Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nieprawidłowości w sygnalizacji neuronalnej i nerwowo-mięśniowej w organizmie modelowym C. Allergana po ekspozycji chemicznej lub manipulacji genetycznej. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie i wytrawienie wzoru mikrokanalików w płytce krzemowej. W drugim etapie forma silikonowa jest używana do odlewania jednego lub więcej mikrokanałów z PDMS.

Następnie elementy akcesoriów są dołączane do formy PDMS. Następnie zachowanie robaków, gdy są stymulowane do pływania przez mikrokanał, jest rejestrowane za pomocą kamery zamontowanej pod mikroskopem. Ostatecznie elektromikrofluidyka służy do określania zmian w nicieniach, układach neuronalnych i mięśniowych spowodowanych manipulacją chemiczną lub genetyczną z lokomocją.

Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, zwłaszcza testami behawioralnymi opartymi na płytkach, jest to, że dzięki tej technice kierunek poruszania się robaka może być ściśle kontrolowany, co pozwala na precyzyjne ilościowe określenie zachowań lokomotywy, takich jak częstotliwość zginania ciała, czas obrotu i prędkość pływania. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera, ponieważ może być stosowana do badań przesiewowych pod kątem czynników chemicznych i genetycznych o właściwościach neuroprotekcyjnych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej techniki, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że brakuje metody analizy zachowań ruchowych metody w sposób ilościowy.

Ruch jest dobrowolny i losowy i trudno go scharakteryzować. Chcieliśmy więc ustalić łatwą metodę, której każdy może się nauczyć: aby główna forma rozpoczęła się od kąpieli trzycalowego wafla krzemowego w acetonie, a następnie metanolu przez 30 sekund każde. Następnie płucz wafel wodą dejonizowaną przez pięć minut.

Następnie użyj pistoletu do przedmuchiwania azotu, aby wysuszyć powierzchnię wafli, a następnie podgrzej wafel na gorącej płycie w temperaturze 120 stopni Celsjusza po dwóch minutach, plazmowo utleniaj powierzchnię płytki krzemowej o mocy 50 watów przez jedną minutę. Teraz używając trzech mililitrów SU osiem 100 fotorezystu, obróć powierzchnię wafla z prędkością 1 750 obr./min przez 40 sekund, a następnie wstępnie upiecz powlekaną płytkę na gorącej płycie w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Po 10 minutach zwiększ temperaturę do 95 stopni Celsjusza w ciągu dwóch minut i piecz wafelek przez dodatkową godzinę.

Po wyjęciu wafla z płyty grzejnej ułóż na nim maskę fotograficzną o pożądanym wzorze. Wystaw fotorezystor na działanie światła UV przez 95 sekund. Następnie upiecz wafel na gorącej płycie, używając tego samego gradientu temperatury, jaki jest używany do wstępnego pieczenia po upieczeniu.

Zanurz wafel w SU eight. Opracuj rozwiązanie przez 10 do 15 minut. Opłucz wafel izopropanolem, aby potwierdzić zakończenie opracowywania projektu.

Następnie spłukuj wodą dejonizowaną przez 30 sekund. Na koniec osusz wafel pistoletem do azotu i krótko piecz w temperaturze 120 stopni Celsjusza. Teraz umieść sfabrykowaną formę wzorcową, a także pustą płytkę silikonową w dwóch oddzielnych szalkach Petriego wyłożonych folią aluminiową.

Wlej 20 mililitrów prepolimeru PDMS do formy głównej i naczynia oraz 15 mililitrów do pustego naczynia waflowego. Następnie delikatnie dociśnij wafle jednorazowym drewnianym aplikatorem, aby wyeliminować wszelkie kieszenie powietrzne pod waflami, a następnie przykryj obie naczynia i odstaw je na jeden dzień do utwardzenia. Po utwardzeniu wafli usuń folię i oderwij PDMS.

Następnie użyj 2,5-milimetrowego jednorożca Harrisa, aby przebić porty dostępu do płynu na obu końcach kanału w PDMS z formy głównej. Pokrój obie tarcze PDMS na paski o podobnej wielkości. Następnie w czystym pomieszczeniu załaduj kanał, czysty pasek PDMS i szklane szkiełko do utleniacza plazmowego.

Wystaw materiały na działanie plazmy tlenowej o mocy 40 watów przez 40 sekund. Następnie przyklej element kanału i szkiełko do przeciwnych stron pustego paska i odłóż materiały na bok, aby zakończyć klejenie. Po dwóch godzinach użyj polimeru wstępnego PDMS, aby przymocować dwa kawałki plastikowej rurki o długości co najmniej sześciu cali do dziurkowanych zbiorników na gorącej płycie w temperaturze 120 stopni Celsjusza.

Poczekaj, aż PDMS się utwardzi przed kontynuowaniem. Następnie przymocuj płynny plastikowy łącznik do jednej z rurek, aby umożliwić załączenie strzykawki. Teraz włóż trzycalowe odcinki izolowanego drutu miedzianego o rozmiarze 22 do każdego zbiornika między rurą wlotową a kanałem zabezpieczającym przewody większą ilością polimeru wstępnego PDMS.

Rozpocznij ten krok od umieszczenia właśnie zmontowanego mikrokanału na ruchomym stoliku XY mikroskopu z zamontowaną kamerą podłączoną do monitora, podłącz zasilanie do elektrod mikrokanałów. Po upewnieniu się, że rezystancja mikrokanału wynosi około 0,6 mega oma, podłącz rurkę wyjściową mikrokanału do jednorazowej strzykawki. Następnie zanurzyć ujście rurki wlotowej w roztworze nicieni zawieszonym w buforze fizjologicznym M nine.

Zastosować podciśnienie wewnątrz strzykawki, aby zassać płyn do kanału. Gdy rurki wlotowe i wylotowe są napełnione, odłącz strzykawkę i hydrostatykę. Manipuluj przepływem, dostosowując względną wysokość rurek, aby umieścić robaka w środku kanału.

Następnie ułóż obie rurki płasko na tej samej wysokości, aby utrzymać zerowy przepływ wewnątrz mikrokanału. Podczas przełączania próbek ślimaków podczas eksperymentu z taksówkami elektrycznymi, po wypoziomowaniu obu rurek wlotowych na tę samą wysokość, jeśli nadal występuje przepływ, dokonaj niewielkich korekt wysokości rurki względem siebie. Jeśli kiedykolwiek nie będziemy pewni, czy przepływ jest naprawdę zerowy, możemy wywołać odwrócenie ruchu robaka, zmieniając polaryzację pola elektrycznego, a następnie oceniając prędkość liniową robaka, gdy się obraca.

Teraz ustaw zasilacz na odpowiednie napięcie. Aktywuj sygnał elektryczny i odczekaj minutę wstępnej ekspozycji, aby robak zaaklimatyzował się w polu, w którym to czasie robak powinien zacząć poruszać się w kierunku katody, gdy minie minuta. Rozpocznij nagrywanie.

Po zakończeniu eksperymentu usuń cały płyn i robaki z kanału. Wypłucz komorę wodą dejonizowaną i pozostaw urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 125 stopni Celsjusza do wyschnięcia. Na tym reprezentatywnym filmie pokazano oś elektryczną młodych dorosłych nicieni typu dzikiego oraz jej położenie i prędkość wyjściową z oprogramowania do śledzenia robaków.

Film zaczyna się od katody po prawej stronie. Pojawienie się szklanej pipety wskazuje na zbliżające się odwrócenie, a następnie usunięcie sygnałów pipety. Moment odwrócenia tutaj, dane dotyczące pozycji w funkcji czasu i prędkości chwilowej w funkcji czasu danych wyjściowych niestandardowego programu do śledzenia robaków dla robaka Na filmie pokazano, że program obliczył krzywą prędkości na podstawie krzywej czasu położenia.

Ten wykres pudełkowy przedstawia dane dotyczące prędkości elektrycznej z zestawu zwierząt dzikich i okopowych. Zwierzęta transgeniczne T wyrażają ludzki gen alfa-synukleiny w mięśniach ściany ciała pod kontrolą promotora genu łańcucha ciężkiego miozyny UNC 54, co powoduje agregację białek i objawia się wolniejszą reakcją elektrotaktyczną niż u zwierząt typu dzikiego. Po opanowaniu, ponad 20 robaków może być testowanych co godzinę, jeśli eksperyment z elektrycznymi taksówkami zostanie przeprowadzony prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że tylko mutacje i substancje chemiczne wpływające na lokomocję lub czucie elektro stworzą fenotypy, które są wykrywalne przez test elektropodatkowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć wzór silikonu. Zebraliśmy kanał mikroprzepływowy i sposób analizy lokomocji metodą N za pomocą testu axxis.