Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja nieprawidłowości w sygnalizacji neuronalnej i nerwowo-mięśniowej w organizmie modelowym C Allergan po ekspozycji chemicznej lub manipulacji genetycznej. Jest to osiągane poprzez zaprojektowanie i wytrawienie wzoru mikrokanałów w płytce krzemowej. W drugim kroku forma krzemowa jest wykorzystywana do odlewania jednego lub większej liczby mikrokanałów z PDMS.

Następnie do formy z PDMS przytwierdza się komponenty pomocnicze. W dalszej kolejności, za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie, rejestruje się zachowanie nicieni stymulowanych do pływania przez mikrokanał. Ostatecznie wykorzystuje się mikroprzepływy elektryczne do określenia zmian w układach neuronalnych i mięśniowych nicieni wywołanych manipulacją chemiczną lub genetyczną, przyjmując lokomocję jako parametr odczytu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, a w szczególności z testami behawioralnymi na płytkach, jest możliwość ścisłej kontroli kierunku lokomocji nicienia, co pozwala na precyzyjną kwantyfikację zachowań lokomocyjnych, takich jak częstotliwość zgięć ciała, czas rotacji oraz prędkość pływania. Zastosowania tej techniki obejmują terapię schorzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera, ponieważ może ona służyć do przesiewowego badania czynników chemicznych i genetycznych o właściwościach neuroprotekcyjnych. Pomysł na tę technikę pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę z braku metody pozwalającej na ilościową analizę zachowań ruchowych.

Ruch jest dobrowolny i losowy, co sprawia, że jego charakterystyka jest trudna. Dlatego chcieliśmy opracować prostą metodę, której każdy może się nauczyć. Aby przygotować formę główną, należy najpierw zanurzyć trzystopniowy wafle krzemowy w acetonie, a następnie w metanolu przez 30 sekund każdorazowo. Następnie wafle należy płukać wodą dejonizowaną przez pięć minut.

Następnie należy użyć pistoletu z azotem, aby osuszyć powierzchnię podłoża, a potem podgrzać podłoże na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C przez dwie minuty, po czym utlenić plazmowo powierzchnię podłoża krzemowego przy mocy 50 W przez jedną minutę. Teraz, używając 3 mL fotorezystu SU-8 100, nanosi się go metodą spin-coatingu na powierzchnię podłoża przy prędkości 1 750 RPM przez 40 s, a następnie przeprowadza wstępne wypiekanie pokrytego podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C. Po 10 min należy zwiększyć temperaturę do 95 °C w ciągu dwóch minut i wypiekać podłoże przez kolejną godzinę.

Po zdjęciu wafla z płyty grzejnej umieść na nim fotomaskę o pożądanym wzorze. Naświetl fotorezyst światłem UV przez 95 sekund. Następnie poddaj wafele wygrzewaniu po naświetlaniu na płycie grzejnej, stosując ten sam gradient temperatury, co podczas wstępnego wygrzewania.

Zanurz płytkę w SU-8. Wywołuj w roztworze przez 10 do 15 minut. Przepłucz płytkę izopropanolem, aby potwierdzić zakończenie wywoływania wzoru.

Następnie płukać wodą dejonizowaną przez 30 sekund. Na koniec osuszyć płytkę za pomocą pistoletu z azotem i krótko wyprać w temperaturze 120°C. Teraz umieścić wykonaną matrycę główną oraz pustą płytkę krzemową w dwóch oddzielnych szalkach Petriego wyłożonych folią aluminiową.

Wlej 20 mililitrów prepolimeru PDMS do formy głównej i szalki, a 15 mililitrów do szalki z pustym wafelem. Następnie delikatnie dociśnij wafle jednorazowym drewnianym aplikatorem, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza pod waflami, po czym przykryj obie szalki i odstaw je na jeden dzień do utwardzenia. Po utwardzeniu wafla usuń folię i odklej PDMS.

Następnie użyj 2,5 milimetrowego przebijaka Harris unicorn, aby wykonać porty dostępu do płynów na obu końcach kanału w PDMS z formy matki. Potnij oba krążki PDMS na paski o podobnej wielkości. Następnie w pomieszczeniu typu clean room umieść kanał, pusty pasek PDMS oraz szkiełko przedmiotowe w utleniaczu plazmowym.

Naraż materiały na działanie plazmy tlenowej przy mocy 40 W przez 40 s. Następnie przytwierdź element kanału oraz szkiełko przedmiotowe do przeciwległych stron pustego paska i odstaw materiały w celu zakończenia procesu wiązania. Po dwóch godzinach użyj prepolimeru PDMS, aby przymocować dwa odcinki rurek plastikowych o długości co najmniej sześciu cali do wybijtych zbiorników, wykorzystując płytkę grzejną ustawioną na 120 °C.

Należy odczekać do utwardzenia PDMS przed kontynuacją. Następnie do jednej z rurek należy przymocować plastikowy konektor płynowy, aby umożliwić podłączenie strzykawek. Teraz do każdego zbiornika, pomiędzy rurką wlotową a kanałem, należy wprowadzić siedmiocentymetrowe odcinki izolowanego drutu miedzianego o rozmiarze 22 gauge, mocując druty dodatkową ilością prepolimeru PDMS.

Krok ten należy rozpocząć od umieszczenia nowo zmontowanego mikrokanału na ruchomym stole XY mikroskopu z zamontowaną kamerą podłączoną do monitora, a następnie podłączyć zasilacz do elektrod mikrokanału. Po potwierdzeniu, że rezystancja mikrokanału wynosi około 0,6 mega ohms, należy przyłączyć rurkę wylotową mikrokanału do jednorazowej strzykawki. Następnie koniec rurki wlotowej należy zanurzyć w roztworze nicieni zawieszonych w buforze fizjologicznym M nine.

Zastosuj podciśnienie wewnątrz strzykawki, aby zassać ciecz do kanału. Po wypełnieniu obu rurek doprowadzającej i odprowadzającej odłącz strzykawkę i układ hydrostatyczny. Steruj przepływem, regulując względną wysokość rurek, aby umieścić nicienia w centrum kanału.

Następnie należy położyć obie probówki płasko na tej samej wysokości, aby utrzymać zerowy przepływ wewnątrz mikrokanału. Podczas wymiany próbek nicieni w eksperymencie z elektrotaksją, po wyrównaniu obu probówek wlotowych do tej samej wysokości, jeśli przepływ nadal występuje, należy wprowadzić niewielkie korekty wysokości probówek względem siebie. W przypadku wątpliwości, czy przepływ jest rzeczywiście zerowy, można wywołać odwrócenie kierunku ruchu nicieni poprzez zmianę polaryzacji pola elektrycznego, a następnie ocenić prędkość liniową nicieni w momencie zawracania.

Następnie ustaw zasilacz na odpowiednie napięcie. Aktywuj sygnał elektryczny i pozostaw robaka na jedną minutę wstępnej ekspozycji, aby mógł zaadaptować się do pola; po upływie minuty robak powinien zacząć poruszać się w kierunku katody. Rozpocznij rejestrację.

Po zakończeniu eksperymentu należy usunąć cały płyn oraz nicienie z kanału. Przepłucz komorę wodą dejonizowaną i pozostaw urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 125°C do wyschnięcia. Na tym reprezentatywnym filmie pokazano młodego dorosłego nicienia typu dzikiego w elektroaksie oraz wyniki w postaci pozycji i prędkości uzyskane z oprogramowania do śledzenia nicieni.

Film rozpoczyna się z katodą po prawej stronie. Pojawienie się szklanej pipety wskazuje na nadchodzące odwrócenie kierunku, a późniejsze usunięcie pipety stanowi sygnał. W momencie odwrócenia przedstawiono dane dotyczące pozycji w czasie oraz chwilowej prędkości w czasie, wygenerowane przez autorski program do śledzenia nicieni dla nicienia w filmie; program obliczył krzywą prędkości na podstawie krzywej pozycji w czasie.

Ten wykres pudełkowy przedstawia dane dotyczące prędkości elektrotaksji zestawu zwierząt typu dzikiego i transgenicznych. Zwierzęta transgeniczne T wykazują ekspresję ludzkiego genu alfa-synukleiny w mięśniach ściany ciała pod kontrolą promotora genu ciężkiego łańcucha miozyny UNC 54, co powoduje agregację białek i przejawia się wolniejszą odpowiedzią elektrotaktyczną niż u zwierząt typu dzikiego. Po opanowaniu metody, przy prawidłowym przeprowadzeniu eksperymentu elektrotaksji, można badać ponad 20 nicieni w każdej godzinie.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że tylko mutacje i substancje chemiczne wpływające na lokomocję lub elektrosensorykę wywołają fenotypy wykrywalne za pomocą testu elektroksy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak odtworzyć wzór w silikonie, złożyć kanał mikrofluidyczny oraz jak analizować lokomocję N. method za pomocą testu axxis.