Name: Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Odkryj metodę polimeryzacji wielowarstwowej z gradientem gęstości do tworzenia biokompatybilnych rusztowań dla inżynierii tkankowej. Technika ta umożliwia badanie migracji i różnicowania komórek bez kosztownego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie od NIH Director's New Innovator Awards (1DP2 OD006499-01 dla A.A. i 1DP2 OD006460-01 dla A.J.E.), oraz King Abdulaziz City for Science and Technology (UC San Diego Center of Excellence in Nanomedicine). Chcielibyśmy podziękować Pani Jessice Moore za jej krytyczne uwagi na temat manuskryptu.

1. Synteza znakowanego fluorescencyjnie akryloilo-PEG-RGDS
<ol>
 <li>Peptyd RGDS należy reagować z estrem karboksymetylo-akrylowym AKRYLOIL-PEG-sukcynimidylo (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g/mol) i N-N diizopropyloetyloaminą (DIPEA) w stosunku molowym 1,2:1:2 w dimetylosulfonku (DMSO) pod argonem w temperaturze pokojowej przez noc. </li>
 <li>Potwierdź koniugację za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF). Dodać 1 μl roztworu reakcyjnego aPEG-RGDS do miejsca próbki na tarczy MALDI i wysuszyć. Przygotować nasycony roztwór Universal MALDI Matrix w tetrahydrofuranie (THF) i wirować przez 1 min. Dodać ~1 μl tego roztworu do tego samego miejsca próbki. Powtórz procedurę dla aPEG-SCM dla porównania. Załaduj i przeanalizuj. Masa cząsteczkowa aPEG-RGDS powinna być większa niż aPEG-SCM (ryc. 2).</li>
 <li>Aby sprzęgnąć fluorofor, dodać równomolową ilość kwasu karboksylowego Alexa Fluor 350 (estru sukcynimydylu), rozpuszczonego w minimalnej objętości DMSO, do roztworu reakcyjnego aPEG-RGDS z 1,1 i przereagować pod argonem w temperaturze pokojowej przez noc. </li>
 <li>Oczyszczać aPEG-RGDS-350 przez dializę (MW 3500 Da) przeciwko DI-H2O w temperaturze 4 °C przez 48 godzin w stosunku objętościowym 1,000:1, wymieniając dialilat co najmniej dwa razy dziennie. </li>
 <li>Oczyszczony aPEG-RGDS-350 należy liofilizować w systemie liofilizacji Labconco Freezone Plus lub równoważnym systemie liofilizacji i przechowywać w temperaturze -20 °C. </li>
</ol>
2. Przygotowanie formy 2D i produkcja żelu 2D PEG z naprzemiennymi warstwami RGDS-350
<ol>
 <li>Przygotuj szkiełka hydrofobowe. Umieść czyste szkiełka w szklanym naczyniu w piekarniku próżniowym. Podgrzewać do 80 °C przez 30 minut, aby całkowicie wyschnąć powierzchnie. Umieść naczynie ze szkiełkami w dygestoriach i dodaj 250 μl Sigmacote do każdego szkiełka, delikatnie kołysząc przez 30 sekund, aby pokryć całą powierzchnię. Dokładnie wypłukać powlekane szkiełka 100% metanolem, a następnie umyć w wodzie destylowanej, mocząc dwukrotnie przez 5 minut w co najmniej 10 ml. </li>
 <li>Wytnij silikonowe przekładki (o grubości 0,8 mm) za pomocą stempli biopsyjnych 10 mm. </li>
 <li>Autoklaw silikonowych przekładek i szkiełek szklanych poddanych obróbce Sigmacote. </li>
 <li>Sformułować roztwory dla każdej odpowiedniej warstwy w oddzielnych probówkach do mikrofuge, mieszając prekursor diakrylanu PEG (PEGda) (stężenie końcowe 15% w/v) z różnymi ilościami jodiksanolu (60% roztwór podstawowy w wodzie) w celu uzyskania różnych stężeń końcowych (np. 40%, 30%, 20% i 10%), uzupełniając pozostałą objętość solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu uzyskania roztworów o stopniowanej gęstości. W podobny sposób, dla naprzemiennych warstw, zmieszaj aPEG-RGDS-350 (stężenie końcowe 8 mM) z jodiksanolem i PBS, aby uzyskać różne stężenia (np. 35%, 25% i 15%). </li>
