Name: Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywych ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych. Technika umożliwia badania elektrofizjologiczne i testowanie leków w kardiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez E.U. (STREP Project 241577 "BIG HEART", 7th European Framework Program, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) i Gilead Sciences (AM).

Protokoły eksperymentalne na tkance ludzkiej zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Szpitala Uniwersyteckiego Careggi (2006/0024713; odnowione w maju 2009). Każdy pacjent wyraził pisemną świadomą zgodę.
1. Przygotowanie rozwiązań i sprzętu
Rozwiązania są opisane w Tabeli 1. Uproszczony schemat blokowy procedury izolacji komórek znajduje się na rysunku 1.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Rozwiązanie</td>
			<td>Cp</td>
			<td>Db</td>
			<td>Baza wiedzy</td>
			<td>Tb</td>
			<td>PS</td>
			<td>EB1</td> powiedział:
			<td>EB2</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="23">Odczynnik (mM)</td>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>8</td>
			<td>Rozdział 1.2</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rozdział 1.2</td>
			<td>Rozdział 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPESY</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenozyna</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glukoza</td>
			<td>140</td> szt.
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>100</td> szt.
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tauryna</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawartość NaCl</td>
			<td></td>
			<td>Rozdział 113</td>
			<td></td>
			<td>136</td> Rozdział
			<td></td>
			<td>Rozdział 113</td>
			<td>Rozdział 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kcl</td>
			<td></td>
			<td>Rozdział 4.7</td>
			<td>Rozdział 85</td>
			<td>5.4</td>
			<td>25</td>
			<td>Rozdział 4.7</td>
			<td>Rozdział 4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rozdział 1.2</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td>0,6</td>
			<td>Rozdział 30</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,6</td>
			<td>0,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td></td>
			<td>0,6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,6</td>
			<td>0,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pirogronian</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM powiedział:</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHBA (Język BHBA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kwas bursztynowy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (EGTA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kwas pirogronowy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kreatyna</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMES (Organizacja Zarządzania</td> T
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rozdział 115</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Enzymy (U/ml)</td>
			<td>Kolagenaza typu V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Z kolei 250</td> szt.
			<td>Z kolei 250</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteaza typu XXIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph</td>
			<td></td>
			<td>7,4 KOH</td>
			<td>7.3 NaOH</td>
			<td>7,1 KOH</td>
			<td>7.35 NaOH</td>
			<td>7,2 KOH</td>
			<td>7.3 NaOH</td>
			<td>7.3 NaOH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Roztwory stosowane do pobierania próbek, izolacji komórek i charakterystyki funkcjonalnej miocytów. CP = roztwór kardioplegyczny; DB = bufor dysocjacyjny; KB = roztwór Krafta-Bruhe'a; TB = bufor tyrodowy; PS=roztwór do pipet; EB1 = bufor enzymatyczny 1; EB2 = bufor enzymatyczny 2.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór kardioplegiczny (CP). Roztwór CP można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.</li>
	<li>Przygotować bufor dysocjacyjny (DB) wolny odCa2+. Roztwór ten należy zużyć w ciągu jednego dnia.</li>
	<li>Przygotuj roztwór Krafta-Bruhe'a (KB). Roztwór KB można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.</li>
	<li>Przygotuj bufor tyrolski (TB) wolny od Ca2+. Roztwór ten należy zużyć w ciągu jednego dnia.</li>
	<li>Przed użyciem przefiltrować wszystkie roztwory za pomocą filtrów strzykawkowych.</li>
	<li>Przygotować urządzenie do wytrawiania (rysunek 2), pojemnik do skrobania wykonany z dwóch szczotek z elastomeru silikonowego, z których jedna obraca się za pomocą silnika elektrycznego. Urządzenie do wytrawiania jest wykonane na zamówienie. Szczegółowe informacje na temat urządzenia do wytrawiania znajdują się na rysunku 8; zdjęcia urządzenia znajdują się na rysunkach 2C i 2D. Umyj komorę na chusteczki 70% etanolem i wodą.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przetwarzanie próbek mięśnia sercowego
