Name: F1FO Przygotowanie pęcherzyków ATPazy i technika wykonywania zapisów patch clamp błon pęcherzyków podmitochondrialnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Naucz się izolacji pęcherzyków podmitochondrialnych z mózgu szczura zawierających kompleksy ATPazy F1FO. Ta metoda umożliwia badanie aktywności syntazy ATP i jej modulacji za pomocą techniki patch clamp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Izolacja mitochondriów z mózgu (Adaptacja na podstawie Brown M.R. et al.9)
<ol>
 <li>Uśmierć szczura metodami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).</li>
 <li>Odciąć głowę zwierzęcia poprzez dekapitację, naciąć skórę i odsłonić czaszkę.</li>
 <li>Ostrożnie otworzyć czaszkę, przecinając ją nożyczkami lub kleszczami kostnymi. Wyjąć mózg.</li>
 <li>Drobno posiekać mózg bez móżdżku w buforze izolacyjnym (patrz Tabela 1) i przenieść go do szklanego lub teflonowego homogenizatora o pojemności 5 ml (patrz lista sprzętu).</li>
 <li>Ostrożnie homogenizować tkankę 10 razy (bez tworzenia pęcherzyków powietrza), przez około 5 min.</li>
 <li>Wirować próbkę przy 1 500 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.</li>
 <li>Zabrać nadnadkład (mitochondria i synaptosomy) i odrzucić osad (materiał jądrowy i szczątki komórkowe). Wirować przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.</li>
 <li>Odrzucić nadnadkład i resuspenderć osad w 500 μl buforu izolacyjnego. Rozbić synaptosomy za pomocą naczynia do rozbijania komórek (patrz lista sprzętu). Zastosować ciśnienie 1 200 psi przez 10 min, a następnie przeprowadzić szybką dekompresję.</li>
 <li>Nanieść mieszaninę na gradienty Ficoll (patrz Tabela 2), umieścić w rotorze SW-50.1 i wirować przy 126 500 × g przez 20 min w temperaturze 4 °C w ultrawirówce (patrz lista sprzętu). Osad stanowi oczyszczone mitochondria, a warstwa pomiędzy różnymi gęstościami Ficollu to nierozbite synaptosomy.</li>
 <li>Przemyć osad poprzez wirowanie w buforze izolacyjnym przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.</li>
</ol>
2. Izolacja pęcherzyków submitochondrialnych (SMV) (Adaptacja z Chan et al.10)
<ol>
 <li>Ponownie zawiesić mitochondria w 200 μl buforu do izolacji (Isolation Buffer) połączonego z równą objętością 1% digitoniny i pozostawić na lodzie na 15 min.</li>
 <li>Dodać więcej buforu do izolacji i odwirować przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej. Powtórzyć tę czynność dwukrotnie.</li>
 <li>Ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do izolacji i dodać 2 μl 10% Lubrol PX (C12E9). Wymieszać i pozostawić na lodzie na 15 min.</li>
 <li>Nanieść mieszaninę warstwowo na bufor do izolacji, umieścić w rotorze SW-50.1 i odwirować przy 182 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 h.</li>
 <li>Przemyć końcowy osad, odwirując go w wirówce stołowej w buforze do izolacji przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Rejestracja elektrofizjologiczna
<ol>
 <li>Typowy zestaw do elektrofizjologii obejmuje wzmacniacz, komputer PC wyposażony w interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego Digidata 1440A wraz z oprogramowaniem pClamp10.0, manipulatory, mikroskop, stół wibroizolacyjny oraz klatkę Faradaya.</li>
 <li>Kapilary z borokrzemianowego szkła umieszcza się w wyciągaczu mikropipet Flaming/Brown Model P-87. Program wyciągacza jest zoptymalizowany tak, aby generować pipety o oporności od 80 do 100 MΩ.</li>
 <li>Pęcherzyki SMV umieszcza się w fizjologicznym roztworze wewnątrzkomórkowym (ATP dodaje się w odpowiednim momencie podczas rejestracji) (Tabela 3). Pipety do techniki patch clamp napełnia się tym samym roztworem (bez ATP). Rejestrację wykonuje się poprzez utworzenie uszczelnienia gigaomowego na SMV w temperaturze pokojowej. Pęcherzyki wizualizuje się za pomocą mikroskopii kontrastowej w odwróconym mikroskopie Nikon lub Zeiss.</li>
 <li>Potencjał błony utrzymuje się na poziomie od -100 mV do +100 mV przez okresy 10 sekund. Rejestracje są filtrowane przy 5 kHz za pomocą układów wzmacniacza. Dla pomyślnej rejestracji pożądany jest poziom zakłóceń elektrycznych lub szumu niespecyficznego poniżej 1 pA.</li>
 <li>Dane analizuje się za pomocą oprogramowania Clampfit 10.0, na przykład w celu określenia częstotliwości i amplitudy zdarzeń pojedynczego kanału. Zależność od napięcia określa się poprzez wykreślenie zależności prądowo-napięciowej.</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj metody umożliwiają izolację czystych mitochondriów po zakończeniu kroku 1 oraz pęcherzyków submitochondrialnych (SMV) po kroku 2 z całego mózgu, bez rozróżnienia fenotypów komórkowych. SMV oczyszczone tą metodą są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami subkomórkowymi, co pokazano na Rysunku 1 oraz w naszych poprzednich pracach (Alavian KN et al.8), i zachowują swoją integralność strukturalną i funkcjonalną przed zamrożeniem. Po zamrożeniu i rozmrożeniu izo...