 <li>Dodać fotoinicjator (2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon, 333 mg/ml zapasu w N-winylopirolidonie) do każdego roztworu dla różnych warstw (10 μl roztworu podstawowego na ml roztworu każdej warstwy). Fotoinicjator jest dodawany jako ostatni, aby zapobiec polimeryzacji przed nałożeniem warstw żeli w formie, ponieważ jest wrażliwy na światło. </li>
 <li>Kolejne etapy tego protokołu będą wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu zapewnienia sterylności.</li>
 <li>Przefiltruj i wysterylizuj każdy roztwór za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i filtra 0,2 μm. Zmontuj konfigurację formy, umieszczając przekładkę między dwoma szkiełkami szklanymi poddanymi obróbce Sigmacore i zabezpiecz za pomocą zacisków, umieszczając je tak, jak pokazano na rysunku 1. </li>
 <li>Odlać warstwowe żele, dodając najpierw najbardziej gęsty roztwór (np. PEGda z 40% jodiksanolu), a następnie mniej gęsty roztwór (np. aPEG-RGDS-350 z 35% jodiksanolu). Powtórz naprzemienne nakładanie warstw, aby uzyskać kilka warstw o pożądanym składzie i gęstości, jak pokazano na rysunku 1. </li>
 <li>Naświetlić formę światłem o długości fali 365 nm przez 3 minuty za pomocą przenośnej lampy UVR-9000. Pozostaw spolimeryzowane żele do utwardzenia przez 5 minut. Zdejmij zaciski, a następnie delikatnie podnieś górny szkiełko i formę; rozwarstwione żele DGMP pozostaną na szkiełkach. Za pomocą sterylnej szpatułki ostrożnie umieścić żele w probówce o pojemności 50 ml zawierającej sterylny PBS lub pożywkę hodowlaną do przemycia.</li>
 <li>Przemyj spolimeryzowane żele w PBS w stosunku objętościowym 1,000:1, wymieniając bufor co najmniej dwa razy dziennie w celu usunięcia modyfikatora gęstości, fotoinicjatora i nieprzereagowanego polimeru. Alternatywnie, PBS można wymienić na pożywkę do wzrostu komórek. Przechowuj żele DGMP w PBS lub pożywce wzrostowej do eksperymentu z hodowlą komórkową opisanego w kroku 3.</li>
 <li>Aby uwidocznić naprzemienne warstwy, ułóż żel DGMP (te żele nie będą nadawały się do hodowli komórkowych) wzdłuż linijki na tacy na próbki w jednostce dokumentacji żelu VersaDoc. Eksponować żele w 350 nm; Czas ekspozycji będzie się różnić w zależności od stężenia fluoroforu. Naprzemienne ciemne i niebieskie pasma w hydrożelu DGMP pokazują tworzenie się dyskretnych warstw o różnym składzie chemicznym (ryc. 3). </li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa 2D na żelach DGMP
<ol>
 <li>W przypadku żeli zawierających peptyd RGDS należy użyć komórek zależnych od adhezji, takich jak mioblasty C2C12.
 </li>
 <li>Delikatnie wprowadzić żele DGMP (przechowywane w PBS) do dołków 48-dołkowych płytek do hodowli komórkowych za pomocą sterylnego skrobaka do komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego. 
 </li>
 <li>Wstępnie ogrzane podłoże wzrostowe (zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco lub DMEM uzupełniona 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej i 1% v/v 100x roztwór penicyliny i streptomycyny) i PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. </li>
 <li>Umyj 60% zlewającą się płytkę (10 mm) komórek C2C12 trzykrotnie za pomocą PBS. Odessać PBS i zebrać komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej i policz komórki. Dobrze wysiewać hodowlę komórkową zawierającą żel DGMP z mioblastami C2C12 (20 000 komórek / cm2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej 5% CO2/95%. Delikatnie wymień podłoże po 4 godzinach, uważając, aby nie usunąć lekko przylegających komórek.</li>
 <li>Po 24 godzinach przyłączenie mioblastów C2C12 do warstw żeli DGMP zawierających RGDS można potwierdzić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i kontrastu fazowego (Zeiss Axiovert 200). </li>
</ol>