<ol>
	<li>Wlać 40 ml roztworu kardiplegicznego (CP) do probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w lodzie w celu transportu próbki z sali operacyjnej do laboratorium izolacji komórek.</li>
	<li>Natychmiast po wycięciu należy pobrać próbkę mięśnia sercowego z sali operacyjnej, przemyć ją lodowatym roztworem CP i przechowywać w probówce. Użyć próbek wsierdzia wyciętych z górnej przegrody międzykomorowej podczas operacji na otwartym sercu, o wadze >100 mg.</li>
	<li>Szybko przenieś próbkę do obszaru laboratoryjnego; rozpocznij przetwarzanie próbki w ciągu 10 minut od wycięcia próbki.</li>
	<li>Trzymając próbkę w lodowatym buforze CP, ostrożnie usuń warstwę zwłóknienia wsierdzia za pomocą cienkich nożyczek pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie pokrój tkankę mięśnia sercowego na małe kawałki (o długości 2-3 mm). W zależności od wielkości próbki tkanki, należy wyciąć całkowitą ilość mięśnia sercowego komory od 100 mg do 1 g na każdą izolację.</li>
	<li>Po zakończeniu mielenia tkanek przenieś kawałki mięśnia sercowego do urządzenia do trawienia za pomocą czystego, lodowatego roztworu CP. Unikaj wypełniania całej objętości między dwiema silikonowymi szczoteczkami (3-4 ml) kawałkami mięśnia sercowego, używając nie więcej niż 1 g całkowitej tkanki.</li>
</ol>
3. Mycie i trawienie kawałków mięśnia sercowego
<ol>
	<li>Po przeniesieniu kawałków do komory skrobania urządzenia do wytrawiania, należy wymienić bufor CP w komorze na zimny bufor dysocjacyjny wolny od Ca2+ (DB).</li>
	<li>Umieść urządzenie do wytrawiania w łaźni termostatycznej, tak aby komora miała kontakt z podgrzaną wodą w kąpieli (rysunek 1). Ustawić kąpiel na 37,5 °C i włączyć ją, aby powoli podnosić temperaturę komory na chusteczki. Włącz silnik urządzenia do wytrawiania, ustawiając prędkość obrotową na 1 obrót/sekundę.</li>
	<li>Wykonaj 3 cykle płukania z DB, zmieniając roztwór w komorze z czystym DB co 8 minut. DB jest podgrzewany (37 °C) i nasycany tlenem przed kontaktem z fragmentami mięśnia sercowego.</li>
	<li>Przygotować bufor enzymatyczny 1 (EB1), dodając 250 U/ml kolagenazy typu V i 4 U/ml proteazy typu XXIV do roztworu DB. Przygotować bufor enzymatyczny 2 (EB2), dodając 250 j./ml kolagenazy typu V do roztworu DB. Rozgrzać (37 °C) i natlenić EB1 i EB2.</li>
	<li>Wykonać dwa 12-minutowe cykle wytrawiania w obrotowym urządzeniu do wytrawiania ze 100% natlenionym EB1 (w temperaturze 37 °C). W każdym cyklu należy użyć ~3 ml EB1. Usunąć roztwór przez aspirację pipetą i wyrzucić go po każdym cyklu.</li>
	<li>Przygotować 6 probówek o pojemności 15 ml do zbierania komórek i ~80 ml zimnego (4 °C) roztworu KB do elucji.</li>
	<li>Wykonać pierwszy 15-minutowy cykl trawienia z 3 ml 100% natlenionego EB2 w temperaturze 37 °C. Po cyklu trawienia zebrać roztwór zawierający pierwsze zdysocjowane miocyty w probówce o pojemności 15 ml i rozcieńczyć zawiesinę komórkową 12 ml zimnego roztworu KB. Przechowywać probówkę płasko w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć pozostały roztwór EB2 równą ilością DB w celu zmniejszenia o połowę stężenia kolagenazy V w następnych cyklach trawienia.</li>
	<li>Wykonać pozostałe 5 12-minutowych cykli trawienia z 3 ml EB2 w temperaturze 37 °C; po każdym z nich zebrać bufor zawierający miocyty w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i rozcieńczyć go 12 ml roztworu KB. Przechowuj probówki zawierające 6 ogniw w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
4. Ponowne zawieszenie komórek i readaptacja Ca2+
<ol>
	<li>Dodać 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 20 ml buforu tyrolskiego (TB) wolnego odCa2+. Przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Odwirować sześć miocytów zawierających stożkowe rurki o masie 100 x g przez 5 minut, aby zmusić miocyty do osiadania. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w każdej probówce zmienną ilością (1-3 ml, w zależności od wydajności) BSA zawierającej gruźlicę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj stężenieCa2+ w komórce zawierającej bufor, dodając małe podwielokrotności 100 mmol/L roztworu CaCl2. W pierwszym i drugim etapie stężenie Ca2+ podnosi się odpowiednio do 50 μmol/L i 100 μmol/L. Następujące etapy dodawania Ca2+ wykonuje się co 5 minut, a stężenie zwiększa się o 100 μmol/L na każdym etapie do końcowego stężenia 0,9 mmol/L.</li>
	<li>Oceń wydajność procedury izolacji. Przenieść 0,5 ml roztworu zawierającego miocyty na szklaną dolną komorę mikroskopu. Oceń 15 pól mikroskopowych przy 10-krotnym powiększeniu obiektywu i oblicz procent zdrowych miocytów (np. komórki w kształcie pręcików z wyraźnymi prążkami i bez znaczących inkluzji, ryc. 2). Oczekiwany plon wynosi około 20 %.</li>
</ol>
5. Ocena funkcjonalna izolowanych kardiomiocytów.
Poniższy protokół jest przykładem oceny funkcjonalnej ludzkich kardiomiocytów, w tym jednoczesnych zapisów potencjałów czynnościowych i wewnątrzkomórkowych strumieni Ca2+.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór pipet (PS) do eksperymentów z zaciskiem krosowym w konfiguracji z perforowaną łatą. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	<li>Dodać 1,8 mmol/L CaCl2 do Ca2+-free Tyrode buffer (TB). Użyj tego roztworu do superfuzji kardiomiocytów podczas eksperymentów z klamrą łatową/fluorescencyjną.</li>
	<li>Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 10 μmol/l Fluoforte i 10 μl koncentratu Powerload. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ustawić probówkę w pozycji pionowej i pozostawić komórkę na 5 minut, aby się uspokoiła; ponownie zawiesić komórki w Ca2+ zawierających gruźlicę.</li>
	<li>Przenieść 0,25 ml zawiesiny komórek do małej (0,5 ml), zamontowanej pod mikroskopem komory rejestracyjnej o kontrolowanej temperaturze, przelanej grawitacyjnie za pomocą podgrzewanego systemu mikroperfuzorów o natężeniu przepływu 0,3 ml/min (temperatura: 37 ± 0,5 °C).</li>
	<li>Za pomocą ściągacza do mikropipet przygotuj pipety typu patch clamp o średnicy końcówki od 3 do 5 μm i rezystancji od 3 do 4,5 m po napełnieniu PS.</li>
	<li>Dodać amfoterycynę B do partii PS (250 μg/ml) i użyć jej do wypełnienia elektrod. </li>
	<li>Wybierz komórkę w kształcie pręta z wyraźnymi prążkami, pozbawioną inkluzji, uformuj giga seal i odczekaj od 5 do 10 minut, aż rezystancja dostępu spadnie poniżej 20 MΩ.</li>
	<li>Uwolnij potencjały czynnościowe w aktualnym trybie cęgowym za pomocą krótkich impulsów (< 3 ms) przy różnych częstotliwościach stymulacji (0,2 Hz, 0,5 Hz i 1 Hz, 1 min przy każdej częstotliwości). Podczas fazy nagrywania włącz oświetlenie jasnego pola przy 492 ± 3 nm i wykryj fluorescencję Fluoforte przy 505-520 nm. Pozyskiwanie sygnałów fluorescencji i potencjału błonowego za pomocą oprogramowania Digidata 1440A i pClamp 10.0. W razie potrzeby powtórz sekwencję nagrywania wiele razy; Należy jednak utrzymać całkowity czas nagrywania poniżej 15 minut dla każdej komórki.</li>
</ol>

<ol><li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cardiac+myocytes.+I.+Preparation+of+adult+myocytes+and+their+homology+with+the+intact+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue.</a> Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).</li>
<li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cardiac+myocytes.+II.+Functional+aspects+of+mature+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells.</a> Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).</li>
<li>Harding, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+dependence+of+contraction+velocity+in+single+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardioscience%22%5BJournal%5D)">Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes.</a> Cardioscience. 1, 49-53 (1990).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Medical+Association+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+calcium-current+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+handling+in+isolated+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation. 85, 1046-1055 (1992).</li>
<li>Cohen, N. M., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+in+single+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Calcium current in single human cardiac myocytes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+K%2B+currents+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation Research. 73, 379-385 (1993).</li>
<li>Virag, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+the+delayed+rectifier+potassium+current+in+undiseased+human+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes.</a> Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).</li>
<li>Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+ventricular+and+atrial+cardiomyocytes%3A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Cardioscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note.</a> Cardioscience. 4, 111-116 (1993).</li>
<li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+inward+current+in+single+cells+isolated+from+adult+human+ventricles.+Pflugers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).</li>
<li>Verkerk, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+delayed+afterdepolarizations+in+ventricular+cells+isolated+from+human+end-stage+failing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts.</a> Circulation. 104, 2728-2733 (2001).</li>
<li>Cerbai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hyperpolarization-activated+current%2C+I%28f%29%2C+in+ventricular+myocytes+from+human+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart.</a> Circulation. 95, 568-571 (1997).</li>
<li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li>
<li>Tomaselli, G. F., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+remodeling+in+hypertrophy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure.</a> Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).</li>
<li>Maron, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).</li>
<li>Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+from+developmental+biology+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).</li>
<li>Maron, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy+is+predominantly+a+disease+of+left+ventricular+outflow+tract+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction.</a> Circulation. 114, 2232-2239 (2006).</li>
<li>Peeters, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+human+ventricular+myocytes+from+single+endocardial+and+epicardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies.</a> The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).</li>
<li>Lippiat, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recording+using+the+perforated+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique.</a> Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127, 575-584 (2013).</li>
<li>Kuusisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-grade+inflammation+and+the+phenotypic+expression+of+myocardial+fibrosis+in+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy.</a> Heart. 98, 1007-1013 (2012).</li>
<li>Yan, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+2+early+afterdepolarization+as+a+trigger+of+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+acquired+long-QT+syndrome+%3A+direct+evidence+from+intracellular+recordings+in+the+intact+left+ventricular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall.</a> Circulation. 103, 2851-2856 (2001).</li>
<li>Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+outward+and+delayed+rectifier+currents+in+canine+atrium%3A+properties+and+role+of+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods.</a> The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).</li>
<li>Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+two+components+of+delayed+rectifier+K%2B+current+in+human+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes.</a> Circulation research. 78, 689-696 (1996).</li>
<li>Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+IKr+and+IKs+heterogeneity+on+action+potential+duration+and+its+rate+dependence%3A+a+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study.</a> Circulation. 99, 2466-2474 (1999).</li>
<li>Volders, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+contribution+of+IKs+to+canine+ventricular+repolarization%3A+key+role+for+beta-adrenergic+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation.</a> Circulation. 107, 2753-2760 (2003).</li>
<li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoproterenol+antagonizes+prolongation+of+refractory+period+by+the+class+III+antiarrhythmic+agent+E-4031+in+guinea+pig+myocytes.+Mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action.</a> Circulation Research. 68, 77-84 (1991).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+pre-clinical+rationale+and+design+of+a+prospective+randomized+pilot+trial+with+ranolazine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine.</a> Circulation. 125, 1(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy i zwalidowaliśmy metodę izolowania żywotnych miocytów z próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Opierając się na wcześniej opisanych protokołach, które z powodzeniem zastosowano do izolacji komórek z przedsionkowych próbek chirurgicznych, opracowano i dopracowano technikę umożliwiającą oddzielenie pojedynczych żywotnych miocytów od chorego mięśnia sercowego komorowego. Wczesne doniesienia wykazały, że izolacja pojedynczych kardiomiocytów z fragmentów tkanki przedsionkowej i komorowej sele...

