Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans
April 4th, 2021
To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.
Protokół ten wykorzystuje dwa różne półautomatyczne testy do szybkiego ilościowego określenia aktywności lokomotorycznej C.elegans w płynnym podłożu i może być potencjalnie stosowany do badań przesiewowych leków w modelach choroby C. elegans. Głównymi zaletami tych dwóch technik są łatwość użycia i łatwość odtwarzalności. Obie techniki mają potencjał do oceny wpływu leków na zachowanie robaków przy zmiennej przepustowości.
Te testy ruchliwości są przydatne do oceny aktywności lokomotorycznej modeli chorób mitochondrialnych C.elegans, w których układ nerwowo-mięśniowy zwierząt jest upośledzony. Aby przeanalizować aktywność lokomotoryczną C.elegans w ciekłym podłożu na szkiełkach po zsynchronizowaniu kontroli w zmutowanych szczepach robaków na płytkach NGM z i bez leczenia farmakologicznego interesującego dla etapu L4, użyj kilofa ślimakowego i stereomikroskopu, aby wybrać pięć robaków na szczep i kondycjonować do pojedynczych 20 mikrolitrowych kropli roztworu S. bazalu na szkiełku podstawowym. Dodaj robaki z tych samych warunków eksperymentalnych z różnych płytek NGM do wielu kropel na tym samym szkiełku, aby uzyskać wiele powtórzeń technicznych.
Po zebraniu wszystkich robaków pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się na szkiełku przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie rejestruj aktywność pływania robaków w każdej kropli przez jedną minutę przy 15 klatkach na sekundę na kroplę. Aby przeanalizować zarejestrowaną aktywność lokomotoryczną C.elegans za pomocą oprogramowania ZebraLab, użyj opcji ZEBRALAB AVI, aby przesłać filmy do oprogramowania. Kliknij opcję Kwantyzacja za pomocą plików AVI.
Aby utworzyć nowy protokół, wybierz Parametry, Parametry protokołu i Czas, a następnie ustaw czas trwania eksperymentu na jedną minutę. Wybierz opcję Brak przedziału czasu i odznacz opcję Okres integracji zgodnie z żądanymi danymi wyjściowymi, a następnie wybierz Plik i Otwórz film, aby przesłać każdy wcześniej nagrany plik wideo. Aby zbudować pojedynczy obszar wykrywania, użyj narzędzia okręgu, aby utworzyć obszar wokół całej kropli cieczy, w której znajdują się robaki.
Zostanie wykryta aktywność wszystkich robaków w wybranym obszarze. Aby wskazać odległość do kalibracji, narysuj poziomą linię od lewej do prawej od obszaru wideo i wybierz opcję Kalibracja, Rysuj i Zastosuj do grupy. Aby umożliwić wykrywanie wszystkich różnych szczepów robaka C.elegans, które mają zostać przeanalizowane, usuń zaznaczenie ikony Obszar i dostosuj czułość wykrywania w Progu aktywności.
Aby zobrazować ślady pozostawione przez zwierzęta podczas analizy aktywności, ustaw skalę wyświetlania na 70 i wybierz opcję Zastosuj do grupy. Aby przeanalizować filmy, kliknij przycisk Odtwórz, a następnie wybierz opcję Eksperymentuj i Wykonaj, aby wprowadzić nazwę pliku wideo. Po zapisaniu pojawi się okno z pytaniem, czy analizować wideo z maksymalną prędkością komputera.
Kliknij przycisk Tak. Otworzy się okno uruchomionego eksperymentu. Kliknij przycisk Start.
Po zakończeniu analizy nagrania kliknij przycisk Eksperymentuj i zatrzymaj się, aby zapisać analizowaną aktywność w droplecie w arkuszu kalkulacyjnym. Aby przeanalizować aktywność lokomotoryczną C.elegans w płynnym podłożu w formacie 96-dołkowej płytki, gdy robaki osiągną stadium L4, dodaj 50 mikrolitrów 2% masy na objętość pożywki E. coli OP50 i S. bazalnej do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby ręcznie wybrać 15 zsynchronizowanych robaków na dołek z 96-dołkowej płytki i pozwól robakom zaaklimatyzować się przez 20 minut.
Pod koniec okresu aklimatyzacji użyj standardowego skanera płaskiego, aby zeskanować każdą mikropłytkę dwa razy w czasie krótszym niż 10 sekund między skanami Aby przeanalizować skany, użyj oprogramowania typu open source, aby wyrównać dwa sekwencyjne skany i uzyskać dane o zmianie pikseli między dwoma obrazami oraz względny wynik skanowania robaka w celu określenia zmian w odpowiedzi lokomotorycznej na podstawie natężenia światła wytwarzanego przez skaner po ustawieniu na piksel próg wynoszący pięć. W tej analizie aktywności lokomotorycznej C.elegans w pojedynczej kropli płynnego podłoża, robaki z chorobą mitochondrialną z kompleksem I wykazały znaczny 38% spadek aktywności lokomotorycznej w stadium L4 w porównaniu z robakami typu dzikiego. Podobnie, analiza skanów robaków w tych samych populacjach wykazała znaczne zmniejszenie aktywności lokomotorycznej u robaków modelowych w stadium L4 w porównaniu z robakami N2 Bristol typu dzikiego.
Tę utratę aktywności lokomotywy zaobserwowano również u dorosłych robaków z chorobą mitochondrialną kompleksu I w pierwszym stadium, co oceniono za pomocą analizy skanów robaków. Ważne jest, aby pamiętać o użyciu odpowiedniej liczby robaków podczas ustawiania każdego testu. Po tej procedurze nasze laboratorium często przeprowadza badania przesiewowe na obecność narkotyków.
Te dwie techniki są stosowane w naszym laboratorium do oceny wpływu leków będących przedmiotem zainteresowania na aktywność robaków w przedklinicznych modelach zwierzęcych choroby mitochondrialnej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie prezentuje protokoły dla dwóch półautomatycznych podejść do analizy aktywności ruchowej u robaków C. elegans z chorobą kompleksu I gas-1 (fc21), a mianowicie ZebraLab i WormScan. Te techniki pozwalają na ilościową ocenę zachowania nicieni i zintegrowaną funkcję nerwowo-mięśniową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Analiza zachowania
- Genetyka
Tło
- C. elegans jest organizmem modelowym do badania funkcji nerwowo-mięśniowych.
- Testy aktywności ruchowej są kluczowe dla oceny efektów leków.
- Modele chorób kompleksu I dostarczają informacji na temat dysfunkcji mitochondria.
- Te testy mogą być stosowane w kontekście przesiewowych badań leków.
Cel badania
- Rozwój półautomatycznych testów do ilościowej oceny aktywności ruchowej.
- Porównanie różnych metod badawczych do analizy zachowania nicieni.
- Ułatwienie przesiewowych badań leków w modelach chorobowych C. elegans.
Stosowane metody
- Dwa półautomatyczne testy aktywności ruchowej: ZebraLab i WormScan.
- Robaki są synchronizowane i analizowane w płynnym medium.
- Użycie szczypc do nicieni i stereomikroskopu do przygotowania próbek.
- Przeprowadzanie wielokrotnych powtórzeń technicznych dla dokładności.
Główne wyniki
- Obie techniki wykazały się łatwością użycia i powtarzalnością.
- Testy skutecznie oceniły wpływ leków na zachowanie nicieni.
- Wyniki wspierają potencjał tych metod w badaniach.
- Analiza porównawcza podkreśla zalety każdego podejścia.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennych protokołów do analizy aktywności ruchowej.
- Te metody mogą ulepszyć przesiewowe badania leków w modelach C. elegans.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach dla dalszych wnikliwości.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of locomotor activity in Caenorhabditis elegans models enables objective evaluation of neuromuscular phenotypes relevant to mitochondrial disease. Semi-automated methods like ZebraLab and WormScan provide scalable, reproducible platforms for preclinical drug screening and mechanistic de-risking in translational research. These approaches support predictive confidence and portfolio triage by standardizing behavioral phenotyping across experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying neuromuscular impairment in disease models.
- Supports functional target validation through objective measurement of locomotor deficits.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing genotype-phenotype relationships in mitochondrial dysfunction.
Screening & Assay Development
- Prepares validated animal models for downstream compound evaluation in drug screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative locomotor activity outputs for assay development.
- Enables medium- to high-throughput screening readiness with adaptable throughput options.
- Supports reliable comparison of drug effects across multiple experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in mitochondrial dysfunction models.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting objective, scalable readouts.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative behavioral data.
Pipeline & Workflow Integration
These semi-automated locomotor assays integrate from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and compound triage in mitochondrial disease models.
- Discovery Biology: Quantitative activity measurements clarify genotype-phenotype relationships and support null hypothesis testing.
- Screening: Standardized outputs enable reproducible, scalable compound evaluation in validated animal models.
- Analytics: Automated software provides objective, quantitative readouts for cross-condition comparison.
- Translational Research: Behavioral endpoints align with disease-relevant phenotypes for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocols and software tools are adaptable for diverse genetic and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of behavioral assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling and behavioral assay setup.
- Needs access to video recording or flatbed scanning instrumentation and compatible analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay parameters and calibration procedures.
- Adaptable to various genetic backgrounds and experimental conditions with protocol optimization.
- Throughput and sensitivity may vary based on assay format and instrumentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Worm Locomotor Activity Analysis in Liquid Medium on Glass Slides
1:37
C. elegans Locomotor Activity Recording Analysis in ZebraLab Software
3:30
Worm Locomotor Activity Analysis in Liquid Medium in 96-Well Plate Format
4:30
Results: Comparative Analysis of Locomotor Activity by ZebraLab and WormScan Software Assays
5:14
Conclusion
