Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie znakowania ImmunoGold w celu określenia ultrastrukturalnej lokalizacji białek synaptycznych w neuronach parametalicznych CA one hipokampa szczura. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie CA jednego regionu plasterka organotypowego, przycięcie górnego rogu, aby zapamiętać prawidłową orientację i inkubację go w utrwalaczu wolnym od osmu na lodzie. Drugim krokiem jest odwodnienie utrwalonej tkanki i pozostawienie jej stwardnienia poprzez naciekanie jej żywicą.

Następnie z tkanek zatopionych w żywicy wycinane są ultracienkie odcinki i umieszczane na siatkach niklowych. Ostatnim krokiem jest wykonanie immunohistochemii na tkankach przekroju. Ostatecznie immunomikroskopia elektronowa służy do określenia lokalizacji białek w synapsie. Porządku.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie plastyczności synaptycznej, takie jak to, w jaki sposób lokalizacje białek w kolcach dendrytycznych mogą pomóc w zrozumieniu ich roli w funkcjonowaniu synapty. Chociaż metoda ta jest zoptymalizowana pod kątem organotypowych wycinków hipokampa, może być również niezwykle cenna w przypadku innych preparatów neuronalnych, w tym ostrych wycinków mózgu i pierwotnych kultur neuronalnych. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia organotypowego wycinka hipokampa na polistyrenowej szalce Petriego zawierającej świeży, lodowaty bufor fosforanowy Sorensena.

Dodaj dodatkowy jeden do dwóch mililitrów lodowatego buforu bezpośrednio na plasterki. Aby wyizolować podpole CA one, użyj jednorazowego skalpela, aby delikatnie przeciąć plasterek obok zakrętu zębatego, który jest równoległy do warstwy CA one cell. Następnie pokrój pozostały plasterek pionowo, aby usunąć subpole CA three i sulu.

Następnie odetnij róg CA o jeden plasterek, aby pomóc zidentyfikować górną powierzchnię tkanki i ostrożnie usuń tkankę z błony za pomocą tylnej strony skalpela. Delikatnie przenieść tkankę na 12-dołkową płytkę zawierającą lodowaty bufor Sorensena. Usunąć bufor i dodać 0,5 do jednego mililitra lodowatego utrwalacza o pH 7,3 rozcieńczonego w buforze Sorensena, tak aby odpowiednio pokrył próbkę.

Następnie inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji wyjąć utrwalacz ze studzienki i umyć próbki trzy razy przez 20 minut w lodowatym buforze Sorensena. Następnie inkubować próbkę w 1% masy kwasu garbnikowego na objętość w 0,1 molowym buforze jabłczanu o pH 6,0.

Po 40 minutach spłukać kwas garbnikowy, przemłukując próbkę dwukrotnie przez 20 minut w buforze jabłczanowym. Następnie inkubuj próbkę przez 40 minut w 1% octanie pisuaru w buforze jabłczanowym octan ustuaru jest wrażliwy na światło i radioaktywny. Dlatego należy obchodzić się z próbką ostrożnie i podczas inkubacji umieścić ją w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji przepłukać próbki dwukrotnie przez 20 minut każda w lodowatym buforze jabłczanowym, a następnie inkubować przez 20 minut w 0,5% chlorku platyny w buforze dla więźniów. Na koniec spłucz resztki chlorku platyny, myjąc dwukrotnie przez 20 minut. Każdy bufor osadzony przechowuje próbki w buforze jabłczanowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będą gotowe do dalszego przetwarzania.

Aby rozpocząć immunohistochemię, utrwalone regiony CA one są najpierw odwadniane żywicą zatapianą i cięte w celu uzyskania ultracienkich odcinków 60 nanometrów na siatkach niklowych, jak opisano w protokole tekstowym dla tego filmu. Następnie umieść kroplę 1% buforu fosforanowego 20 o pH 7,5 na kawałku czystej paraformy. Następnie delikatnie podnieś siatkę czystymi kleszczami i spławij ją na buforze sekcją skierowaną w dół, inkubuj w ten sposób przez 10 minut w temperaturze pokojowej po inkubacji, spuść nadmiar płynu z siatki, kładąc sekcję stroną do góry na bibule filtracyjnej.

Usuń również roztwór uwięziony między ramionami kleszczyków EM, delikatnie odprowadzając go kawałkiem bibuły filtracyjnej, upewniając się, że sekcje nie wyschną całkowicie. Następnie umieść kroplę 50 milimolowej glicyny na folii para i unieś część siatki stroną do dołu na roztworze glicyny w temperaturze pokojowej. Podczas gdy próbka inkubuje się przez 15 minut, dodać 2,5% surowicy od zwierzęcia przeciwciała drugorzędowego do 2,5% roztworu BSA i umieścić kroplę tej mieszaniny na folii para.

Po 15 minutach inkubacji osuszyć siatkę bibułą filtracyjną i unosić się na roztworze blokującym przez 30 minut. W temperaturze pokojowej przygotuj komorę inkubacyjną, umieszczając zwinięte chusteczki Kim wzdłuż wnętrza czystej plastikowej szalki Petriego. Umieść kawałek czystego parametru na środku szalki Petriego, a następnie dodaj przefiltrowaną wodę do chusteczek Kim.

Następnie umieść kroplę roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na paraformie i umieść na niej próbkę w temperaturze pokojowej lub na noc W temperaturze czterech stopni Celsjusza należy eksperymentalnie określić optymalny czas i temperaturę inkubacji, a także stężenie przeciwciał. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przemyć siatkę trzy razy przez dwie minuty za pomocą 1% buforu fosforanowego 20. Następnie inkubuj z przeciwciałem drugorzędowym, używając od jednego do 20 przeciwciał anty króliczych lub anty-amerykańskich, sprzężonych z 10 nanometrowym złotem po jednej godzinie.

W temperaturze pokojowej myć trzy razy przez dwie minuty za pomocą 1% buforu fosforanowego 20. Następnie umieść próbkę w buforowanym 2% aldehydzie glutarowym przez pięć minut. Usunąć nadmiar aldehydu gluarowego, spłukując trzykrotnie 1% buforem fosforanowym o stężeniu 1%, 20 fosforanów, a następnie trzykrotnie przefiltrowaną wodą, za każdym razem przez dwie minuty.

Po wypłukaniu inkubować siatkę w 2% octanie pisuaru przez 10 minut. Podczas inkubacji przygotuj komorę wolną od CO2, umieszczając kawałek paraformy na środku szklanej szalki Petriego. Następnie umieść od 10 do 15 granulek wodorotlenku sodu w naczyniu wokół paraformy, aby wchłonąć CO2 z powietrza.

Trzymaj górę zamkniętą przez kilka minut. Następnie użyj pipety pastwiskowej i szybko przenieś niewielką objętość świeżo przygotowanego roztworu cytrynianu ołowiu Reynoldsa do paraformy. Otwórz górną część na tyle, aby włożyć pipetę pastwiskową, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie CO2 do komory.

W trzech małych zlewkach przygotuj ciepłą, świeżo przegotowaną wodę dejonizowaną, zmyj octan pisuaru, zanurzając kratkę w pierwszym dziobie i delikatnie obracaj nią przez 30 sekund. Powtórz ten krok w pozostałych dwóch zlewkach. Po wypłukaniu otwórz górną część szklanej szalki Petriego na tyle, aby umieścić siatkę na kropli roztworu cytrynianu ołowiu Reynoldsa.

Jeśli to możliwe, noś przy tym maskę, aby uniknąć wdychania cytrynianu ołowiu i zapobiec tworzeniu się osadu. Po 10 minutach lekko otwórz górną część i zdejmij siatkę. Umyj go trzy razy, zanurzając go kolejno w trzech świeżych zlewkach z ciepłą wodą destylowaną.

Następnie pozwól siatce wyschnąć na kawałku bibuły filtracyjnej do góry. Próbka jest teraz gotowa do oglądania za pomocą mikroskopu elektronowego, ultracienkie skrawki tkanki około jednego obszaru hipokampa, pokazane tutaj jako transmisyjny mikrograf elektronowy, zawierają łatwo rozróżnialne dendryty i kolce neuronów parametalicznych. Identyfikacja asymetrycznych synaps między zakończeniem aksonalnym oznaczonym literą T a kolcami dendrytycznymi oznaczonymi literą S jest ułatwiona dzięki obecności gęstości postsynaptycznej i dobrze zdefiniowanej błony plazmatycznej.

Rozkład neuro Grandin w kolcach dendrytycznych można zobaczyć za pomocą znakowania ImmunoGold EM i jest podkreślony na tych obrazach TEM za pomocą strzałek. Odległość promieniową neuro grandin od środka kręgosłupa do błony plazmatycznej kręgosłupa można zmierzyć jako znormalizowaną odległość promieniową. Odległość równa zero odpowiada cząstce leżącej na membranie, a wartość odległości jeden reprezentuje cząstkę znajdującą się w środku kręgosłupa.

Odległość neuro grandina od kolca dendrytycznego można wtedy przedstawić graficznie. Tutaj jego rozkład jako znormalizowana odległość radialna jest pokazany na niebiesko, a w porównaniu z rozkładem losowym pokazanym na różowo, ten wykres pokazuje, że neuro Grandin znajduje się blisko błony komórkowej. Technika ta utorowała drogę naukowcom badającym układ nerwowy do zbadania lokalizacji i dystrybucji receptorów, białek oddziałujących z receptorami, transporterów i kanałów jonowych oraz wielu innych w różnych tkankach mózgowych, w tym w korze mózgowej, wzgórzu, opuszki węchowej i móżdżku.

Nie zapominaj, że praca z utrwalaczami może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego oraz obchodzenie się z utrwalaczami w kapturze folii, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.