Analiza właściwości elektrofizjologicznych mięśnia sercowego znacznie się rozwinęła po opracowaniu technik izolacji pojedynczych miocytów serca. Niedawne postępy w zrozumieniu sprzężenia skurczowego pobudzenia serca (EC-Coupling) stały się również możliwe dzięki możliwości izolowania żywotnych pojedynczych kardiomiocytów, które zachowują wszystkie fizjologiczne właściwości nienaruszonej tkanki. Metody zacisków krosowych są rutynowo stosowane do badania funkcji i farmakologicznej modulacji prądów jonowych sarkolemmalnych serca. Zapisy wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia z barwnikami wrażliwymi na Ca2 + są również regularnie wykonywane na pojedynczych miocytach serca z różnych zdrowych i chorych modeli, dostarczając istotnych danych na temat fizjologii sprzężenia EC, a także na temat patologicznych zmian wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2 + prowadzących do upośledzenia mechanicznego i zwiększonego obciążenia arytmogennego w chorobach serca. Informacje z tych badań mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia elektrofizjologicznych i mechanicznych skutków leków w warunkach klinicznych. Istnieją jednak specyficzne dla gatunku różnice w prądach transbłonowych i białkach sprzęgających EC, które odpowiadają za specyficzne cechy potencjału czynnościowego serca i mechaniki serca. Tak więc, podczas gdy badania miocytów wyizolowanych od ssaków innych niż ludzie wyjaśniły właściwości biofizyczne i fizjologiczne role określonych transbłonowych kanałów jonowych i białek sprzęgających EC, niekoniecznie dostarczają odpowiednich modeli ludzkich miocytów sercowych. Izolacja żywotnych miocytów z ludzkiego mięśnia sercowego jest zatem niezbędna, aby w pełni zrozumieć patofizjologię chorób serca i zweryfikować nowatorskie podejścia terapeutyczne.
Ludzka tkanka przedsionkowa jest łatwo dostępna, ponieważ przydatki przedsionkowe są często odrzucane podczas zabiegów chirurgicznych. We wstępnych badaniach ilościowych potencjałów czynnościowych serca i prądów jonowych dorosłego człowieka wykorzystano enzymatycznie izolowane komórki przedsionkowe1-4. Zapisy potencjałów czynnościowych lub prądów z izolowanych dorosłych ludzkich komórek komorowych zostały następnie zgłoszone3,5-10. W większości tych badań wykorzystano komórki uzyskane z eksplantowanych serc i wykorzystano albo perfuzję kolagenazy odcinka tętnicy wieńcowej, albo ekspozycję stosunkowo dużych ilości wyciętej tkanki na kolagenazę w celu uzyskania izolowanych komórek. Badania te pozwoliły na szczegółową charakterystykę szeregu transbłonowych prądów jonowych z ludzkich kardiomiocytów komorowych ze zdrowych serc oraz od pacjentów z terminalną niewydolnością serca. Zgłoszono zapisy prądu Ca2+ typu L (ICa-L)5-7, przejściowego prądu potasowego wychodzącego (Ido)8, prądu potasowego prostownika wewnętrznego (Iκ1)8, różnych składników opóźnionego prądu potasowego prostownika (Iκ)9. Postępy i udoskonalenie proceduryizolacji10 pozwoliły na jasne scharakteryzowanie jonowych podstaw zwiększonego potencjału arytmogennego w terminalnej niewydolności serca, obejmującego wydłużenie potencjału czynnościowego11, opóźnione po depolaryzacjach12 i zwiększony prąd zabawny13 prowadzące do depolaryzacji rozkurczowej i przedwczesnych uderzeń.
Dorosłe miocyty serca są zwykle izolowane od małych zwierząt poprzez wsteczną perfuzję całego serca za pomocą różnych mieszanin enzymów, technika, która daje wysoką wydajność komórek tolerujących Ca2+ 14. Izolacja miocytów serca z fragmentów tkanki jest z natury mniej skuteczna, prawdopodobnie ze względu na ograniczony dostęp enzymów do poszczególnych miocytów w porównaniu z tym, który osiąga się przez perfuzję tętnic wieńcowych. Ze względu na bardzo ograniczoną dostępność niewykorzystanych serc dawców, jedynym praktycznym sposobem na regularne uzyskiwanie normalnych ludzkich komórek komorowych jest trawienie enzymatyczne często bardzo małych fragmentów tkanek wycinanych podczas planowych zabiegów chirurgicznych. Jedynym modelem choroby ludzkiej, który został dokładnie scharakteryzowany na poziomie komórkowym, jest nieuleczalna niewydolność serca, ze względu na dostępność do przeszczepionych serc. Jednak nieuleczalna niewydolność serca występuje u mniejszości pacjentów i często wiąże się z powszechną ścieżką ciężkiej przebudowy komórek mięśnia sercowego, która jest stosunkowo niezależna od podstawowej przyczyny15. Zdolność do oceny funkcji pojedynczych kardiomiocytów od pacjentów we wcześniejszym, niezawiłym stadium choroby ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia specyficznej patofizjologii różnych chorób dziedzicznych lub nabytych. Kardiomiopatia przerostowa (HCM) jest wymownym przykładem. HCM jest powszechną (1/500 osób) dziedziczną chorobą serca charakteryzującą się przerostem mięśnia sercowego, zwiększonym ryzykiem arytmogenności i zmianami skurczowymi spowodowanymi niedrożnością dróg odpływu i dysfunkcją rozkurczową16. Kardiomiocyty z serc HCM przechodzą złożone procesy przebudowy obejmujące zmiany w strukturze komórkowej (przerost, nieład miofibrylarny) i sprzężenie EC17. Jednak większość informacji na temat dysfunkcji miocytów w HCM pochodzi z transgenicznych modeli zwierzęcych. Ponieważ tylko mniejszość pacjentów z HCM ewoluuje w kierunku nieuleczalnej niewydolności serca i wymaga przeszczepu serca, serca HCM są bardzo rzadko dostępne do izolacji komórek standardowymi metodami. Jednak u co najmniej 30% pacjentów z HCM rozwijają się objawy obturacyjne z powodu masywnego przerostu przegrody zmieniającego przepływ krwi w drogach odpływu podczas skurczu (HCM)18. Najskuteczniejszą dostępną opcją terapeutyczną w celu złagodzenia niedrożności w HCM jest chirurgiczna miektomia przegrody nosowej: podczas tego zabiegu chirurgicznego część górnej przegrody jest usuwana o zmiennej wielkości z dostępu przezaortalnego. Ta część przerośniętej przegrody jest zatem dostępna do izolacji komórek ze świeżej tkanki.
Metoda izolacji ludzkich miocytów komorowych z pojedynczych, małych próbek z przezżylnej biopsji endomięśnia sercowego została wcześniej opracowana i opublikowana19. Wdrożyliśmy metodę izolacji pojedynczych miocytów przegrody od próbek mięśnia sercowego komorowego od pacjentów poddawanych zabiegom kardiochirurgicznym, w tym pacjentów z HCM poddawanych miektomii przegrody oraz pacjentów poddawanych zabiegom wymiany zastawki. Oprócz szczegółowego opisu protokołu izolacji przedstawiono reprezentatywne pomiary elektrofizjologiczne i fluorescencjiCa2+, wykazujące żywotność izolowanych miocytów komorowych człowieka oraz wykonalność badań patch clamp i wewnątrzkomórkowych Ca2+.

<table><tbody><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp; region=IT">P9791 </a></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny(MgSO4*7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp; region=IT">M1880 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp; region=IT">H3375 </a></td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp; region=IT">A9251 </a></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp; region=IT">G8270 </a></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp; region=IT">M4125 </a></td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp; region=IT">S7653</a></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp; region=IT">P9333 </a></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp; region=IT">S7907 </a></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp; region=IT">S6297 </a></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu (KHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp; region=IT">237205</a></td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp; region=IT">P2256 </a></td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanodion monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp; region=IT">B0753 </a></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp; region=IT">S8045 </a></td><td></td></tr><tr><td>L-sól monopotasowa kwasu glutaminowego jednowodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp; region=IT">49601</a></td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp; region=IT">107360</a></td><td></td></tr><tr><td>3-Kwas hydroksymasłowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp; region=IT">166898</a></td><td></td></tr><tr><td>Sól dipotasowa 5&trifosforanu adenozyny dwuwodna (K2-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp; region=IT">A8937</a></td><td></td></tr><tr><td>Kreatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp; region=IT">C0780 </a></td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp; region=IT">S3674 </a></td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy kwas (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp; region=IT">E0396 </a></td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp; region=IT">A0281</a></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp; region=IT">M8266 </a></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp; region=IT">C9263 </a></td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza, Bakteryjna, Typ XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia, ~1 M w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp; region=IT">21115</a></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia 0,1 M roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp; region=IT">53704</a></td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp; region=IT">83000</a></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik FluoForte</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-52015</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat Powerload, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>Perfuzja Fast-Step System</td><td>Warner</td><td>Instruments VC-77SP</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B rozpuszczona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp; region=IT">A9528 </a></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B wzmacniacz patch-clamp</td> Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0&nbsp;</td>Urządzenie <td></td><td></td>do trawienia <td>molekularnego</td></tr><tr><td></td><td>NIESTANDARDOWE</td><td>NIESTANDARDOWE</td><td>Urządzenie jest wykonane na zamówienie w naszym laboratorium przy użyciu plastikowych rurek, odlewanego Sylgarda i silnika; jest szczegółowo opisane na rysunku 1C-1D i na rysunku 7. Na życzenie możemy podać dalsze szczegóły.</td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy do szczotek urządzenia do mineralizacji</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>Silnik obrotowy o zmiennej prędkości obrotowej do urządzenia do mineralizacji</td><td>Crouzet</td><td>Crouzet 178-4765</td><td></td></tr><tr><td>Forma do szczotek odlewniczych</td><td>nie dotyczy</td><td>Nie</td> dotyczy<td>Forma jest wykonana na zamówienie ze standardowych prętów PTFE o średnicy 2,5 cm.</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Kardiomiocyty z chorych serc są poddawane złożonym procesom przebudowy, obejmującym zmiany w strukturze komórki, sprzężenie skurczu wzbudzenia i prądy jonów błonowych. Zmiany te mogą być odpowiedzialne za zwiększone ryzyko arytmogennej i zmian skurczowych prowadzących do dysfunkcji skurczowej i rozkurczowej u pacjentów kardiologicznych. Jednak większość informacji na temat zmian funkcji miocytów w chorobach serca pochodzi z modeli zwierzęcych.
Tutaj opisujemy i zatwierdzamy protokół izolacji żywotnych miocytów z małych próbek chirurgicznych mięśnia sercowego komorowego od pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym. Protokół jest szczegółowo opisany. Przedstawiono elektrofizjologiczne i wewnątrzkomórkowe pomiary wapnia w celu wykazania wykonalności szeregu pomiarów pojedynczych komórek w ludzkich kardiomiocytach komorowych uzyskanych tą metodą.
Opisany tutaj protokół może być przydatny do przyszłych badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami funkcjonalnych zmian ludzkiego serca w obecności różnych chorób serca. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji nowych celów terapeutycznych na poziomie komórkowym oraz do testowania skuteczności nowych związków na ludzkich kardiomiocytach o bezpośredniej wartości translacyjnej.

Opisana powyżej metoda została zastosowana do charakterystyki nieprawidłowości funkcjonalnych kardiomiocytów wyizolowanych z przegrody międzykomorowej pacjentów z przerostową kardiomiopatią (HCM), którzy zostali poddani operacji miektomii, w porównaniu z pacjentami operacyjnymi bez niewydolności i przerostu serca21. Wyniki zawarte w tej sekcji pochodzą z tej pracy21 i są tu przedstawione jako przykład wykorzystania tej techniki do charakterystyki zmian w funkcji komórek mięśnia sercowego w stanach c...

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie żywotnych kardiomiocytów z chorych próbek ludzkiej komory serca oraz charakterystyka ich zmian funkcjonalnych. Osiąga się to najpierw poprzez szybkie pobranie i posiekanie świeżych próbek komory w lodowatym roztworze kardioplegicznym, aby uniknąć nadmiernej degradacji tkanek i uszkodzenia komórek. Drugim krokiem jest przeprowadzenie stopniowego trawienia fragmentów mięśnia sercowego przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do trawienia oraz roztworów enzymatycznych.W ciągu sześciu cykli zawartość komórki z buforem jest zbierana do probówki w każdym cyklu, a następnie rozcieńczana roztworem do konserwacji komórek. Końcowym etapem jest resuspensja komórek znajdujących się w sześciu probówkach w mniejszej objętości standardowego roztworu fizjologicznego o normalnym stężeniu wapnia w celu przeprowadzenia charakterystyki funkcjonalnej. Ostatecznie, do wykazania zmian w potencjale czynnościowym, czasie trwania potencjału oraz cyklu wapnia wewnątrzkomórkowego w kardiomiocytach pacjentów z przerostową kardiomiopatią, stosuje się rejestrację potencjałów czynnościowych metodą patch clamp oraz jednoczesną ocenę wapnia międzykomórkowego z użyciem barwników fluorescencyjnych.Główną zaletą metody DYS w porównaniu z metodą 16, taką jak standardowa metoda dysocjacji fragmentów, jest to, że w połączeniu z roztworem enzymatycznym stosujemy specjalnie zaprojektowane urządzenie do trawienia, które umożliwia wspólną dysocjację różnych kardiomiocytów dzięki zastosowaniu krzemowych łopatek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu kardiologii, takie jak to, w jaki sposób znane przebudowy molekularne i strukturalne związane z chorobami serca przekładają się na zmiany w pojedynczych kardiomiocytach, które mogą być analizowane za pomocą naszej metody i będące celem działania konkretnych leków. W związku z tym zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię genetycznych chorób serca, takich jak przerostowa kardiomiopatia.W rzeczywistości metodę tę można wykorzystać do testowania nowych podejść neuropatycznych na kardiomiocytach komorowych pobranych od pacjentów z przerostowymi lub niedokrwiennymi chorobami serca, którzy zostali poddani operacji kardiochirurgicznej. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas porównywania analogii między preparatami ludzkich tętnic a biopsjami komór uzyskanymi podczas operacji serca. Procedurę należy rozpocząć od nalania 40 ml roztworu kardioplegicznego do probówki o pojemności 50 ml i przechowywania jej w lodzie podczas transportu preparatu z sali operacyjnej do laboratorium izolacji komórek; należy szybko przetransportować preparat do laboratorium i rozpocząć jego przetwarzanie w ciągu 10 minut od momentu wycięcia próbki.Kolejny zbiorczy preparat mięśnia komór myocardialnego z sali operacyjnej bezpośrednio po wycięciu. Przemyć go lodowatym roztworem CP i przechowywać w probówce, utrzymując preparat w lodowatym buforze CP. Następnie ostrożnie usunąć włóknistą warstwę wsierdzia za pomocą drobnych nożyczek.Pokroić tkankę mięśnia sercowego na małe kawałki o długości od dwóch do trzech milimetrów, tak aby całkowita masa mięśnia komory na każdą izolację wynosiła od 100 mg do 1 g. Po przeniesieniu fragmentów do komory do skrobania urządzenia do trawienia, wymienić bufor CP w komorze na zimny bufor dysocjujący wolny od wapnia. Następnie umieścić urządzenie do trawienia w łaźni termostatycznej.Ustaw kąpiel wodną na 37.5 °C i włącz ją. Następnie włącz silnik urządzenia do trawienia i ustaw prędkość obrotową na jedną obrotową na sekundę. Przeprowadź trzy cykle płukania w DB, wymieniając roztwór w komorze na czysty, nasycony tlenem DB o temperaturze 37 °C co osiem minut.Następnie przygotować bufor enzymatyczny 1, dodając do roztworu DB kolagenazę typu V w stężeniu 250 units/mL oraz proteazę typu 24 w stężeniu 4 units/mL. Następnie przygotować bufor enzymatyczny 2, dodając kolagenazę w stężeniu 250 units/mL.Nalej 5 µL roztworu DB do natlenionego EB 1 i podgrzej go do 37 °C. Następnie przeprowadź dwa 12-minutowe cykle trawienia w obrotowym urządzeniu do trawienia, stosując 3 mL 100% natlenionego EB 1 w temperaturze 37 °C. Po każdym cyklu usuń roztwór za pomocą aspiracji pipetą i go zutylizuj.Następnie przygotuj sześć probówek o pojemności 15 ml do zbierania komórek oraz 80 ml roztworu craft brew w temperaturze 4 °C do elucji buforów; napowietrz EB two i ogrzej go do 37 °C. Następnie przeprowadź pierwszy 15-minutowy cykl trawienia z użyciem 3 ml 100% napowietrzonego EB two w temperaturze 37 °C. Po cyklu trawienia zbierz roztwór zawierający pierwsze odseparowane miocyty do probówki 15 ml i rozcieńcz zawiesinę komórkową 12 ml zimnego roztworu KB.Przechowywać probówkę w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej, przeprowadzić pięć kolejnych 12-minutowych cykli trawienia z użyciem 3 ml buforu EB 2 w temperaturze 37 °C i zbierać bufor zawierający miocyty po każdym cyklu do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Należy pamiętać o rozcieńczeniu 3 ml zebranego buforu w 12 ml roztworu KB po każdym cyklu. Na koniec przechowywać sześć probówek z komórkami w temperaturze pokojowej.W tym kroku należy dodać albuminę surowiczą bydlęcą w stężeniu 1 mg/ml do 20 ml buforu Tyro pozbawionego wapnia. Następnie należy przefiltrować roztwór, a potem odwirować sześć stożkowych probówek zawierających miocyty przy 100 g przez pięć minut. Aby wymusić osadzenie miocytów, należy usunąć supernatant i zawiesić komórki w każdej probówce w zmiennej ilości TB z dodatkiem BSA w temperaturze pokojowej.Stopniowo zwiększaj stężenie wapnia w komórce zawierającej bufor, dodając małe ilości 100 mM roztworu chlorku wapnia w pierwszym i drugim kroku. Stężenie wapnia zostaje podniesione odpowiednio do 50 µM i 100 µM. Kolejne etapy dodawania wapnia wykonuje się co pięć minut, zwiększając stężenie o 100 µM w każdym kroku, aż do osiągnięcia stężenia końcowego 0,9 mM.Aby ocenić wydajność procedury izolacji, przenieś 0,5 milliliters roztworu zawierającego miocyty do komory z szklanym dnem mikroskopu. Oceń 15 pól widzenia przy użyciu obiektywu o powiększeniu 10x i oblicz procent zdrowych miocytów, takich jak komórki o kształcie pręta z wyraźnymi prążkami i bez istotnych inkluzji. Oczekiwana wydajność powinna wynosić około 20%, aby umożliwić funkcjonalną ocenę ludzkich kardiomiocytów, w tym jednoczesne rejestrowanie potencjałów czynnościowych i wewnątrzkomórkowych przepływów jonów wapnia.Najpierw należy przygotować roztwór do pipety do eksperymentów patch clamp w konfiguracji perforowanej membrany (perforated patch). Następnie do roztworu tb pozbawionego wapnia należy dodać 1,8 mM chlorku wapnia. Roztwór ten służy do superfuzji kardiomiocytów podczas eksperymentów patch clamp z wykorzystaniem fluorescencji.Następnie przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki 1,5 ml i dodaj 10 µM flu fort oraz 10 µL power load. Inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej w pozycji poziomej. Następnie ustaw probówkę w pozycji pionowej i odstaw na pięć minut, aby komórki osiadły.Następnie odpipetuj nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w buforze tb zawierającym wapń. Przenieś 25 ml zawiesiny komórkowej do małej, kontrolowanej temperaturowo komory rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie. Prowadź perfuzję grawitacyjną za pomocą podgrzewanego systemu mikroperfuzji z prędkością przepływu 0,3 ml/min w temperaturze 37 °C.Używając wyciągacza mikrokapilar, przygotuj pipety do techniki patch clamp o średnicy końcówki od trzech do pięciu µm i oporności od trzech do 4,5 MΩ po napełnieniu roztworem PS. Następnie dodaj amfoterycynę B do PS w stężeniu 250 µg/mL i użyj tego roztworu do napełnienia elektrod, a następnie zamocuj elektrodę w uchwycie do pipet. W dalszej kolejności wybierz komórkę o kształcie Ron z wyraźnymi prążkami i bez inkluzji.Utwórz giga-uszczelnienie (giga seal) i odczekaj od pięciu do 10 minut, aż rezystancja dostępu spadnie poniżej 20 ohm. Następnie wywołaj potencjały czynnościowe w trybie clampingu prądowego (current clamp), stosując krótkie impulsy o różnych częstotliwościach stymulacji. W fazie rejestracji włącz oświetlenie w polu jasnym przy 492 nanometrach i wykrywaj fluorescencję Fluor fort w zakresie od 505 do 520 nanometrów.Następnie zarejestruj sygnały fluorescencji i potencjału błonowego. Rysunek ten przedstawia zmiany potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach komorowych z próbek HCM. Poniżej znajdują się reprezentatywne nałożone na siebie potencjały czynnościowe wywołane przy częstotliwości 0,2 Hz, 0,5 Hz i 1 Hz z miocytu kontrolnego oraz miocytu HCM.Przedstawiono nałożone na siebie potencjały czynnościowe o częstotliwości 0,5 Hz z miocytu kontrolnego. Pokazano wyniki w obecności oraz w nieobecności izoproterenolu w stężeniu 10⁻⁷ M; tutaj znajduje się reprezentatywny zapis potencjału błonowego kardiomiocytu od pacjenta z HCM, w którym wystąpiło kilka spontanicznych depolaryzacji, czyli wczesnych depolaryzacji następczych. Rysunek przedstawia zmiany przejściowego stężenia wapnia w kardiomiocytach komorowych z próbek HCM.Poniżej przedstawiono reprezentatywne nałożone na siebie przemiany wapniowe wywołane stymulacją z częstotliwością 0,2 Hz za pomocą pipety patch w miocycie kontrolnym oraz komórce HCM. Przedstawiono kinetykę przemian wapniowych w kardiomiocytach HCM i kontrolnych w różnych odstępach czasu, a tutaj znajdują się reprezentatywne długie zapisy pokazujące wewnątrzkomórkowy poziom wapnia podczas stymulacji w trzech różnych częstotliwościach, co podkreśla zwiększony poziom wapnia rozkurczowego przy wysokich częstotliwościach stymulacji w miocycie HCM. Rycina ta przedstawia dodatkowe zastosowania eksperymentalne z wykorzystaniem ludzkich miocytów komór ventricular.Po lewej stronie przedstawiono reprezentatywne nałożone zapisy prądu wapniowego typu L zarejestrowanego przy różnych napięciach błonowych, a po prawej stronie średnią szczytową gęstość prądu wapniowego typu L z 18 komórek wyizolowanych z próbek HCM przy różnych napięciach błonowych; zaprezentowano tutaj również zapis wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia zarejestrowany z miocytu komorowego podczas stymulacji polem elektrycznym z częstotliwością 1 Hz. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby rozpocząć ją krótko po pobraniu materiału z bloku operacyjnego, aby zapewnić żywotność po przeprowadzeniu tej procedury izolacji ludzkich kardiomiocytów komorowych. Można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna czasu rzeczywistego lub immunochemia, co będzie kluczowe dla odpowiedzi na fundamentalne pytania, na przykład w kwestii tego, jak lokalizacja subkomórkowa struktur błonowych i jednostek uwalniania wapnia ulega zmianie w chorobach serca po ich opracowaniu.Technika ta utorowała drogę w kardiologii komórkowej do badania nieprawidłowości funkcjonalnych w kardiomiocytach komór komory oraz do testowania potencjalnej użyteczności nowych opcji terapeutycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować żywe pojedyncze kardiomiocyty z próbek ludzkich oraz jak charakteryzować funkcje komórek w różnych warunkach.

isolation-functional-characterization-human-ventricular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich komórek mięśnia sercowego komór z próbek chirurgicznych

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

W tym artykule przedstawiono metodę izolowania mezenchymalnych komórek zrębu serca z próbek bioptycznych endomiokardiów pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną. Opisano ich charakterystykę oraz protokół zwiększający ich różnicowanie adipogenne.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębowych serca z próbek bioptycznych endomięśnia sercowego pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Poznaj metodę izolacji żywych ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych. Technika umożliwia badania elektrofizjologiczne i testowanie leków w kardiologii.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Przeglądaj więcej filmów