<ol><li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li>
<li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li>
<li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li>
<li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly%28ethylene+glycol%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li>
<li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li>
<li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft%2C+Bilayered+Drosophila+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)"> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

DGMP to prosta strategia przygotowania wielowarstwowych żeli, która nie opiera się na drogim oprzyrządowaniu. Protokół ten można dostosować do tworzenia rusztowań przy użyciu innych biokompatybilnych materiałów, takich jak kolagen i kwas hialuronowy. Bioaktywne małe cząsteczki, na przykład peptyd RGDS sprzyjający adhezji komórek, mogą być przywiązane do matrycy polimerowej, aby zapobiec mieszaniu się sygnałów między warstwami. Białka mogą być zamknięte w odrębnych warstwach bez konieczności koniugacji chemicznej, ponieważ, w zależności od rozmiaru oczek matrycy, są mniej podatne na dyfuzję przez hydrożele10. W tym przypadku użyliśmy jodiksanolu (Nycoprep), obojętnego modyfikatora gęstości, który wcześniej był używany do zastosowań w żywotnych komórkach. Można również stosować inne modyfikatory gęstości, takie jak sacharoza i dekstroza. Zmieniając czas ustalania (ts), można precyzyjnie dostroić interfejsy między dwiema warstwami, aby uzyskać gładkie lub ostre przejścia w zależności od potrzeb (dłuższy czas osiadania zapewnia płynniejsze przejścia)10. Na przykład, płynniejsze przejścia między warstwami żelu DGMP mogą być wykorzystane do generowania ciągłego gradientu sygnału biologicznego w celu zbadania procesów komórkowych, takich jak chemotaksja. 
Wpływ modyfikatora gęstości na sztywność żelu pokazano na rysunku 5 dla żelu 15% aPEGda; Obecnie trwają prace nad pełniejszą charakterystyką sztywności i porowatości w funkcji stężeń PEGda i jodiksanolu. Chociaż stężenie PEGda w tym przykładzie jest stosunkowo wysokie, zaobserwowaliśmy o 60% większy moduł sprężystości w żelach zawierających 30% jodiksanol w porównaniu z żelami bez niego. Zmianę sztywności żelu można skorygować, modulując stężenie makromeru lub gęstość usieciowania.
Zastosowaliśmy również technikę DGMP do tworzenia wielowarstwowych żeli 3D z wykorzystaniem prekursorów poliakrylamidu i PEG10. Zmiana stężenia lub stopnia usieciowania prepolimeru pozwala na zmianę strukturalną rusztowań, które można wykorzystać do badania zachowania komórek, takiego jak spolaryzowany wzrost i migracja w 3D. 
Podsumowując, DGMP to elastyczna technika, którą można zastosować do wytwarzania rusztowań 2D i 3D z różnych materiałów biokompatybilnych do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych i badań podstawowych.

<table><tbody><tr><td>Glikol polietylenowy sukcynimydyl karboksymetylo (a-PEG-SCM)</td><td>Laysan</td><td>120-64</td><td></td></tr><tr><td>Diakrylan glikolu polietylenowego (PEGda)</td><td>Dajac</td><td>Labs 9359</td><td></td></tr><tr><td>Kwas argininino-glicynowy-asparaginowy-seryna (RGDS)</td><td>Amerykański peptyd</td><td>49-01-4</td><td></td></tr><tr><td>N,N- Diizopropyloetyloamina (DIPEA)</td><td>Sigma</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>N,N- dimetyloformamid (DMF)</td><td>Fisher</td><td>D119-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>Kaseta</td> do dializy Fisher <td>T397</td><td></td></tr><tr><td>(3500 Da)</td><td>Thermo Scientific</td><td>66330</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 ester sukcynimydylowy kwasu karboksylowego</td><td>Life Technologies</td><td>A-10168</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Dystanse silikonowe</td><td>Grainger</td><td>1MWA4</td><td></td></tr><tr><td>Stemple do biopsji</td><td>Acuderm</td><td>P1025 (10 mm) P850 (8 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Hyclon</td><td>SH30028</td><td></td></tr><tr><td>Jodixanol (NycoPrep)</td><td>Fisher</td><td>NC9388846</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4'-(2- hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon </td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco)</td> <td>Life Technologies</td><td>11054</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Mioblasty C2C12</td><td></td><td>ATCC CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>MALDI</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UVR-9000</td><td>Bayco</td><td>UVR-9000</td><td></td></tr><tr><td>VersaDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (dgmp): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Złożone matryce kultur tkankowych, w których typy i stężenia bodźców biologicznych (np. czynniki wzrostu, inhibitory lub małe cząsteczki) lub struktura matrycy (np. skład, stężenie lub sztywność matrycy) zmieniają się w przestrzeni, umożliwiłyby szeroki zakres badań dotyczących wpływu tych zmiennych na różnicowanie komórek, migrację i inne zjawiska. Głównym wyzwaniem w tworzeniu matryc warstwowych jest utrzymanie integralności strukturalnej interfejsów warstw bez dyfuzji poszczególnych komponentów z każdej warstwy1. Obecne metodologie pozwalające to osiągnąć obejmują fotowzorce2-3, litografię4, funkcjonalizację sekwencyjną5, liofilizację6, mikrofluidykę7 lub wirowanie8, z których wiele wymaga zaawansowanego oprzyrządowania i umiejętności technicznych. Inne polegają na sekwencyjnym łączeniu poszczególnych warstw, co może prowadzić do rozwarstwieniawarstw 9. 
DGMP rozwiązuje te problemy, używając obojętnego modyfikatora gęstości, takiego jak jodixanol, do tworzenia warstw o różnej gęstości10. Ponieważ modyfikator gęstości można mieszać z dowolnym prepolimerem lub cząsteczką bioaktywną, DGMP umożliwia dostosowanie każdej warstwy rusztowania. Prosta zmiana stężenia modyfikatora gęstości zapobiega mieszaniu się sąsiednich warstw, gdy pozostają one wodne. Następująca po niej jednoetapowa polimeryzacja prowadzi do powstania strukturalnie ciągłego rusztowania wielowarstwowego, w którym każda warstwa ma odrębne właściwości chemiczne i mechaniczne. Modyfikator gęstości można łatwo usunąć po wystarczającym wypłukaniu bez zakłóceń poszczególnych warstw lub ich składników. Technika ta doskonale nadaje się zatem do tworzenia hydrożeli o różnych rozmiarach, kształtach i materiałach.
Protokół wytwarzania żelu z glikolu polietylenowego (PEG) 2D, w którym naprzemienne warstwy zawierają RGDS-350, jest opisany poniżej. Używamy PEG, ponieważ jest biokompatybilny i obojętny. RGDS, peptyd adhezyjny11 komórek, służy do wykazania przestrzennego ograniczenia sygnału biologicznego, a koniugacja fluoroforu (Alexa Fluor 350) umożliwia wizualne rozróżnienie różnych warstw. Procedura ta może być dostosowana do innych materiałów (np. kolagenu, hialuronianu itp.) i może być rozszerzona o wytwarzanie żeli 3D z pewnymi modyfikacjami10.

Analiza MALDI-TOF potwierdza sprzężenie peptydy RGDS z akryloyl-PEG (Rysunek 2). Obrazowanie żelu wykazuje naprzemienne warstwy RGDS-350 (niebieskie) po fotopolimeryzacji (Rysunek 3A). Jak pokazano na Rysunku 3A, rozmiar żelu 2D DGMP może być zróżnicowany w zależności od średnicy form silikonowych (10 mm, po lewej; 8 mm, po prawej), dzięki czemu można go łatwo dostosować do wielu testów – w tym przypadku do dopasowania do 48-dołkowej płytki do hodowli komórek (Rysunek 3B). Mikroskopia epifluorescencyjna i fazowo-kontrastowa mioblastów C2C12 hodowanych na żelu DGMP wykazuje selektywne przywieranie do warstw PEG zawierających RGDS-350 (Rysunek 4), co demonstruje kompartymentację peptydy adhezyjnego komórek (RGDS).
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Wykres spektrometrii mas MALDI-TOF, aPEG-SCM vs. aPEG-RGDS, intensywność vs. masa cząsteczkowa." fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Analiza masy cząsteczkowej metodą MALDI-TOF porównująca aPEG-SCM z aPEG-RGDS otrzymanym po konjugacji z peptydem RGDS.
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Schemat gradientu gęstości rozpuszczalnika, dwuwymiarowy wielowarstwowy podłoże tkankowe, jodiksanol, układ fotoniczny." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie wytwarzania żelu DGMP. Po uwarstwieniu gradientów można pozostawić je do ustabilizowania przez różny czas (ts) w celu stworzenia stopniowanych interfejsów, a następnie przeprowadzić fotopolimeryzację. Uwarstwione żele DGMP można łatwo wyciągnąć z formy do dalszego zastosowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Schemat analizy wzorców mikroprzepływowych; eksperyment na płytce wielodołkowej do testowania hodowli komórkowych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. A) Wielowarstwowe żele 2D uzyskane po fotopolimeryzacji, obrazowane przy użyciu kanałów 350 nm i światła białego w systemie dokumentacji żeli VersaDoc. Obraz w skali szarości ukazuje naprzemienne warstwy zawierające RGDS zaznaczone na biało. B) Umieszczenie żelu DGMP w 48-dołkowych naczyniach do hodowli komórkowej.
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopowy komórek fibroblastów; badanie morfologii komórkowej w skali 50 μm; badania biomedyczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Połączony obraz w kontraście fazowym i epifluorescencji myoblastów C2C12 hodowanych na żelach DGMP (pasek skali 50 μm). 
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Wykres modułu sprężystości w zależności od stężenia jodixanolu; istotność statystyczna zaznaczona gwiazdkami." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wpływ jodixanolu na sprężystość powierzchni żelu. Pomiary za pomocą mikroskopii sił atomowych statycznych próbek podłoży z sieciowanego PEG, przeprowadzone przy użyciu wcześniej ustalonych metod z wyzwalaczem siły 2 nN 12. *p&lt; 0,05 i **p&lt;0,01.

Tutaj opisujemy unikalną strategię tworzenia biokompatybilnych, warstwowych matryc z ciągłymi interfejsami między różnymi warstwami dla inżynierii tkankowej. Takie rusztowanie może zapewnić idealne, konfigurowalne środowisko do modulowania zachowania komórek za pomocą różnych sygnałów biologicznych, chemicznych lub mechanicznych

