Name: Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj półautomatyczne metody ZebraLab i WormScan do ilościowej analizy aktywności ruchowej Caenorhabditis elegans w modelach chorób mitochondrialnych. Techniki te umożliwiają skalowalne i powtarzalne badania przesiewowe leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni doktorowi Anthony'emu Rosnerowi, za jego wsparcie organizacyjne dla wczesnego przygotowania tego projektu, oraz Erin Haus za wkład w analizę protokołu. Praca ta została sfinansowana przez Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund oraz National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 i T32-NS007413). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy fundatorów lub National Institutes of Health.

1. Analiza aktywności lokomotorycznej robaków w płynnych mediach na szkiełkach przy użyciu oprogramowania ZebraLab
<ol>
	<li>Wzrost i postępowanie z nicieniami
	<ol>
		<li>Hoduj C. elegans na płytkach Petriego zawierających pożywki wzrostowe nicieni (NGM) i rozprzestrzeniaj się z Escherichia coli OP50 jako źródłem pożywienia. Utrzymuj kulturę robaków w temperaturze 20 °C, zgodnie z wcześniejszym opisem8.</li>
		<li>Zsynchronizuj robaki wykonujące składanie jaj na czas52 i zbadaj robaki na pożądanym etapie. W tym protokole przeanalizowano robaki etapu L4.</li>
		<li>Hodowla szczepów kontrolnych i zmutowanych robaków na płytkach NGM z leczeniem farmakologicznym lub kontrolą buforową i bez niego, które mają być testowane. Aby ocenić efekty leczenia farmakologicznego, należy przygotować pożądane stężenie leku w roztworze podstawowym S.; Rozprowadź obliczoną objętość właściwą na płytkach NGM i pozostaw do wyschnięcia. Przenieś robaki w określonym stadium larwalnym lub dorosłym i trzymaj na płytce leczenia farmakologicznego przez pożądany czas przed analizą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymentalna konfiguracja robaków do rejestrowania aktywności lokomotorycznej, nagrywania wideo i analizy ZebraLab
	<ol>
		<li>Wybierz 5 zsynchronizowanych robaków L4 na szczep i kondycję za pomocą kilofa. Odpipetuj pojedynczą kroplę 20 μl roztworu podstawowego S. na szklane szkiełko umieszczone pod mikroskopem stereoskopowym podłączonym do kamery i przenieś do niego 5 robaków (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A,B). Przenieść 5 robaków z szalki Petriego zawierającej NGM i E. coli OP50 do kropli cieczy tylko w momencie poprzedzającym zapis. 
		UWAGA: Kontynuuj utrzymywanie innych robaków na szalce Petriego, aż do nagrania poprzedniego filmu. Pozwoli to uniknąć uszkodzeń wyrządzonych innym robakom z powodu wyschnięcia kropli 20 μl podczas zabiegu (czas schnięcia ~15-20 min).</li>
		<li>Pipetuj wiele kropli na jednym szkiełku, aby uzyskać wiele powtórzeń technicznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wybierz robaki z różnych płytek NGM (replika biologiczna). Nie używaj szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Dostosuj odległość roboczą mikroskopu, aby uwidocznić cały obszar pojedynczej kropli. Ustaw i utrzymuj niską rozdzielczość wideo (<1024 x 768), aby przesłać pliki w oprogramowaniu.</li>
		<li>Pozwól robakom zaaklimatyzować się na szkiełku w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przed nagraniem.</li>
		<li>Rejestruj aktywność pływania robaka w 1 kropli przez 1 minutę przy 15 klatkach na sekundę (fps). Powtórz obrazowanie dla każdej dodatkowej kropli na płytce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza zapisu aktywności lokomotorycznej C. elegans w oprogramowaniu ZebraLab
	<ol>
		<li>Użyj opcji ZEBRALAB AVI, aby przesłać filmy do oprogramowania. Kliknij na opcję Kwantyzacja za pomocą plików AVI (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Aby utworzyć nowy protokół, wybierz opcję Plik > Generuj protokół, a następnie dodaj liczbę obszarów wybranych do analizy. Wybierz liczbę lokalizacji: 1.</li>
		<li>Otwórz pozycję Parametry protokołu i wybierz pozycję 1 min w oknie Czas trwania eksperymentu. Wybierz inny czas trwania eksperymentu dla różnych czasów trwania eksperymentu. Zaznacz lub usuń zaznaczenie okna Brak przedziału czasowego i wybierz Okres integracji, w zależności od żądanego wydruku danych. W tym badaniu wybrano No Time Bin (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). 
		UWAGA: Przedział czasu to czas, w którym aktywność zostanie uśredniona.</li>
		<li>Jeśli protokół został już utworzony, wybierz opcję Otwórz protokół i wybierz zapisany protokół (w formacie .vte).</li>
		<li>Wybierz Plik i Otwórz film, aby przesłać każdy pojedynczy plik wideo, który został wcześniej nagrany.</li>
		<li>Wybierz ikonę obszaru wskazaną w Rysunek 1E (strzałka), aby zbudować pojedynczy obszar wykrywania i utworzyć obszar wokół całej kropli cieczy, w którym znajdują się robaki. Kliknij Wybierz, a następnie ikonę zielonego kółka (szara strzałka) w obszarze Obszary > Kompilacja > Wyczyść znaki. 
		UWAGA: Aktywność wszystkich robaków w zdefiniowanym spadku zostanie wykryta w wybranym obszarze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E,F).</li>
		<li>Przejdź do Kalibracji > Narysuj skalę (Rysunek 1E) i narysuj poziomą linię od lewej do prawej strony obszaru wideo. Wskaż rzeczywistą odległość do kalibracji. Następnie wybierz pozycję Zastosuj do grupy.</li>
		<li>Usuń zaznaczenie ikony wybranej do zbudowania obszaru (strzałka w <silna klasa="xfig">Rysunek 1E) i zaznacz lub odznacz opcję Przezroczysty. 
		UWAGA: W tym badaniu wybrano Transparent i dał lepsze wyniki.</li>
		<li>Dostosuj czułość wykrywania i próg aktywności, aby umożliwić wykrycie wszystkich różnych analizowanych szczepów robaka C. elegans. 
		UWAGA: W tym eksperymencie czułość wykrywania została ustawiona na 8 z wartościami burst i freezing odpowiednio 15 i 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
		<li>Ustaw skalę wyświetlania na 70, aby zobrazować ślad pozostawiony przez zwierzę podczas analizy aktywności. Następnie wybierz opcję Zastosuj do grupy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
		<li>Kliknij pozycję Experiment > Execute > Save as, a następnie pozycję Start. Otworzy się okno. Wybierz Czy chcesz przetworzyć nośnik wideo z maksymalną prędkością komputera?, aby szybko przeanalizować wideo (np. 1-minutowe nagranie wideo jest analizowane przez oprogramowanie ZebraLab w ciągu 5 sekund).</li>
		<li>Otworzy się kolejne okno: Uruchamianie eksperymentu; kliknij Start, aby kontynuować eksperyment.</li>
		<li>Po zakończeniu nagrywania wideo analiza zostanie zatrzymana. Kliknij Eksperymentuj > zatrzymaj. Pozwala to zaoszczędzić analizowaną aktywność z pojedynczego spadku w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		<li>Powtórz analizę dla każdego filmu z pojedynczą kroplą. Każda kropla to jedna techniczna replika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjście i analiza danych ZebraLab 
	UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu dane z każdego filmu są indywidualnie zapisywane jako osobne arkusze kalkulacyjne w wybranym folderze. W pliku wyjściowym danych zintegrowany poziom aktywności wszystkich robaków poruszających się w pojedynczej kropli jest rejestrowany jako zmiany pikseli w obszarze actinteg.
	<ol>
		<li>Otwórz każdy arkusz kalkulacyjny uzyskany z analizy każdego filmu. Skompiluj je ręcznie do jednego pliku. 
		Znormalizuj dane zmutowane i dzikie do procentu kontrolki. W tym przypadku przeprowadzono analizy statystyczne w celu porównania średnich poziomów aktywności między grupami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza aktywności lokomotorycznej robaków w płynnych podłożach w formacie płytki 96-dołkowej za pomocą analizy oprogramowania WormScan
<ol>
	<li>Wzrost i postępowanie z nicieniami
	<ol>
		<li>Uprawiaj C. elegans zgodnie z opisem w sekcji 1.1.1.</li>
		<li>Synchronizuj robaki zgodnie z opisem w sekcji 1.1.2.</li>
		<li>Hodować robaki na określonych pożywkach, jak opisano w sekcji 1.1.3, do stadium L4 lub do 1. dnia dorosłości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymentalne ustawienie robaków na 96-dołkowej płytce do analizy aktywności WormScan
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl 2% wagowych na objętość E. coli OP50 w płynnej zawiesinie w pożywce S. do każdej studzienki 96-dołkowej, klarownej, płaskodennej mikropłytki, jak opisano wcześniej49,53.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym ręcznie wybierz 15 zsynchronizowanych robaków w stadium L4 lub dorosłym w 1. dniu z ich płytek NGM do płynnych pożywek w każdym dołku eksperymentalnym 96-dołkowej mikropłytki. Pozwól robakom zaaklimatyzować się w płynnym podłożu przez 20 minut przed skanowaniem. 
