Name: Test nadwrażliwości trans-vivo typu opóźnionego w celu regulacji specyficznej dla antygenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj test trans-vivo DTH do oceny odpowiedzi immunologicznych u biorców przeszczepów. Ta metoda umożliwia bezpieczne wycofanie leków immunosupresyjnych poprzez monitorowanie komórek PBMC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować A.M. VanBuskirk za wkład w rozwój naszej wiedzy na temat regulowanej odpowiedzi DTH u biorców przeszczepów. Praca ta była wspierana przez granty NIH PO1AI084853 oraz R01AI066219-06, a także przez sponsorowane przez UE badanie One Study.

1. Przygotowanie limfocytów
<ol>
	<li>Pobrać krew do probówek z ACD (kwasem cytrynowo-dekstrozowym).</li>
	<li>Wyizolować PBMC ze świeżej ludzkiej krwi obwodowej, używając medium do separacji limfocytów (Lymphocyte Separation Medium) zgodnie ze standardowymi metodami.</li>
	<li>Przemyć PBMC trzy razy roztworem PBS, aby usunąć zanieczyszczające płytki krwi. Stwierdzono, że płytki krwi zakłócają przebieg testu DTH trans-vivo. Maksymalnie dopuszczalne zanieczyszczenie preparatu PBMC płytkami krwi wynosi ≤1x107/iniekcję.</li>
	<li>W przypadku zauważalnego zanieczyszczenia erytrocytami, po pierwszym przemyciu przeprowadzić lizę czerwonych krwinek za pomocą buforu lizującego ACK. Usunąć bufor ACK, przemywając próbkę 2 razy roztworem PBS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie alloantygenu
<ol>
	<li>Wyizolować PBMC z krwi obwodowej dawcy zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej.</li>
	<li>Resuspendować PBMC dawcy w PBS do stężenia 120x106 komórek/ml (4x106 komórek / 30 μl).</li>
	<li>Dodać do mieszaniny 1 μM PMSF, aby zapobiec degradacji białek.</li>
	<li>Poddać zawiesinę komórkową sonikacji, stosując siedem 1-sekundowych impulsów za pomocą sonikatora z sondą 2 mm. (Uwaga: Materiał należy utrzymać w niskiej temperaturze i unikać nadmiernego powstawania pęcherzyków powietrza. W przypadku pienienia należy pozostawić zawiesinę komórkową na lodzie na 2-3 min.)</li>
	<li>Zweryfikować za pomocą hemocytometru, czy rozbito &gt;90% komórek.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę z prędkością 14 000 rpm w temperaturze 4 °C przez 20 min w chłodzonej mikrowirówce.</li>
	<li>Przenieść nadsącz do nowej probówki typu safe-lock o pojemności 2,0 ml i oznaczyć stężenie białka.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do iniekcji
<ol>
	<li>Do każdej probówki typu safe-lock o pojemności 2,0 ml przenieś 7x106 PBMC na każdą dawkę iniekcyjną.</li>
	<li>Wiruj przez minutę z prędkością 6 000 rpm w mikrowirówce, a następnie usuń nadsącz.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w PBS z dodatkiem antygenów lub bez nich. Dostosuj objętość iniekcyjną do 35 μl za pomocą PBS. W iniekcjach stosuje się następujący schemat: 
	Kontrola negatywna: PBMC + PBS 
	Kontrola pozytywna: PBMC + TT/DT (25 μg/iniekcję) 
	Eksperymentalna odpowiedź specyficzna dla antygenu: PBMC + testowy Ag (4-8 μg/iniekcję) 
	Eksperymentalna regulacja specyficzna dla antygenu: PBMC + testowy Ag + TT/DT</li>
</ol>
4. Etap przed pomiarem, wtryskiwanie i etap po pomiarze
<ol>
	<li>Zanurz mysz CB17 SCID w narkozie z użyciem izofluranu. Zmierz grubość poduszki stopy tylnej za pomocą suwmiarki sprężynowej. Umieść suwmiarkę w centrum poduszki stopy, tak aby jedna krawędź dotykała ostatniej poduszki chodnej stopy, aby zapewnić punkt odniesienia dla zachowania spójności miejsca pomiaru. Grubość poduszki stopy zapisuje się, gdy odczyt z miernika ulegnie stabilizacji.</li>
	<li>Powoli wstrzyknij zawiesiny komórkowe podskórnie w poduszki stóp myszy, używając strzykawek insulinowych o pojemności ½ cc z igłą 28G. Wykonaj wstrzyknięcie tak, aby igła była skierowana w stronę palców, a ścięcie igły było skierowane do góry. (Uwaga: upewnij się, że nie ma wycieku).</li>
	<li>W odstępie 18-24 h po wstrzyknięciu z narkozuj mysz izofluranem i powtórz pomiar obrzęku poduszki stopy.</li>
	<li>Odejmij grubość każdej poduszki stopy sprzed wstrzyknięcia od wartości po wstrzyknięciu, aby uzyskać wartość obrzęku poduszki stopy; dane wyraź w jednostkach 10-4 cala. Oblicz netto obrzęk specyficzny dla antygenu, odejmując obrzęk poduszki stopy kontrolnej (PBMC+PBS) od wartości obrzęku poduszki stopy uzyskanych z grup badanych (PBMC + alloantygen dawcy, TT/DT lub alloantygen dawcy + TT/DT). Aby test uznano za ważny, wymagana jest pozytywna odpowiedź kontrolna na antygen pamięci TT/DT wynosząca ≥ 25x10-4 cala powyżej odpowiedzi tła na PBS.</li>
	<li>Określ inhibicję odpowiedzi pamięci w obecności antygenów dawcy, porównując netto obrzęk każdego wstrzyknięcia za pomocą następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór na procent inhibicji; równanie do pomiaru wyników inhibicji związanej z antygenem." fo:src="/files/ftp_upload/4454/4454eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4454/4454eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>

<ol><li>Carrodeguas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans+vivo+analysis+of+human+delayed-type+hypersensitivity+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity.</a> Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).</li>
<li>Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+and+injection+site+are+crucial+for+detecting+linked+suppression+in+transplant+recipients+by+trans-vivo+DTH+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay.</a> Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).</li>
<li>Burlingham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tolerance+to+a+maternal+kidney+transplant+is+selective+for+HLA+class+II%3A+Evidence+from+trans-vivo+DTH+and+alloantibody+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis.</a> Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).</li>
<li>Geissler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+allograft+acceptance+and+the+%27tolerance+assay%27%3A+In+vitro+anti-donor+T+cell+assays+show+hyporeactivity+to+donor+cells+but%2C+unlike+DTH%2C+fail+to+detect+linked+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression.</a> Transplantation. 72, 571-580 (2001).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+allograft+acceptance+and+the+%27tolerance+assay%27.+II.+donor+HLA-A%2C+-B+but+not+DR+antigens+are+able+to+trigger+regulation+of+DTH%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH.</a> Hum. Immunol. 63, 862(2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+H+Antigen+HA-1-specific+Regulator+and+Effector+CD8%2B+T+Cells%2C+and+HA-1+Microchimerism%2C+in+Allograft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance.</a> J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).</li>
<li>Rodriguez, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+and+graft+survival+in+kidney+transplant+recipients+are+both+enhanced+by+human+leukocyte+antigen+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching.</a> Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4%2BCD25low+adaptive+T+regulatory+cells+suppress+delayed-type+hypersensitivity+during+transplant+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance.</a> J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).</li>
<li>Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+type+determines+the+mechanism+of+bystander+suppression+by+adaptive+T+regulatory+cells+specific+for+the+minor+antigen+HA-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1.</a> J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+reduction+of+immunosuppression+in+older+renal+transplant+recipients+who+exhibit+donor-specific+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation.</a> Transplantation. 88, 533-541 (2009).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretransplant+immune+regulation+predicts+allograft+outcome%3A+bidirectional+regulation+correlates+with+excellent+renal+transplant+function+in+living-related+donor-recipient+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs.</a> Transplantation. 93, 283-290 (2012).</li>
<li>Knechtle, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+limited+use+of+tacrolimus+to+avoid+rejection+in+an+alemtuzumab+and+sirolimus+regimen+for+kidney+transplantation%3A+clinical+results+and+immune+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring.</a> Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).</li>
<li>Haynes, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-specific+indirect+pathway+analysis+reveals+a+B-cell-independent+signature+which+reflects+outcomes+in+kidney+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients.</a> Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).</li>
<li>Burlingham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-dependent+cellular+immunity+to+collagen+type+V+predisposes+to+obliterative+bronchiolitis+in+human+lung+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants.</a> J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).</li>
<li>Bobadilla, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH-17%2C+Monokines%2C+Collagen+Type+V%2C+and+Primary+Graft+Dysfunction+in+Lung+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).</li>
<li>Olson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+prostate+tumor+antigen-specific+CD8%2B+regulatory+T+cells+are+inhibited+by+CTLA-4+or+IL-35+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade.</a> J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).</li>
</ol>

Autorzy niniejszego manuskryptu nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Test trans-vivo DTH jest nowatorskim testem diagnostycznym o potencjalnym zastosowaniu klinicznym w ocenie odpowiedzi komórkowych u pacjentów po transplantacji, z nowotworami oraz z chorobami autoimmunologicznymi. Jest on cenny, ponieważ jest przydatny nie tylko w monitorowaniu odpowiedzi efektorowych limfocytów T pamięci, ale może również wykrywać odpowiedzi regulacyjne limfocytów T. Niezawodna metoda wykrywania regulacji DTH u ludzi mogłaby pomóc w przewidzeniu bezpieczeństwa odstawienia immunosupresji u pacjentów będą...

<table><tbody><tr><td>probetka ACD do pobierania krwi</td><td>BD</td><td>02-684-26</td><td></td></tr><tr><td>Medium do separacji limfocytów</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CM</td><td>Bez wapnia &amp;AMP; magnez</td></tr><tr><td>bufor lizujący ACK</td><td>BioWhittaker</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>TT/DT lub EBV</td><td>Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.</td><td></td><td>TT/DT 25 &amp;mu;g/wstrzyknięcie EBV 8 &amp;mu;g/iniekcję</td></tr><tr><td>Inhibitor proteaz PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna do zliczania komórek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6003</td><td></td></tr><tr><td>Alloantygen</td><td></td><td></td><td>Zamiast bezkomórkowych lizatów komórek donora można zastosować oczyszczone antygeny HLA lub syntetyczne allopeptydy</td></tr><tr><td>sterylne probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>pipety 10 ml i pipetor</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>probówki 2 ml z bezpiecznym zamknięciem (safe-lock)</td><td>Costar</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;l, 100 &amp;mu;l, 10 &amp;mu;pipety z jałowymi końcówkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora countingowa (hemocytometr)</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka pełnowymiarowa i mikrowirówka</td><td>Beckman Coulter/Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawki insulinowe 1/2 ml lub 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-826-79</td><td>igła 28 G</td></tr><tr><td>Sonikator Vibracell</td><td>Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc</td><td></td><td>sonda 2 mm</td></tr><tr><td>Wskaźnik grubości zegarowy</td><td>Mitutoyo, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>myszy SCID</td><td>Harlan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td>Anestezja inhalacyjna</td></tr></tbody></table>

test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Odpowiedź nadwrażliwości opóźnionej (DTH) jest szybką manifestacją in vivo odpowiedzi immunologicznej zależnej od limfocytów T na obcy antygen (Ag), z którym układ odpornościowy gospodarza zetknął się w niedawnej przeszłości. Reakcje DTH są często podzielone na fazę uczulania, odnoszącą się do pierwszego kontaktu z antygenem, oraz fazę wyzwalania, która zazwyczaj następuje kilka dni po uczuleniu. Brak odpowiedzi nadwrażliwości opóźnionej na antygen przypominający, wykazany w próbie skórnej, jest często uznawany za dowód anergii. Tradycyjny test DTH jest skutecznie wykorzystywany w diagnostyce wielu infekcji mikrobiologicznych.
Mimo wspólnych cech immunologicznych, takich jak naciek limfocytarny, obrzęk i nekroza tkanek, bezpośrednia próba DTH nie jest wykonalną techniką diagnostyczną u pacjentów po transplantacji ze względu na ryzyko, że bezpośredni wtrysk doprowadzi do uczulenia na antygeny dawcy i utraty przeszczepu. Aby uniknąć tego problemu, opracowano ludzko-mysią próbę DTH „trans-vivo” 1,2. Test ten jest w istocie próbą transferowej DTH, w której ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) oraz specyficzne antygeny wstrzykuje się podskórnie do małżowin usznych lub poduszek stóp naiwnej myszy, a po 18-24 h mierzy się obrzęk typu DTH 3. Prezentacja antygenu przez ludzkie komórki prezentujące antygen, takie jak makrofagi lub komórki DC, limfocytom T w silnie unaczynionej tkance myszy uruchamia kaskadę zapalną i przyciąga mysie komórki odpornościowe, co skutkuje wystąpieniem reakcji obrzękowej. Odpowiedź ta jest swoista dla antygenu i wymaga wcześniejszego uczulenia na ten antygen. Dodatnia odpowiedź DTH reagująca z dawcą w próbie Tv-DTH wskazuje, że u pacjenta po transplantacji rozwinęła się prozapalna dyspozycja immunologiczna wobec alloantygenów przeszczepu.
Najważniejszą cechą tego testu jest możliwość wykrywania limfocytów T regulatorowych, które wywołują supresję typu bystander. Supresja bystander odpowiedzi DTH po ponownym podaniu antygenu dawcy w obecności antygenu jest charakterystyczna dla biorców przeszczepów z zaakceptowanymi allograftami 2,4-14. Monitorowanie biorców przeszczepów pod kątem alloreaktywności i regulacji za pomocą Tv-DTH może pozwolić na zidentyfikowanie grupy pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyść z redukcji immunosupresji bez zwiększonego ryzyka odrzucenia przeszczepu lub pogorszenia funkcji nerek.
Obiecującym obszarem jest zastosowanie testu Tv-DTH w monitorowaniu autoimmunizacji15,16, a także w immunologii nowotworów 17.

1. Ocena odpowiedzi biorców przeszczepów nerek na antygeny dawcy z wykorzystaniem testu Tv-DTH
Aby przetestować komórkową odporność reaktywną wobec dawcy u biorców przeszczepów nerek, wstrzyknięto PBMC od tych pacjentów z samymi antygenami dawcy lub z antygenem przypominającym w postaci toksyny tężcowej (TT). Jako kontrolę pozytywną komórki wstrzyknięto z samą TT. Zaobserwowaliśmy trzy główne wzorce nadwrażliwości opóźnionej u biorców przeszczepów (Rysunek 1). Wszyscy pacjenci si...

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Odpowiedź nadwrażliwości opóźnionej (DTH) jest szybką manifestacją in vivo odpowiedzi immunologicznej zależnej od limfocytów T na obcy antygen (Ag), który gospodarz...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie testu trans vivo DTH do monitorowania zarówno pro-, jak i przeciwzapalnych odpowiedzi swoistych względem antygenu u ludzi. Najpierw należy wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej z krwi obwodowej badanego. Następnie preparat PBMC należy wymieszać z PBS.Antygen przypominający testowy oraz antygen testowy wraz z antygenem przypominającym. Przeprowadzić pomiary wstępne poduszek stóp i wstrzyknąć przygotowane mieszaniny myszom w stanie spoczynku. Pomiary poduszek stóp powtórzyć po 24 godzinach. Trzy.Kreskowe wzorce odpowiedzi DTH mogą mieć charakter regulacyjny, nieregulacyjny lub uwrażliwiony. Test trans vivo opóźnionej nadwrażliwości może być stosowany do określania parametrów klinicznych, takich jak odpowiedzi alloreaktywne, w których źródłem antygenu są komórki dawcy przeszczepu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod in vitro jest możliwość łatwego wykrycia zarówno odpowiedzi prozapalnych, jak i regulacyjnych na alloantygeny, autoantygeny lub antygeny nowotworowe przy użyciu jednego systemu testowego.Egon, badacz z mojego laboratorium, zademonstruje teraz procedurę, wykorzystując świeżą ludzką krew obwodową pobraną do probówek z kwasem cytrynowym i dekstrozą, aby uniknąć aktywacji płytek krwi. Wyizoluj PBMC, używając medium do separacji limfocytów zgodnie ze standardowymi metodami. Przemyj preparat PBMC roztworem PBS, aby usunąć zanieczyszczające go płytki krwi.W przypadku zauważalnego zanieczyszczenia erytrocytami należy przeprowadzić lizę czerwonych krwinek, używając buforu do lizy CK. Następnie należy wykonać dwa kolejne przemycia w PBS Resus. PBMC należy zawiesić w PBS w stężeniu 10 milionów PBMC na mililitr dla antygenu allogenicznego.Zacznij od P BMCs, wyizolowanych z krwi obwodowej dawcy zgodnie z procedurą przedstawioną wcześniej. Następnie resus. Zawieś komórki dawcy w PBS w stężeniu 120 milionów komórek na mililitr i dodaj jeden mikromol PMSF, aby zapobiec degradacji białek.Następnie poddaj zawiesinę komórkową sonikacji, stosując siedem jednosekundowych impulsów za pomocą sonikatora z sondą o średnicy 2 mm. Używając cytometru hemocytometrycznego, potwierdź rozbicie ponad 90% komórek.Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 14 000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Ostrożnie przenieś nadsącz do probówki typu safe-lock i określ stężenie białka dla każdej iniekcji standardowymi metodami. Odmierz siedem aliquotów po 10⁶ PBMC do dwóch mililitrów.Komórki w probówkach typu safe-lock należy osadzić w drodze wirowania. Najpierw należy przygotować zawiesinę kontrolną ujemną z PBMC w 35 µL PBS. Następnie, w przypadku kontroli dodatniej, należy dodać 25 µL antygenu przypominającego (tężec, toksoida; błonica, toksoida) i uzupełnić objętość iniekcji do 35 µL za pomocą PBS.Zgodnie z planem eksperymentalnym oceny odpowiedzi specyficznej dla dawcy, resuspenduj osad komórkowy w 10 µL antygenu dawcy oraz 25 µL PBS, aby uzyskać objętość całkowitą 35 µL. W celu oceny eksperymentalnej regulacji specyficznej dla antygenu dawcy, resuspenduj osad komórkowy do objętości 35 µL, dodając 10 µL antygenu dawcy oraz 25 µL antygenu przypominającego TT DT. Po znieczuleniu myszy typu skid izofluranem, umieść suwmiarkę sprężynową w centrum poduszki stopy, tak aby jedna krawędź dotykała ostatniej poduszki opuszkowej stopy, aby zapewnić punkt odniesienia dla zachowania spójności miejsca pomiaru po ustabilizowaniu się odczytu miernika.Zapisz wyjściową grubość poduszeczki stopy przed wstrzyknięciem. Umieść strzykawkę tak, aby igła była skierowana w stronę palców, a ścięcie igły było skierowane do góry. Następnie rozpocznij podskórne iniekcje każdej zawiesiny komórek w tylne poduszeczki stóp myszy.Po pierwsze, powoli wstrzyknij do prawej poduszeczki stopy preparat kontroli negatywnej. Następnie wstrzyknij do lewej poduszeczki stopy kontrolę pozytywną w postaci PBMC plus TT dt. Teraz przenieś mysz z powrotem do klatki.Po drugie, w prawą stopę wstrzyknij PBMC wraz z antygenem allogenicznym, a w lewą stopę PBMC wraz z antygenem allogenicznym oraz TT dt. Upewnij się, że od 18 do 24 godzin po iniekcji nie występuje wyciek. Z narkozuj każdą mysz izofluranem i powtórz pomiar obrzęku stopy.Odjąć grubość każdej poduszki stopy przed iniekcją od wartości po iniekcji, aby uzyskać wartość obrzęku poduszki stopy. Następnie obliczyć specyficzny dla antygenu obrzęk netto, odejmując wartość obrzęku poduszki stopy kontrolnej od wartości obrzęku poduszki stopy uzyskanych w grupach badanych. Zweryfikować odczyt kontroli pozytywnej, przyjmując odpowiedź kontroli pozytywnej na antygen przypominający TT DT większą niż lub równą 25 × 10⁻⁴ cali.Aby test można było uznać za prawidłowy, wymagana jest odpowiedź tła na PBS. Następnie należy określić stopień hamowania odpowiedzi przypominających w obecności antygenów dawcy. Eksperyment ten służy ocenie biorców przeszczepów nerek pod kątem odpowiedzi specyficznej dla antygenów dawcy oraz regulacji.Wśród biorców przeszczepów wyróżnia się trzy główne wzorce nadwrażliwości opóźnionej: regulacyjny, nieregulacyjny oraz uczulony. Wszyscy pacjenci wykazali silną odpowiedź na kontrolę pozytywną w postaci antygenu przypominającego tt. Pacjent numer 62 wykazuje wzorzec regulacyjny, który charakteryzuje się słabą odpowiedzią na antygen dawcy oraz wyraźną supresją powiązaną z odpowiedzią na antygen przypominający w obecności antygenu dawcy.Jest to wzorzec, który uznano za związany z tolerancją allograftu narządu. Pacjent numer 48 wykazuje wzorzec nieregulacyjny, którego cechą jest słaba odpowiedź na dawcę, ale brak powiązanej supresji. Wzorzec ten był często obserwowany u pacjentów przyjmujących leki immunosupresyjne.Pacjent numer osiem wykazuje wzorzec uczulenia na dawcę, charakteryzujący się silną odpowiedzią na antygen dawcy i brakiem powiązanej supresji. Odpowiedź ta wiąże się z odrzuceniem przeszczepu. W klinicznych studiach przypadków, PBMC od osób włączonych do badania obserwacyjnego poddano analizie pod kątem pośredniej ścieżki specyficznej dla dawcy oraz odpowiedzi limfocytów T efektorowych i T regulatorowych, aby ocenić rolę regulacji specyficznej dla dawcy w tolerancji klinicznej.Pośrednie odpowiedzi efektorowe na antygeny dawcy wykazują wyraźne spektrum w zależności od grup rekrutacyjnych. Obrzęk poduszki stopy wzrasta w miarę przejścia stanu klinicznego pacjenta z grupy osób tolerancyjnych do osób z chronicznym odrzuceniem. W tym przypadku powiązany test supresji mierzy antydonorsową pośrednią drogę odpowiedzi limfocytów T regulatorowych.Dane te wykazują spadek odpowiedzi regulacyjnych w zakresie od pacjentów najbardziej tolerancyjnych, przez pacjentów o tolerancji pośredniej, aż po pacjentów z najniższą tolerancją u osób z przewlekłym odrzucaniem przeszczepu. Podsumowując, regulacja odpornościowa mierzona za pomocą testu DTH trans vivo wydaje się być istotnym mechanizmem akceptacji allograftu nerki.Obiecującym obszarem jest zastosowanie testu TDTH w monitorowaniu autoimmunizacji. Nasze badanie roli kolagenu typu V w procesie patologicznym zespołu zapalenia oskrzelików OBL wykazało, że najwyższe ryzyko względne rozwoju BOS zaobserwowano u pacjentów z dodatnią odpowiedzią PBMC z krwi obwodowej biorców przeszczepów płuc na kolagen V, a nie u zdrowych kontroli lub w przypadku kolagenu.Czterech pacjentów z zespołem dobrego pastwiska wykazujących reaktywność po przeszczepie nerki często reagowało na kolagen typu V. Test TDTH może być również wykorzystany do badania reaktywności PBMC od pacjentów onkologicznych na antygeny swoiste dla nowotworu. Na przykład obecność limfocytów T regulatorowych swoistych dla PAP u pacjentów z rakiem prostaty może ograniczać odpowiedź na szczepienie antygenem PAP.Test TRANSVAAL DTH jest nowoczesnym testem diagnostycznym o zastosowaniu klinicznym w ocenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych u pacjentów po transplantacjach, z nowotworami oraz z chorobami autoimmunologicznymi. Jest on cenny, ponieważ znajduje zastosowanie nie tylko w monitorowaniu odpowiedzi przypominających efektorowych limfocytów T, ale może być również wykorzystany do wykrywania odpowiedzi regulatorowych limfocytów T, gdyż nie opiera się na pomiarze konkretnej cytokiny w celu wykrycia efektorowych lub regulatorowych limfocytów T. Metoda ta jest bardzo elastyczna i ma szeroki zakres zastosowań.

trans-vivo-delayed-type-hypersensitivity-assay-for-antigen-specific

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test nadwrażliwości opóźnionej typu in vivo na potrzeby specyficznej dla antygenu regulacji

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez CCR7-efektorowe limfocyty T pamięci. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak indukować aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) wykazujące ekspresję CCR7. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak aktywować swoiste dla antygenu komórki TEM, indukować adopcyjną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Celem tego protokołu jest umożliwienie wykrywania in vivo specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej w modelu mysim.

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

Tutaj prezentujemy demonstrację modelu przywołania pęcherza ssącego na skórę. Model ten umożliwia prosty dostęp do badania in vivo adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych u ludzi, na przykład w kontekście opracowywania szczepionek.

Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Poznaj test trans-vivo DTH do oceny odpowiedzi immunologicznych u biorców przeszczepów. Ta metoda umożliwia bezpieczne wycofanie leków immunosupresyjnych poprzez monitorowanie komórek PBMC.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Przeglądaj więcej filmów