Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wielowarstwowego rusztowania do hodowli komórkowych. Ten film pokaże, jak wytworzyć matrycę hodowli komórkowej 2D, włączając peptyd adhezyjny RGDS w naprzemiennych warstwach w celu oddzielenia regionów C dwóch komórek C 12. Osiąga się to poprzez pierwsze przywiązanie peptydu RGDS do lojalnego makro

Kombinacja makropeptydów jest następnie oznaczana barwnikiem LOR, aby umożliwić wizualizację warstw zawierających peptyd wielowarstwowych żeli. Drugim krokiem jest uformowanie form poprzez wycięcie ich z arkusza silikonu i umieszczenie ich między dwoma szkiełkami szkiełkowymi następnie po przygotowaniu, mieszając poszczególne składniki każdej warstwy. Roztwory peg di acrl i peg di acrl z PEG RGDS Alexa three 50 są naprzemiennie nakładane warstwami w formach.

Żele są polimeryzowane przez promieniowanie UV. Ostatnim krokiem jest wysianie C dwóch komórek C 12 na wielowarstwowych żelach 2D w celu zbadania, jak skład macierzy wpływa na wzrost i przyczepienie komórek. Ostatecznie mikroskopia jasnego pola i mikroskopia fluorescencyjna są wykorzystywane do wizualizacji selektywnego wzrostu komórek C 2 C 12 na rusztowaniach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest to prosta i opłacalna metoda tworzenia wielowarstwowych matryc 2D i 3D do hodowli komórkowych. Nie opiera się na potrzebie drogiego oprzyrządowania. Podczas gdy interfejsy między warstwami są ciągłe i strukturalnie integralne.

Nie ma mieszania składników poszczególnych warstw. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, w jaki sposób komórki migrują i polaryzują się w odpowiedzi na wzorce biologiczne, chemiczne i mechaniczne sygnały. Metoda ta może zapewnić delikatny wgląd w migrację i różnicowanie komórek i może być stosowana w innych systemach, takich jak kierowanie nowym prawym wzrostem i synaptogeneza neuronalnych komórek macierzystych.

Aby rozpocząć tę procedurę, połącz peptyd RGDS i ester metylowy sukcynylokarbo-metylowy z kołkiem acro w stosunku od jednego do dwóch do jednego mola w suchym DMSO pod Argonne. Następnie dodaj NN diop, propylometyloaminę lub D-I-P-E-A w stosunku dwa do jednego mola w stosunku do aquilo PEG SCM, aby ułatwić reakcję, potwierdź koniugację cząsteczki aquilo PEG RGDS za pomocą spleśniałej spektrometrii mas TOF. W tym celu osobno dodaj jeden mikrolitr roztworu reakcyjnego AQUILO PEG RGDS i jeden mikrolitr niereaktywnego aquilo PEG SCM do różnych miejsc na spleśniałym celu.

Pozwól im obu wyschnąć. Następnie przygotuj nasycony roztwór uniwersalnej spleśniałej matrycy w wirze THF przez jedną minutę i dodaj jeden mikrolitr do tych samych dwóch miejsc. Pozwól im obu wyschnąć.

Następnie załaduj próbki. Wykonuj analizę spleśniałych, twardych elementów za pomocą lasera 60 Hz o mocy około 19%, korzystając z algorytmów SAVIS gole smoothing, top hat, odejmowania linii bazowej i wykrywania pików OID. Masę cząsteczkową acro PEG RGDS należy przesunąć w prawo, co odpowiada zmianie masy spowodowanej kowalencyjnie związanym peptydem.

Następnym krokiem jest koniugacja fluoru poprzez dodanie równomolowej ilości LOR trzech 50 kwasów karboksylowych zasysa ester środkowy w stosunku do aquilo PEG SCM rozpuszczony w minimalnej objętości DMSO do roztworu reakcyjnego aquilo PEG RGDS Pod argonem inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie oczyść kołek do oleju acro RGD S3 50, dializując go wodą barwiącą w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą kasety dializacyjnej o masie cząsteczkowej 3 500 DAU. Kontynuuj dializę przez 48 godzin, stosując współczynnik objętościowy 1001, wymieniając zimny dializat co najmniej dwa razy dziennie.

Produkt jest dalej oczyszczany przez sterylizację filtra przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona. Na koniec, w sterylnym środowisku, podwielokrotnić sterylny, oczyszczony kołek do oleju akro RGD S3 50 do sterylnych, wstępnie zważonych mikroprobówek wirówkowych. Uszczelnij otwarte probówki mikrowirówek w sterylnym wężu odpowietrzającym.

Próbki należy liofilizować i przechowywać każdą szczelnie zawiniętą w folię parafinową w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Umyj wstępnie szkiełka w 100% metanolu i wysusz w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż płyn odparuje. Następnie umieść naczynie zawierające szklane szkiełka w dygestorium i dodaj 250 mikrolitrów płaszcza sigma do każdego szkiełka.

Delikatnie kołysz szkiełkami przez 30 sekund, aby pokryć całą powierzchnię. Następnie dokładnie spłucz powlekane szkiełka 100% metanolem, a następnie umyj i zanurz w wodzie destylowanej, mocząc je dwukrotnie przez pięć minut w co najmniej 10 mililitrach wody. Po wypłukaniu pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.

Przygotuj silikonowe przestrzenie o grubości 0,8 milimetra, przycinając arkusz silikonu do tych samych wymiarów, co szkiełka. Następnie za pomocą stempli biopsyjnych wykonaj 10 milimetrowe lub ośmiomilimetrowe otwory w silikonie, aby utrzymać rusztowania za pomocą żyletki. Wykonaj około dwóch milimetrowych kanałów w górnej części formy, aby umożliwić dodanie materiału rusztowania.

Następnie autoklawuj silikonowe przestrzenie i szkiełka szklane pokryte powłoką sigma, aby je wysterylizować. Sterylizuj również dodatkowe materiały do odlewania żeli, takie jak probówki einor i kleszcze. W filtrze kapturowym do hodowli tkankowych wysterylizuj podstawowy roztwór Peg di aquil za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra i filtra 0,2 mikrona.

Zacznij od sformułowania roztworów prepolimerowych PEG o stosunku wagowym 15% do objętości dla każdej odpowiedniej warstwy w indywidualnych bursztynowych probówkach z mikroodpadami, łącząc 50% PEG D acrl z różnymi ilościami sterylnego roztworu podstawowego 60% IO DAL PBS i fotoinicjatora, aby uzyskać różne stężenia końcowe 10%20%30% i 40%I oal dokładnie wymieszaj roztwory, aby przygotować fluorescencyjnie oznakowany 15% roztwór prepolimeru PEG, połączyć 50% PEG di aquil i aquilo PEG RGD S3 50 o końcowym stężeniu ośmiu milimolowych z roztworem podstawowym IO Dal PBS i fotoinicjatorem w bursztynowych probówkach Microview, aby uzyskać stężenia 15% 25% i 35% IO IAL dokładnie wymieszać roztwory. Następnie zmontuj zestaw formy, umieszczając wstępnie przyciętą przekładkę między dwoma szkiełkami szklanymi poddanymi obróbce sigma co i zabezpiecz zaciskami. Po złożeniu formy odlej warstwowy żel, dodając najpierw 10 mikrolitrów 40% roztworu, a następnie 10 mikrolitrów fluorescencyjnie znakowanego 35% roztworu.

Powtórz naprzemienne nakładanie warstw, aby uzyskać kilka warstw. Następnie naświetlaj formę światłem o długości 365 nanometrów przez trzy minuty. Używając przenośnej lampy UVR 9 000, pozwól spolimeryzowanym hydrożelom utwardzić się przez pięć minut.

Następnie zdejmij zaciski i delikatnie podnieś górną szklaną prowadnicę i formę. Warstwowy gradient gęstości. Polimeryzacja wielowarstwowa lub żele DG MP pozostaną na szkiełkach.

Za pomocą sterylnej szpatułki ostrożnie wyjmij żele z formy i umieść je w 50-mililitrowej probówce zawierającej sterylny DMEM. Płukać spolimeryzowane żele przy użyciu stosunku objętościowego DMEM 1000 do jednego przez 48 godzin z dwiema wymianami buforu dziennie. Spowoduje to usunięcie wszelkiej gęstości, modyfikatora, inicjatora fotograficznego i reakcji wstępnej polimeru.

Następnie przechowuj żele DGMP w DMEM uzupełnione 1% penicyliną streptomycyną. Aby uwidocznić naprzemienne warstwy, ułóż żel DGMP wzdłuż linijki na tacy na próbki jednostki dokumentacji żelu. Następnie naświetl i zobrazuj żele za pomocą Alexy: trzy 50 naprzemiennych ciemnych i niebieskich pasków w hydrożelu DGMP pokazują tworzenie dyskretnych warstw o różnym składzie chemicznym.

Aby przygotować żele DGMP do hodowli komórkowej, delikatnie włóż je do studzienek 48-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i spłukać je trzykrotnie w pożywce do hodowli komórkowych. Następnie zbierz C, dwa mioblasty C 12 z 100-milimetrowej płytki do hodowli komórek, gdy są w 60% zlewne.

Aby to zrobić, spłucz płytkę trzykrotnie ciepłym PBS. Następnie dodaj jeden mililitr 0,25% płynów w EDTA i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Po odłączeniu komórek dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w celu odwirowania.

Po granulowaniu komórek Reeses, umieść je w pożywce wzrostowej i policz żywe komórki, dodając niebieski triam i używając licznika komórek TC 10. Następnie wysiewamy rusztowanie DG MP za pomocą C dwóch C 12 mioblastów i inkubujemy przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Potwierdzić przyłączenie C dwóch C 12 mioblastów do RGDS zawierającego warstwy żeli DGMP za pomocą mikroskopii epifluorescencji i kontrastu fazowego.

Naprzemienne warstwy żeli DGMP mogą zawierać różne peptydy, takie jak RGDS pokazany po prawej stronie, który wspomaga przyczepianie i wzrost komórek. Warstwa po lewej stronie nie zawierała jednak żadnych peptydów przyłączających komórki i komórki nie przetrwały w tym regionie. IO diol może wpływać na sztywność żelu.

W tym przypadku moduł sprężystości zmierzono za pomocą mikroskopii sił atomowych. Zaobserwowano 60% wzrost sztywności przy użyciu 30% IAL w tej formule żelu, wpływ IAL na sztywność żelu może się różnić w zależności od użytych materiałów Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o kolejności warstw. Warstwa zawierająca największą wartość IEX null będzie znajdować się na dole, podczas gdy warstwa z najmniejszą wartością IEX null będzie znajdować się na górze.

Zawsze pamiętaj, aby dodać inicjator fotograficzny na końcu, aby zapobiec polimeryzacji pod wpływem światła otoczenia. Wraz z naszymi współpracownikami adaptujemy tę technikę, aby uporządkować rozrost neurytów w 3D. Pozwoli to na porównanie komórek progenitorowych neuro pochodzących od osób zdrowych i tych pochodzących od pacjentów z zaburzeniami neurorozwojowymi.

Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym może być niebezpieczna. Nosić okulary chroniące przed promieniowaniem UV podczas wykonywania etapu sieciowania.