Name: Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj metodę stymulacji mechanicznej i obrazowania neuronów C. elegans za pomocą mikroprzepływowego układu pułapkowego. Technika umożliwia nieinwazyjną imobilizację nicieni i precyzyjną analizę odpowiedzi neuronalnych na bodźce mechaniczne w wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Sandrze N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divyi Gopisetty i Veronice Sanchez za wsparcie w projektowaniu urządzeń i generowaniu zmutowanych zwierząt. Badania te były wspierane przez granty NIH R01EB006745 (dla BLP), R01NS092099 (dla MBG), K99NS089942 (dla MK), F31NS100318 (dla ALN) i otrzymały finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa grantowa nr 715243 do MK).

<ol><li>Eastwood, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+mechanics+govern+the+rapidly+adapting+and+symmetrical+response+to+touch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).</li>
<li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+Force%3A+Physical+and+Physiological+Principles+Enabling+Sensory+Mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).</li>
<li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+systems+biology+of+C.+elegans+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation.</a> BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).</li>
<li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+the+sense+of+touch+by+%CE%B2-spectrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin.</a> Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).</li>
<li>Gaub, B. M., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+Piezo1+receptors+depends+on+extracellular+matrix+proteins+and+directionality+of+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force.</a> Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).</li>
<li>Geffeney, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEG%2FENaC+but+not+TRP+channels+are+the+major+mechanoelectrical+transduction+channels+in+a+c.+Elegans+nociceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor.</a> Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).</li>
<li>O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MEC-4+DEG%2FENaC+channel+of+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons+transduces+mechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals.</a> Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+C.+elegans+Mechanosensory+Neurons+Demonstrates+a+Specific+Role+for+the+MEC-4+Channel+in+the+Process+of+Gentle+Touch+Sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation.</a> Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).</li>
<li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li>
<li>Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+and+compressive+immobilization+of+C.+elegans+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip.</a> Lab Chip. 9 (1), 151(2009).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-on-a-chip%3A+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li>
<li>Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+automatic+counting+system+for+the+study+of+C.+elegans+reproductive+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging.</a> Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).</li>
<li>Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microfluidic+platform+for+calcium+imaging+of+chemosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J. Vis. Exp. , e50998(2014).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+that+Contain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Enhance+Neuronal+Cell+Mechanics+and+Touch+Sensation%5BTitle%5D)+AND+%22CellReports%22%5BJournal%5D)">Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation.</a> CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+in+%CE%B2-spectrin+and+tau+sensitize+C.+elegans+axons+to+movement-induced+damage+via+torque-tension+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling.</a> Elife. 6 (2010), e20172(2017).</li>
<li>Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEG%2FENaC+protein+MEC-10+regulates+the+transduction+channel+complex+in+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons.</a> J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).</li>
<li>Lockhead, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5170555/">The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth.</a> Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).</li>
<li>Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEC-2+regulates+C.+elegans+DEG%2FENaC+channels+needed+for+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation.</a> Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).</li>
<li>Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. , (2017).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. (119), e55276(2017).</li>
<li>Jenkins, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+PDMS+devices+using+SU-8+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography.</a> Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).</li>
<li>Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+microfluidic+devices+by+using+low-cost+fabrication+techniques%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review.</a> J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="https://www.fkit.unizg.hr/_download/repository/Soft_litography_Whitesides_Review__aciee98.pdf">SOFT LITHOGRAPHY.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+and+controlled+mechanical+stimulation+and+functional+imaging+in+vivo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans.</a> Lab Chip. , (2017).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. <a target="_blank" href="http://www.biorxiv.org/content/early/2017/02/10/107318">High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo.</a> BiorXiv. , (2017).</li>
<li>Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS-based+force-clamp+analysis+of+the+role+of+body+stiffness+in+C.+elegans+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).</li>
<li>Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+applied+during+classical+touch+assays+for+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (5), e0178080(2017).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599(2011).</li>
<li>Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/15/5/005">Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems.</a> J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).</li>
<li>Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+under+Pressure%3A+Bulk+Mechanical+Properties+of+C.+elegans+Are+Independent+of+the+Cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle.</a> Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten demonstruje metodę dostarczania precyzyjnej stymulacji mechanicznej do skóry glisty uwięzionej w chipie mikroprzepływowym. Ma on na celu ułatwienie integracji bodźców fizycznych w celu udzielenia odpowiedzi na pytania biologiczne i ma na celu usprawnienie badań mechanobiologicznych w laboratoriach biologicznych. Metoda ta rozszerza wcześniejsze testy w celu oceny funkcji neuronów mechanosensorycznych u C. elegans. Poprzednie techniki ilościowe i półilościowe mierzyły siły <su...

Zmysł dotyku dostarcza zwierzętom kluczowych informacji o ich otoczeniu. W zależności od przyłożonej siły, dotyk jest postrzegany jako nieszkodliwy, przyjemny lub bolesny. Deformacja tkanki pod wpływem dotyku jest wykrywana przez wyspecjalizowane komórki mechanoreceptorowe osadzone w skórze, które wyrażają białka receptorowe, najczęściej kanały jonowe. Kroki łączące percepcję siły z aktywacją kanałów jonowych podczas dotyku i bólu nie są w pełni zrozumiałe. Jeszcze mniej wiadomo o tym, w jaki sposób tkanka skórna filtruje deformacje mechaniczne i czy mechanoreceptory wykrywają zmiany w odkształceniu lub stresie1,2,3. Ta luka w zrozumieniu wynika po części z braku odpowiednich narzędzi do stosowania precyzyjnych stymulacji mechanicznych na powierzchni skóry żywego zwierzęcia przy jednoczesnej obserwacji reakcji na poziomie komórkowym. Podczas gdy mikroskopia sił atomowych była szeroko stosowana do przykładania i mierzenia sił w izolowanych komórkach4,5, a także do aktywacji receptorów Piezo1 w żywych komórkach6, podobne eksperymenty z użyciem żywych zwierząt, zwłaszcza C. elegans, były notorycznie trudne ze względu na wewnętrzną mobilność obiektu. To wyzwanie jest tradycyjnie obchodzone poprzez użycie kleju cyjanoakrylowego klasy weterynaryjnej lub chirurgicznej do unieruchamiania poszczególnych zwierząt na podkładkach agarowych1,7,8,9. To podejście było produktywne, ale ma ograniczenia związane z umiejętnościami wymaganymi do unieruchomienia przez klejenie i miękką powierzchnią agaru w zakresie podatności mechanicznej. Strategia mikrofluidyczna jest komplementarną alternatywą, która pozwala uniknąć niektórych komplikacji związanych z klejeniem.
Nicień C. elegans to genetyczny organizm modelowy z całkowicie zmapowanym układem nerwowym, który, ze względu na rozmiar zwierzęcia, dobrze pasuje do technologii mikrofluidycznej. Urządzenia oparte na mikrofluidyce mają tę zaletę, że niezwykle ruchliwe zwierzęta mogą być skrępowane podczas wykonywania obrazowania w wysokiej rozdzielczości i dostarczania odpowiednich bodźców neuromodulacyjnych. Za pomocą technologii mikroprzepływowych żywe zwierzęta mogą być unieruchomione bez szkody10,11, umożliwiając monitorowanie aktywności behawioralnej przez całe życie12,13 i obrazowanie aktywności neuronalnej w wysokiej rozdzielczości14,15,16,17. Co więcej, wiele neuronów mechanoreceptorowych potrzebnych do zmysłu dotyku i bólu można scharakteryzować na podstawie ich fizjologicznych1,8, mechanical4,18,19, oraz poziom molekularny20,21,22.
C. elegans wyczuwa delikatne bodźce mechaniczne na ścianie swojego ciała za pomocą sześciu TRN, z których trzy unerwiają przednią część zwierzęcia (ALML/R i AVM), a trzy z nich unerwiają tylną część zwierzęcia (PLML/R i PVM). Cząsteczki kanału jonowego potrzebne do przekształcenia przyłożonej siły w sygnał biochemiczny zostały szeroko zbadane w TRNs8. W tym artykule przedstawiono platformę mikroprzepływową23, która umożliwia naukowcom przyłożenie precyzyjnych sił mechanicznych do skóry unieruchomionej glisty C. elegans, jednocześnie odczytując deformację jej wewnętrznych tkanek za pomocą obrazowania optycznego. Oprócz prezentowania dobrze zdefiniowanych bodźców mechanicznych, przejściowe stany wapnia mogą być rejestrowane w neuronach mechanoreceptorowych z rozdzielczością subkomórkową i skorelowane z cechami morfologicznymi i anatomicznymi. Urządzenie składa się z centralnego kanału pułapkowego, który utrzymuje pojedyncze zwierzę i prezentuje jego skórę obok sześciu pneumatycznych kanałów uruchamiających (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Sześć kanałów jest rozmieszczonych wzdłuż kanału pułapkowego, aby dostarczać bodźce mechaniczne do każdego z sześciu TRN robaka. Kanały te są oddzielone od komory pułapkowej cienkimi membranami PDMS, które mogą być napędzane przez zewnętrzne źródło ciśnienia powietrza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Skalibrowaliśmy ugięcie w odniesieniu do ciśnienia i przedstawiliśmy pomiary w tym artykule. Każdy siłownik może być adresowany indywidualnie i używany do stymulacji wybranego mechanoreceptora. Ciśnienie jest dostarczane za pomocą pompy ciśnieniowej z napędem piezoelektrycznym, ale można zastosować dowolne urządzenie alternatywne. Pokazujemy, że protokół ciśnienia może być wykorzystany do aktywacji TRN in vivo i zademonstrowania urządzeń operacyjnych odpowiednich do dostarczania bodźców mechanicznych dorosłym C. elegans, ładowania dorosłych zwierząt do urządzeń, wykonywania eksperymentów obrazowania wapnia i analizowania wyników. Produkcja urządzenia składa się z dwóch głównych etapów: 1) fotolitografii w celu wykonania formy z SU-8; oraz 2) formowanie PDMS w celu wykonania urządzenia. Dla zwięzłości i jasności czytelnicy są odsyłani do wcześniej opublikowanych artykułów i protokołów24,25 w celu uzyskania instrukcji dotyczących produkcji form i urządzeń.

<table><tbody><tr><td>Maska Chrome</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Chromowana</td><td>maska Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Chromowana</td><td>maska Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>4-calowy wafel krzemowy (test B)</td><td>Stanford Nanofabrication Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>Zegar ekspozycji</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler</td> <td>oświetleniaOptical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 deweloper</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethylsilane (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>Uwaga: TCMS jest toksyczny i reaguje na wodę</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>PDMS prepolimer</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Plazma tlenowa Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe metalowe rurki (0,635 mm średnica zewnętrzna, 0,4318 mm średnica wewnętrzna, długość 12,7 mm); rozmiar miernika 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Nalgene, 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>do filtrowania całego roztworu, małe cząsteczki zatkałyby chip</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa; 0,9652 mm średnicy zewnętrznej, 0,5842 mm średnicy wewnętrznej</td> Strzykawka <td>Solomon Scientific</td><td>BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml Strzykawka</td> BD <td>Scientific</td><td>309628</td><td>do wychwytywania i uwalniania robaków</td></tr><tr><td>, 20 ml</td><td>309661 BD Scientific</td><td></td><td>do przepływu grawitacyjnego</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, perystaltyczny pompa</td><td>Gilson</td><td></td><td>do zasysania roztworów i ślimaków z chipa</td></tr><tr><td>Mikroprzepływowy regulator przepływu, wyposażony w 0&ndash; Kanał ciśnieniowy 800 kPa</td><td>Dostarczanie ciśnienia</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td></tr><tr><td>Wodoodporna, przezroczysta rurka poliuretanowa, 4 mm ID i 6 mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>Przyłącze od powietrza domowego do pompy ciśnieniowej</td></tr><tr><td>Wodoodporna przezroczysta rurka poliuretanowa, średnica wewnętrzna 2,6 mm i średnica zewnętrzna 4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>podłącz pompę ciśnieniową do małej rurki</td></tr><tr><td>Złączka rurkowa Push-to-Connect do powietrza</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>konwerter calowy</td></tr><tr><td>Łącznik prosty do 6 mm & czas; 1/4&Prime; Rura zewnętrzna</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>System mikroskopowy Leica DMI 4000 B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO obiektyw olejowy</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT aparat cyfrowy CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Silnik świetlny Spectra X</td><td>Lumencor</td><td></td><td>Z cyjanem i zielono-żółtym źródłem światła</td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki wzbudzenia</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>w mikroskopie</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini Optyka rozdzielająca obraz</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>do podziału emisji zielonej i czerwonej i rzutowania ich na różne obszary na chipie kamery</td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki emisyjnej</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>w rozdzielaczu obrazu</td></tr><tr><td>Filtry emisyjne GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>w rozdzielaczu obrazu</td></tr><tr><td>Filtry emisyjne mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>w rozdzielaczu obrazu</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania c. elegans w wysokiej rozdzielczości

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Jednym z głównych celów mechanobiologii jest zrozumienie wzajemnego wpływu stresu mechanicznego na białka i komórki. Pomimo swojego znaczenia, wpływ stresu mechanicznego na funkcjonowanie komórek jest nadal słabo poznany. Luka w wiedzy wynika po części z tego, że niewiele narzędzi umożliwia jednoczesną deformację tkanek i komórek, obrazowanie aktywności komórkowej u żywych zwierząt oraz skuteczne ograniczanie ruchliwości w organizmach modelowych, które w przeciwnym razie byłyby wysoce mobilne, takie jak nicienie Caenorhabditis elegans. Niewielkie rozmiary C. elegans sprawiają, że doskonale pasują do urządzeń badawczych opartych na mikrofluidyce, a rozwiązania do immobilizacji zostały zaprezentowane przy użyciu urządzeń mikroprzepływowych. Chociaż urządzenia te pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, zwierzę jest całkowicie zamknięte w polidimetylosiloksanach (PDMS) i szkle, co ogranicza fizyczny dostęp do dostarczania siły mechanicznej lub zapisów elektrofizjologicznych. Niedawno stworzyliśmy urządzenie, które integruje siłowniki pneumatyczne z konstrukcją pułapki, która jest kompatybilna z mikroskopią fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości. Kanał uruchamiający jest oddzielony od kanału wychwytywania ślimaków cienką membraną PDMS. Membrana ta jest odchylana w bok ślimaka poprzez wywieranie nacisku z zewnętrznego źródła. Urządzenie może celować w poszczególne neurony wrażliwe mechanicznie. Aktywacja tych neuronów jest obrazowana w wysokiej rozdzielczości za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. W artykule przedstawiono ogólną metodę z wykorzystaniem szczepów C. elegans wykazujących ekspresję wskaźnika aktywności wrażliwej na wapń (GCaMP6s) w neuronach receptora dotyku (TRN). Metoda ta nie ogranicza się jednak do TRN ani do czujników wapnia jako sondy, ale może być rozszerzona na inne mechanicznie wrażliwe ogniwa lub czujniki.

Litografia SU-8 i bondowanie chipa 
Protokół litografii i formowania w PDMS przebiega zgodnie ze standardowymi procedurami. Szczegóły można znaleźć w innych źródłach23,24,25,26. Po utwardzeniu PDMS powinien bez problemu oddzielić się od wafla. Jeśli elementy z SU-8 odrywają się podczas oddzielania PDMS, oznacza to, że warstwa adhezyjna SU-8 l...

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Ogólnym celem tej techniki jest zmierzenie, w jaki sposób nicienie i ich neurony reagują na zewnętrzne bodźce mechaniczne za pomocą mikroprzepływowego układu chipowego z siłownikami ciśnieniowymi. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny mechanobiologii i biologii sensorycznej, takie jak to, jak komórki, tkanki i zwierzęta reagują na stymulację mechaniczną. Główną zaletą tej techniki jest to, że w nieinwazyjny sposób wystarczająco zmniejsza ruchomość robaka, aby umożliwić obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, a jednocześnie mieć dostęp do naskórka robaka w celu stymulacji mechanicznej.Metoda ta może być również wykorzystana do badania wpływu wskazówek mechanicznych na rozwój. Może być nawet stosowany do innych układów, takich jak ex vivo eksponsy narządowe lub inne zwierzęta o rozmiarach podobnych do C.Elegans. Skonfiguruj system mikroskopowy do jednoczesnego wzbudzania GCaMP i RFP.Jedną z opcji jest dyskretne źródło światła, które przepuszcza tylko światło błękitne i żółte. Do oglądania użyj obiektywu 10-krotnego i obiektywu o dużym powiększeniu. Wyślij również obraz do komputera za pomocą aparatu cyfrowego.Następnie dołącz kostkę florescencyjną i, jeśli to kon

using-microfluidics-device-for-mechanical-stimulation-high-resolution

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Ustanowiono szereg metod unieruchamiania, aby umożliwić celowe napromienianie żywych osób Caenorhabditis elegans za pomocą niedawno opracowanego ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody. To nowatorskie unieruchomienie na chipie jest również odpowiednie do obserwacji obrazowych. Wyjaśniono szczegółowe przykłady obróbki i zastosowania chipa.

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.

Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metodę stymulacji mechanicznej i obrazowania neuronów C. elegans za pomocą mikroprzepływowego układu pułapkowego. Technika umożliwia nieinwazyjną imobilizację nicieni i precyzyjną analizę odpowiedzi neuronalnych na bodźce mechaniczne w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów