Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie żywotnych kardiomiocytów z chorych próbek ludzkiej komory serca oraz charakterystyka ich zmian funkcjonalnych. Osiąga się to najpierw poprzez szybkie pobranie i posiekanie świeżych próbek komory w lodowatym roztworze kardioplegicznym, aby uniknąć nadmiernej degradacji tkanek i uszkodzenia komórek. Drugim krokiem jest przeprowadzenie stopniowego trawienia fragmentów mięśnia sercowego przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do trawienia oraz roztworów enzymatycznych.

W ciągu sześciu cykli zawartość komórki z buforem jest zbierana do probówki w każdym cyklu, a następnie rozcieńczana roztworem do konserwacji komórek. Końcowym etapem jest resuspensja komórek znajdujących się w sześciu probówkach w mniejszej objętości standardowego roztworu fizjologicznego o normalnym stężeniu wapnia w celu przeprowadzenia charakterystyki funkcjonalnej. Ostatecznie, do wykazania zmian w potencjale czynnościowym, czasie trwania potencjału oraz cyklu wapnia wewnątrzkomórkowego w kardiomiocytach pacjentów z przerostową kardiomiopatią, stosuje się rejestrację potencjałów czynnościowych metodą patch clamp oraz jednoczesną ocenę wapnia międzykomórkowego z użyciem barwników fluorescencyjnych.

Główną zaletą metody DYS w porównaniu z metodą 16, taką jak standardowa metoda dysocjacji fragmentów, jest to, że w połączeniu z roztworem enzymatycznym stosujemy specjalnie zaprojektowane urządzenie do trawienia, które umożliwia wspólną dysocjację różnych kardiomiocytów dzięki zastosowaniu krzemowych łopatek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu kardiologii, takie jak to, w jaki sposób znane przebudowy molekularne i strukturalne związane z chorobami serca przekładają się na zmiany w pojedynczych kardiomiocytach, które mogą być analizowane za pomocą naszej metody i będące celem działania konkretnych leków. W związku z tym zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię genetycznych chorób serca, takich jak przerostowa kardiomiopatia.

W rzeczywistości metodę tę można wykorzystać do testowania nowych podejść neuropatycznych na kardiomiocytach komorowych pobranych od pacjentów z przerostowymi lub niedokrwiennymi chorobami serca, którzy zostali poddani operacji kardiochirurgicznej. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas porównywania analogii między preparatami ludzkich tętnic a biopsjami komór uzyskanymi podczas operacji serca. Procedurę należy rozpocząć od nalania 40 ml roztworu kardioplegicznego do probówki o pojemności 50 ml i przechowywania jej w lodzie podczas transportu preparatu z sali operacyjnej do laboratorium izolacji komórek; należy szybko przetransportować preparat do laboratorium i rozpocząć jego przetwarzanie w ciągu 10 minut od momentu wycięcia próbki.

Kolejny zbiorczy preparat mięśnia komór myocardialnego z sali operacyjnej bezpośrednio po wycięciu. Przemyć go lodowatym roztworem CP i przechowywać w probówce, utrzymując preparat w lodowatym buforze CP. Następnie ostrożnie usunąć włóknistą warstwę wsierdzia za pomocą drobnych nożyczek.

Pokroić tkankę mięśnia sercowego na małe kawałki o długości od dwóch do trzech milimetrów, tak aby całkowita masa mięśnia komory na każdą izolację wynosiła od 100 mg do 1 g. Po przeniesieniu fragmentów do komory do skrobania urządzenia do trawienia, wymienić bufor CP w komorze na zimny bufor dysocjujący wolny od wapnia. Następnie umieścić urządzenie do trawienia w łaźni termostatycznej.

Ustaw kąpiel wodną na 37.5 °C i włącz ją. Następnie włącz silnik urządzenia do trawienia i ustaw prędkość obrotową na jedną obrotową na sekundę. Przeprowadź trzy cykle płukania w DB, wymieniając roztwór w komorze na czysty, nasycony tlenem DB o temperaturze 37 °C co osiem minut.

Następnie przygotować bufor enzymatyczny 1, dodając do roztworu DB kolagenazę typu V w stężeniu 250 units/mL oraz proteazę typu 24 w stężeniu 4 units/mL. Następnie przygotować bufor enzymatyczny 2, dodając kolagenazę w stężeniu 250 units/mL.

Nalej 5 µL roztworu DB do natlenionego EB 1 i podgrzej go do 37 °C. Następnie przeprowadź dwa 12-minutowe cykle trawienia w obrotowym urządzeniu do trawienia, stosując 3 mL 100% natlenionego EB 1 w temperaturze 37 °C. Po każdym cyklu usuń roztwór za pomocą aspiracji pipetą i go zutylizuj.

Następnie przygotuj sześć probówek o pojemności 15 ml do zbierania komórek oraz 80 ml roztworu craft brew w temperaturze 4 °C do elucji buforów; napowietrz EB two i ogrzej go do 37 °C. Następnie przeprowadź pierwszy 15-minutowy cykl trawienia z użyciem 3 ml 100% napowietrzonego EB two w temperaturze 37 °C. Po cyklu trawienia zbierz roztwór zawierający pierwsze odseparowane miocyty do probówki 15 ml i rozcieńcz zawiesinę komórkową 12 ml zimnego roztworu KB.

Przechowywać probówkę w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej, przeprowadzić pięć kolejnych 12-minutowych cykli trawienia z użyciem 3 ml buforu EB 2 w temperaturze 37 °C i zbierać bufor zawierający miocyty po każdym cyklu do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Należy pamiętać o rozcieńczeniu 3 ml zebranego buforu w 12 ml roztworu KB po każdym cyklu. Na koniec przechowywać sześć probówek z komórkami w temperaturze pokojowej.

W tym kroku należy dodać albuminę surowiczą bydlęcą w stężeniu 1 mg/ml do 20 ml buforu Tyro pozbawionego wapnia. Następnie należy przefiltrować roztwór, a potem odwirować sześć stożkowych probówek zawierających miocyty przy 100 g przez pięć minut. Aby wymusić osadzenie miocytów, należy usunąć supernatant i zawiesić komórki w każdej probówce w zmiennej ilości TB z dodatkiem BSA w temperaturze pokojowej.

Stopniowo zwiększaj stężenie wapnia w komórce zawierającej bufor, dodając małe ilości 100 mM roztworu chlorku wapnia w pierwszym i drugim kroku. Stężenie wapnia zostaje podniesione odpowiednio do 50 µM i 100 µM. Kolejne etapy dodawania wapnia wykonuje się co pięć minut, zwiększając stężenie o 100 µM w każdym kroku, aż do osiągnięcia stężenia końcowego 0,9 mM.

Aby ocenić wydajność procedury izolacji, przenieś 0,5 milliliters roztworu zawierającego miocyty do komory z szklanym dnem mikroskopu. Oceń 15 pól widzenia przy użyciu obiektywu o powiększeniu 10x i oblicz procent zdrowych miocytów, takich jak komórki o kształcie pręta z wyraźnymi prążkami i bez istotnych inkluzji. Oczekiwana wydajność powinna wynosić około 20%, aby umożliwić funkcjonalną ocenę ludzkich kardiomiocytów, w tym jednoczesne rejestrowanie potencjałów czynnościowych i wewnątrzkomórkowych przepływów jonów wapnia.

Najpierw należy przygotować roztwór do pipety do eksperymentów patch clamp w konfiguracji perforowanej membrany (perforated patch). Następnie do roztworu tb pozbawionego wapnia należy dodać 1,8 mM chlorku wapnia. Roztwór ten służy do superfuzji kardiomiocytów podczas eksperymentów patch clamp z wykorzystaniem fluorescencji.

Następnie przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki 1,5 ml i dodaj 10 µM flu fort oraz 10 µL power load. Inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej w pozycji poziomej. Następnie ustaw probówkę w pozycji pionowej i odstaw na pięć minut, aby komórki osiadły.

Następnie odpipetuj nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w buforze tb zawierającym wapń. Przenieś 25 ml zawiesiny komórkowej do małej, kontrolowanej temperaturowo komory rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie. Prowadź perfuzję grawitacyjną za pomocą podgrzewanego systemu mikroperfuzji z prędkością przepływu 0,3 ml/min w temperaturze 37 °C.

Używając wyciągacza mikrokapilar, przygotuj pipety do techniki patch clamp o średnicy końcówki od trzech do pięciu µm i oporności od trzech do 4,5 MΩ po napełnieniu roztworem PS. Następnie dodaj amfoterycynę B do PS w stężeniu 250 µg/mL i użyj tego roztworu do napełnienia elektrod, a następnie zamocuj elektrodę w uchwycie do pipet. W dalszej kolejności wybierz komórkę o kształcie Ron z wyraźnymi prążkami i bez inkluzji.

Utwórz giga-uszczelnienie (giga seal) i odczekaj od pięciu do 10 minut, aż rezystancja dostępu spadnie poniżej 20 ohm. Następnie wywołaj potencjały czynnościowe w trybie clampingu prądowego (current clamp), stosując krótkie impulsy o różnych częstotliwościach stymulacji. W fazie rejestracji włącz oświetlenie w polu jasnym przy 492 nanometrach i wykrywaj fluorescencję Fluor fort w zakresie od 505 do 520 nanometrów.

Następnie zarejestruj sygnały fluorescencji i potencjału błonowego. Rysunek ten przedstawia zmiany potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach komorowych z próbek HCM. Poniżej znajdują się reprezentatywne nałożone na siebie potencjały czynnościowe wywołane przy częstotliwości 0,2 Hz, 0,5 Hz i 1 Hz z miocytu kontrolnego oraz miocytu HCM.

Przedstawiono nałożone na siebie potencjały czynnościowe o częstotliwości 0,5 Hz z miocytu kontrolnego. Pokazano wyniki w obecności oraz w nieobecności izoproterenolu w stężeniu 10⁻⁷ M; tutaj znajduje się reprezentatywny zapis potencjału błonowego kardiomiocytu od pacjenta z HCM, w którym wystąpiło kilka spontanicznych depolaryzacji, czyli wczesnych depolaryzacji następczych. Rysunek przedstawia zmiany przejściowego stężenia wapnia w kardiomiocytach komorowych z próbek HCM.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne nałożone na siebie przemiany wapniowe wywołane stymulacją z częstotliwością 0,2 Hz za pomocą pipety patch w miocycie kontrolnym oraz komórce HCM. Przedstawiono kinetykę przemian wapniowych w kardiomiocytach HCM i kontrolnych w różnych odstępach czasu, a tutaj znajdują się reprezentatywne długie zapisy pokazujące wewnątrzkomórkowy poziom wapnia podczas stymulacji w trzech różnych częstotliwościach, co podkreśla zwiększony poziom wapnia rozkurczowego przy wysokich częstotliwościach stymulacji w miocycie HCM. Rycina ta przedstawia dodatkowe zastosowania eksperymentalne z wykorzystaniem ludzkich miocytów komór ventricular.

Po lewej stronie przedstawiono reprezentatywne nałożone zapisy prądu wapniowego typu L zarejestrowanego przy różnych napięciach błonowych, a po prawej stronie średnią szczytową gęstość prądu wapniowego typu L z 18 komórek wyizolowanych z próbek HCM przy różnych napięciach błonowych; zaprezentowano tutaj również zapis wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia zarejestrowany z miocytu komorowego podczas stymulacji polem elektrycznym z częstotliwością 1 Hz. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby rozpocząć ją krótko po pobraniu materiału z bloku operacyjnego, aby zapewnić żywotność po przeprowadzeniu tej procedury izolacji ludzkich kardiomiocytów komorowych. Można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna czasu rzeczywistego lub immunochemia, co będzie kluczowe dla odpowiedzi na fundamentalne pytania, na przykład w kwestii tego, jak lokalizacja subkomórkowa struktur błonowych i jednostek uwalniania wapnia ulega zmianie w chorobach serca po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę w kardiologii komórkowej do badania nieprawidłowości funkcjonalnych w kardiomiocytach komór komory oraz do testowania potencjalnej użyteczności nowych opcji terapeutycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować żywe pojedyncze kardiomiocyty z próbek ludzkich oraz jak charakteryzować funkcje komórek w różnych warunkach.