Używanie skanerów płaskich do zbierania poklatkowych obrazów o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi grawitropowej korzenia rzodkiewnika
25 stycznia 2014
Ten protokół opisuje proces szybkiego zbierania obrazów sadzonek rzodkiewnika reagujących na bodziec grawitacyjny za pomocą dostępnych na rynku skanerów płaskich. Metoda ta pozwala na niedrogie, wysokonakładowe przechwytywanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które można poddać dalszym algorytmom analizy.
Ogólnym celem tego filmu jest zilustrowanie opartej na skanerze metody przechwytywania obrazu o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi tropikalnej korzeni w modelowej operacji rośliny. Aby rozpocząć ten protokół, nasiona z wyznaczonego materiału siewnego sadzi się na szalkach Petriego zawierających przezroczyste podłoże Po wykiełkowaniu nasion przez wyznaczony okres czasu, szalki Petriego są wyjmowane z komory wzrostowej, przygotowywane do skanowania, a następnie umieszczane w pionowo zorientowanych skanerach płaskich. Płyty są następnie obracane o 90 stopni i skanowane przez określony czas.
Obrazy są zapisywane na komputerze lub urządzeniu do przechowywania danych i wykorzystywane później do przetwarzania obrazu. Przed akwizycją obrazu należy przygotować płytki aga zawierające dwie zeskanowane tkanki roślinne B. Najpierw zaabsorbuj wszelkie zebrane kondensacje na pokrywie i bokach płytki AGA za pomocą chusteczki kim chusteczką.
Następnie nałóż dużą ilość Triton X 100, aby zapobiec przyszłej kondensacji. Na koniec zakończ ten proces, owijając płytkę taśmą z mikroporami, aby zabezpieczyć pokrywę i umożliwić wentylację w celu rozpoczęcia akwizycji obrazu. Skonfiguruj foldery do zapisywania obrazów w żądanej lokalizacji.
Każda nazwa folderu składa się z kompilacji metadanych, które odnoszą się do informacji, które mają być skanowane. W tym przykładzie unikatowe identyfikatory wiek, rozmiar i materiał siewny były danymi zawartymi w nazwach folderów. Te metadane można następnie skopiować i wkleić do nazwy folderu.
Protokół ten zakłada, że do zbierania obrazów używany jest więcej niż jeden skaner i zawiera instrukcje dotyczące podłączania wielu skanerów do jednego komputera. Z tego powodu skonfigurowano trzy foldery do zapisywania obrazów. Następnym krokiem jest ustawienie timerów na wyznaczony czas zbierania.
Ponieważ w tym momencie jest jeszcze sporo przygotowań, pamiętaj, aby ustawić timery na trochę więcej czasu. Następnie włącz pierwszy skaner i otwórz program do skanowania widoków. Na karcie danych wejściowych ustaw źródło na właściwy skaner, a pole rozwijane automatycznego powtarzania na brak na karcie przycinania.
Ustaw obszar podglądu na Maksimum i naciśnij przycisk podglądu. Wybierz pole kadrowania, które przechwyci obszar zainteresowania i ustaw obszar podglądu na pole przycinania. Następnie ponownie wyświetl podgląd obrazu.
Aby zapisać zebrane dane w żądanej lokalizacji, naciśnij kartę wyjściową i znajdź wcześniej utworzone nazwy folderów, które odpowiadają każdemu skanerowi. Włącz następny skaner i powtórz skanowanie widoku. Skonfiguruj wskazówki dojazdu dla pozostałych dwóch skanerów, upewniając się, że wybrałeś odpowiednie foldery, w których chcesz zapisać dane.
Ważne jest również, aby przejrzeć każdą zakładkę i upewnić się, że wszystkie ustawienia skanera są zgodne z potrzebami. Nasze laboratorium odkryło, że następujące ustawienia najlepiej sprawdzają się w przypadku typu zbieranego obrazu. Jednak różne typy kolekcji obrazów mogą wymagać innych ustawień.
Po zaznaczeniu wszystkich ustawień wybierz kartę wejściową i ustaw pole rozwijane automatycznego powtarzania na ciągłe we wszystkich trzech skanerach. Przygotowane płytki należy umieścić w skanerach z sadzonkami ustawionymi poziomo i tymczasowo przyłożyć filcową stronę tła do płyt, aby zapewnić stabilność w skanerze. Jeśli wykonujesz ten protokół z partnerem, poproś jedną osobę o obrócenie płytek o 90 stopni i natychmiast wyczuwalne tło, druga osoba naciska przycisk skanowania i obie przymocowują tło do skanera za pomocą linki bungee.
Powtarza ten proces dla skanerów drugiego i trzeciego. Pełne zeskanowanie każdego obrazu powinno zająć około dwóch do trzech minut, końcowe obrazy będą wyglądać tak, jak pokazano. Dobrym pomysłem jest sprawdzenie folderów, w których zapisywane są obrazy, aby upewnić się, że wszystkie zapisują się poprawnie.
Idealnie jest trzymać skanery w miejscu, które będzie wolne od zakłóceń przez wyznaczony czas skanowania. Rozsądne jest również uwzględnienie warunków środowiskowych w obszarze skanowania, aby zapewnić idealne odpowiedzi fenotypowe. Poniższe obrazy są przykładami tych zebranych przy użyciu metody opisanej w tym filmie.
Panele A i B oraz C i D są pierwszymi i ostatnimi obrazami z pojedynczego okresu skanowania. A i B pokazują cały zeskanowany obszar. Podczas gdy C i D są przyciętym obszarem skanowanego obszaru pokazującym pojedynczą płytę, można zaobserwować kilka niespójności.
Rysunek A przedstawia różnice w kiełkowaniu i trajektorii wzrostu. Obraz B pokazuje, że na płytkach może gromadzić się kondensacja, podczas gdy obrazy C i D są uważane za dobre wyniki ze względu na silny wzrost siewek i jakość obrazu w całym przebiegu. Procedura opisana w tym artykule wpisuje się w swoją własną niszę w świecie obrazowania korzeniowego, ponieważ charakteryzuje się wysoką przepustowością i wysoką rozdzielczością, a jednocześnie jest stosunkowo przystępna cenowo.
Dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że można je łatwo dostosować do potrzeb obrazowania konkretnej grupy badawczej. Metoda jest również dostosowywana do obrazowania innych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę uzyskiwania wysokorozdzielczych obrazów siewek Arabidopsis w odpowiedzi na grawitację przy użyciu skanerów płaskich. Podejście to jest kosztowo efektywne i pozwala na gromadzenie dużej liczby obrazów odpowiednich do dalszej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Analiza obrazu
- Reakcja tropistyczna korzeni
Wprowadzenie
- Arabidopsis służy jako organizm modelowy w badaniach nad roślinami.
- Zrozumienie reakcji korzeni na grawitację jest kluczowe dla badań nad rozwojem roślin.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości usprawniają gromadzenie danych do analizy fenotypowej.
- Skanery płaskie stanowią przystępne cenowo rozwiązanie dla obrazowania wysokoprzepustowego.
Cel badania
- W celu zademonstrowania metody opartej na skanerze do rejestracji tropizmów korzeni.
- Aby ułatwić gromadzenie obrazów do późniejszej analizy.
- Aby dostarczyć konfigurowalny protokół obrazowania dla grup badawczych.
Zastosowane Metody
- Nasiona są kiełkowane na przezroczystych podłożach w szalkach Petriego.
- Szalki są skanowane przy użyciu skanerów płaskich z orientacją pionową.
- W celu zwiększenia wydajności do jednego komputera można podłączyć wiele skanerów.
- Parametry akwizycji obrazu są dostosowywane w celu uzyskania optymalnych wyników.
Główne wyniki
- Przechwycone obrazy wykazują różnice w trajektoriach kiełkowania i wzrostu.
- Odnotowano problemy z kondensacją na płytkach, co wpłynęło na jakość obrazu.
- Uzyskano wysokiej jakości obrazy, wykazujące silny wzrost siewek.
- Metoda ta umożliwia wysokoprzepustowe i konfigurowalne obrazowanie.
Wnioski
- Protokół zapewnia skuteczną metodę obrazowania reakcji korzeni.
- Można go dostosować do różnych potrzeb obrazowania w warunkach badawczych.
- Podejście to równoważy koszty i wydajność gromadzenia danych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Obrazowanie fenotypowe o wysokiej rozdzielczości w odpowiedzi grawitropowej korzeni umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnej fazie walidacji celów w procesie odkrywania terapeutyków opartych na roślinach. To niskokosztowe podejście do obrazowania o wysokiej przepustowości zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad funkcjami genów poprzez generowanie ilościowych danych z odstępami czasowymi, odpowiednich dla dalszych potoków analizy obrazu. Metoda ta rozwiązuje problemy ze skalowalnością w biologii odkrywczej, zapewniając jednocześnie integralność danych dla ciągłości translacyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowy pomiar trajektorii wzrostu korzeni jako fenotypowego odczytu funkcji genów.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza ryzyko biologiczne dzięki wysokoprzepustowemu rejestrowaniu 216 indywidualnych odpowiedzi na dobę z rozdzielczością 4,800 dpi.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfela projektów poprzez generowanie znacznej ilości wysokiej jakości danych obrazowych dla aplikacji do analizy obrazu, które wyjaśniają wariacje w trajektoriach wzrostu.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych (siewek Arabidopsis na przezroczystych pożywkach) do standaryzowanych i powtarzalnych procesów screeningu związków lub genetycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie gotowości testów poprzez zautomatyzowaną akwizycję obrazów w odstępach czasowych co kilka minut przy użyciu niedrogich skanerów płaskich.
- Wartość skalowalności: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy i adaptacji między grupami badawczymi dzięki możliwości dostosowania projektu protokołu oraz łączności wielu skanerów z jednym komputerem.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zapewnia ciągłość systemu istotnego dla badania choroby, od etapu odkrycia po ilościowe określenie fenotypu reakcji tropicznej korzeni, która jest mechanizmem konserwatywnym u organizmów modelowych.
- Kierunkowe ograniczanie ryzyka: Zmniejsza niepewność w walidacji celu poprzez izolację zmiennej niezależnej (przesunięcie wektora grawitacji) i pomiar zmiennej zależnej (wzrost korygujący) z wysoką rozdzielczością czasową.
- Pewność prognostyczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka, dostarczając ilościowych wyników umożliwiających analizę statystyczną wariancji kiełkowania oraz trajektorii wzrostu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, dostarczając standaryzowanych, ilościowych danych fenotypowych, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na wczesnym etapie walidacji celu terapeutycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie obserwacji wzrostu korygującego w korzeniach siewek przesuniętych względem wektora grawitacji.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analizy dzięki kontrolowanemu przygotowaniu płytek (zapobieganie kondensacji za pomocą Triton X-100 i taśmy mikroporowej) oraz spójnym protokołom zapisu obrazów.
- Analityka: Generuje zbiory obrazów z serii czasowej o rozdzielczości 4 800 dpi, odpowiednie do ilościowych pomiarów trajektorii wzrostu i spójności kiełkowania.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, dostarczając istotnych dla choroby odczytów fenotypowych w systemie modelowym podatnym na zaburzenia genetyczne i farmakologiczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotna możliwość obrazowania, a nie jednorazowa technika, ze względu na niski koszt, wysoką przepustowość i łatwość dostosowania do potrzeb różnych grup badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w fenotypowaniu odpowiedzi grawitropowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność osiągnięte dzięki zautomatyzowanym protokołom skanowania oraz organizacji danych za pomocą nazewnictwa folderów opartego na metadanych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone ryzyko biologiczne na późniejszym etapie dzięki wczesnemu ograniczaniu ryzyka fenotypowego z wykorzystaniem obrazowania o wysokiej rozdzielczości i dużej objętości.
- Wpływ na portfolio: Decyzje o priorytetyzacji i rozwoju dostosowane do ryzyka, możliwe dzięki szerokiemu zakresowi wysokiej jakości danych obrazowych wspierających aplikacje do analizy obrazu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza naukowa z zakresu biologii roślin oraz protokołów akwizycji obrazu dla obrazowania korzeni Arabidopsis.
- Wymagane instrumentarium obejmuje skanery płaskie o orientacji pionowej z rozdzielczością 4 800 dpi oraz możliwość podłączenia wielu skanerów do jednego komputera.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga spójnego przygotowania płytek (kontrola kondensacji za pomocą Triton X-100 i taśmy mikroporowatej) oraz nazewnictwa folderów w oparciu o metadane w celu zapewnienia powtarzalności zapisu danych.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych obejmują dostosowanie orientacji skanera i przygotowania płytek do różnych rozmiarów siewek oraz warunków wzrostu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zarządzanie kondensacją na płytkach oraz zapewnienie stabilnej orientacji siewek podczas obrotu o 90 stopni w celu indukcji odpowiedzi grawitrotropowej.