<table><tbody><tr><td>Homogenizator tkanek Potter-Elvehjem z tłuczkiem z PTFE</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf Centrifuge 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do rozbijania komórek 4639</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Policarbonatowe probówki do wirowania</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW-50.1 </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka L8-70M</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilara z borokrzemianu</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet Flaming/Brown Model P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie pęcherzyków f1fo atpase oraz technika rejestracji patch-clamp błon pęcherzyków submitochondrialnych

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria uczestniczą w wielu istotnych funkcjach komórkowych, w tym w metabolizmie, przeżywalności1, rozwoju oraz sygnalizacji wapniowej2. Dwie z najważniejszych funkcji mitochondriów wiążą się z wydajną produkcją ATP, będącego walutą energetyczną komórki, poprzez fosforylację oksydacyjną, a także z pośredniczeniem w przekazywaniu sygnałów do zaprogramowanej śmierci komórki3.
Enzymem odpowiedzialnym przede wszystkim za produkcję ATP jest syntaza F1FO-ATP, nazywana również syntazą ATP4-5. W ostatnich latach znaczną uwagę poświęcono roli mitochondriów w apoptotycznej i nekrotycznej śmierci komórek. W przypadku śmierci apoptotycznej białka z rodziny BCL-2, takie jak Bax, wnikają w zewnętrzną błonę mitochondrialną, oligomeryzują i zwiększają jej przepuszczalność, uwalniając czynniki proapoptotyczne do cytozolu6. W klasycznej śmierci nekrotycznej, takiej jak wywołana przez niedokrwienie lub ekscytotoksyczność w neuronach, znaczny, słabo regulowany wzrost poziomu wapnia w macierzy przyczynia się do otwarcia poru w błonie wewnętrznej – mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności (mPTP). Prowadzi to do depolaryzacji błony wewnętrznej i wywołuje zmiany osmotyczne, co przyczynia się do pęknięcia błony zewnętrznej, uwalniania czynników proapoptotycznych i dysfunkcji metabolicznych. Wiele białek, w tym Bcl-xL7, oddziałuje na syntazę F1FO-ATP, modulując jej funkcję. Bcl-xL oddziałuje bezpośrednio z podjednostką beta syntazy F1FO-ATP, a ta interakcja zmniejsza konduktancję przecieku w kompleksie F1FO-ATPazy, zwiększając wypadkowy transport H+ przez F1FO podczas aktywności F1FO-ATPazy8, a tym samym zwiększając wydajność mitochondriów. Aby zbadać aktywność i modulację syntazy ATP, wyizolowaliśmy z mózgu gryzoni pęcherzyki submitochondrialne (SMVs) zawierające F1FO-ATPazę. SMVs zachowują integralność strukturalną i funkcjonalną F1FO-ATPazy, co wykazali Alavian et al. W niniejszej pracy opisujemy metodę, której z sukcesem używaliśmy do izolacji SMVs z mózgu szczura, oraz przedstawiamy technikę patch clamp służącą do analizy aktywności kanałów (konduktancji przecieku jonowego) w SMVs.

Pierwszy krok naszego protokołu pozwala na izolację oczyszczonych mitochondriów, co zostało wykazane za pomocą analizy Western blot na Rysunku 1. Na Rysunku 2 przedstawiono przykład rejestracji prądów z plastra pęcherzyków submitochondrialnych pochodzących z mózgu. Wykorzystując konfigurację plastra „inside-out”, wykazujemy aktywność kanałów modulowaną przez ATP. Rejestracja kontrolna (CTL) (po lewej) pokazuje aktywność kanałów o wielokrotnej przewodności ze średnią przewodnością szczyto...

Opisano metodę izolacji pęcherzyków submitochondrialnych wzbogaconych w kompleksy syntazy ATP F1FO z mózgu szczura. Pęcherzyki te umożliwiają badanie aktywności kompleksu ATP-azy F1FO oraz jego modulacji z wykorzystaniem techniki patch clamp.

Przygotowanie pęcherzyków F1FO ATPase oraz technika rejestracji patch-clamp błon pęcherzyków submitochondrialnych

Mitochondria biorą udział w wielu istotnych funkcjach komórkowych, w tym w metabolizmie, przeżywalności1, rozwoju oraz sygnalizacji wapniowej2. Dwie z najistotniejszych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja pęcherzyków F1 F zero APA z mózgu szczura w celu przeprowadzenia pomiarów metodą patch clamp. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wyjęcie mózgu ze szczura i jego homogenizację. Drugim krokiem jest zniszczenie stref synaptycznych poprzez zastosowanie nacisku.Następnie synaptosomy nanosi się warstwami na gradienty w fiolkach. Ostatnim krokiem jest inkubacja z digitoniną i L w celu uzyskania końcowych pęcherzyków do rejestracji metodą patch-clamp. Ważną funkcją mitochondriów jest produkcja ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej.Enzymem odpowiedzialnym za produkcję ATP jest syntaza ATP zlokalizowana w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Aby szczegółowo zbadać funkcję syntazy ATP, izolujemy specjalne pęcherzyki submitochondrialne, które nazywamy SMV. Zawierają one enzym syntazę ATP w konfiguracji odwróconej (inside-out).Następnie rejestrujemy te SMV za pomocą elektrody patch-clamp i określamy przepuszczalność ich błon. Pozwala to ocenić wydajność produkcji TP przez mitochondria. Procedurę tę zaprezentuje dziś Sylvia ti, stażystka podoktorska w moim laboratorium na Uniwersytecie Yale.W tej procedurze, po pobraniu głowy szczura poprzez dekapitację, należy naciąć skórę, aby odsłonić czaszkę, a następnie ostrożnie otworzyć czaszkę, przecinając ją nożyczkami lub kleszczami Ronsa. Następnie należy wyjąć mózg, posiekać go (bez móżdżku), a w końcowym etapie wyizolować w buforze, po czym przenieść do szklanego homogenizatora teflonowego o pojemności 5 mL. Należy delikatnie homogenizować tkankę 10 razy, co zajmuje łącznie około pięciu minut. Po tym czasie próbkę należy odwirować w wirówce laboratoryjnej z prędkością 1 500 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Należy zachować nadsącz zawierający mitochondria i synaptosomy, a osad odrzucić. Następnie próbkę należy ponownie odwirować w wirówce laboratoryjnej przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie należy odlać nadsącz i zawiesić osad w 500 µL buforu izolacyjnego. Synaptosomy należy rozbić za pomocą naczynia do homogenizacji komórek, stosując ciśnienie 1 200 PSI przez 10 minut, a następnie gwałtownie je rozprężyć. Rozbite synaptosomy należy nanieść na probówki do wirowania z dwiema różnymi koncentracjami FiCoL, co spowoduje utworzenie dwóch warstw.Następnie umieść probówki w wirniku SW 50.1 i wiruj przy 126 500 ×g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osadem w ultrawirówce są oczyszczone mitochondria. Warstwa pomiędzy różnymi gęstościami w probówce to nieuszkodzone synaptosomy.Następnie wypłucz osad, wirując go w buforze izolacyjnym przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce laboratoryjnej. Teraz resuspenduj mitochondria w 200 µL buforu izolacyjnego połączonego z równą objętością 1% digitoniny.Umieścić na lodzie na 15 minut. Następnie dodać więcej buforu izolacyjnego i odwirować z prędkością 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Powtórzyć tę procedurę dwukrotnie, a następnie zawiesić osad w 200 µL buforu izolacyjnego, dodać 2 µL 10% mieszaniny Lybra PX i pozostawić na lodzie na 15 minut.Następnie nałóż warstwami mieszaninę z izolatem oraz bufor do probówek wirówkowych. Umieść probówki w rotorze SSW 50.1 i wiruj przy 182 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius za jedną godzinę. Po godzinie.Przemyj końcowy osad, wirując go w buforze izolacyjnym przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Typowe stanowisko do elektrofizjologii obejmuje wzmacniacz, komputer PC wyposażony w DigiData 1440, interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego współpracujący z oprogramowaniem pCLAMP 10.0, manipulatory, mikroskop, stół wibroizolacyjny oraz klatkę Faradaya. Najpierw wyciągnij pipetę z kapilary wykonanej z borokrzemianowego szkła, używając mikro-wyciągarki do pipet z ogniem.Optymalna rezystancja pipety powinna wynosić od 80 do 100 mega ohm. Dodaj pęcherzyki submitochondrialne do fizjologicznego roztworu wewnątrzkomórkowego. Następnie napełnij pipetę do patch-clamp tym samym roztworem.Wizualizuj pęcherzyki za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym po wprowadzeniu SMVs w konfigurację patch-clamp w temperaturze pokojowej. Rejestruj aktywność, utrzymując potencjał błonowy w zakresie od -100 mV do +100 mV przez 10 sekund w każdym okresie.Zarejestrowane dane są filtrowane z częstotliwością 5 kHz przy użyciu układów wzmacniacza i analizowane za pomocą oprogramowania Clampfit 10.0. Rysunek ten przedstawia analizę western blot lizatu przygotowanego z cytozolu i mitochondriów. Górny panel przedstawia immunoblot z użyciem przeciwciała przeciwko białku cytozolowemu GA dh.Dolny panel przedstawia analizę Western blot z użyciem przeciwciała przeciwko białku wewnętrznej błony mitochondrialnej Cox four. Przedstawiono tutaj dwa reprezentatywne zapisy techniki patch-clamp przed i po dodaniu 1 mM ATP. Potencjał utrzymujący wynosi +70 mV. Linia przerywana oznacza 0 pA.Każdy ślad jest rejestrowany przez 10 sekund, a przerwy między wyświetlanymi śladami wynoszą 10 sekund. Przedstawiono tutaj przykładowe ślady zmian intensywności fluorescencji wskaźnika CMA w czasie w obecności SMV oraz w obecności i przy braku TP. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat izolacji mitochondriów oraz pęcherzyków submitochondrialnych zawierających syntazę F1 FO 80 TP. Ponadto powinni Państwo zrozumieć sposób tworzenia odpornej uszczelki z elektrodą na błonie pęcherzyka w celu analizy aktywności kanału kompleksu syntazy ATP.

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

F1FO ATPase Preparaty pęcherzykowe i technika wykonywania nagrań zaciskania płata membran pęcherzykowych podmitochondrialnych

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca2+-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej.  Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Ten artykuł o metodzie szczegółowo opisuje główne etapy pomiaru przecieku H+ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pomocą techniki patch-clamp, nowego podejścia do badania termogenicznej zdolności mitochondriów.

Zastosowanie techniki patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Naucz się izolacji pęcherzyków podmitochondrialnych z mózgu szczura zawierających kompleksy ATPazy F1FO. Ta metoda umożliwia badanie aktywności syntazy ATP i jej modulacji za pomocą techniki patch clamp.

Przygotowanie pęcherzyków F₁F_O ATPase oraz technika rejestracji patch-clamp błon pęcherzyków submitochondrialnych

Przeglądaj więcej filmów