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wielowarstwowego rusztowania do hodowli komórkowych. Ten film pokaże, jak wytworzyć matrycę hodowli komórkowej 2D, włączając peptyd adhezyjny RGDS w naprzemiennych warstwach w celu oddzielenia regionów C dwóch komórek C 12. Osiąga się to poprzez pierwsze przywiązanie peptydu RGDS do lojalnego makro.Kombinacja makropeptydów jest następnie oznaczana barwnikiem LOR, aby umożliwić wizualizację warstw zawierających peptyd wielowarstwowych żeli. Drugim krokiem jest uformowanie form poprzez wycięcie ich z arkusza silikonu i umieszczenie ich między dwoma szkiełkami szkiełkowymi następnie po przygotowaniu, mieszając poszczególne składniki każdej warstwy. Roztwory peg di acrl i peg di acrl z PEG RGDS Alexa three 50 są naprzemiennie nakładane warstwami w formach.Żele są polimeryzowane przez promieniowanie UV. Ostatnim krokiem jest wysianie C dwóch komórek C 12 na wielowarstwowych żelach 2D w celu zbadania, jak skład macierzy wpływa na wzrost i przyczepienie komórek. Ostatecznie mikroskopia jasnego pola i mikroskopia fluorescencyjna są wykorzystywane do wizualizacji selektywnego wzrostu komórek C 2 C 12 na rusztowaniach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest to prosta i opłacalna metoda tworzenia wielowarstwowych matryc 2D i 3D do hodowli komórkowych. Nie opiera się na potrzebie drogiego oprzyrządowania. Podczas gdy interfejsy między warstwami są ciągłe i strukturalnie integralne.Nie ma mieszania składników poszczególnych warstw. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, w jaki sposób komórki migrują i polaryzują się w odpowiedzi na wzorce biologiczne, chemiczne i mechaniczne sygnały. Metoda ta może zapewnić delikatny wgląd w migrację i różnicowanie komórek i może być stosowana w innych systemach, takich jak kierowanie nowym prawym wzrostem i synaptogeneza neuronalnych komórek macierzystych.Aby rozpocząć tę procedurę, połącz peptyd RGDS i ester metylowy sukcynylokarbo-metylowy z kołkiem acro w stosunku od jednego do dwóch do jednego mola w suchym DMSO pod Argonne. Następnie dodaj NN diop, propylometyloaminę lub D-I-P-E-A w stosunku dwa do jednego mola w stosunku do aquilo PEG SCM, aby ułatwić reakcję, potwierdź koniugację cząsteczki aquilo PEG RGDS za pomocą spleśniałej spektrometrii mas TOF. W tym celu osobno dodaj jeden mikrolitr roztworu reakcyjnego AQUILO PEG RGDS i jeden mikrolitr niereaktywnego aquilo PEG SCM do różnych miejsc na spleśniałym celu.Pozwól im obu wyschnąć. Następnie przygotuj nasycony roztwór uniwersalnej spleśniałej matrycy w wirze THF przez jedną minutę i dodaj jeden mikrolitr do tych samych dwóch miejsc. Pozwól im obu wyschnąć.Następnie załaduj próbki. Wykonuj analizę spleśniałych, twardych elementów za pomocą lasera 60 Hz o mocy około 19%, korzystając z algorytmów SAVIS gole smoothing, top hat, odejmowania linii bazowej i wykrywania pików OID. Masę cząsteczkową acro PEG RGDS należy przesunąć w prawo, co odpowiada zmianie masy spowodowanej kowalencyjnie związanym peptydem.Następnym krokiem jest koniugacja fluoru poprzez dodanie równomolowej ilości LOR trzech 50 kwasów karboksylowych zasysa ester środkowy w stosunku do aquilo PEG SCM rozpuszczony w minimalnej objętości DMSO do roztworu reakcyjnego aquilo PEG RGDS Pod argonem inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie oczyść kołek do oleju acro RGD S3 50, dializując go wodą barwiącą w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą kasety dializacyjnej o masie cząsteczkowej 3 500 DAU. Kontynuuj dializę przez 48 godzin, stosując współczynnik objętościowy 1001, wymieniając zimny dializat co najmniej dwa razy dziennie.Produkt jest dalej oczyszczany przez sterylizację filtra przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona. Na koniec, w sterylnym środowisku, podwielokrotnić sterylny, oczyszczony kołek do oleju akro RGD S3 50 do sterylnych, wstępnie zważonych mikroprobówek wirówkowych. Uszczelnij otwarte probówki mikrowirówek w sterylnym wężu odpowietrzającym.Próbki należy liofilizować i przechowywać każdą szczelnie zawiniętą w folię parafinową w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Umyj wstępnie szkiełka w 100% metanolu i wysusz w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż płyn odparuje. Następnie umieść naczynie zawierające szklane szkiełka w dygestorium i dodaj 250 mikrolitrów płaszcza sigma do każdego szkiełka.Delikatnie kołysz szkiełkami przez 30 sekund, aby pokryć całą powierzchnię. Następnie dokładnie spłucz powlekane szkiełka 100% metanolem, a następnie umyj i zanurz w wodzie destylowanej, mocząc je dwukrotnie przez pięć minut w co najmniej 10 mililitrach wody. Po wypłukaniu pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.Przygotuj silikonowe przestrzenie o grubości 0,8 milimetra, przycinając arkusz silikonu do tych samych wymiarów, co szkiełka. Następnie za pomocą stempli biopsyjnych wykonaj 10 milimetrowe lub ośmiomilimetrowe otwory w silikonie, aby utrzymać rusztowania za pomocą żyletki. Wykonaj około dwóch milimetrowych kanałów w górnej części formy, aby umożliwić dodanie materiału rusztowania.Następnie autoklawuj silikonowe przestrzenie i szkiełka szklane pokryte powłoką sigma, aby je wysterylizować. Sterylizuj również dodatkowe materiały do odlewania żeli, takie jak probówki einor i kleszcze. W filtrze kapturowym do hodowli tkankowych wysterylizuj podstawowy roztwór Peg di aquil za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra i filtra 0,2 mikrona.Zacznij od sformułowania roztworów prepolimerowych PEG o stosunku wagowym 15% do objętości dla każdej odpowiedniej warstwy w indywidualnych bursztynowych probówkach z mikroodpadami, łącząc 50% PEG D acrl z różnymi ilościami sterylnego roztworu podstawowego 60% IO DAL PBS i fotoinicjatora, aby uzyskać różne stężenia końcowe 10%20%30% i 40%I oal dokładnie wymieszaj roztwory, aby przygotować fluorescencyjnie oznakowany 15% roztwór prepolimeru PEG, połączyć 50% PEG di aquil i aquilo PEG RGD S3 50 o końcowym stężeniu ośmiu milimolowych z roztworem podstawowym IO Dal PBS i fotoinicjatorem w bursztynowych probówkach Microview, aby uzyskać stężenia 15% 25% i 35% IO IAL dokładnie wymieszać roztwory. Następnie zmontuj zestaw formy, umieszczając wstępnie przyciętą przekładkę między dwoma szkiełkami szklanymi poddanymi obróbce sigma co i zabezpiecz zaciskami. Po złożeniu formy odlej warstwowy żel, dodając najpierw 10 mikrolitrów 40% roztworu, a następnie 10 mikrolitrów fluorescencyjnie znakowanego 35% roztworu.Powtórz naprzemienne nakładanie warstw, aby uzyskać kilka warstw. Następnie naświetlaj formę światłem o długości 365 nanometrów przez trzy minuty. Używając przenośnej lampy UVR 9 000, pozwól spolimeryzowanym hydrożelom utwardzić się przez pięć minut.Następnie zdejmij zaciski i delikatnie podnieś górną szklaną prowadnicę i formę. Warstwowy gradient gęstości. Polimeryzacja wielowarstwowa lub żele DG MP pozostaną na szkiełkach.Za pomocą sterylnej szpatułki ostrożnie wyjmij żele z formy i umieść je w 50-mililitrowej probówce zawierającej sterylny DMEM. Płukać spolimeryzowane żele przy użyciu stosunku objętościowego DMEM 1000 do jednego przez 48 godzin z dwiema wymianami buforu dziennie. Spowoduje to usunięcie wszelkiej gęstości, modyfikatora, inicjatora fotograficznego i reakcji wstępnej polimeru.Następnie przechowuj żele DGMP w DMEM uzupełnione 1% penicyliną streptomycyną. Aby uwidocznić naprzemienne warstwy, ułóż żel DGMP wzdłuż linijki na tacy na próbki jednostki dokumentacji żelu. Następnie naświetl i zobrazuj żele za pomocą Alexy: trzy 50 naprzemiennych ciemnych i niebieskich pasków w hydrożelu DGMP pokazują tworzenie dyskretnych warstw o różnym składzie chemicznym.Aby przygotować żele DGMP do hodowli komórkowej, delikatnie włóż je do studzienek 48-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i spłukać je trzykrotnie w pożywce do hodowli komórkowych. Następnie zbierz C, dwa mioblasty C 12 z 100-milimetrowej płytki do hodowli komórek, gdy są w 60% zlewne.Aby to zrobić, spłucz płytkę trzykrotnie ciepłym PBS. Następnie dodaj jeden mililitr 0,25% płynów w EDTA i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Po odłączeniu komórek dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w celu odwirowania.Po granulowaniu komórek Reeses, umieść je w pożywce wzrostowej i policz żywe komórki, dodając niebieski triam i używając licznika komórek TC 10. Następnie wysiewamy rusztowanie DG MP za pomocą C dwóch C 12 mioblastów i inkubujemy przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Potwierdzić przyłączenie C dwóch C 12 mioblastów do RGDS zawierającego warstwy żeli DGMP za pomocą mikroskopii epifluorescencji i kontrastu fazowego.Naprzemienne warstwy żeli DGMP mogą zawierać różne peptydy, takie jak RGDS pokazany po prawej stronie, który wspomaga przyczepianie i wzrost komórek. Warstwa po lewej stronie nie zawierała jednak żadnych peptydów przyłączających komórki i komórki nie przetrwały w tym regionie. IO diol może wpływać na sztywność żelu.W tym przypadku moduł sprężystości zmierzono za pomocą mikroskopii sił atomowych. Zaobserwowano 60% wzrost sztywności przy użyciu 30% IAL w tej formule żelu, wpływ IAL na sztywność żelu może się różnić w zależności od użytych materiałów Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o kolejności warstw. Warstwa zawierająca największą wartość IEX null będzie znajdować się na dole, podczas gdy warstwa z najmniejszą wartością IEX null będzie znajdować się na górze.Zawsze pamiętaj, aby dodać inicjator fotograficzny na końcu, aby zapobiec polimeryzacji pod wpływem światła otoczenia. Wraz z naszymi współpracownikami adaptujemy tę technikę, aby uporządkować rozrost neurytów w 3D. Pozwoli to na porównanie komórek progenitorowych neuro pochodzących od osób zdrowych i tych pochodzących od pacjentów z zaburzeniami neurorozwojowymi.Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym może być niebezpieczna. Nosić okulary chroniące przed promieniowaniem UV podczas wykonywania etapu sieciowania.

density-gradient-multilayered-polymerization-dgmp-novel-technique-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Gradient gęstości wielowarstwowa polimeryzacja (DGMP): Nowatorska technika tworzenia wieloskładnikowych, modyfikowalnych scaffoldów dla inżynierii tkankowej

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Rusztowania dla inżynierii tkankowej muszą podsumować złożone biochemiczne i biofizyczne mikrośrodowisko niszy komórkowej. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie międzyfazowych włókien kompleksowania polielektrolitów jako platformy do tworzenia kompozytowych, wieloskładnikowych rusztowań polimerowych o przedłużonym uwalnianiu biochemicznym.

Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

W tej pracy, rusztowania z poli(kwasu mlekowego)/glikolu polietylenowego (PLA/PEG) zostały przygotowane przy użyciu kombinacji mieszania stopionego i selektywnego ługowania. Omawiana tu metoda pozwoliła na opracowanie rusztowań trójwarstwowych poprzez ścisłą kontrolę zarówno porowatości, jak i wielkości porów. Właściwości mechaniczne oceniano również w środowisku fizjologicznym.

Łatwa i przyjazna dla środowiska metoda wytwarzania rusztowań z poli(kwasu mlekowego) o stopniowanej wielkości porów

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Obecne modele hodowli dwuwarstwowych nie pozwalają na funkcjonalne badania in vitro, które naśladują mikrośrodowiska in vivo. Wykorzystując glikol polietylenowy i metodę szablonowania tlenku, protokół ten opisuje rozwój ultracienkiej biomimetycznej błony podstawnej o regulowanej sztywności, porowatości i składzie biochemicznym, która ściśle naśladuje matryce zewnątrzkomórkowe in vivo.

Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

Odkryj metodę polimeryzacji wielowarstwowej z gradientem gęstości do tworzenia biokompatybilnych rusztowań dla inżynierii tkankowej. Technika ta umożliwia badanie migracji i różnicowania komórek bez kosztownego sprzętu.

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów