Name: Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Poznaj metodę znakowania ImmunoGold do lokalizacji białek synaptycznych w neuronach hipokampa szczura przy użyciu mikroskopii elektronowej. Technika ta zachowuje integralność strukturalną i antygenowość tkanek OUN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Matthew Florence'owi za przygotowanie kultur w warstwach hipokampa. Prace te były wspierane przez granty z amerykańskiego Narodowego Instytutu Starzenia się i Stowarzyszenia Alzheimera dla NZG.

1. Fiksacja
Utrwalacze są rakotwórcze; noś rękawiczki i trzymaj je w dygestoriach. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie inkubacje przeprowadza się na lodzie, a wszystkie roztwory należy przefiltrować przed użyciem. Używaj odczynników klasy mikroskopii elektronowej.
Dzień 1
<ol>
	<li class="jove_content">Po warunkach eksperymentalnych (np. wstrzyknięcie wirusa, leczenie farmakologiczne), umieść membranę z organotypowymi plastrami hipokampa na polistyrenowej szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm zawierającej lodowaty bufor fosforanowy 0,1 M (bufor fosforanowy Sorensena), pH 7,3. Dodaj 1 - 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego bezpośrednio na plastry, aby były zimne.</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: Zawsze używaj świeżo przygotowanych i utrwalaczy. Upewnij się, że pH buforu mieści się w pożądanym zakresie. Niezastosowanie się do tego może spowodować uszkodzenie struktur komórkowych.
<ol start="2">
	<li>Aby wyizolować podpole CA1 wycinka, użyj jednorazowego skalpela, aby delikatnie przeciąć plasterek obok DG, równolegle do warstwy komórek CA1 (Rysunek 1). Następnie wytnij pozostały plasterek pionowo, aby usunąć subpole CA3 i subiculum. Wytnij róg plasterka, aby pomóc zidentyfikować górną powierzchnię tkanki.</li>
</ol>
UWAGA: W przypadku, gdy nie jest wymagane dostarczenie interesującego nas białka wirusa, cały wycinek tkanki można naprawić po usunięciu podłoża za pomocą delikatnego płukania lodowatego buforu. Następnie następuje wycięcie CA1.
KRYTYCZNY KROK: Śledź górną część tkanki, aby później prawidłowo podzielić siatki.
<ol start="3">
	<li>Ostrożnie usuń tkankę z błony za pomocą tylnej strony skalpela. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie przenieś tkankę na 12-dołkową płytkę zawierającą 0,1 M bufor fosforanowy.</li>
	<li>Usunąć bufor z płytki i dodać 500 μl - 1 ml lodowatego utrwalacza (pH 7,3) składającego się z następujących składników: 0,1% kwasu pikrynowego, 1% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
UWAGA: Kwas pikrynowy może być wybuchowy po wyschnięciu. Przechowywać go zwilżonego wodą w szczelnie zamkniętym pojemniku. Przechowywać w suchym i dobrze wentylowanym miejscu.
<ol start="5">
	<li>Wyjąć utrwalacz ze studzienki i przemyć próbki 3 razy (po 20 minut każda) w 0,1 M buforze fosforanowym.</li>
	<li>Inkubować przez 40 minut w 1% kwasie garbnikowym (w/v) w 0,1 M buforze maleinianu o pH 6,0.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie (po 20 minut) w buforze maleinianowym.</li>
	<li>Inkubować przez 40 minut w 1% octanie uranylu (w/v) w buforze maleinianu w ciemności. Octan uranylu jest wrażliwy na światło i jest radioaktywny. Po rozpuszczeniu przykryć zlewkę preparatem Parafilm i przechowywać niewykorzystany bufor w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie (po 20 minut) w buforze maleinianowym.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w 0,5% chlorku platyny (w/v) w buforze maleinianu.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie (po 20 minut) w buforze maleinianowym. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
2. Odwodnienie i osadzanie
Tlenek propylenu jest rakotwórczy. Unikaj oparów, pracując z nim w dygestorium. Używaj absolutnego, w 100% czystego etanolu, który nie zawiera śladu wody. Rozcieńczyć ten absolutny etanol, aby uzyskać różne stężenia do odwodnienia.
Dzień 2
<ol>
	<li>Inkubować przez 5 minut w 50% etanolu, a następnie przez 5 minut w 70% etanolu.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w świeżo przygotowanej 1% p-fenylenodiaminie (PPD) w 70% etanolu. </li>
	<li>Spłucz trzy razy w 70% etanolu.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w 80% etanolu, a następnie przez 5 minut w 95% etanolu.</li>
	<li>Inkubować w 100% etanolu dwa razy po 5 minut.</li>
	<li>Przygotować szklane fiolki z zakrętkami i upewnić się, że są czyste i całkowicie suche. Przenieść plastry do szklanych fiolek i oznaczyć każdą fiolkę w prosty i wyraźny sposób.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w stosunku 1:1 etanol:tlenek propylenu.</li>
	<li>Inkubować w 100% tlenku propylenu dwa razy po 5 minut.</li>
	<li>Dodaj żywicę (Epon) do każdej fiolki, aby uzyskać mieszaninę 1:1 z tlenkiem propylenu. Delikatnie mieszaj przez 2 godziny. Nie należy potrząsać fiolkami zbyt rygorystycznie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które mogłyby przeszkadzać w zatapianiu.</li>
	<li>Dodaj żywicę, aby uzyskać mieszaninę 3:1 z tlenkiem propylenu i mieszaj przez 2 godziny.</li>
	<li>Przenieś do 100% żywicy i inkubuj O/N.</li>
</ol>
Dzień 3
<ol start="12">
	<li>Próbki warstwowe umieszcza się między paskami tworzywa sztucznego ACLAR i utwardza przez 24 godziny w temperaturze 60 °C.</li>
</ol>
3. Podział i montaż na rusztach
Dzień 4
<ol>
	<li>Wytnij półcienkie (0,5 μm) odcinki i zabarwij 1% błękitu toluidynowego + 1% boraksu, aby określić prawidłową orientację próbek.</li>
	<li>Wytnij ultracienkie odcinki (60 nm) i zamontuj na rusztach niklowych, po jednej sekcji na siatkę.</li>
</ol>
4. Immunohistochemia
Wszystkie i woda powinny być przefiltrowane przed użyciem.
Dzień 5
<ol>
	<li>Umieść kroplę (~50 μl) 1% buforu Tween-20/fosforanowego (T/PB), pH 7,5, na kawałku czystego Parafilmu na płaskiej powierzchni. Delikatnie podnieś siatkę czystymi kleszczami za krawędź i spławiaj ją na buforze, przeciąć w dół i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spuść nadmiar cieczy z siatki, kładąc sekcję do góry na bibule filtracyjnej, a następnie unosić się na 50 mM glicyny w T/PB przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: Aby uniknąć nadmiernego 'przenoszenia' roztworów z jednej kropli roztworu na drugą podczas inkubacji, odcedź nadmiar płynu, delikatnie dotykając krawędzi siatki na bibułę filtracyjną #1 pomiędzy każdą wymianą roztworu. Usuń również wszelkie roztwory uwięzione między ramionami kleszczy EM przytrzymujących siatkę, delikatnie odprowadzając kawałkiem bibuły filtracyjnej między ramionami kleszczy, upewniając się, że sekcje nie wyschną całkowicie.
<ol start="3">
	<li>Osuszyć siatkę bibułą filtracyjną, a następnie unosić się na roztworze blokującym zawierającym 2,5% BSA i 2,5% surowicy zwierzęcia przeciwciała drugorzędowego w T / PB przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (w T/PB) w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Optymalny czas i temperatura inkubacji, a także stężenie przeciwciał muszą zostać określone doświadczalnie.</li>
	<li>Umyj kratkę trzy razy (po 2 minuty) za pomocą T/PB.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1:20 anty-króliczym lub anty-mysim sprzężonym ze złotem 10 nm) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj trzy razy (po 2 minuty) za pomocą T/PB.</li>
	<li>Postfix z 2% aldehydem glutarowym w T/PB przez 5 min.</li>
	<li>Przemyć trzy razy (po 2 minuty) preparatem T/PB, a następnie trzykrotnie (po 2 minuty) przefiltrowaną wodą.</li>
	<li>Inkubować z 2% octanem uranylu w wodzie przez 10 minut.</li>
</ol>
Podczas barwienia siatki, przygotuj komorę wolną odCO2, umieszczając kawałek Parafilmu na środku szklanej szalki Petriego. Następnie umieść 4-6 granulek NaOH w naczyniu wokół Parafilmu, aby wchłonąć CO2 z powietrza. Trzymaj górę zamkniętą przez kilka minut. Użyj pipety Pasteura i szybko przenieś niewielką objętość roztworu cytrynianu ołowiu Reynoldsa do Parafilmu na szklanej szalce Petriego. Otwórz górną część na tyle, aby włożyć pipetę Pasteura, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie CO2 do komory.
UWAGA: Aby przygotować roztwór cytrynianu ołowiu Reynoldsa, zagotuj 100 ml dejonizowanej wody w kuchence mikrofalowej i pozwól mu ostygnąć w hermetycznym pojemniku. W kolbie miarowej o pojemności 50 ml z korkiem wymieszać 1,33 g azotanu ołowiu, 1,76 g cytrynianu sodu i 30 ml przegotowanej wody, energicznie wstrząsając przez 1 minutę. Następnie wstrząsaj z przerwami przez 30 minut. Do tego mętnego roztworu dodać 8 ml 1 M wodorotlenku sodu i powoli odwrócić kolbę kilka razy. Rozwiązanie stanie się jasne. Doprowadzić roztwór do 50 ml z przegotowaną wodą. Przechowywać roztwór szczelnie zamknięty. Jeśli pojawi się osad, wyrzuć i zrób nowy.
<ol start="11">
	<li>W trzech mniejszych zlewkach przygotuj ciepłą, świeżo przegotowaną wodę dejonizowaną. Zmyj octan uranylu, zanurzając siatkę w pierwszej zlewce i delikatnie obracaj nią przez 30 sekund. Powtórz ten krok w pozostałych dwóch zlewkach.</li>
	<li>Otwórz górną część szklanej szalki Petriego na tyle, aby umieścić siatkę na kropli roztworu cytrynianu ołowiu Reynoldsa. Jeśli to możliwe, noś przy tym maskę, aby uniknąć wdychania cytrynianu ołowiu i zapobiec tworzeniu się osadu. Inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Otwórz górę na tyle, aby wyjąć siatkę. Unikaj wdychania cytrynianu ołowiu. Umyj kratkę trzy razy, zanurzając ją kolejno w trzech zlewkach w ciepłej, świeżo przegotowanej wodzie destylowanej. Pozostaw siatkę do wyschnięcia na kawałku bibuły filtracyjnej, przekrój do góry. Próbka jest teraz gotowa do pracy pod mikroskopem elektronowym.</li>
</ol>

<ol><li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-+and+affinity+probes+for+electron+microscopy%3A+a+review+of+labeling+and+preparation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).</li>
<li>Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+optimize+post-embedding+single+and+double+staining+for+amino+acid+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).</li>
<li>Berryman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tannic+acid+on+antigenicity+and+membrane+contrast+in+ultrastructural+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li>
<li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li>
<li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique%3A+effects+of+processing+on+probe+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li>
<li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+osmium-free+method+of+epon+embedment+that+preserves+both+ultrastructure+and+antigenicity+for+post-embedding+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).</li>
<li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> Embo J. 28, 3027-3039 (2009).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
<li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275(2012).</li>
<li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li>
<li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li>
<li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li>
<li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li>
<li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+antigen%2C+one+gold%3F+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5%27-nucleotidase+in+frozen+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.</li>
<li>Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BImmunologic+analysis+of+families+with+complement+receptor+deficiency%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon.+Rinsho%22%5BJournal%5D)">[Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency].</a> Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).</li>
<li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces%3A+a+method+for+precise+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li>
<li>Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JR+%22Electron+Microscopy%22">Electron Microscopy</a>. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).</li>
<li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li>
<li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li>
<li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein%3A+the+%28ACTH%29-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li>
<li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+phosphoprotein+B-50%2FGAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim.+Pol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li>
<li>Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaunsbach%2C+AA+%22Biomedical+Electron+Microscopy+Illustrated+Methods+and+Interpretations%22">Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations</a>. , Academic Press. 383-426 (1999).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W tym protokole przyjęliśmy metodę Phenda i Weinberga dla tkanek mózgu i rdzenia kręgowego w celu zbadania kolców dendrytycznych w kulturach warstw hipokampa szczurów. Kolce dendrytyczne w obszarze hipokampa CA3-CA1 są delikatnymi strukturami zawierającymi szeroką gamę białek, które odgrywają ważną rolę w regulacji funkcji neuronalnych. Przedstawiona metoda zapewnia zrównoważone podejście do osiągnięcia zwiększonej antygenowości przy zachowaniu dobrego zachowania ultrastrukturalnego (ryc. 2A), co pozwala...

<table><tbody><tr><td>60 x 15 mm polistyrenowa szalka Petriego</td><td>Sokół</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel</td><td>EXELINT</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych</td><td>Milipory</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>10 nm Kozio-anty-królicze złoto</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-neurograninowe</td><td>Millipore</td><td>AB5620</td><td></td></tr><tr><td>100% Kwas pikrynowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19550</td><td></td></tr><tr><td>96% Paraformaldehyd</td><td>Acros Organics</td><td>AC41678-0030</td><td></td></tr><tr><td>25% Aldehyd glutarowy (klasa EM)</td> <td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>p-fenylenodiamina</td><td>Sigma</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>platyny (IV)Sigma</td><td>379840</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>kwasu garbnikowego</td><td>Nauki 21710</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu immunogold w kulturach warstw hipokampa

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Mikroskopia immunoelektronowa to potężne narzędzie do badania cząsteczek biologicznych na poziomie subkomórkowym. Przeciwciała sprzężone z markerami o dużej gęstości elektronów, takimi jak złoto koloidalne, mogą ujawnić lokalizację i dystrybucję określonych antygenów w różnych tkankach1. Dwie najczęściej stosowane techniki to techniki wstępnego osadzania i po osadzaniu. W technikach mikroskopii immunozłoto-elektronowej (EM) przed zatopieniem, tkanka musi być przepuszczalna, aby umożliwić penetrację przeciwciał przed jej osadzeniem. Techniki te są idealne do konserwacji struktur, ale słaba penetracja przeciwciała (często tylko pierwszych kilku mikrometrów) jest poważną wadą2. Metody znakowania po osadzeniu mogą uniknąć tego problemu, ponieważ znakowanie odbywa się na odcinkach utrwalonych tkanek, w których antygeny są łatwiej dostępne. Na przestrzeni lat szereg modyfikacji udoskonalił metody po osadzeniu w celu zwiększenia immunoreaktywności i zachowania ultrastruktury3-5.
Utrwalanie tkanek jest kluczową częścią badań EM. Utrwalacze chemicznie sieciują makrocząsteczki, aby zablokować struktury tkankowe na miejscu. Wybór utrwalacza wpływa nie tylko na zachowanie strukturalne, ale także na antygenowość i kontrast. Tetratlenek osmu (OsO4), formaldehyd i aldehyd glutarowy są od dziesięcioleci standardowymi utrwalaczami, w tym w tkankach ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które są szczególnie podatne na uszkodzenia strukturalne podczas przetwarzania chemicznego i fizycznego. Niestety, OsO4 jest wysoce reaktywny i wykazano, że maskuje antygeny6, co skutkuje słabym i niewystarczającym znakowaniem. Alternatywne podejścia do uniknięcia utrwalenia chemicznego obejmują zamrażanie tkanek. Ale te techniki są trudne do wykonania i wymagają drogiego oprzyrządowania. Aby rozwiązać niektóre z tych problemów i poprawić znakowanie tkanek OUN, Phend i wsp. zastąpił OsO4 octanem uranylu (UA) i kwasem garbnikowym (TA) oraz z powodzeniem wprowadził dodatkowe modyfikacje w celu poprawy czułości wykrywania antygenu i zachowania strukturalnego w tkankach mózgu i rdzenia kręgowego7. Zastosowaliśmy tę wolną od osmu metodę po osadzeniu w tkance mózgowej szczura i zoptymalizowaliśmy technikę znakowania immunogold w celu wykrywania i badania białek synaptycznych.
Prezentujemy tutaj metodę określania ultrastrukturalnej lokalizacji białek synaptycznych w neuronach piramidowych CA1 w hipokampie szczura. Używamy organotypowych plastrów z kultur hipokampa. Wycinki te utrzymują obwody trisynaptyczne hipokampa, a zatem są szczególnie przydatne do badania plastyczności synaptycznej, mechanizmu powszechnie uważanego za leżący u podstaw uczenia się i pamięci. Organotypowe plastry hipokampa z 5. i 6. dnia po urodzeniu mogą być przygotowane w sposób opisany wcześniej8 i są szczególnie przydatne do ostrego powalania lub nadekspresji białek egzogennych. Wcześniej używaliśmy tego protokołu do scharakteryzowania neurograniny (Ng), białka specyficznego dla neuronów, które odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji synaptycznej8,9 . Wykorzystaliśmy go również do scharakteryzowania ultrastrukturalnej lokalizacji kalmoduliny (CaM) i kinazy białkowej II zależnej od Ca2 + / CaM (CaMKII)10. Jak pokazano w wynikach, protokół ten pozwala na dobre zachowanie ultrastrukturalne kolców dendrytycznych i skuteczne znakowanie Ng w celu scharakteryzowania jego rozmieszczenia w kręgosłupie8. Co więcej, opisana tutaj procedura może mieć szerokie zastosowanie w badaniu wielu innych białek zaangażowanych w funkcje neuronalne.

Rysunek 2B przedstawia przykład rozmieszczenia endogennych cząsteczek Ng w kolcach dendrytycznych neuronów piramidowych obszaru CA1 hipokampa. Siatki niklowe z ultracienkimi (60 nm) skrawkami tkanek zawierającymi obszar CA1 hipokampa (widoczne na Rysunku 2A) pokryto 1% T/PB i 50 mM glicyną, a następnie zablokowano 2,5% BSA i 2,5% serum przed inkubacją z przeciwciałem anty-Ng. Po przemyciu T/PB siatki pokryto przeciwciałem wtórnym anty-króliczym sprzężonym z 10 nm złotem. Na koniec siatki...

Lokalizacja i dystrybucja białek dostarcza ważnych informacji dla zrozumienia ich funkcji komórkowych. Doskonała rozdzielczość przestrzenna mikroskopii elektronowej (EM) może być wykorzystana do określenia subkomórkowej lokalizacji danego antygenu po immunohistochemii. W przypadku tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zachowanie integralności strukturalnej przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości było szczególnie trudne w badaniach EM. Tutaj przyjmujemy procedurę, która została zastosowana do zachowania struktur i antygenów w OUN w celu zbadania i scharakteryzowania białek synaptycznych w neuronach piramidowych CA1 hipokampa szczura.

Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie znakowania ImmunoGold w celu określenia ultrastrukturalnej lokalizacji białek synaptycznych w neuronach piramidalnych obszaru CA1 hipokampa szczura. Osiąga się to poprzez najpierw wycięcie obszaru CA1 z plastra organotypowego, przycięcie górnego narożnika w celu zachowania prawidłowej orientacji oraz inkubację w utrwalaczu bez zawartości osmu w warunkach chłodniczych. Drugim krokiem jest odwodnienie utrwalonej tkanki i umożliwienie jej stwardnienia poprzez infiltrację żywicą.Następnie z tkanek zatopionych w żywicy wycina się ultrazcieńkie przekroje i nanosi je na siatki niklowe. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie immunohistochemii na przekrojach tkanek. W końcowym etapie wykorzystuje się immuno-mikroskopię elektronową do określenia lokalizacji białek w synapsie.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu plastyczności synaptycznej, takie jak wpływ lokalizacji białek w kolcach dendrytycznych na zrozumienie ich roli w funkcji synaptycznej. Chociaż metoda ta jest zoptymalizowana dla organotypowych skrawków hipokampa, może być ona również niezwykle cenna dla innych preparatów neuronalnych, w tym dla świeżych skrawków mózgu i pierwotnych kultur neuronów. Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia organotypowego skrawka hipokampa w polistyrenowej szalce Petri zawierającej świeży, lodowaty bufor fosforanowy Sorensena.Dodaj dodatkowe 1–2 ml lodowatego buforu bezpośrednio na plastry. Aby wyizolować podpole CA1 plastra, użyj jednorazowego skalpela, aby delikatnie przeciąć plaster obok zakrętu zębatego, równolegle do warstwy komórek CA1. Następnie przetnij pozostałą część plastra pionowo, aby usunąć podpole CA3 oraz sulu.Następnie naciąć róg jednej warstwy CA, aby ułatwić identyfikację górnej powierzchni tkanki, a następnie ostrożnie oddzielić tkankę od membrany, używając grzbietu skalpela. Delikatnie przenieść tkankę do płytki 12-dołkowej zawierającej lodowaty bufor Sorensena. Odlać bufor i dodać od 0,5 do 1 ml lodowatego utrwalacza o pH 7,3 rozcieńczonego w buforze Sorensena, tak aby całkowicie przykrył próbkę.Następnie inkubować przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Po inkubacji usunąć utrwalacz z dołka i przemyć próbki trzykrotnie przez 20 minut w lodowatym buforze Sorensena. Następnie inkubować próbkę w 1% (m/v) kwasie taninowym w 0,1 M buforze malonianowym o pH 6,0.Po 40 minutach wypłucz kwas taninowy, myjąc próbkę dwukrotnie przez 20 minut w buforze malonianowym. Następnie inkubuj próbkę przez 40 minut w 1% octanie uranylu w buforze malonianowym; octan uranylu jest światłoczuły i radioaktywny, dlatego należy z nim obchodzić się ostrożnie i podczas inkubacji przechowywać próbkę w ciemności w temperaturze 4 °C.Po inkubacji próbki należy dwukrotnie płukać przez 20 minut każdorazowo w lodowatym buforze malonianowym, a następnie inkubować przez 20 minut w 0,5% chlorku platyny w buforze malonianowym. Na koniec należy usunąć pozostałości chlorku platyny, płukając próbki dwukrotnie przez 20 minut w buforze malonianowym. Próbki należy przechowywać w buforze malonianowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu dalszego przetwarzania.Aby rozpocząć immunohistochemię, utrwalone regiony CA1 są najpierw odwadniane, zatapiane w żywicy i cięte w celu uzyskania ultracienkich sekcji o grubości 60 nanometrów na siatkach niklowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym do tego filmu. Następnie na czystym parafilmie należy umieścić kroplę 1% buforu fosforanowego z tween 20 o pH 7.5. Potem delikatnie chwycić siatkę czystą pęsetą i unosić ją na buforze stroną z sekcją skierowaną w dół; inkubować w ten sposób przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji należy odprowadzić nadmiar cieczy z siatki, kładąc ją stroną z sekcją do góry na papierze filtracyjnym.Należy również usunąć wszelki roztwór uwięziony między ramionami pęsety do EM, delikatnie odsączając go skrawkiem papieru filtracyjnego, dbając jednocześnie o to, aby skrawki nie wyschły całkowicie. Następnie należy nanieść kroplę 50 millimolar glycine na parafilm i umieścić siatkę stroną ze skrawkiem skierowaną w dół na roztworze glycine w temperaturze pokojowej. Podczas 15-minutowej inkubacji próbki, należy dodać 2,5% serum zwierzęcia, z którego pochodzi przeciwciało wtórne, do 2,5% roztworu BSA, a następnie nanieść kroplę tej mieszaniny na parafilm.Po 15-minutowej inkubacji osuszyć siatkę papierem filtrowanym i pozostawić na powierzchni roztworu blokującego na 30 minut. W temperaturze pokojowej przygotować komorę inkubacyjną, układając zwinięte chusteczki Kim wipes wzdłuż wewnętrznej krawędzi czystej plastikowej szalki Petriego. Umieścić kawałek czystego parafilmu w centrum szalki Petriego, a następnie dodać przefiltrowaną wodę do chusteczek Kim wipes.Następnie nanieś kroplę roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na parafilm i umieść na niej próbkę w temperaturze pokojowej lub pozostaw ją przez noc w temperaturze 4 °C; optymalny czas i temperatura inkubacji, a także stężenie przeciwciał muszą zostać określone eksperymentalnie. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przemyj siatkę trzy razy po dwie minuty buforem fosforanowym z dodatkiem 1% Tween 20. Następnie inkubuj przez jedną godzinę z przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu od 1:10 do 1:20 (anty-króliczym lub anty-USA), sprzężonym z 10 nm złotem.W temperaturze pokojowej trzy razy przemyć próbkę buforem fosforanowym z 1% tween 20, każdorazowo przez dwie minuty. Następnie przeprowadzić postfiksację próbki w 2% glutaraldehydzie buforowanym przez pięć minut. Nadmiar glutaraldehydu usunąć, płucząc trzy razy buforem fosforanowym z 1% tween 20, a następnie trzy razy wodą filtrowaną, każdorazowo przez dwie minuty.Po wypłukaniu inkubuj siatkę w 2% octanie uranylowym przez 10 minut. Podczas inkubacji przygotuj komorę wolną od CO2, umieszczając kawałek paraformy w centrum szklanej szalki Petriego. Następnie umieść w szalce wokół paraformy od 10 do 15 granulek wodorotlenku sodu, aby pochłonęły CO2 z powietrza.Pozostaw górną część zamkniętą przez kilka minut. Następnie, używając pipety Pasteura, szybko przenieś niewielką objętość świeżo przygotowanego roztworu cytrynianu ołowiu Reynoldsa na paraformę. Otwórz górną część tylko na tyle, aby włożyć pipetę Pasteura, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie CO2 do komory.W trzech małych zlewkach przygotować ciepłą, świeżo przegotowaną wodę dejonizowaną; wypłukać octan z moczu, zanurzając siatkę w pierwszej zlewce i delikatnie nią obracając przez 30 sekund. Powtórzyć ten krok w dwóch pozostałych zlewkach. Po wypłukaniu uchylić pokrywę szklanej szalki Petriego na tyle, aby móc położyć siatkę na kropli roztworu cytrynianu ołowiu według metody Reynoldsa.Jeśli to możliwe, podczas wykonywania tej czynności należy założyć maseczkę, aby uniknąć oddychania nad cytrynianem ołowiu i zapobiec powstaniu osadu. Po 10 minutach należy lekko uchylić pokrywkę i wyjąć siatkę. Wymyć ją trzykrotnie, zanurzając ją kolejno w trzech świeżych zlewkach z ciepłą wodą destylowaną.Następnie należy pozostawić siatkę do wyschnięcia na fragmencie papieru filtrowanego, stroną z preparatem skierowaną do góry. Próbka jest teraz gotowa do obserwacji pod mikroskopem elektronowym. Ultrabieka pręża tkanki z obszaru CA1 hipokampa, przedstawione tutaj na mikrografii elektronowej transmisyjnej, zawierają łatwo rozróżnialne dendryty i kolce neuronów piramidowych. Identyfikację synaps asymetrycznych pomiędzy zakończeniem aksonalnym oznaczonym literą T a kolcami dendrytycznymi oznaczonymi literą S ułatwia obecność gęstości postsynaptycznej oraz wyraźnie zarysowanej błony plazmatycznej.Rozmieszczenie neurograndiny w kolcach dendrytycznych można zobrazować za pomocą znakowania ImmunoGold EM, co zostało podkreślone strzałkami na tych obrazach TEM. Odległość radialna neurograndiny od centrum kolca do jego błony plazmatycznej może być mierzona jako znormalizowana odległość radialna. Odległość równa zero odpowiada cząsteczce znajdującej się na błonie, natomiast wartość odległości równa jeden reprezentuje cząsteczkę w centrum kolca.Odległość neurograndyny od kolca dendrytycznego można następnie przedstawić graficznie. Tutaj jej rozkład jako znormalizowanej odległości radialnej pokazano na niebiesko i porównano z rozkładem losowym przedstawionym na różowo; wykres ten wskazuje, że neurograndyna znajduje się blisko błony plazmatycznej. Technika ta utorowała drogę badaczom układu nerwowego do analizy lokalizacji i rozkładu receptorów, białek oddziałujących z receptorami, transporterów, kanałów jonowych i wielu innych w różnych tkankach mózgu, w tym w korze, wzgórzu, opuszce węchowej i móżdżku.Należy pamiętać, że praca z utrwalaczami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego oraz obchodzenie się z utrwalaczami w dygestorium.

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Immunogoldowe znakowanie po osadzania białek synaptycznych w kulturach tkaniczki hipokampu

Ten film pokazuje procedurę barwienia utrwalonych wycinków mózgu szczura zawierających interneurony wypełnione biocytyną. Protokół obejmuje inkubację z kompleksem awidyny-biotyny (ABC), barwienie za pomocą HRP i substratu chromogennego, konserwację struktur tetratlenkiem osmu i zatopienie tkanki w żywicy w celu obrazowania.

Znakowanie interneuronów wypełnionych biocytyną w wycinkach hipokampa szczurów w celu wizualizacji

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Udostępniamy szczegółowy protokół indukcji długotrwałego wzmocnienia w regionie CA1 hipokampa i późniejszej izolacji frakcji wzbogaconych jądrowo z obszaru tetanizowanego wycinka. Podejście to można wykorzystać do określenia zależnego od aktywności importu białek jądrowych w komórkowych modelach uczenia się i pamięci.

Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Poznaj metodę znakowania ImmunoGold do lokalizacji białek synaptycznych w neuronach hipokampa szczura przy użyciu mikroskopii elektronowej. Technika ta zachowuje integralność strukturalną i antygenowość tkanek OUN.

Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Przeglądaj więcej filmów