Test nadwrażliwości trans-vivo typu opóźnionego w celu regulacji specyficznej dla antygenu

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie testu trans vivo DTH do monitorowania zarówno pro, jak i przeciwzapalnych odpowiedzi specyficznych dla antygenu u ludzi. Po pierwsze, wyizoluj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od krwi obwodowej człowieka. Następnie wymieszaj preparat PBMC z PBS.

Przywołaj antygen testowy antygen i antygen testowy oraz antygen wycofany. Kontynuuj pomiary prem podkładki pod stopę i wstrzyknij przygotowane mieszanki myszom ślizgowym. Podnóżki powtarzają pomiary 24 godziny później. Trzy.

Możliwe są ostateczne wzorce odpowiedzi DTH: regulacyjne, nieregulacyjne i uwrażliwione. Test nadwrażliwości trans vivo typu opóźnionego można zastosować do określenia parametrów klinicznych, takich jak odpowiedzi allo reakcji, w których źródłem antygenu są komórki dawcy przeszczepu. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami in vitro jest to, że można łatwo wykryć zarówno prozapalne, jak i regulacyjne odpowiedzi na antygeny allo, autoantygeny lub antygeny nowotworowe za pomocą jednego systemu testów.

Egon, badacz z mojego laboratorium, zademonstruje teraz procedurę z wykorzystaniem świeżej ludzkiej krwi obwodowej zebranej w probówkach z kwaśnym roztworem cytrynianu dekstrozy, aby uniknąć aktywacji płytek krwi. Wyizolować PBMC za pomocą pożywki do separacji limfocytów zgodnie ze standardowymi metodami. Przemyć preparat PBMC PBS w celu usunięcia zanieczyszczających płytek krwi.

Jeśli zauważalne jest zanieczyszczenie krwinek czerwonych, należy przeprowadzić lizę krwinek czerwonych za pomocą buforu do lizy CK. Następnie wykonaj jeszcze dwa mycia za pomocą PBS Resus. Zawiesić PBMC w PBS w stężeniu 10 milionów PBMC na mililitr dla antygenu allo.

Zacznij od P BMC, wyizolowanych z krwi obwodowej dawcy przy użyciu procedury pokazanej wcześniej. Następnie resus. Zawieś komórki dawcy w PBS w stężeniu 120 milionów komórek na mililitr i dodaj jeden mikromol PMSF, aby zapobiec degradacji białka.

Teraz poddaj sonikę zawiesiny komórek za pomocą siedmiu jednosekundowych impulsów za pomocą dwumilimetrowej sondy sonica. Za pomocą hemocytometru. Sprawdź, czy przerwanie działania jest w ponad 90% komórek.

Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 14 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Ostrożnie przenieść supernatant do dwóch bezpiecznych probówek blokujących i oznaczyć stężenie białka za pomocą standardowych metod dla każdego wstrzyknięcia. Podwielokrotność siedem razy 10 do szóstego P BMC na dwa mililitry.

Bezpieczne probówki blokujące granulują komórki przez odwirowanie. Najpierw należy przygotować zawiesinę kontroli ujemnej PBMC w 35 mikrolitrach PBS. Następnie w celu kontroli pozytywnej dodać 25 mikrolitrów antygenu przywoławczego, tężca, toksoidu, błonicy, toksoidu i dostosować objętość wstrzyknięcia do 35 mikrolitrów za pomocą PBS.

Zgodnie z projektem eksperymentalnym służącym do oceny odpowiedzi specyficznej dla dawcy, ponownie zawieś osad komórkowy w 10 mikrolitrach antygenu dawcy oraz 25 mikrolitrach PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 35 mikrolitrów. W celu oceny eksperymentalnej regulacji specyficznej dla antygenu dawcy, resus zawiesił osad komórkowy w 35 mikrolitrach, dodając 10 mikrolitrów antygenu dawcy i 25 mikrolitrów antygenu TT DT z powrotem. Po znieczuleniu mysz ślizgowa z izofluorem umieszcza sprężynową suwmiarkę na środku podnóżka, tak aby jedna krawędź dotykała ostatniej podkładki do chodzenia stopy, aby zapewnić punkt odniesienia, aby utrzymać spójne miejsce pomiaru, gdy odczyt miernika się ustabilizuje.

Zapisać wyjściową grubość opuszki stopy do wstrzyknięcia opuszki na stopę. Umieścić strzykawkę z igłą skierowaną w stronę palców u nóg i skosem skierowanym do góry. Teraz rozpocznij podskórne wstrzyknięcia każdej zawiesiny komórkowej do tylnych opuszków stóp dla myszy.

Po pierwsze, powoli wstrzyknij prawą poduszkę stopy z preparatem do kontroli ujemnej. Następnie wstrzyknąć do lewej opuszki stopy dodatnią kontrolę PBMC plus TT dt. Teraz przywróć mysz do klatki dla myszy.

Po drugie, wstrzyknąć prawą poduszkę stopy z PBMC plus antygen allo, a lewą poduszkę stopy z PBMC plus allo antigen plus TT dt. Upewnij się, że nie ma wycieku około 18 do 24 godzin po wstrzyknięciu. Znieczulij każdą mysz izofluorem i powtórz pomiar obrzęku opuszki stopy.

Odejmij grubość każdej opuszki stopy przed wstrzyknięciem od wartości po wstrzyknięciu, aby uzyskać wartość obrzęku opuszki stopy. Następnie obliczyć obrzęk siatki specyficznej dla antygenu, odejmując kontrolną wartość obrzęku opuszki stopy od wartości obrzęku opuszki stopy uzyskanych z zabiegów. Sprawdzić, czy kontrola dodatnia odczytuje reakcję kontroli dodatniej, aby przywołać antygen TT DT większy lub równy 25 razy 10 do minus czwartego cala nad.

Aby test został uznany za ważny, wymagana jest odpowiedź w tle na PBS. Następnie określ hamowanie reakcji przywoławczych w obecności antygenów dawcy. W tym eksperymencie ocenia się biorców przeszczepu nerki pod kątem specyficznej odpowiedzi antygenu dawcy i regulacji.

Istnieją trzy główne wzorce nadwrażliwości typu opóźnionego u biorców przeszczepów: regulacyjny, nieregulacyjny i uczulony. Wszyscy pacjenci silnie zareagowali na pozytywną kontrolę antygenu przypominającego tt. Pacjent numer 62 pokazuje wzorzec regulacyjny charakteryzujący się słabą odpowiedzią na antygen dawcy i wyraźną sprzężoną supresją w celu przypomnienia odpowiedzi antygenowej w obecności antygenu dawcy.

Jest to wzorzec, który okazał się być związany z tolerancją przeszczepu allogenicznego narządu. Pacjent numer 48 wykazuje nieregulacyjny wzorzec, który charakteryzuje się słabą odpowiedzią na dawcę, ale bez powiązanej supresji. Wzorzec ten był często obserwowany u pacjentów przyjmujących leki immunosupresyjne.

Pacjent numer osiem wykazuje wzorzec uwrażliwienia dawcy charakteryzujący się wysoką odpowiedzią na antygen dawcy i brakiem powiązanej supresji. Ta odpowiedź jest związana z odrzuceniem przeszczepu. W klinicznych badaniach przypadków BMC P od osób włączonych do badania obserwacyjnego oznaczano pod kątem specyficznego dla dawcy szlaku pośredniego, efektora T i odpowiedzi regulatorowej T w celu oceny roli regulacji specyficznej dla dawcy w tolerancji klinicznej.

Pośrednie odpowiedzi tektora na antygeny dawcy ujawniają wyraźne spektrum we wszystkich grupach rekrutacyjnych. Obrzęk opuszki stopy zwiększa się, gdy stan kliniczny pacjenta zmienia się z tolerancyjnych na chronicznie odrzucających. W tym przypadku połączony test supresji mierzy pośredni szlak odpowiedzi regulacyjnej T przeciwko donorowi.

Dane te wskazują na spadek odpowiedzi regulacyjnych w zakresie od pacjentów najbardziej tolerancyjnych do pacjentów o średniej do najmniej tolerancyjnej przewlekle odrzucającej. Wzięte razem. Regulacja immunologiczna mierzona za pomocą testu trans vivo DTH wydaje się być ważnym mechanizmem akceptacji alloprzeszczepu nerkowego.

Obiecującym obszarem jest zastosowanie testu TDTH w monitorowaniu autoimmunizacji. Nasze badanie roli kolagenu typu piątego w procesie patologicznym zespołu OBL zapalenia oskrzelików wykazało, że najwyższe względne ryzyko rozwoju BOS zaobserwowano u pacjentów z pozytywną odpowiedzią na kolagen. Pięć pbmc od biorców przeszczepu płuc, ale nie od zdrowych osób z grupy kontrolnej lub kolagenu.

Cztery reaktywne zespoły dobrego pastwiska Pacjenci po przeszczepie nerki często byli kolagen pięć reaktywnych. Test TDTH może być również stosowany do badania reaktywności pbmc od pacjentów z rakiem na antygeny specyficzne dla nowotworu. Na przykład obecność limfocytów regulatorowych T specyficznych dla PAP u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego może ograniczać odpowiedź na szczepienie antygenem PAP.

Test DTH TRANSVAAL jest nowatorskim testem diagnostycznym mającym zastosowanie kliniczne w ocenie komórkowej odpowiedzi immunologicznej u pacjentów po przeszczepach i pacjentów autoimmunologicznych. Jest cenny, ponieważ jest nie tylko przydatny w monitorowaniu odpowiedzi przywołania efektora t, ale może być również używany do wykrywania odpowiedzi regulacyjnych T, ponieważ nie opiera się na konkretnym pomiarze cytokin w celu wykrycia efektu lub regulatorowych limfocytów T. Jest bardzo elastyczny i ma szerokie zastosowanie.