Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych
April 21st, 2014
Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie żywotnych kardiomiocytów z chorobowych próbek komorowych człowieka i scharakteryzowanie ich zmian funkcjonalnych. Osiąga się to poprzez szybkie zebranie i zmielenie świeżych próbek komorowych w lodowatym roztworze kardioplegicznym, aby uniknąć nadmiernej degradacji tkanek i uszkodzenia komórek. Drugim krokiem jest przeprowadzenie stopniowego trawienia kawałków mięśnia sercowego przy użyciu specjalnie przygotowanego urządzenia do trawienia i roztworów enzymatycznych.
W sześciu cyklach komórka zawierająca bufor jest zbierana w probówce w każdym cyklu i rozcieńczana roztworem konserwującym komórkę. Ostatnim krokiem jest ponowne zawieszenie komórek zawartych w sześciu probówkach w mniejszej objętości wzorcowego roztworu fizjologicznego o normalnym stężeniu wapnia w celu przeprowadzenia charakterystyki funkcjonalnej. Ostatecznie, rejestracja potencjałów czynnościowych za pomocą klamry łatowej i jednoczesna ocena międzykomórkowego wapnia za pomocą barwników fluorescencyjnych służy do pokazania zmian działania, czasu trwania potencjału i wewnątrzkomórkowego obiegu wapnia w kardiomiocytach u pacjentów z kardiomiopatią przerostową.
Główną zaletą DYS unikalnej w porównaniu z metodą 16, podobnie jak standardowej metody odchudzania kawałków, jest to, że w połączeniu z roztworem enzymatycznym używamy specjalnie wykonanego urządzenia do trawienia, które umożliwia wspólną asocjację zmiennych cytów dzięki zeskrobaniom krzemu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kardiologii, takie jak to, w jaki sposób dobrze znana przebudowa molekularna i strukturalna związana z chorobami serca przekłada się na zmiany pojedynczych kardiomiocytów, które mogą być analizowane za pomocą naszej metody i kierowane przez określone leki. Tak więc implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii genetycznych chorób serca, takich jak kardiomiopatia przerostowa.
W rzeczywistości metoda ta może być wykorzystana do testowania nowatorskich podejść neuropatycznych na kardiomiocytach komorowych od pacjentów z chorobami przerostowymi lub niedokrwiennymi serca, którzy przeszli operację serca. Na pomysł tej metody po raz pierwszy wpadliśmy podczas porównania analogii między próbkami tętnic ludzkich a biopsjami komorowymi uzyskanymi podczas operacji kardiochirurgicznej. Rozpocznij tę procedurę od wlania 40 mililitrów roztworu kardiofilgicznego do 50-mililitrowej probówki i przechowuj ją w lodzie w celu transportu próbki z sali operacyjnej do laboratorium izolacji komórek, szybko przenieś próbkę do obszaru laboratoryjnego i rozpocznij przetwarzanie próbki w ciągu 10 minut od wycięcia próbki.
Następny zbiorowy wycinek mięśnia sercowego z sali operacyjnej bezpośrednio po wycięciu. Przemyć ją lodowatym roztworem CP i przechowywać w probówce, trzymając próbkę w lodowatym buforze CP. Następnie ostrożnie usuń warstwę zwłóknienia wsierdzia za pomocą cienkich nożyczek.
Pokrój tkankę mięśnia sercowego na małe kawałki o długości od dwóch do trzech milimetrów z całkowitą ilością mięśnia sercowego komorowego od 100 miligramów do jednego grama na każdą izolację. Po przeniesieniu kawałków do komory skrobania urządzenia do wytrawiania, należy wymienić bufor CP w komorze z zimnym buforem dysocjacyjnym wolnym od wapnia. Następnie umieść urządzenie do wytrawiania w kąpieli termostatycznej.
Ustaw wannę na 37,5 stopnia Celsjusza i włącz ją. Następnie włącz silnik urządzenia wytrawiającego i ustaw prędkość obrotową na jeden obrót na sekundę. Wykonaj trzy cykle mycia z DB i zmieniaj roztwór w komorze z nasyconym tlenem DB o temperaturze 37 stopni Celsjusza co osiem minut.