		UWAGA: Inne stadia i wiek zwierząt mogą być łatwo zastąpione badaniami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza aktywności WormScan na płytce 96-dołkowej i eksport danych do arkusza kalkulacyjnego.
	<ol>
		<li>Skanuj każdą 96-dołkową, przezroczystą, płaskodenną mikropłytkę dwa razy po kolei za pomocą standardowego skanera płaskiego, z mniej niż 10 sekundami między skanowaniami. 
		UWAGA: W tym przypadku do tworzenia obrazów jpeg użyto skanera fotograficznego o rozdzielczości 1 200 punktów/cal i 16-bitowej skali szarości. Czas potrzebny na zeskanowanie czterech płytek 96-dołkowych za pomocą skanera fotograficznego wynosi mniej niż 10 minut.</li>
		<li>Wyrównaj dwa skany sekwencyjne (Rysunek 2A) za pomocą oprogramowania open source49. 
		UWAGA: Oprogramowanie generuje obraz różnicowy w celu oceny zmian pikseli między dwoma sekwencyjnymi obrazami dla obszaru zainteresowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) i względnego wyniku WormScan. Ten wynik WormScan jest równoważny zmianom w odpowiedzi lokomotorycznej w oparciu o natężenie światła wytwarzanego przez skaner po ustawieniu na próg pikseli 5 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
		<li>Wyeksportuj dane z programu WormScan jako arkusz kalkulacyjny. Zapisz arkusz kalkulacyjny zawierający dane na komputerze lokalnym. Znormalizuj dane jako procent kontroli (POC) i porównaj eksperymenty replikacji biologicznej dla różnych zmutowanych lub leczonych warunków. Przeprowadź analizę statystyczną, aby porównać średnie mutantów i kontrolne za pomocą testu t-Studenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

M.L., N.D.M., N.S. oraz E.N.-O. nie ujawniają żadnych istotnych informacji finansowych. M.J.F. jest współzałożycielem MitoCUREia, Inc., członkiem naukowej rady doradczej z udziałami w RiboNova, Inc. oraz członkiem rady naukowej jako płatny konsultant w Khondrion i Larimar Therapeutics. M.J.F. był wcześniej lub jest obecnie zaangażowany w kilka firm zajmujących się opracowywaniem przedklinicznych i/lub klinicznych terapii chorób mitochondrialnych jako płatny konsultant (Astellas [dawniej Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) i/lub sponsorowany współpracownik badawczy (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics i Stealth BioTherapeutics).

W tym miejscu badanie podsumowało szczegółowe informacje i przesłanki do badania aktywności nerwowo-mięśniowej C. elegans na poziomie różnych wyników, w tym rzucania robakami, lokomocji, pompowania gardła i chemotaksji. Porównano 16 różnych metodologii analizy aktywności pod względem względnej przepustowości, zalet i ograniczeń ilościowego określania aktywności nicieni w pojedynczych populacjach robaków lub robaków w różnym wieku i czasie trwania eksperymentu. Wśród nich zwrócono uwagę na dwie nowatorskie adapta...

Caenorhabiditis elegans jest powszechnie uznawany za wybitny model w neurobiologii, ponieważ posiada 302 neurony, które koordynują wszystkie zachowania robaków, w tym krycie, karmienie, składanie jaj, defekację, pływanie i poruszanie się na stałych podłożach1. Te hermafrodytyczne nicienie są również szeroko stosowane do zrozumienia szerokiego wachlarza mechanizmów chorobowych u ludzi, co jest możliwe dzięki dobrze scharakteryzowanemu genomowi i wysokiej homologii ~80% genów między C. elegans a ludźmi2,3,4. C. elegans od dawna są używane do badania ludzkich chorób mitochondrialnych5,6,7,8,9,10, która jest wysoce genetycznie i fenotypowo heterogenną grupą dziedzicznych zaburzeń metabolicznych, które mają upośledzoną zdolność do generowania energii komórkowej i często klinicznie występują z Znacznie upośledzone funkcje nerwowo-mięśniowe, nietolerancja wysiłku fizycznego i zmęczenie11,12,13,14. W tym celu wykorzystanie modeli C. elegans umożliwia przedkliniczne modelowanie ilościowych aspektów aktywności zwierząt i funkcji nerwowo-mięśniowych w różnych podtypach genetycznych choroby mitochondrialnej, a także ich odpowiedzi na potencjalne terapie, które mogą poprawić ich funkcję nerwowo-mięśniową i ogólną aktywność.
Aktywność nerwowo-mięśniowa u C. elegans jest obiektywnie mierzalna za pomocą szeregu metod eksperymentalnych, w tym zarówno manualnych, jak i półautomatycznych, które umożliwiają analizy funkcjonalne w pożywkach stałych lub płynnych (Tabela 1)1,15. Dokładna ocena ilościowa aktywności C. elegans okazała się ważna dla umożliwienia odkryć związanych z funkcją i rozwojem układu mięśniowego i nerwowego16,17,18. Badanie to podsumowuje i porównuje wymagania eksperymentalne, zalety i ograniczenia 17 różnych testów, które można przeprowadzić w laboratoriach badawczych w celu oceny funkcji i aktywności nerwowo-mięśniowej w odniesieniu do czterech kluczowych wyników w modelach chorób C. elegans, zarówno na początku badania na różnych etapach rozwoju i w różnym wieku, jak i w odpowiedzi na potencjalne terapie (Tabela 1). Rzeczywiście, badanie zapewnia szczegółowy przegląd zakresu dostępnych podejść eksperymentalnych w celu scharakteryzowania szybkości rzucania się C. elegans (zgięcia ciała na minutę), aktywności lokomotorycznej, pompowania gardła i chemotaksji - w każdym przypadku określając zastosowaną metodologię eksperymentalną i analityczną, zalety i ograniczenia każdej metody, sprzęt i oprogramowanie potrzebne do wykonania i analizy każdego testu, oraz przepustowość każdej metody w celu wsparcia jej wykorzystania do wysokoprzepustowych genetycznych badań przesiewowych lub badań przesiewowych leków. Przepustowość każdego testu jest opisana jako niska, średnia lub wysoka w zależności od złożoności protokołu eksperymentalnego, w tym konserwacji robaków, czasu przetwarzania, użycia płytek jedno- lub wielodołkowych i/lub czasu eksperymentatora potrzebnego do ukończenia warunków eksperymentalnych i analiz danych.
Ręczne analizy młócenia19, aktywność lomotoryczna20, pompowanie gardła17,21, oraz chemotaxis22,23 to sprawdzone metodologie oceny aktywności robaków, które wymagają mikroskopu stereoskopowego24. Podczas gdy pomiar aktywności młócącej robaków wymaga analizy w pożywkach płynnych w celu określenia częstotliwości zgięć ciała na minutę, aktywność lokomotoryczna robaków może być mierzona zarówno na podłożach stałych, jak i w pożywkach płynnych. Jednak ręczne analizy aktywności poszczególnych robaków są z natury czasochłonne i wiążą się z nieuniknionymi uprzedzeniami generowanymi przez użytkowników. Automatyzacja analiz aktywności robaków minimalizuje stronniczość generowaną przez użytkowników i może znacznie zwiększyć przepustowość eksperymentalną25. Nagrania wideo aktywności robaków w płynnych mediach mogą być analizowane za pomocą wrMTrck, wtyczki ImageJ26. Jednak pierwotne ustawienia eksperymentalne, które zostały opracowane dla wrMTrck, ograniczały jego użyteczność, ponieważ zbyt wiele robaków w jednej kropli płynu prowadziło do nakładania się robaków, co utrudniało dokładne śledzenie. Chociaż to eksperymentalne ograniczenie zostało rozwiązane27, metoda wrMTrck nie jest w stanie obsługiwać przesiewania o wysokiej przepustowości.
Istnieje szereg metod do ilościowego określania aktywności lokomotorycznej robaków na początku badania i w odpowiedzi na potencjalne terapie w modelach chorób mitochondrialnych C. elegans. Należą do nich: ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, platforma śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32 oraz WMicrotracker One33 (Tabela 1). Metody te umożliwiają jednoczesną analizę lokomocji w wielu szczepach robaków lub warunkach, zwykle na płytkach wielodołkowych, wspierając w ten sposób zastosowania badań przesiewowych leków o wyższej przepustowości. Niektóre z tych metod mają unikalne względy, które mogą ograniczać lub zwiększać ich ogólną użyteczność, takie jak potrzeba drogiego sprzętu w porównaniu z oprogramowaniem o otwartym dostępie oraz różna łatwość wykonywania protokołów eksperymentalnych. Ogólnie rzecz biorąc, żaden pojedynczy system lub protokół eksperymentalny nie jest idealnie dopasowany do wszystkich eksperymentów aktywności lokomotorycznej C. elegans. Ważne jest raczej, aby starannie wybrać, która metoda jest najlepiej dopasowana do celów i wymagań eksperymentalnych konkretnego badacza.
Pompowanie gardła stanowi kolejny ważny wynik do oceny aktywności nerwowo-mięśniowej u C. elegans. Gardło C. elegans składa się z 20 komórek mięśniowych, 20 neuronów i 20 innych komórek, które umożliwiają spożycie Escherichia coli (E. coli) na przednim końcu przewodu pokarmowego robaka34,35,36. Ustalono kilka ręcznych metod określania szybkości pompowania gardła17,21,37,38. Większość metod opiera się na wykorzystaniu mikroskopu stereoskopowego i kamery do wizualizacji i rejestracji częstotliwości pompowania gardła z bezpośrednim zliczaniem przez eksperymentalnego obserwatora21. Zautomatyzowana analiza szybkości pompowania pokarmu gardłowego jest możliwa po wykonaniu zapisu zewnątrzkomórkowego zwanego elektrogardłowogramem (EPG), który dostarcza dodatkowych informacji na temat czasu trwania każdej pompy39. Analiza szybkości pompowania gardła jest również możliwa w systemie mikroprzepływowym WormSpa, w którym poszczególne robaki są zamknięte w komorach40,41. Komercyjną metodą ułatwiającą analizę szybkości pompy gardłowej jest system ScreenChip (InVivo Biosystems), który mierzy, wizualizuje i analizuje nerwowo-mięśniowe aspekty zachowań żywieniowych u pojedynczego robaka, który jest unieruchomiony w niestandardowym chipie. To podejście do kwantyfikacji pompowania gardłowego może być wykorzystane do oceny zarówno neuronalnych, jak i fizjologicznych reakcji na leki, starzenie się i inne czynniki42,43,44,45.
Chemotaksja opisuje ruch C. elegans w odpowiedzi na zapach umieszczony z dala od robaków w określonym obszarze płytki pożywki dla nicieni (NGM). Ocena odpowiedzi chemotaksji zapewnia zintegrowaną miarę aktywności neuronalnej i nerwowo-mięśniowej robaków, którą można określić ilościowo poprzez obserwację i pomiar fizycznej odległości przebytej przez robaki w kierunku substancji zapachowej w określonym czasie46. Multi-Worm Tracker to automatyczna metoda, która może być wykorzystana do poprawy eksperymentalnej wydajności ilościowego określania odległości przebytej przez robaki w kierunku atraktantu lub repelentu47.
Tutaj opisany jest szczegółowy protokół dla dwóch nowatorskich, półautomatycznych metod stworzonych do ilościowego określania aktywności robaków. Pierwsze podejście wykorzystuje ZebraLab, komercyjne oprogramowanie, które zostało pierwotnie opracowane do badania aktywności pływackiej Danio rerio (danio pręgowanego), do nowatorskiego średnioprzepustowego zastosowania do ilościowego określania ogólnej aktywności lokomotorycznej w płynnych pożywkach C. elegans na podstawie zmian pikseli podczas ruchu (Tabela 1, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Dane wyjściowe są szybko uzyskiwane z dużej liczby jednoczesnych warunków i próbek analizowanych na szkiełku podstawowym, chociaż metoda ta nie jest odpowiednia dla formatu płytek wielodołkowych. Drugie podejście to nowatorska adaptacja metodologii WormScan48,49 (Rysunek 2), która wykorzystuje skaner płaski do tworzenia obrazu różnicowego dwóch sekwencyjnych skanów, które mogą być różnie używane z oprogramowaniem typu open source, aby umożliwić półautomatyczną analizę ilościową zintegrowanych wyników fizjologicznych, takich jak płodność i przeżycie. W tym celu opracowano nową, wysokoprzepustową adaptację metodologii WormScan do ilościowego określania aktywności lokomotorycznej robaków w pożywkach płynnych w populacjach piętnastu robaków w stadium larwalnym 4 (L4) na studzienkę 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Ta półautomatyczna i tania metodologia WormScan może być łatwo dostosowana do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, a także do analiz różnych etapów i wieku zwierząt48,49.
Tutaj protokół i skuteczność analizy aktywności lokomotorycznej C. elegans przy użyciu metod półautomatycznych ZebraLab i WormScan jest pokazana w dobrze znanym modelu C. elegans dla choroby mitochondrialnego kompleksu I, gas-1(fc21). gaz-1 (gen K09A9.5) jest ortologiem ludzkiego NDUFS2 (NADH: rdzeń oksydoreduktazy ubichinonowej (białko żelazowo-siarkowe) podjednostka 2) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3). Zmutowany szczep C. elegans gas-1(fc21) jest nosicielem homozygotycznej mutacji missense p.R290K w ludzkim ortologu NDUFS250, powodując znacznie obniżoną płodność i długość życia, upośledzoną zdolność fosforylacji oksydacyjnej łańcucha oddechowego (OXPHOS)51, a także zmniejszoną masę mitochondrialną i potencjał błonowy ze zwiększonym stresem oksydacyjnym5,8. Pomimo ugruntowanego zastosowania w ciągu ostatnich dwóch dekad do badania chorób mitochondrialnych, aktywność lokomotoryczna mutantów GAS-1 (fc21) nie była wcześniej zgłaszana. W tym przypadku metody ZebraLab i WormScan zostały zastosowane do niezależnego ilościowego określenia aktywności lokomotorycznej robaków gas-1(fc21) w porównaniu z robakami typu dzikiego (WT, N2 Bristol), zarówno w celu walidacji metod, jak i wykazania ich porównawczej użyteczności i skuteczności protokołów eksperymentalnych i analiz informatycznych. Oprogramowanie ZebraLab umożliwiło szybkie ilościowe określenie kilku jednoczesnych stanów aktywności lokomotorycznej robaków w modelach chorób mitochondrialnych C. elegans, co może znaleźć zastosowanie w ukierunkowanych badaniach przesiewowych leków lub badaniach walidacyjnych. Analiza WormScan, w szczególności, jest dobrze przystosowana do łatwego umożliwienia wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w bibliotekach związków i priorytetyzacji potencjalnych klientów, które poprawiają funkcję nerwowo-mięśniową zwierząt i aktywność lokomotoryczną w przedklinicznych modelach pierwotnej choroby mitochondrialnej C. elegans.

<table><tbody><tr><td>C. elegans dziki izolat</td><td>&nbsp; Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td>N2 Bristol</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>gas-1(fc-21)</td><td>CGC</td><td>CW152</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>ThermoFisher</td><td>4951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>CGC</td><td></td><td>Uracil auksotrop E. coli szczep</td></tr><tr><td>szalki Petriego (60 mm)</td><td>&nbsp; VWR international</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>S. Basal</td><td>VWR 5,85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4 i 5 mg cholesterolu, w 1 l H2O</td><td>VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660</td><td></td></tr><tr><td>Skaner</td><td>EPSON</td><td>V800</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td> Mikroskop <td></td><td>Olympus</td><td>MVX10</td></tr><tr><td>96-dołkowy płaski dno</td><td>&nbsp; VWR international</td><td>29442-056</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie WormScan</td><td>Mathew et al. 45</td><td>S1 Samodzielna platforma Java</td><td>Oprogramowanie do automatyzacji różnicowego obrazu zeskanowanych płyt</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ZebraLab</td><td>Oprogramowanie ViewPoint</td><td></td><td>do automatycznej kwantyzacji i śledzenia zachowania danio pręgowanego, zaprojektowane przez ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) i tutaj zastosowane do C. elegans. Ten system ma zastosowanie do wysokoprzepustowej analizy behawioralnej</td></tr></tbody></table>

analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej caenorhabditis elegans

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans jest powszechnie rozpoznawany ze względu na swoją główną użyteczność jako translacyjny model zwierzęcy do skutecznego badania mechanizmów i terapii różnych chorób ludzkich. Robaki szczególnie dobrze nadają się do wysokoprzepustowych badań genetycznych i przesiewowych leków, aby uzyskać głębszy wgląd w cele terapeutyczne i terapie poprzez wykorzystanie ich szybkiego cyklu rozwojowego, dużej wielkości lęgu, krótkiej żywotności, mikroskopijnej przezroczystości, niskich kosztów utrzymania, solidnego zestawu narzędzi genomicznych, repozytoriów mutantów i metodologii eksperymentalnych do badania fizjologii zarówno in vivo, jak i ex vivo. Aktywność lokomotoryczna robaków stanowi szczególnie istotny fenotyp, który jest często upośledzony w chorobie mitochondrialnej, która jest wysoce niejednorodna pod względem przyczyn i objawów, ale łącznie ma upośledzoną zdolność do wytwarzania energii komórkowej. Chociaż do badania zachowania robaków można wykorzystać zestaw różnych metodologii, różnią się one znacznie pod względem kosztów eksperymentalnych, złożoności i użyteczności w przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych genomu lub leków. W tym miejscu porównano względną przepustowość, zalety i ograniczenia 16 różnych metodologii analizy aktywności, które określają ilościowo lokomocję nicieni, rzucanie, pompowanie gardła i / lub chemotaksję u pojedynczych robaków lub populacji robaków C. elegans na różnych etapach, w różnym wieku i czasie trwania eksperymentu. Zademonstrowano szczegółowe protokoły dla dwóch półautomatycznych metod ilościowego oznaczania aktywności lokomotorycznej nicieni, które reprezentują nowatorskie zastosowania dostępnych narzędzi programowych, a mianowicie ZebraLab (podejście średnioprzepustowe) i WormScan (podejście wysokoprzepustowe). Dane uzyskane przy zastosowaniu tych metod wykazały, że podobny stopień zmniejszonej aktywności zwierząt wystąpił w stadium larwalnym L4 i postępował u dorosłych w dniu 1, w chorobie kompleksu mitochondrialnego I (gas-1(fc21)) zmutowane robaki w stosunku do dzikiego typu (N2 Bristol) C. elegans. Dane te potwierdzają przydatność tych nowatorskich zastosowań w wykorzystaniu narzędzi programowych ZebraLab lub WormScan do ilościowego określania aktywności lokomotorycznej robaków w sposób skuteczny i obiektywny, ze zmienną zdolnością do wspierania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków dotyczących zachowania robaków w przedklinicznych modelach zwierzęcych choroby mitochondrialnej.

Analiza aktywności lokomotorycznej C. elegans w środowisku ciekłym mogłaby łatwo uchwycić zintegrowany fenotyp modeli nicieni z chorobą mitochondrialną, który może nie być łatwo mierzalny na podłożach stałych. Program ZebraLab został wykorzystany do ilościowej oceny aktywności lokomotorycznej ugruntowanego szczepu z chorobą kompleksu I mitochondriów gas-1(fc21) w stosunku do nicieni typu dzikiego (WT) w środowisku ciekłym na etapie larwalnym L4. Aktywność 5 nicieni w pojedynczej kropli cieczy r...

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Protokół ten wykorzystuje dwa różne półautomatyczne testy do szybkiego ilościowego określenia aktywności lokomotorycznej C.elegans w płynnym podłożu i może być potencjalnie stosowany do badań przesiewowych leków w modelach choroby C. elegans. Głównymi zaletami tych dwóch technik są łatwość użycia i łatwość odtwarzalności. Obie techniki mają potencjał do oceny wpływu leków na zachowanie robaków przy zmiennej przepustowości.Te testy ruchliwości są przydatne do oceny aktywności lokomotorycznej modeli chorób mitochondrialnych C.elegans, w których układ nerwowo-mięśniowy zwierząt jest upośledzony. Aby przeanalizować aktywność lokomotoryczną C.elegans w ciekłym podłożu na szkiełkach po zsynchronizowaniu kontroli w zmutowanych szczepach robaków na płytkach NGM z i bez leczenia farmakologicznego interesującego dla etapu L4, użyj kilofa ślimakowego i stereomikroskopu, aby wybrać pięć robaków na szczep i kondycjonować do pojedynczych 20 mikrolitrowych kropli roztworu S. bazalu na szkiełku podstawowym. Dodaj robaki z tych samych warunków eksperymentalnych z różnych płytek NGM do wielu kropel na tym samym szkiełku, aby uzyskać wiele powtórzeń technicznych.Po zebraniu wszystkich robaków pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się na szkiełku przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie rejestruj aktywność pływania robaków w każdej kropli przez jedną minutę przy 15 klatkach na sekundę na kroplę. Aby przeanalizować zarejestrowaną aktywność lokomotoryczną C.elegans za pomocą oprogramowania ZebraLab, użyj opcji ZEBRALAB AVI, aby przesłać filmy do oprogramowania. Kliknij opcję Kwantyzacja za pomocą plików AVI.Aby utworzyć nowy protokół, wybierz Parametry, Parametry protokołu i Czas, a następnie ustaw czas trwania eksperymentu na jedną minutę. Wybierz opcję Brak przedziału czasu i odznacz opcję Okres integracji zgodnie z żądanymi danymi wyjściowymi, a następnie wybierz Plik i Otwórz film, aby przesłać każdy wcześniej nagrany plik wideo. Aby zbudować pojedynczy obszar wykrywania, użyj narzędzia okręgu, aby utworzyć obszar wokół całej kropli cieczy, w której znajdują się robaki.Zostanie wykryta aktywność wszystkich robaków w wybranym obszarze. Aby wskazać odległość do kalibracji, narysuj poziomą linię od lewej do prawej od obszaru wideo i wybierz opcję Kalibracja, Rysuj i Zastosuj do grupy. Aby umożliwić wykrywanie wszystkich różnych szczepów robaka C.elegans, które mają zostać przeanalizowane, usuń zaznaczenie ikony Obszar i dostosuj czułość wykrywania w Progu aktywności.Aby zobrazować ślady pozostawione przez zwierzęta podczas analizy aktywności, ustaw skalę wyświetlania na 70 i wybierz opcję Zastosuj do grupy. Aby przeanalizować filmy, kliknij przycisk Odtwórz, a następnie wybierz opcję Eksperymentuj i Wykonaj, aby wprowadzić nazwę pliku wideo. Po zapisaniu pojawi się okno z pytaniem, czy analizować wideo z maksymalną prędkością komputera.Kliknij przycisk Tak. Otworzy się okno uruchomionego eksperymentu. Kliknij przycisk Start.Po zakończeniu analizy nagrania kliknij przycisk Eksperymentuj i zatrzymaj się, aby zapisać analizowaną aktywność w droplecie w arkuszu kalkulacyjnym. Aby przeanalizować aktywność lokomotoryczną C.elegans w płynnym podłożu w formacie 96-dołkowej płytki, gdy robaki osiągną stadium L4, dodaj 50 mikrolitrów 2% masy na objętość pożywki E. coli OP50 i S. bazalnej do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby ręcznie wybrać 15 zsynchronizowanych robaków na dołek z 96-dołkowej płytki i pozwól robakom zaaklimatyzować się przez 20 minut.Pod koniec okresu aklimatyzacji użyj standardowego skanera płaskiego, aby zeskanować każdą mikropłytkę dwa razy w czasie krótszym niż 10 sekund między skanami Aby przeanalizować skany, użyj oprogramowania typu open source, aby wyrównać dwa sekwencyjne skany i uzyskać dane o zmianie pikseli między dwoma obrazami oraz względny wynik skanowania robaka w celu określenia zmian w odpowiedzi lokomotorycznej na podstawie natężenia światła wytwarzanego przez skaner po ustawieniu na piksel próg wynoszący pięć. W tej analizie aktywności lokomotorycznej C.elegans w pojedynczej kropli płynnego podłoża, robaki z chorobą mitochondrialną z kompleksem I wykazały znaczny 38% spadek aktywności lokomotorycznej w stadium L4 w porównaniu z robakami typu dzikiego. Podobnie, analiza skanów robaków w tych samych populacjach wykazała znaczne zmniejszenie aktywności lokomotorycznej u robaków modelowych w stadium L4 w porównaniu z robakami N2 Bristol typu dzikiego.Tę utratę aktywności lokomotywy zaobserwowano również u dorosłych robaków z chorobą mitochondrialną kompleksu I w pierwszym stadium, co oceniono za pomocą analizy skanów robaków. Ważne jest, aby pamiętać o użyciu odpowiedniej liczby robaków podczas ustawiania każdego testu. Po tej procedurze nasze laboratorium często przeprowadza badania przesiewowe na obecność narkotyków.Te dwie techniki są stosowane w naszym laboratorium do oceny wpływu leków będących przedmiotem zainteresowania na aktywność robaków w przedklinicznych modelach zwierzęcych choroby mitochondrialnej.

comparative-analysis-experimental-methods-to-quantify-animal-activity

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten film demonstruje zastosowanie testu lokomocji promieniowej do oceny dysfunkcji motorycznej u C. elegans wykazujących ekspresję ludzkiego białka TDP-43 typu dzikiego lub z mutacją ALS. Robaki o różnym poziomie ekspresji TDP-43 typu dzikiego lub zmutowanego mogą pełzać, a ich ruch jest mierzony odległością promieniową przebytą od centralnego punktu na płytce testowej. Test rozróżnia łagodne, umiarkowane i ciężkie upośledzenie motoryczne na podstawie odległości przebytej przez różne szczepy C.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans za pomocą testu lokomocji radialnej

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni.

Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Poznaj półautomatyczne metody ZebraLab i WormScan do ilościowej analizy aktywności ruchowej Caenorhabditis elegans w modelach chorób mitochondrialnych. Techniki te umożliwiają skalowalne i powtarzalne badania przesiewowe leków.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów