Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem tej techniki jest zmierzenie, w jaki sposób nicienie i ich neurony reagują na zewnętrzne bodźce mechaniczne za pomocą mikroprzepływowego układu chipowego z siłownikami ciśnieniowymi. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny mechanobiologii i biologii sensorycznej, takie jak to, jak komórki, tkanki i zwierzęta reagują na stymulację mechaniczną. Główną zaletą tej techniki jest to, że w nieinwazyjny sposób wystarczająco zmniejsza ruchomość robaka, aby umożliwić obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, a jednocześnie mieć dostęp do naskórka robaka w celu stymulacji mechanicznej.

Metoda ta może być również wykorzystana do badania wpływu wskazówek mechanicznych na rozwój. Może być nawet stosowany do innych układów, takich jak ex vivo eksponsy narządowe lub inne zwierzęta o rozmiarach podobnych do C.Elegans. Skonfiguruj system mikroskopowy do jednoczesnego wzbudzania GCaMP i RFP.

Jedną z opcji jest dyskretne źródło światła, które przepuszcza tylko światło błękitne i żółte. Do oglądania użyj obiektywu 10-krotnego i obiektywu o dużym powiększeniu. Wyślij również obraz do komputera za pomocą aparatu cyfrowego.

Następnie dołącz kostkę florescencyjną i, jeśli to konieczne, filtr wzbudzenia. Dodaj do sześcianu lustro dichroiczne, które odbija światło cyjanowe i żółte oraz przepuszcza światło zielone i czerwone. Ustaw rozdzielacz wiązki z długoprzepustowym zwierciadłem dichroicznym z odcięciem na 570 nanometrach.

Należy również zapewnić filtr pasmowo-przepustowy dla zielonego światła o długości 525 nanometrów i szerokości 50 nanometrów oraz filtr emisji pasmowo-przepustowej dla światła czerwonego o długości 632 nanometrów i szerokości 60 nanometrów. Rzuć obie wiązki na pole widzenia kamery. Upewnij się, że zielona część jest wyświetlana na górnej połowie ekranu, a czerwona na dole.

Zawsze używaj chipów mikroprzepływowych, które mają mniej niż jeden miesiąc. W celu konfiguracji najpierw załaduj zbiornik przepływu grawitacyjnego filtrowanym M9. Umieść zbiornik około 60 centymetrów nad chipem i podłącz go do wylotu chipa. Następnie podłącz drugi wylot do pojemnika na odpady z dwoma wejściami, a drugie wejście podłącz do pojemnika na odpady do pompy perystaltycznej.

Wykonaj wszystkie połączenia za pomocą rurek polietylenowych. Następnie zmontuj interkonektory, 50-milimetrowe długości przewodów z metalowymi łącznikami rurek na obu końcach. Pasuje na wcisk i łączy się na każdym z sześciu palców uruchamiających oraz we wlocie ślimaka.

Teraz umieść chip pod optyką. Pamiętaj, aby pozostawić interkonekty podłączone do chipa, ponieważ PDMS szybko się zużyje przy powtarzających się manipulacjach. Istotne jest, aby siłownik PDMS i rurka łącząca chip ze zbiornikiem powietrza były odpowiednio uszczelnione, aby zapewnić dobre chromatyczne uruchamianie membrany.

Przed załadowaniem zwierząt sprawdź, czy nie ma utraty ciśnienia w chipie mikroprzepływowym. Zmierz ugięcie membrany, wykonując kilka cykli uruchamiania przy żądanym ciśnieniu. Następnie porównaj wartości ilościowe z przewidywaniami teoretycznymi.

Jeśli zmierzone wartości nie są zgodne z oczekiwaniami, sprawdź, czy nie ma wycieków w przewodach lub złączach przewodów. PDMS może mieć również różną elastyczność ze względu na alternatywny stosunek polimeru bazowego i utwardzacza lub masa PD może być stara i nadmiernie usieciowana. Przygotowali C.elegans zsynchronizowane wiekowo z młodymi dorosłymi lub dorosłymi w pierwszym dniu, zgodnie z opisem Porta-de-la-Riva i spółki w ich publikacji Jove z 2012 roku.

Teraz wybierz od dwóch do pięciu młodych dorosłych lub jednodniowych hermafrodytów. Wybór zwierząt o odpowiedniej wielkości ma kluczowe znaczenie. Małe zwierzęta nie zostaną uwięzione w kanale, a zbyt duże zwierzęta będą trudne do usunięcia i mogą zatkać urządzenie.

Wyciągnij zebrane robaki do kropli przefiltrowanego M9. Następnie wciągnij je do rurki za pomocą jednomililitrowej strzykawki, nie wciągając ich do samego korpusu strzykawki. Następnie podłącz rurkę do interkonektu na wlocie ślimakowym chipa. Następnie aktywuj przepływ grawitacyjny, otwierając zawór do zbiornika i uruchamiając pompę.

Teraz obserwuj kanał pułapki przy czterokrotnym powiększeniu i delikatnie wepchnij zwierzęta do urządzenia. Po załadowaniu zwierząt do komory poczekalni, za pomocą tłoka delikatnie przekierować jedno z nich na przód kanału pułapkowego, tak aby jego głowa weszła w zwężający się kształt kanału. Jeśli robak nie wypełnia całego przekroju kanału od nosa do prawie końca ciała, usuń robaka.

Wiele razy robaki, które są zbyt małe, przejdą prosto przez chip, nie zostając uwięzionymi. Jeśli zwierzę, które zostało złapane w kanał pułapki, musi zostać usunięte, po prostu naciśnij tłok strzykawki, aż robak zniknie z kanału, a następnie załaduj nowego robaka. Po prawidłowym załadowaniu robaka przełącz się w tryb fluorescencji i zwiększ powiększenie.

Aby zapobiec nasyceniu, należy dostosować intensywność wzbudzenia w zależności od intensywności kwitnienia. Sprawdź, czy neuryt interesującego neuronu leży w poprzek membrany jednego z siłowników. Ten siłownik musi być również wysunięty do przodu ciała komórkowego neuronu.

Jeśli nie, wyreguluj pozycję zwierzęcia, ciągnąc lub naciskając tłok. Jeśli to nie pomoże, usuń robaka i załaduj nowy. Ponadto, jeśli zdarzy się, że wokół neuronu wystąpi autofluorescencja, wymień robaka.

Po prawidłowym załadowaniu robaka skup się na ciele komórki neuronu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie określ, który siłownik znajduje się po przedniej stronie i podłącz ten siłownik do programowalnej pompy ciśnieniowej za pomocą odpowiedniego interkonektora. Jeśli eksperyment wymaga zmierzenia odległości między siłownikiem a neuronem, dopasuj oba do pola widzenia ze ścianą kanału równoległą do górnej i dolnej krawędzi obrazu. Następnie zdefiniuj protokół ciśnienia za pomocą programowalnej pompy ciśnieniowej.

Zawsze zaczynaj od zrobienia co najmniej 50 zdjęć w temperaturze zero kilopaskalów, aby zdefiniować linię bazową. Następnie zaprogramuj przebieg bodźca i ciśnienie. Teraz uruchom protokół obrazowania i ciśnienia.

Podczas nagrywania interesujący nas neuron musi znajdować się w najjaśniejszym punkcie w obszarze o powierzchni 10 pikseli kwadratowych. Nie może przesunąć się o więcej niż 10 pikseli na dwóch kolejnych obrazach i musi pozostać w polu widzenia. Podczas nagrywania można zaobserwować zmiany intensywności kwitnienia, gdy zmienia się ciśnienie i siłowniki.

Wskazuje to na udaną stymulację neuronów. Pomiędzy bodźcami uwzględnij 10 sekund przy stałym ciśnieniu zero kilopaskala. Możliwe jest jednoczesne nagrywanie sygnałów z wielu neuronów w polu widzenia, o ile są one oddalone od siebie o co najmniej 10 pikseli podczas całego nagrania.

Aby zachować robaki do dalszych badań, odłącz wyloty chipa w kierunku przepływu grawitacyjnego i pojemnika na odpady. Następnie delikatnie naciśnij tłok, aż cały robak zostanie wepchnięty przez kanał pułapkowy do kanału przepływowego i kontynuuj naciskanie tłoka, aż zwierzę pojawi się w postaci kropli na zewnątrz chipa. Teraz odłączyć strzykawkę od rurki i zassać robaka z kropli na płytkę agarową.

Aby usunąć i poświęcić robaka w kanale, naciśnij tłok, aż cały robak zostanie wepchnięty przez kanał pułapkowy i do kanału przepływowego. Następnie robak wypłynie z chipa i trafi do pojemnika na odpady. Po ustawieniu chipa mikroprzepływowego przetestowano ugięcie membrany.

Zmierzone wartości były powtarzalne z niewielkimi odchyleniami nieprzekraczającymi jednego mikrona przy ciśnieniu 450 kilopaskalów. Po włożeniu robaków do wlotu chipa, skóra pojedynczego zwierzęcia znajdującego się wewnątrz kanału pułapkowego została zaprezentowana sześciu siłownikom. Dzięki takiej konstrukcji neuron PLM zwykle nie może być całkowicie unieruchomiony, więc może swobodnie poruszać się na boki i w pionie.

Chociaż możliwa jest skuteczna aktywacja neuronów PLM, rejestrowanie z nich stanów przejściowych wapnia jest trudne ze względu na ruch ogona. Po umieszczeniu zwierzęcia na miejscu stymulowano za pomocą jednego z sześciu siłowników ustawionych tak, aby dostarczać bodźce mechaniczne do każdego z sześciu TRN. Zaprezentowano jeden z trzech różnych bodźców dwusekundowych.

Zatrzymanie na poziomie 275 kilopaskalów, rampa do 275 kilopaskali lub brzęczenie składające się z 75-kilopaskalowego 10-hercowego sinusa nałożonego na 275-kilopaskalowy krok. 10-sekundowe przerwy bez ciśnienia oddzielały bodźce. Rampy ciśnienia i kroki nacisku aktywowały TRN tylko wtedy, gdy bodźce osiągały ciśnienie powyżej 400 kilopaskal, podczas gdy bodźce brzęczące silnie aktywowały wszystkie TRN.

Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu minut na robaka. Należy pamiętać, że słabe uszczelnienie między chipem a szkiełkiem nakrywkowym lub między chipem a interkonektorami spowoduje wyciek i awarię urządzenia. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie napięciowe lub ukierunkowane dostarczanie bodźców mechanicznych do różnych neuronów, w celu scharakteryzowania odpowiedzi mechanicznej nocyceptorów.

Ponadto, ponieważ zwierzęta mogą zostać odzyskane po tej procedurze, technika ta może być wykorzystana do badań przesiewowych w kierunku mutantów z wadami w reakcji na bodźce mechaniczne. Nie zapominaj, że praca ze sprężonymi gazami i chemikaliami może być bardzo niebezpieczna. Podejmij środki ostrożności, takie jak noszenie osobistej odzieży ochronnej i praca w wyciągach, gdy jest to konieczne, aby uniknąć tych zagrożeń.