar Kobe I</td><td>, Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>Składnik NGM</td></tr><tr><td>Biblioteka Ahringer hsp-1 siRNA</td><td>Źródło: BioScience, Wielka Brytania Limited</td>, <td>F26D10.3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td>, <td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.3</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>B& H DCS-120 SPC-150</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Aquisition oprogramowanie</td></tr><tr><td>B& H SPC830-SPC Obraz</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Oprogramowanie Aquisition</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD-Bionsciences</td><td>211677</td><td>NGM component</td></tr><tr><td>C. elegans iQ44-YFP</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OG412</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans iQ85-YFP</td><td></td><td></td><td>Miły prezent od Morimoto Lab</td></tr><tr><td>C. elegans mQ40-RFP</td><td></td><td></td><td>Miły prezent od Morimoto Lab</td></tr><tr><td>C. elegans nQ40-CFP</td><td></td><td></td><td>Miły prezent od Morimoto Lab</td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>Szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2316.4</td><td></td></tr><tr><td>Leica M165 FC</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Montaż Mikroskop stereoskopowy</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Chlorowodorek lewamizolu</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>Anesthetic</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>PicoQuant PicoHarp300</td><td>PicoQuant GmbH</td><td></td><td>FLIM Aquisition Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K305.1</td><td>Znieczulający</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>Składnik</td></tr> <tr><td>NGMStandard-Objekttr&auml; ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>Szkiełka szklane</td></tr><tr><td>Universal Agarose</td><td>Bio & Sprzedaj GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td></td></tr><tr>Mikroskop konfokalny<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510-meta NLO</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się c. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fibryle amyloidowe są związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Huntingtona, Parkinsona czy Alzheimera. Te fibryle amyloidowe mogą sekwestrować endogenne białka metastabilne, a także składniki sieci proteostazy (PN), a tym samym nasilać nieprawidłowe fałdowanie białek w komórce. Dostępna jest ograniczona liczba narzędzi do oceny procesu agregacji białek amyloidowych w organizmie zwierzęcia. Przedstawiamy protokół mikroskopii czasu życia fluorescencji (FLIM), który umożliwia monitorowanie i kwantyfikację fibrylacji amyloidu w określonych komórkach, takich jak neurony, w sposób nieinwazyjny oraz wraz z postępem starzenia się i zaburzeniami PN. FLIM jest niezależny od poziomów ekspresji fluoroforu i umożliwia analizę procesu agregacji bez dalszego barwienia lub wybielania. Fluorofory są wygaszane, gdy znajdują się w bliskim sąsiedztwie struktur amyloidowych, co powoduje skrócenie czasu życia fluorescencji. Wygaszanie bezpośrednio koreluje z agregacją białka amyloidowego. FLIM to wszechstronna technika, którą można zastosować do porównania procesu fibrylacji różnych białek amyloidowych, bodźców środowiskowych lub tła genetycznego in vivo w sposób nieinwazyjny.

Protokół przedstawia sposób dokładnego monitorowania tworzenia się form zagregowanych u żywych C. elegans, zarówno podczas naturalnego starzenia się, jak i w warunkach stresu. Wybrano cztery różne szczepy transgenicznych nicieni wykazujące ekspresję białek poliglutaminowych z powtórzeniami 40Q, 44Q lub 85Q. Białka te są syntetyzowane w różnych tkankach i zostały połączone z różnymi fluoroforami. Szczepy C. elegans wykazywały ekspresję Q40-mRFP w mięśniach ściany ciała (m...

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Metoda ta pozwala na wyraźne odróżnienie zintegrowanych struktur białek amyloidowych od rozpuszczalnych, a nawet skumulowanych odpowiedników. Technika jest wykonywana in vivo w sposób nieinwazyjny z niewielkimi lub żadnymi toksycznymi skutkami ubocznymi. Ponieważ zależy to od właściwości fluorescencyjnych samego fluoroforu, jest on bardzo wytrzymały i powtarzalny w czasie.FLIM został wykorzystany w diagnostyce nowotworów. Wykorzystujemy go jednak do badania podstawowych mechanizmów agregacji białek, które są rzeczywiście istotne w chorobach neurodegeneracyjnych. Metodologia ta może być stosowana w dziedzinie agregacji białek.Tak długo, jak białko związane z chorobą jest znakowane sondą fluorescencyjną, można je śledzić i monitorować w czasie. Związki i strategie, które albo promują, albo zapobiegają agregacji, mogą być z powodzeniem badane. Każdy system biologiczny, który pozwala na wizualizację za pomocą mikroskopii świetlnej, nadaje się do FLIM zarówno in vivo, jak i ex vivo, na przykład w hodowli komórkowej, w próbkach utrwalonych lub przepuszczalnych oraz w dowolnym niezbędnym pożywce.Upewnij się, że przetestowałeś właściwości wybranego fluoroforu w nicieniu przed uzyskaniem danych eksperymentalnych i przetestuj, czy konfiguracja jest w pełni funkcjonalna przed uzyskaniem pomiarów. Na początek hoduj i utrzymuj nicienie w temperaturze 20 stopni Celsjusza na płytkach NGM. Nicienie starzeją się do czwartego dnia życia jako młodzi dorośli i ósmego dnia życia jako starsi dorośli.W dniu badania obrazowego należy rozpocząć od przygotowania preparatów obrazowych. Umieścić agarozę i podwójnie destylowaną wodę o stężeniu 3% wagowo. Przenieś go do kuchenki mikrofalowej, aby się rozpuścił, a następnie pozwól mu lekko ostygnąć.Odetnij końcówkę jednomililitrowej końcówki pipety i weź około 200 mikrolitrów stopionej agarozy. Odpipetuj agarozę na czyste szklane szkiełko i natychmiast umieść drugą na wierzchu, unikając tworzenia się pęcherzyków. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia i delikatnie zdejmij górną szklaną szkiełko.Rezultatem jest szklane szkiełko z równą powierzchnią agarozy, na której zostaną umieszczone nicienie. Gdy zestaw do obrazowania jest gotowy do użycia, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, umieść 10-mikrolitrową kroplę związku znieczulającego na waciku agarozowym i delikatnie przenieś do niego od pięciu do 10 nicieni. Użyj końcówki rzęs, aby oddzielić nicienie.Trzymaj je blisko siebie, ale nie dotykaj, aby umożliwić łatwiejszą lokalizację nicieni podczas pozyskiwania obrazu. Ostrożnie przykryj nicienie szkiełkiem nakrywkowym. W ciągu godziny po zamontowaniu wykonaj pomiary.Upewnij się, że nicienie są całkowicie nieruchome. Otwórz oprogramowanie do akwizycji FLIM. Znajdź przycisk zakładki i naciśnij włącz wyjścia.Umieść szkiełko z zamontowanymi C.elegans na scenie i za pomocą soczewki o powiększeniu 10X w trybie transmisyjnym zlokalizuj położenie nicieni na szkiełku. Zdejmij szkiełko, zmień obiektyw na soczewkę o powiększeniu 63x i nałóż wymagane medium zanurzeniowe. Umieść szkiełko na scenie i zlokalizuj nicienie.Rozpocznij skanowanie próbki. Wybierz obszar zainteresowania i skoncentruj się na jego maksymalnej płaszczyźnie rzutowania. W interfejsie oprogramowania FLIM wyświetl podgląd liczby wykrytych fotonów.Wartość ADC powinna wynosić od jednego razy 10 do czwartego i od jednego razy 10 do piątego. W razie potrzeby przenieś ostrość na inną płaszczyznę lub zwiększ moc lasera, aby zebrać więcej fotonów. Upewnij się, że unikasz nawarstwiania się fotonów, ale zbierasz wystarczającą ilość fotonów, aby uzyskać dobre dopasowanie i pomiar w całym okresie użytkowania.Na pasku menu wybierz kartę, aby ustawić parametry pozyskiwania. Wybierz opcję Skanuj synchronizację, aby umożliwić wykrywanie pojedynczych fotonów. Ustaw akwizycję na określony czas lub ustaloną liczbę fotonów.Naciśnij start, aby rozpocząć pobieranie. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj pliki danych FLIM za pomocą pliku, załaduj dane FLIM. Załaduj wszystkie próbki z jednego stanu, nawet jeśli zostały uzyskane w różnych sesjach i z różnych powtórzeń biologicznych.W razie potrzeby segmentuj, aby zasygnalizować nicienie dla wielu obrazów FLIM za pomocą segmentacji, menedżera segmentacji. Przeciągnij narzędzie do przycinania wokół obszaru zainteresowania, aż zostanie podświetlone. Po zakończeniu naciśnij OK. Wybierz mały obszar, w którym pojawia się obraz C.elegans oparty na intensywności.Krzywa zaniku tego obszaru pojawia się w dużym oknie zaniku po prawej stronie interfejsu. Aby ekstrapolować okres istnienia, na karcie Dane ustaw dowolną zintegrowaną wartość minimalną z zakresu od 40 do 300, aby wykluczyć wszystkie piksele, które są zbyt ciemne, aby uzyskać dobre dopasowanie. Wybierz minimalną i maksymalną liczbę czasu, aby ograniczyć sygnał FLIM do tych wartości.Nie zmieniaj wstępnie ustawionego fotonu zliczającego jeden. Wprowadź częstotliwość powtarzania w megahercach lasera używanego podczas akwizycji. Wprowadź maksymalną wartość bramki, aby wykluczyć wszystkie nasycone piksele.Na karcie okresu istnienia wybierz łącznik globalny, który ma zostać użyty. Nie zmieniaj żadnego innego parametru poza liczbą wyboru wykładniczego, jeśli wiadomo, że wybrany rozpad fluorescencji jest wielowykładniczy i wykazuje więcej niż jeden czas życia. Prześlij plik IRF za pomocą menu IRF.Aby oszacować przesunięcie IRF, wybierz IRF, oszacuj przesunięcie IRF. Zestaw wartości zostanie automatycznie wyświetlony na karcie IRF. Po ustaleniu tego nie zmieniaj żadnych innych parametrów tej zakładki.Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij zestaw danych dopasowania. Wynikowe dopasowanie zaznaczone niebieską linią powinno nakładać się na wszystkie zdarzenia. Dobre dopasowanie uzyskuje się, gdy wszystkie zdarzenia są wyrównane wzdłuż dopasowania.Kliknij zakładkę parametrów znajdującą się w prawym górnym menu interfejsu oprogramowania i wybierz statystykę, średnią ważoną i sprawdź, czy wartość chi-kwadrat jest jak najbardziej zbliżona do jednego. Wartość życiowa wybranego obrazu jest zatem ujawniana jako wartość tau jeden. Eksportuj dowolne interesujące Cię informacje za pomocą pliku, eksportuj obrazy intensywności, tabelę wyników dopasowania, obrazy, histogramy.Reprezentatywne mapy C.elegans wyrażających muskularne Q40 RFP w czwartym lub ósmym dniu życia są pokazane tutaj. Dłuższy odcinek Q IQ85 był bardziej podatny na agregację i wykazywał przesunięcie czasu życia fluorescencji w histogramie już w czwartym dniu życia. W rzeczywistości w czwartym dniu zaobserwowano tworzenie ognisk dla IQ85, podczas gdy nadal nie było ich w IQ44.Jednak po starzeniu się IQ44 wykazywał również tworzenie ognisk, a tym samym skróconą żywotność fluorescencji. Wreszcie, nie wykryto tworzenia ognisk ani nie stwierdzono skrócenia czasu życia fluorescencji w NQ40CFP szczepie. W przypadku tego szczepu wystąpiły tylko subtelne, nieistotne zmiany w średnim czasie życia fluorescencji po starzeniu.Po ustaleniu modelu nicieni ilość zebranych fotonów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrego dopasowania w ciągu całego życia. Metodę tę można dodatkowo połączyć z różnymi technikami, takimi jak transfer energii rezonansu Forstera, FRET, odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu, FRAP lub pomiar. Wszystkie te adaptacje dostarczają dodatkowych informacji na temat właściwości badań białka i jego zagregowanej formy.W dziedzinie agregacji białek i homeostazy białek technika ta pozwoliła na zbadanie wszelkich zakłóceń nałożonych na system, rozmieszczenia różnych gatunków białek oraz transportu i ogólnie różnic i znaczenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji białkowych w organizmie żywym. Znieczulający azydek sodu jest toksyczny i należy go obchodzić w rękawiczkach i okularach ochronnych oraz rozcieńczać pod wyciągiem. Ponieważ technika ta opiera się na mikroskopii, ważne jest, aby przestrzegać wszystkich ostrzeżeń związanych z pracą z laserami.

characterization-amyloid-structures-aging-c-elegans-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje test oparty na obrazowaniu in vivo, który pozwala określić spadek proteostazy spowodowany starzeniem się. W teście wykorzystuje Caenorhabditis elegans eksprymujące białko fuzyjne poliglutaminy YFP w mięśniach ścian ciała w celu zmierzenia związanej z wiekiem agregacji poliglutaminy i indukcji proteotoksyczności, co prowadzi do paraliżu.

Fluorescencyjny test paraliżu reporterowego: technika oceny związanego z wiekiem postępującego tworzenia się fluorescencyjnego reportera poliglutaminy i związanego z nim paraliżu w Caenorhabditis elegans

Źródło: Nyström, S., et al., Obrazowanie tkanek amyloidowych wybarwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia analizę struktur amyloidowych za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM), przy użyciu barwnika hFTAA w celu ujawnienia zwartych rdzeni jako niebieskich/zielonych i niestabilnych peryferii jako czerwonych/żółtych na obrazach...

Analiza struktur amyloidowych w skrawku tkanki przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między...

Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Przewodnik krok po kroku do badania utraty kwasowości lizosomalnej w jelicie C. elegans przy użyciu wrażliwego na pH barwnika witalnego 5(6)-karboksyloksy-2',7'-dichlorofluoresceiny dioctanu...

Ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Poznaj metodę FLIM do obrazowania agregacji białek w żywych organizmach C. elegans. Technika ta pozwala nieinwazyjnie rozróżniać struktury amyloidowe od białek rozpuszczalnych w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów