F₁F_O Przygotowanie pęcherzyków ATPazy i technika wykonywania zapisów patch clamp błon pęcherzyków podmitochondrialnych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pęcherzyków F1 F zero APA z mózgu szczura w celu wykonania nagrań patch clamp. Osiąga się to poprzez usunięcie mózgu szczura i jego homogenizację. Drugim krokiem jest zakłócenie stref synaptycznych poprzez zastosowanie nacisku.

Następnie synaptosomy są nakładane na gradienty fiolki. Ostatnim krokiem jest inkubacja z cyfrą toiny i L w celu uzyskania końcowych pęcherzyków do rejestracji zacisku krosowego. Ważną funkcją mitochondriów jest produkcja TP w procesie fosforylacji oksydacyjnej.

Enzymem odpowiedzialnym za produkcję TP jest syntaza A TP zlokalizowana na wewnętrznej błonie mitochondriów. Aby szczegółowo zbadać funkcję syntazy A TP, izolujemy specjalne pęcherzyki submitochondrialne, które nazywamy SMV. Zawierają enzym syntazę A TP w konfiguracji wywróconej na lewą stronę.

Następnie rejestrujemy te SMV za pomocą elektrody krosowej i określamy nieszczelność ich membrany. To mówi nam o wydajności produkcji TP przez mitochondria. Dzisiaj tę procedurę zademonstruje Sylvia ti, adiunkt w moim laboratorium na Uniwersytecie Yale.

W tej procedurze, po uzyskaniu głowy szczura przez dekapitację, przetnij skórę, aby odsłonić czaszkę, a następnie delikatnie otwórz czaszkę, przecinając ją nożyczkami lub Ronsem. Następnie usuń mózg, zmiel mózg bez móżdżku, ostatecznie w izolacji, buforuj, a następnie przenieś go do pięciomililitrowego szklanego homogenizatora teflonowego, delikatnie homogenizuj tkankę 10 razy, w sumie około pięciu minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 1 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce stołowej.

Zachowaj supernatant z mitochondriami i synaptosomem i wyrzuć osad. Następnie odwiruj go ponownie 16 000 razy, G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce stołowej. Następnie odrzuć supernatant i ponownie zawieś podniebienie W 500 mikrolitrach buforu izolacyjnego rozerwij synaptosom za pomocą naczynia do rozerwania komórek, wywierając ciśnienie 1,200 PSI przez 10 minut, a następnie szybko odkompresuj warstwę zakłóconych stref synap na probówkach wirówkowych z dwoma różnymi stężeniami fiala, które utworzą dwie warstwy.

Następnie umieść probówki w wirniku SW 50.1 i odwiruj przy 126, 500 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W ultra wirówce podniebienie jest oczyszczonymi mitochondriami. Warstwą pomiędzy różnymi gęstościami fial jest niezakłócony synaptosom.

Następnie umyj granulkę, odwirowując ją w izolacji. Bufor w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce stołowej. Teraz Resus zawieś mitochondria w 200 mikrolitrach bufora izolacyjnego w połączeniu z równą objętością 1% toiny cyfrowej.

Umieść go na lodzie na 15 minut. Następnie dodaj więcej izolacji, buforu i odwirowania w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórz tę procedurę dwukrotnie, a następnie ponownie zawieś podniebienie w 200 mikrolitrach buforu izolacyjnego i dodaj dwa mikrolitry 10% Lu bra, PX, wymieszaj i umieść na lodzie na 15 minut.

Następnie ułóż mieszaninę warstwowo w izolacji, buforuj w probówkach wirówkowych. Umieść probówki w wirniku SSW 50.1 i odwiruj je w temperaturze 182 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę. Po godzinie.

Umyj końcową paletę, odwirowując ją w buforze izolacyjnym o temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Typowe stanowisko do elektrofizjologii składa się ze wzmacniacza, komputera PC wyposażonego w digi data 1, 440, interfejsu przetwornika analogowo-cyfrowego w połączeniu z zaciskiem P, manipulatorów programowych 10.0, mikroskopu, stołu do tłumienia drgań i klatki Faradaya. Najpierw wyciągnij pipetę z rurki kapilarnej ze szkła krzemianowego Boros w płonącym brązowym ściągaczu do mikropipet.

Optymalna rezystancja pipety powinna wynosić od 80 do 100 megaomów. Dodaj pęcherzyki submitochondrialne do fizjologicznego roztworu wewnątrzkomórkowego. Następnie tym samym roztworem napełnij pipetę z zaciskiem krosowym.

Wizualizuj pęcherzyki w kontraście fazowym. Mikroskopia po łataniu SMV w temperaturze pokojowej. Rejestruj aktywność, gdy potencjał błony jest utrzymywany na poziomie napięcia w zakresie od ujemnych 100 miliwoltów do dodatnich 100 miliwoltów przez 10 sekund przez 10 sekund każdego okresu.

Zarejestrowane dane są filtrowane w tempie pięciu kiloherców za pomocą obwodów wzmacniacza i analizowane za pomocą oprogramowania clamp fit 10.0. Ten rysunek przedstawia blot lizatu przygotowany z cytozolu i mitochondriów. Górny panel pokazuje immuno blot przy użyciu przeciwciała przeciwko białku cytozolowemu GA dh.

Dolny panel pokazuje plamę przy użyciu przeciwciała przeciwko białku wewnętrznej błony mitochondrialnej. Cox cztery: Oto dwa reprezentatywne nagrania zacisku krosowego przed i po dodaniu jednego milimola TP. Potencjał trzymania jest dodatni 70 miliwoltów. Linia przerywana oznacza zero pikoampów.

Każdy ślad jest rejestrowany przez 10 sekund, a między śladami a pokazanymi jest 10 sekund. Oto przykładowe ślady zmian intensywności fluorescencji wskaźnika A CMA w czasie w obecności SMV oraz przy braku i obecności TP. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować mitochondria, pęcherzyk submitochondriów zawierający syntezatory F1 FO 80 TP. Ponadto należy zrozumieć naszą odporną na formę I uszczelkę z elektrodą na membranie pęcherzyka, aby przeanalizować aktywność kanału kompleksu syntazy A TP.