Następnie przygotuj bufor enzymatyczny jeden, dodając 250 jednostek na mililitr kolagenazy typu piątego i czterech jednostek na mililitr proteazy. Wpisz 24 do rozwiązania DB. Następnie przygotuj bufor enzymatyczny dwa, dodając 250 jednostek na mililitr kolagenazy.
Wpisz pięć do roztworu DB, natlenij EB jeden i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj dwa 12-minutowe cykle trawienia w obrotowym urządzeniu do wytrawiania z trzema mililitrami 100% natlenionego EB, jeden w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usunąć roztwór przez aspirację pipetą i wyrzucić go po każdym cyklu.
Następnie przygotuj sześć 15-mililitrowych probówek do zbierania komórek i 80 mililitrów roztworu do naparu rzemieślniczego o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uniknąć, natlenić EB dwa i rozpracować go do 37 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj pierwszy 15-minutowy cykl trawienia z trzema mililitrami 100% natlenionego EB dwa w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po cyklu trawienia zebrać roztwór zawierający pierwsze powiązane miocyty w 15-mililitrowej probówce i rozcieńczyć zawiesinę komórkową 12 mililitrami zimnego roztworu KB.
Przechowywać probówkę płasko w temperaturze pokojowej, wykonać pięć innych 12-minutowych cykli trawienia z trzema mililitrami EB dwa w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zebrać bufor zawierający miocyty w każdym cyklu w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Należy również pamiętać, aby rozcieńczyć trzymililitrowy zebrany bufor 12 mililitrami roztworu KB w każdym cyklu. Na koniec przechowuj sześć komórek zawierających probówki w temperaturze pokojowej.
Na tym etapie dodaj jeden miligram na mililitr albuminy surowicy bydlęcej do 20 mililitrów bezwapniowego buforu tyro. Następnie przefiltruj roztwór, a następnie odwiruj sześć miocytów zawierających stożkowe probówki o zawartości 100 sera przez pięć minut. Aby zmusić miocyty do osiadania, należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w każdej probówce ze zmienną ilością BSA zawierającą gruźlicę w temperaturze pokojowej.
Stopniowo zwiększaj stężenie wapnia w komórce zawierającej bufor, dodając małe OTT o stężeniu 100 milimoli na litr roztworu chlorku wapnia w pierwszym i drugim etapie. Stężenie wapnia podnosi się odpowiednio do 50 mikro trzonowców na litr i 100 mikro molowców na litr. Następujące etapy dodawania wapnia są wykonywane co pięć minut, a stężenie zwiększa się o 100 mikromoli na litr na każdym etapie do końcowego stężenia 0,9 milimola na litr.
Aby ocenić wydajność procedury izolacji, przenieś 0,5 mililitra roztworu zawierającego miocyty na szklaną dolną komorę mikroskopu. Oceń 15 pól mikroskopowych przy 10-krotnym powiększeniu obiektywu i oblicz procent zdrowych miocytów, takich jak komórki w kształcie pręcików z wyraźnymi prążkami i bez znaczących wtrąceń. Oczekiwane plony powinny wynosić około 20%, aby wykazać ocenę funkcjonalną ludzkich kardiomiocytów, w tym jednoczesne zapisy potencjałów czynnościowych i wewnątrzkomórkowych przepływów wapnia.
Najpierw należy przygotować roztwór pipety do eksperymentów z zaciskiem krosowym w konfiguracji z plastrem perforowanym. Następnie dodaj 1,8 milimola chlorku wapnia do gruźlicy wolnej od wapnia. Roztwór należy stosować do superfuzji kardiomiocytów podczas eksperymentów fluorescencyjnych z klamrą plastrową.
Następnie przenieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej do 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 10 mikromolów na litr grypy i 10 mikrolitrów obciążenia mocy. Koncentrat inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej ustawionej w pozycji poziomej. Następnie ustaw probówkę w pozycji pionowej i pozostaw komórki na pięć minut, aby się uspokoiły.
Następnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze wapniowym zawierającym gruźlicę. Przenieś punkt 25 mililitrów zawiesiny komórek do małej komory rejestracyjnej zamontowanej pod mikroskopem o kontrolowanej temperaturze. Super stopiony grawitacyjnie z podgrzewanym systemem mikro fuer o natężeniu przepływu 0,3 mililitra na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Za pomocą ściągacza do mikropipet przygotuj pipety z zaciskiem krosowym o średnicy końcówki od trzech do pięciu mikrometrów i rezystancji od trzech do 4,5 megaoma po napełnieniu ps. Następnie dodaj amfoterycynę B do PS w ilości 250 mikrogramów na mililitr i użyj jej do napełnienia elektrod, a następnie zamontuj elektrodę na uchwycie pipety. Następnie wybierz komórkę w kształcie Rona z wyraźnymi prążkami i pozbawioną inkluzji.
Uformuj giga seal i odczekaj od pięciu do 10 minut, aż rezystancja dostępu spadnie poniżej 20 omów. Następnie wyzwalaj potencjały czynnościowe w aktualnym trybie cęgowym za pomocą krótkich impulsów o różnych częstotliwościach stymulacji. Podczas fazy nagrywania włącz oświetlenie jasnego pola o długości fali 492 nanometry i wykryj fluorescencję Fluor fort o długości fali od 505 do 520 nanometrów.
Następnie uzyskaj sygnały fluorescencji i potencjału błonowego. Rysunek ten przedstawia zmiany potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach komorowych z próbek HCM. Oto reprezentatywne nałożone potencjały czynnościowe wywołane przy 0,2 Hz, 0,5 Hz i jednym hercu z miocytu kontrolnego i miocytu HCM.
Nałożone potencjały czynnościowe o częstotliwości 0,5 herca z miocytu kontrolnego. Przy braku i obecności od 10 do siedmiu molowych izoproterenolu pokazano, a oto reprezentatywny ślad potencjału błonowego kardiomiocytu od pacjenta z HCM, który wykazywał kilka spontanicznych depolaryzacji wcześnie po depolaryzacjach. Rysunek przedstawia zmiany przejściowego wapnia w kardiomiocytach komorowych z próbek HCM.
Oto reprezentatywny nałożony przejściowy wapń wywołany podczas stymulacji z częstotliwością 0,2 Hz za pomocą pipety z plastrem w kontrolnym miocycie i komórce HCM. Pokazano kinetykę przejściowych stanów wapnia w kardiomiocytach HCM i kontrolnych w różnym czasie, a oto reprezentatywne długie ślady pokazujące wewnątrzkomórkowy wapń podczas stymulacji przy trzech różnych częstotliwościach, co podkreśla zwiększony rozkurczowy wapń przy wysokich szybkościach stymulacji w miocytach HCM. Rysunek ten przedstawia dodatkowe zastosowania eksperymentalne z wykorzystaniem ludzkich miocytów komorowych.
Reprezentatywne nałożone ślady pokazujące prąd wapnia typu L zarejestrowany przy różnych napięciach błony pokazano po lewej stronie, a średnia gęstość szczytowa prądu wapniowego typu L z 18 komórek wyizolowanych z próbek HCM przy różnych napięciach błonowych jest pokazana po prawej stronie, a pokazano tutaj wewnątrzkomórkowy ślad wapnia zarejestrowany z miocytu komorowego podczas stymulacji polem elektrycznym w jednym hercu. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby rozpocząć procedurę wkrótce po pobraniu próbki z sali operacyjnej, aby zapewnić ses Po tej procedurze należy wyizolować ludzkie kardiomiocyty komorowe. Można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna stylu życia lub immunochemia, co będzie miało kluczowe znaczenie dla odpowiedzi na podstawowe pytania, takie jak na przykład, w jaki sposób subkomórkowa lokalizacja struktur błonowych i jednostek uwalniających wapń jest hamowana w chorobach serca po jego rozwoju.
Technika ta utorowała drogę w kardiologii komórkowej do badania nieprawidłowości funkcjonalnych w kardiomiocytach komorowych i testowania potencjalnej użyteczności nowych opcji terapeutycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować żywotne pojedyncze kardiomiocyty od próbek ludzkich i jak scharakteryzować funkcję komórek w różnych warunkach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę izolowania żywych ludzkich kardiomiocytów z małych chirurgicznych próbek mięśnia sercowego komór prawej. Izolowanych komórek można wykorzystać do badań elektrofizjologicznych i testów leków, dostarczając informacji na temat chorób serca.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Fizjologia układu krążenia
- Elektrofizjologia
- Biologia komórki
Tło
- Obecne badania nad chorobami serca głównie wykorzystują modele zwierzęce.
- Ludzkie miocyty komór prawej są niezwykle ważne dla zrozumienia funkcji serca człowieka.
- Izolowanie żywych kardiomiocytów z ludzkich próbek stwarza unikalne wyzwania.
- Kardiomiopatia przerostowa jest stanem, który wpływa na funkcjonowanie kardiomiocytów.
Cel badania
- Izolowanie żywych kardiomiocytów z ludzkich próbek komór prawej.
- Charakteryzowanie zmian funkcjonalnych w tych komórkach.
- Ułatwienie badań elektrofizjologicznych i testów leków.
Zastosowane metody
- Zbieranie i drobne krojenie świeżych próbek mięśnia sercowego w lodowatej roztworze kardioplegicznym.
- Stopniowe trawienie kawałków mięśnia za pomocą niestandardowego urządzenia do trawienia i enzymatycznych roztworów.
- Zbieranie bufora zawierającego komórki w cyklach i rozcieńczanie go roztworem zachowującym komórki.
- Ponownoje zawieszenie komórek w roztworze fizjologicznym w celu charakteryzacji funkcjonalnej.
Główne wyniki
- Udane izolowanie żywych kardiomiocytów z ludzkich próbek.
- Charakteryzowanie czasu trwania potencjału czynnościowego i cyklu wapnia wewnątrzkomórkowego.
- Identyfikacja zmian funkcjonalnych w kardiomiocytach pacjentów z przerostem mięśnia sercowego.
- Zastosowanie nagrań z techniką patch clamp i barwników fluorescencyjnych do oceny.
Wnioski
- Metoda pozwala na badanie funkcji ludzkich kardiomiocytów.
- Uzyskane informacje mogą poprawić zrozumienie chorób serca.
- To podejście może poprawić testowanie leków i strategie terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct isolation and functional characterization of human ventricular cardiomyocytes from surgical samples addresses a critical translational gap between animal models and human cardiac disease biology. This capability enables mechanistic de-risking and target validation in disease-relevant human systems, supporting predictive confidence for early-stage cardiac drug discovery. The approach enhances portfolio decision-making by providing actionable data on human-specific electrophysiological and calcium handling alterations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of disease mechanisms in primary human cardiomyocytes, clarifying therapeutic hypotheses.
- Supports functional target validation by quantifying action potential and calcium cycling abnormalities in patient-derived cells.
- Facilitates mechanistic de-risking for cardiac targets by revealing human-specific remodeling signatures.
Screening & Assay Development
- Provides validated human cardiomyocyte systems for downstream electrophysiological and calcium flux assays.
- Enables reproducible, quantitative measurement of drug effects on action potentials and intracellular calcium.
- Supports assay standardization and screening readiness for cardiac safety and efficacy profiling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical testing with human disease biology by using patient-derived ventricular myocytes.
- Enables translational biomarker development through direct measurement of functional endpoints in human cells.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by bridging discovery and preclinical validation in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct human target validation, assay development, and translational research for cardiac indications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification in human cardiac tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in validated human systems.
- Analytics: Provides electrophysiological and calcium flux measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects early discovery findings to preclinical endpoints using patient-derived cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional testing of novel cardiac therapeutics in human cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac drug discovery.
- Operational Value: Standardizes isolation and functional assessment of human cardiomyocytes for scalable workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by grounding discovery in human biology.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human tissue handling and advanced electrophysiological techniques.
- Demands specialized instrumentation for patch clamp and calcium imaging analyses.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cardiac disease models or tissue sources.
- Sample availability and timing are practical constraints for routine implementation.
