Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Protokół ten ma na celu określenie submitochondrialnej lokalizacji białek mitochondrialnych drożdży, co jest uważane za podstawowy krok podczas wyjaśniania funkcji białek mitochondrialnych. Protokół jest odpowiedni dla naszych szczepów drożdży utrzymywanych w różnych warunkach wzrostu. Stanowi potężne narzędzie do badań, takich jak badanie mitochondriów.

Na początek umieść komórki smugowe z zapasu glicerolu przechowywanego w temperaturze 80 C na płytce agarowej YPD, aby wyizolować pojedyncze kolonie ze szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. I inkubować płytkę w temperaturze 30 C przez 2 do 3 dni. Przygotować kulturę starterową, zaszczepiając 2 do 3 pojedynczych kolonii z płytki agarowej YPD w 100 ml kolbie Erlenmeyera zawierającej od 10 do 30 ml pożywki YPGal.

Inkubować kolbę w temperaturze 30 °C przez 24 godziny, energicznie wstrząsając przy 180—200 obr./min. Rozcieńczyć kulturę starterową w 1 l świeżej pożywki YPGal do gęstości optycznej mniejszej niż 0,1 przy długości fali 600 nm. Hodować komórki w temperaturze 30 C z energicznym wytrząsaniem z prędkością od 180 do 200 obr./min przez około 12 godzin, aż gęstość optyczna osiągnie 1 do 1,5.

Wykonaj izolację wysoce oczyszczonych mitochondriów zgodnie z opisem w tekście. I określić stężenie białka w wysoce oczyszczonym preparacie mitochondrialnym, używając testu Bradforda, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Dostosuj stężenie białka do 10 mg/ml za pomocą lodowatego buforu SEM.

Przenieść 40 l wysoko oczyszczonych mitochondriów do czterech wstępnie schłodzonych i oznakowanych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 360 l buforu SEM do pierwszej i drugiej probówki. I 360 l buforu EM w trzeciej i czwartej probówce.

Korzystając ze schematu pipetowania, zgodnie z tekstem, dodaj 4 litry świeżo przygotowanej proteinazy K do drugiej i czwartej probówki. Po delikatnym wymieszaniu wszystkich probówek, inkubować na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu mieszając. Aby zatrzymać aktywność proteinazy K, dodaj 4 l 200 mM PMSF do wszystkich czterech probówek.

Odwirować probówki o stężeniu 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, nie naruszając osadu, do nowej, wstępnie schłodzonej, oznakowanej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Następnie ponownie zawiesić osad w 400 l lodowatego bufora SEM. Aby dezaktywować możliwe ślady proteinazy K, wytrącić zebrany supernatant i ponownie zawiesić osad z kwasem trichlorooctowym do końcowego stężenia 10%Inkubować probówki na lodzie przez 10 minut.

Odwirować próbki poddane działaniu kwasu trichlorooctowego przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 200 l buforu do próbki. Jeśli błękit bromofenolowy zmieni kolor na żółty, dodaj od 1 do 5 litrów 1 M Tris zasady, aż zmieni kolor na niebieski. Dodaj 4 l 200 mM PMSF do wszystkich probówek.

Próbki należy przechowywać w temperaturze 80 C do czasu dalszej analizy za pomocą SDS-PAGE i western blot. Przenieść 200 l wysoko oczyszczonych mitochondriów do 1,5 ml wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej. Rozcieńczyć mitochondria jednorazowo lodowatym buforem SEM.

Używając sonikatora kompatybilnego z małymi objętościami, sonikuj mitochondria 3 razy przez 30 sekund na lodzie. Odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w nowej, wstępnie schłodzonej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Po oznaczeniu probówki jako S" dla rozpuszczalnej frakcji białkowej, trzymaj probówkę na lodzie.

Zawiesić osad z poprzedniego etapu w 400 l lodowatego bufora SEM. Przenieść 100 l zawieszonego osadu do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówkę jako SMP "dla frakcji cząstek submitochondrialnych i trzymaj probówkę na lodzie.

Pozostałe 300 l zawieszonego osadu rozcieńczyć jednorazowo świeżo przygotowanym 200 mM węglanem sodu. I inkubować rozcieńczoną próbkę na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.

Oznaczyć próbkę jako CS" dla frakcji supernatantu węglanowego i trzymać probówkę na lodzie. Zawiesić osad z poprzedniego etapu w 400 l lodowatego bufora SEM. I nazwij próbkę jako CP "dla frakcji wytrąconej węglanami.

Wytłoć wszystkie próbki kwasem trichlorooctowym do końcowego stężenia 10% i inkubować probówki na lodzie przez 10 minut. Następnie odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić każdą osadkę w buforze próbki. Jeśli bufor próbki zmieni kolor na żółty, dodaj od 1 do 5 litrów zasady 1 M Tris, aż zmieni kolor na niebieski.

Dodać 1 l 200 mM PMSF do wszystkich probówek i przechowywać w temperaturze 80 C do czasu dalszej analizy za pomocą SDS-PAGE i western blot. Surową frakcję mitochondrialną oczyszczono metodą wirowania w gradiacji gęstości sacharozy i zaobserwowano redukcję innych zanieczyszczeń komórkowych. Konwersja mitochondriów do mitoplastów była monitorowana przez zanik białka przestrzeni międzybłonowej cytochromu b2 w osadzie.

Z jednoczesnym pojawieniem się w supernatancie. Degradację białka międzybłonowego Sco1 za pośrednictwem proteinazy K zaobserwowano z powodu przerwania błony zewnętrznej przez szok osmotyczny. Integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej została potwierdzona przez ochronę cytochromu b2 i Sco1 przed degradacją proteinazy K we frakcji osadu.

Podobnie, ochrona rozpuszczalnego w macierzy białka KGD potwierdziła integralność wewnętrznej błony mitochondrialnej. Profil western blot Prx1 sugerował podwójną lokalizację mitochondriów w przestrzeni międzybłonowej i macierzy. Mitochondria poddano sonikacji i ekstrakcji węglanowej w celu zbadania topologii białek błonowych.

Integralne nalewanie białka błonowego pozostało we frakcjach osadów. KGD wykryto we frakcji supernatantu. Wykrycie białka KGD w osadzie było spowodowane zmianami parametrów sonikacji wpływającymi na tworzenie SMP.

Po obróbce węglanem sodu frakcję KGD i SMP rozpuszczono i stwierdzono we frakcji supernatantowej. Profil western blot Prx1 sugerował związek z obwodem błony. Dla powodzenia protokołu frakcjonowania submitochondrialnego ważne jest zatrzymanie aktywności proteinazy K po obrzęku hipotonicznym poprzez dodanie PMSF do próbek.

Miejsca dostarczają informacji na temat lokalizacji białek submitochondrialnych. Protokół ten może być również stosowany do sprawdzania integralności preparatów mitochondrialnych, co ma zasadnicze znaczenie podczas badań proteomicznych podkompartmentów mitochondrialnych.