Name: Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj elektrotaksję opartą na mikroprzepływach do analizy lokomocji Caenorhabditis elegans. Ta metoda umożliwia szybkie badanie czynników wpływających na zdrowie neuronowe i sygnalizację neuromuskularną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych, Programowi Kanadyjskich Katedr Badawczych, Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem oraz Ministerstwu Badań i Innowacji Ontario za wsparcie finansowe.

1. Fotolitografia do produkcji form
<ol>
	<li>Kąpać 3-calową płytkę krzemową w acetonie przez 30 sekund, a następnie w metanolu przez 30 sekund. Płukać wodą dH20 przez 5 minut.</li>
	<li>Osusz powierzchnię wafla za pomocą pistoletu do przedmuchiwania N2. Podgrzej wafel na płycie grzejnej w temperaturze 140 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Plazma utlenia powierzchnię płytki krzemowej (1 min, 50 W).</li>
	<li>Pokryj powierzchnię płytki 3 ml fotorezystu SU-8 100 (40 sek; 1 750 obr./min).</li>
	<li>Wstępnie piecz powlekaną wafel na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie zwiększ temperaturę do 95 °C w ciągu 2 minut. Utrzymuj to ustawienie przez dodatkową 1 godzinę.</li>
	<li>Wyrównaj fotomaskę zawierającą żądany projekt kanału. Wystaw rezystor na działanie światła UV 550-600 mJ/cm2 (350-400 nm). Fotomaski można projektować w programie AutoCAD i drukować na folii przezroczystej z drukowaniem w wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Po upieczeniu wafla na gorącej płycie w temperaturze 65 °C przez 1 minutę i 95 °C przez 10 minut, zwiększając temperaturę jak poprzednio.</li>
	<li>Zanurz wafel w roztworze wywoływacza SU-8 na 10-15 minut. Sprawdź, czy zakończono wywoływanie, płucząc izopropanolem. Jeśli pojawi się biały osad, kontynuuj rozwój. Forma wzorcowa jest pokazana na rysunku 2A.</li>
</ol>
2. Miękka litografia do produkcji mikrokanałów
<ol>
	<li>Zmieszać 35 ml bazy elastomerowej polidimetylosiloksanu (PDMS) z 3,5 ml utwardzacza PDMS.</li>
	<li>Umieść sfabrykowaną formę wzorcową (wzorem skierowanym do góry) i pustą płytkę krzemową na szalkach Petriego wyłożonych folią aluminiową.</li>
	<li>Wlać 20 ml prepolimeru PDMS do naczynia wzorcowego i 15 ml do drugiego naczynia. Wyeliminuj kieszenie powietrzne pod waflami, delikatnie naciskając je jednorazowym drewnianym aplikatorem.</li>
	<li>Przykryj obie potrawy i odstaw na jeden dzień do wytwardzenia. Alternatywnie, w celu szybszego utwardzania, usuń pęcherzyki powietrza z PDMS za pomocą odgazowywacza próżniowego, a następnie pozostaw naczynia na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C na 2 godziny.</li>
	<li>Usuń folię i oderwij PDMS od wafli.</li>
	<li>Użyj Harris Uni-Core (2.5 mm), aby przebić porty dostępu do płynów na obu końcach kanału. Wytnij kanał i puste PDMS na paski o podobnej wielkości.</li>
	<li>Załaduj kanał, ślepy pasek PDMS i szklany szkiełko (75×25 mm2) do utleniacza plazmowego, prawdopodobnie znajdującego się w pomieszczeniu czystym. Wystaw na działanie plazmy tlenowej przez 40 sekund przy mocy 40 W.</li>
	<li>Przyklej element kanału i szklany suwak po przeciwnych stronach pustego paska. Odstawić na 2 godziny, aby zakończyć wiązanie.</li>
	<li>Umieść zespół na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C. Podłącz plastikowe rurki (średnica wewnętrzna 1/32", średnica zewnętrzna 3/32"), każda o długości co najmniej 6 cali, do dziurkowanych zbiorników za pomocą prepolimeru PDMS. Przymocuj płynny plastikowy łącznik do jednej lub obu probówek, aby umożliwić podłączenie strzykawki, lub użyj dostępnych w handlu łączników.</li>
	<li>Poczekaj, aż PDMS mocujący rurkę utwardzi się. Włóż 3-calowe odcinki izolowanego drutu miedzianego o średnicy 22 do każdego zbiornika, między rurą wlotową a kanałem i zabezpiecz prepolimerem PDMS. Gotowy produkt pokazano na rysunku 2B.</li>
</ol>
3. Eksperyment z elektrotaksją
<ol>
	<li>Umieść mikrokanalik na stoliku (najlepiej ruchomym XY) mikroskopu z zamontowaną kamerą podłączoną do monitora (rysunek 1).</li>
	<li>Podłącz zasilacz lub amplifier przewody wyjściowe do elektrod mikrokanału. Prosty zasilacz prądu stałego jest wystarczający, jeśli pożądany jest tylko sygnał DC, ale wzmacniacz podłączony do generatora funkcyjnego umożliwia również zastosowanie impulsowych sygnałów DC i AC.</li>
	<li>Podłącz rurkę wyjściową mikrokanału do jednorazowej strzykawki. Zanurzyć wylot rurki wlotowej w buforze fizjologicznym M9 i delikatnie zassać płyn do kanału, przykładając podciśnienie wewnątrz strzykawki (ręcznie lub za pomocą pompy strzykawkowej). Gdy rurki wlotowe i wylotowe są napełnione M9, odłączyć strzykawkę od rurki. Wypoziomuj obie rury na tej samej wysokości, aby zapobiec przepływowi napędzanemu hydrostatycznie.</li>
	<li>Przyłóż napięcie stałe do kanału i upewnij się, że rezystancja (R= V/I) wynosi około 0,6 MΩ (dla mikrokanału o długości 50 mm, szerokości 0,3 mm i głębokości ~0,1 mm).</li>
	<li>Jeśli jesteś zadowolony z integralności kanału, wykonaj powyższe kroki, aby załadować robaki z rozcieńczonej zawiesiny do kanału.</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę i hydrostatycznie manipulować przepływem, regulując względną wysokość rurek. Użyj tej metody, aby umieścić robaka na środku kanału, a następnie ułóż obie rurki płasko na tej samej wysokości.</li>
	<li>Ustaw zasilanie na odpowiednie napięcie: 4-12 V/cm dla zwierząt w stadium L3, 4-10 V/cm dla L4 i 2-4 V/cm dla młodych dorosłych. Aktywuj sygnał elektryczny i pozwól robakowi na 1 minutę wstępnej ekspozycji zaaklimatyzować się w terenie. Robak powinien zacząć poruszać się w kierunku katody. Po upływie minuty użyj aparatu, aby rozpocząć nagrywanie.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z prądem przemiennym i impulsowym prądem stałym można przyjąć maksymalne czułe pole elektryczne od góry, a częstotliwość i cykl pracy sygnału można modulować zgodnie z potrzebami 7, 8.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu usuń cały płyn (i robaki) z kanału, przepłucz go dH20 i pozostaw urządzenie na gorącej płycie w temperaturze 125 °C do wyschnięcia.</li>
	<li>Wyodrębnij dane lokomotoryczne z nagranych filmów ręcznie za pomocą NIH ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>) lub niestandardowego oprogramowania do śledzenia robaków opartego na MATLAB.</li>
</ol>

<ol><li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+Parkinson+mutant+%CE%B1-synuclein+causes+dopamine+neuron+dysfunction+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).</li>
<li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+reveals+involvement+of+endocytic+pathway+in+neuronal+dysfunction+in+a-synuclein+transgenic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic.</a> 17 (19), 2997-3009 (2008).</li>
<li>Su, L. J., Auluck, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).</li>
<li>Salam, S., Ansari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics+set+up+to+study+neuronal+degeneration+and+identification+of+neuroprotective+compounds+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+sorting+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrical sorting of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pulse+direct+current+signals+on+electrotactic+movement+of+nematodes+Caenorhabditis+elegans+and+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae.</a> Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Caenorhabditis+elegans+in+alternating+electric+field+and+its+application+to+their+localization+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control.</a> Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).</li>
<li>van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+model+identifies+genetic+modifiers+of+alpha-synuclein+inclusion+formation+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging.</a> PLoS Genet. 4, e1000027(2008).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).</li>
<li>Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).</li>
<li>Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+measuring+parameters+of+nematode+sinusoidal+movement%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genet%22%5BJournal%5D)">An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement.</a> BMC Genet. 6, 5(2005).</li>
<li>Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+worms%3A+C.+elegans+self-sorting+by+electrotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis.</a> PLoS One. 6 (2), e16637(2011).</li>
</ol>

Technologia elektrotaksji mikroprzepływowej została zgłoszona do opatentowania w Stanach Zjednoczonych Ameryki i Kanadzie.

Wykorzystując zjawisko behawioralne po raz pierwszy opisane przez Gabela i współpracowników oraz opierając się na pracy Chuanga i współpracowników w zakresie manipulacji dielektroforetycznej 11,12, nasz test elektrotaksji oparty na mikroprzepływach zapewnia łatwą, solidną i czułą metodę badania aktywności neuronalnej u robaków przy użyciu ruchu jako danych wyjściowych. Analiza parametrów ruchu pozwala na ilościowe porównanie różnych genotypów. Precyzja wytwarzania mikrokanalików i zastosowanie pola elektryczne...

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>CALEDON Labs</td><td>1200-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>6700-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>8600-1-40</td><td></td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y131273</td><td>SU-8 100</td></tr><tr><td>SU-8 Deweloper</td><td>Microchem Corp.</td><td></td><td></td>Y020100</tr><tr><td>92x16mm Szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Zawiera bazę elastomerową i utwardzacz</td></tr><tr><td>Generator funkcji</td><td>Tektronix Inc.</td><td></td><td>Model AFG3022B</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Trek Inc.</td><td></td><td>Model 2210-CE</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-4506</td><td>Model 11 ELITE</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Fisher Scientific</td><td>11675916Q</td><td>Model HP131725Q</td></tr></tbody></table>

elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji caenorhabditis elegans

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Nicień Caenorhabditis elegans jest wszechstronnym organizmem modelowym do badań biomedycznych, ze względu na zachowanie genów i szlaków związanych z chorobą, a także łatwość uprawy. Opisano kilka modeli choroby C. elegans, w tym zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona (PD), która obejmuje zwyrodnienie neuronów dopaminergicznych (DA) 1. Zarówno transgeny, jak i neurotoksyczne substancje chemiczne zostały wykorzystane do wywołania neurodegeneracji DA i wynikających z niej wad ruchowych u robaków, co pozwoliło na badania nad podstawami neurodegeneracji i badania przesiewowe pod kątem genów i związków neuroprotekcyjnych 2,3.
Ekrany u niższych eukariontów, takich jak C. elegans, dostarczają skutecznego i ekonomicznego sposobu identyfikacji związków i genów wpływających na sygnalizację neuronalną. Konwencjonalne ekrany są zwykle wykonywane ręcznie i oceniane przez kontrolę wzrokową; W związku z tym są czasochłonne i podatne na błędy ludzkie. Ponadto większość skupia się na analizie poziomu komórkowego, ignorując lokomocję, która jest szczególnie ważnym parametrem w przypadku zaburzeń ruchowych.
Opracowaliśmy nowatorski system badań przesiewowych mikroprzepływowych (Rysunek 1), który kontroluje i określa ilościowo lokomocję C. elegans za pomocą bodźców pola elektrycznego wewnątrz mikrokanałów. Wykazaliśmy, że pole prądu stałego (DC) może silnie indukować ruch na żądanie w kierunku katody ("elektrotaksja") 4. Odwrócenie polaryzacji pola powoduje, że robak szybko zmienia również swój kierunek. Wykazaliśmy również, że defekty w neuronach dopaminergicznych i innych neuronach czuciowych zmieniają reakcję pływania 5. W związku z tym nieprawidłowości w sygnalizacji neuronalnej można określić za pomocą lokomocji jako odczytu. Reakcję ruchową można dokładnie określić ilościowo za pomocą szeregu parametrów, takich jak prędkość pływania, częstotliwość zginania ciała i czas odwrócenia.
Nasza praca wykazała, że reakcja elektrotaktyczna zmienia się wraz z wiekiem. W szczególności młodzi dorośli reagują na niższy zakres pól elektrycznych i poruszają się szybciej w porównaniu z larwami 4. Odkrycia te skłoniły nas do zaprojektowania nowego urządzenia mikroprzepływowego do pasywnego sortowania robaków według wieku i fenotypu 6.
Przetestowaliśmy również reakcję robaków na impulsowe pola elektryczne prądu stałego i przemiennego (AC). Impulsowe pola prądu stałego o różnych cyklach pracy skutecznie generowały elektrotaksję zarówno u C. elegans, jak i u jego kuzyna C. briggsae 7. W innym eksperymencie symetryczne pola prądu przemiennego o częstotliwościach od 1 Hz do 3 kHz unieruchomiły robaki wewnątrz kanału 8.
Implementacja pola elektrycznego w środowisku mikroprzepływowym umożliwia szybkie i zautomatyzowane wykonanie testu elektrotaksji. Podejście to może ułatwić wysokoprzepustowe genetyczne i chemiczne badania przesiewowe pod kątem czynników wpływających na funkcję i żywotność neuronów.

Reprezentatywny film przedstawiający elektrotaksję młodego dorosłego nicienia typu dzikiego oraz wyniki analizy jego pozycji i prędkości uzyskane z oprogramowania do śledzenia nicieni przedstawiono w Supplementary Video 1 oraz na Rysunku 3. Samo oprogramowanie do analizy ruchu nie rozpoznaje kierunku polaryzacji pola ani momentu odwrócenia polaryzacji; informacje te muszą zostać pobrane z filmu źródłowego. Można to osiągnąć, wykorzystując sygnał dźwiękowy lub wizualny w filmie lub zapisu...

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja nieprawidłowości w sygnalizacji neuronalnej i nerwowo-mięśniowej w organizmie modelowym C Allergan po ekspozycji chemicznej lub manipulacji genetycznej. Jest to osiągane poprzez zaprojektowanie i wytrawienie wzoru mikrokanałów w płytce krzemowej. W drugim kroku forma krzemowa jest wykorzystywana do odlewania jednego lub większej liczby mikrokanałów z PDMS.Następnie do formy z PDMS przytwierdza się komponenty pomocnicze. W dalszej kolejności, za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie, rejestruje się zachowanie nicieni stymulowanych do pływania przez mikrokanał. Ostatecznie wykorzystuje się mikroprzepływy elektryczne do określenia zmian w układach neuronalnych i mięśniowych nicieni wywołanych manipulacją chemiczną lub genetyczną, przyjmując lokomocję jako parametr odczytu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, a w szczególności z testami behawioralnymi na płytkach, jest możliwość ścisłej kontroli kierunku lokomocji nicienia, co pozwala na precyzyjną kwantyfikację zachowań lokomocyjnych, takich jak częstotliwość zgięć ciała, czas rotacji oraz prędkość pływania. Zastosowania tej techniki obejmują terapię schorzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera, ponieważ może ona służyć do przesiewowego badania czynników chemicznych i genetycznych o właściwościach neuroprotekcyjnych. Pomysł na tę technikę pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę z braku metody pozwalającej na ilościową analizę zachowań ruchowych.Ruch jest dobrowolny i losowy, co sprawia, że jego charakterystyka jest trudna. Dlatego chcieliśmy opracować prostą metodę, której każdy może się nauczyć. Aby przygotować formę główną, należy najpierw zanurzyć trzystopniowy wafle krzemowy w acetonie, a następnie w metanolu przez 30 sekund każdorazowo. Następnie wafle należy płukać wodą dejonizowaną przez pięć minut.Następnie należy użyć pistoletu z azotem, aby osuszyć powierzchnię podłoża, a potem podgrzać podłoże na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C przez dwie minuty, po czym utlenić plazmowo powierzchnię podłoża krzemowego przy mocy 50 W przez jedną minutę. Teraz, używając 3 mL fotorezystu SU-8 100, nanosi się go metodą spin-coatingu na powierzchnię podłoża przy prędkości 1 750 RPM przez 40 s, a następnie przeprowadza wstępne wypiekanie pokrytego podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C. Po 10 min należy zwiększyć temperaturę do 95 °C w ciągu dwóch minut i wypiekać podłoże przez kolejną godzinę.Po zdjęciu wafla z płyty grzejnej umieść na nim fotomaskę o pożądanym wzorze. Naświetl fotorezyst światłem UV przez 95 sekund. Następnie poddaj wafele wygrzewaniu po naświetlaniu na płycie grzejnej, stosując ten sam gradient temperatury, co podczas wstępnego wygrzewania.Zanurz płytkę w SU-8. Wywołuj w roztworze przez 10 do 15 minut. Przepłucz płytkę izopropanolem, aby potwierdzić zakończenie wywoływania wzoru.Następnie płukać wodą dejonizowaną przez 30 sekund. Na koniec osuszyć płytkę za pomocą pistoletu z azotem i krótko wyprać w temperaturze 120°C. Teraz umieścić wykonaną matrycę główną oraz pustą płytkę krzemową w dwóch oddzielnych szalkach Petriego wyłożonych folią aluminiową.Wlej 20 mililitrów prepolimeru PDMS do formy głównej i szalki, a 15 mililitrów do szalki z pustym wafelem. Następnie delikatnie dociśnij wafle jednorazowym drewnianym aplikatorem, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza pod waflami, po czym przykryj obie szalki i odstaw je na jeden dzień do utwardzenia. Po utwardzeniu wafla usuń folię i odklej PDMS.Następnie użyj 2,5 milimetrowego przebijaka Harris unicorn, aby wykonać porty dostępu do płynów na obu końcach kanału w PDMS z formy matki. Potnij oba krążki PDMS na paski o podobnej wielkości. Następnie w pomieszczeniu typu clean room umieść kanał, pusty pasek PDMS oraz szkiełko przedmiotowe w utleniaczu plazmowym.Naraż materiały na działanie plazmy tlenowej przy mocy 40 W przez 40 s. Następnie przytwierdź element kanału oraz szkiełko przedmiotowe do przeciwległych stron pustego paska i odstaw materiały w celu zakończenia procesu wiązania. Po dwóch godzinach użyj prepolimeru PDMS, aby przymocować dwa odcinki rurek plastikowych o długości co najmniej sześciu cali do wybijtych zbiorników, wykorzystując płytkę grzejną ustawioną na 120 °C.Należy odczekać do utwardzenia PDMS przed kontynuacją. Następnie do jednej z rurek należy przymocować plastikowy konektor płynowy, aby umożliwić podłączenie strzykawek. Teraz do każdego zbiornika, pomiędzy rurką wlotową a kanałem, należy wprowadzić siedmiocentymetrowe odcinki izolowanego drutu miedzianego o rozmiarze 22 gauge, mocując druty dodatkową ilością prepolimeru PDMS.Krok ten należy rozpocząć od umieszczenia nowo zmontowanego mikrokanału na ruchomym stole XY mikroskopu z zamontowaną kamerą podłączoną do monitora, a następnie podłączyć zasilacz do elektrod mikrokanału. Po potwierdzeniu, że rezystancja mikrokanału wynosi około 0,6 mega ohms, należy przyłączyć rurkę wylotową mikrokanału do jednorazowej strzykawki. Następnie koniec rurki wlotowej należy zanurzyć w roztworze nicieni zawieszonych w buforze fizjologicznym M nine.Zastosuj podciśnienie wewnątrz strzykawki, aby zassać ciecz do kanału. Po wypełnieniu obu rurek doprowadzającej i odprowadzającej odłącz strzykawkę i układ hydrostatyczny. Steruj przepływem, regulując względną wysokość rurek, aby umieścić nicienia w centrum kanału.Następnie należy położyć obie probówki płasko na tej samej wysokości, aby utrzymać zerowy przepływ wewnątrz mikrokanału. Podczas wymiany próbek nicieni w eksperymencie z elektrotaksją, po wyrównaniu obu probówek wlotowych do tej samej wysokości, jeśli przepływ nadal występuje, należy wprowadzić niewielkie korekty wysokości probówek względem siebie. W przypadku wątpliwości, czy przepływ jest rzeczywiście zerowy, można wywołać odwrócenie kierunku ruchu nicieni poprzez zmianę polaryzacji pola elektrycznego, a następnie ocenić prędkość liniową nicieni w momencie zawracania.Następnie ustaw zasilacz na odpowiednie napięcie. Aktywuj sygnał elektryczny i pozostaw robaka na jedną minutę wstępnej ekspozycji, aby mógł zaadaptować się do pola; po upływie minuty robak powinien zacząć poruszać się w kierunku katody. Rozpocznij rejestrację.Po zakończeniu eksperymentu należy usunąć cały płyn oraz nicienie z kanału. Przepłucz komorę wodą dejonizowaną i pozostaw urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 125°C do wyschnięcia. Na tym reprezentatywnym filmie pokazano młodego dorosłego nicienia typu dzikiego w elektroaksie oraz wyniki w postaci pozycji i prędkości uzyskane z oprogramowania do śledzenia nicieni.Film rozpoczyna się z katodą po prawej stronie. Pojawienie się szklanej pipety wskazuje na nadchodzące odwrócenie kierunku, a późniejsze usunięcie pipety stanowi sygnał. W momencie odwrócenia przedstawiono dane dotyczące pozycji w czasie oraz chwilowej prędkości w czasie, wygenerowane przez autorski program do śledzenia nicieni dla nicienia w filmie; program obliczył krzywą prędkości na podstawie krzywej pozycji w czasie.Ten wykres pudełkowy przedstawia dane dotyczące prędkości elektrotaksji zestawu zwierząt typu dzikiego i transgenicznych. Zwierzęta transgeniczne T wykazują ekspresję ludzkiego genu alfa-synukleiny w mięśniach ściany ciała pod kontrolą promotora genu ciężkiego łańcucha miozyny UNC 54, co powoduje agregację białek i przejawia się wolniejszą odpowiedzią elektrotaktyczną niż u zwierząt typu dzikiego. Po opanowaniu metody, przy prawidłowym przeprowadzeniu eksperymentu elektrotaksji, można badać ponad 20 nicieni w każdej godzinie.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że tylko mutacje i substancje chemiczne wpływające na lokomocję lub elektrosensorykę wywołają fenotypy wykrywalne za pomocą testu elektroksy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak odtworzyć wzór w silikonie, złożyć kanał mikrofluidyczny oraz jak analizować lokomocję N. method za pomocą testu axxis.

microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Elektrotaksja oparta na mikrofluidyce do analizy ilościowej lokomocji Caenorhabditis elegans na życzenie

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Mikroskopijne organizmy, takie jak wolno pływający nicień C. elegans, żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Przedstawiamy nowatorskie podejście umożliwiające analizę C. elegans z wykorzystaniem wzorów dyfrakcyjnych. Metoda ta polega na śledzeniu periodyczności czasowej wzorów dyfrakcyjnych generowanych poprzez kierowanie wiązki lasera przez kuwetę.

Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Przedstawiona tutaj technika mierzy ścieżkę swobodnie pływających mikroskopijnych gatunków za pomocą ekspozycji na pojedynczej długości fali.  C. elegans są używane do demonstracji obrazowania cieni jako niedrogiej alternatywy dla kosztownych mikroskopów.  Technikę tę można dostosować do różnych orientacji, środowisk i gatunków w celu pomiaru kierunku, prędkości, przyspieszenia i sił.

Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Ustanowiono szereg metod unieruchamiania, aby umożliwić celowe napromienianie żywych osób Caenorhabditis elegans za pomocą niedawno opracowanego ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody. To nowatorskie unieruchomienie na chipie jest również odpowiednie do obserwacji obrazowych. Wyjaśniono szczegółowe przykłady obróbki i zastosowania chipa.

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Badanie to analizuje wpływ wieku na lokomocję u C. elegans poprzez pomiar największego wykładnika Lyapunova (LLE). Wraz z wiekiem C. elegans wykazują wzrost i późniejszy spadek kontroli motorycznej. Wyniki pokazują szczyt LLE po pięciu dniach, a następnie spadek wraz z wiekiem robaków.

Wiekowa dynamika lokomocji u Caenorhabditis elegans: analiza wykładnika Lyapunova

Poznaj elektrotaksję opartą na mikroprzepływach do analizy lokomocji Caenorhabditis elegans. Ta metoda umożliwia szybkie badanie czynników wpływających na zdrowie neuronowe i sygnalizację neuromuskularną.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów