Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Umieść wycinek hipokampa z mózgu myszy w studzience zawierającej bufor. Wycinek zawiera sieć neuronów, które komunikują się za pośrednictwem synaps.

Presynaptyczne zakończenia neuronów zawierają pęcherzyki wypełnione neuroprzekaźnikami z charakterystycznymi transbłonowymi transporterami, podczas gdy zakończenia postsynaptyczne zawierają charakterystyczne białka rusztowania, które regulują receptory neuroprzekaźników. Oba służą jako kluczowe markery struktur synaptycznych.

Zastąp bufor roztworem blokującym przepuszczalność i inkubuj z mieszaniem, aby przeniknąć błony komórkowe i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.

Dodaj pierwszorzędowe przeciwciała skierowane do markerów presynaptycznych i postsynaptycznych i inkubuj z mieszaniem, aby umożliwić wiązanie.

Umyj plasterek, dodaj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem specyficzne dla przeciwciał pierwszorzędowych i inkubuj z mieszaniem w ciemności.

Umyj plasterek, a następnie umieść go na zjeżdżalni.

Używając mikroskopu konfokalnego, zidentyfikuj obszar zainteresowania i powiększ, aby uwidocznić synapsy.

Uchwyć obrazy, aby zidentyfikować fluorescencyjnie znakowane markery presynaptyczne i postsynaptyczne oraz ocenić ich kolokalizację w synapsach.

Aby rozpocząć barwienie immunofluorescencyjne, zastąp PBS w dołkach plastrowych buforem blokującym i przepuszczalnym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 4 do 6 godzin na wytrząsarce. Pod koniec etapu blokowania rozcieńczyć przeciwciało przeciwko VGLUT1 1 do 2000 w buforze blokującym i przepuszczalnym. Należy pamiętać, że rozcieńczenie to może się różnić w zależności od firmy i partii użytego przeciwciała. Inkubuj plastry w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyj potrząsającej platformy energicznym ruchem.

Równomierne rozmieszczenie przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych jest ważne dla optymalnego barwienia. Z naszego doświadczenia wynika, że energiczne potrząsanie umożliwia najlepszą penetrację przeciwciał.

Po inkubacji w przeciwciałie pierwszorzędowym należy przemyć plastry trzy razy w PBS przez 10 minut za każdym razem, tak jak poprzednio. Podczas ostatniego płukania rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w ilości od 1 do 500 w buforze blokującym. Następnie inkubuj plastry w tym roztworze przez 2 do 3 godzin w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że plastry są chronione przed światłem, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło.

Po umyciu plastrów jak poprzednio, za pomocą pędzla ostrożnie wyjmij plastry z płytki 24-dołkowej i umieść je równomiernie na wstępnie oznaczonych szkiełkach podstawowych. Dodaj kroplę podłoża montażowego na wierzch każdego plasterka. A następnie delikatnie połóż szklane szkiełko nakrywkowe na plasterkach, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków powietrza.

Chronić przed światłem i pozostawić szkiełka do wyschnięcia przez co najmniej trzy do czterech dni w temperaturze pokojowej. Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez krótki czas. Ale do długotrwałego przechowywania trzymaj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Zacznij od użycia obiektywu 10x lub 20x, aby zidentyfikować obszar hipokampa, który ma być obrazowany - w tym przypadku synapsy między neuronami piramidowymi CA1 a aksonami pobocznymi Schaffera.

Zmień obiektyw na 40-krotny lub 63-krotny zanurzony w olejku i upewnij się, że anatomia plastra jest nienaruszona, identyfikując ciągłe neuryty i zorganizowaną strukturę. Użyj markera neuronalnego, takiego jak MAP2, jako odniesienia. Dostosuj ustawienia dla każdego kanału, aby uzyskać optymalny sygnał i kontrast o rozdzielczości 1024 na 1024 piksele. Ustaw intensywność każdego lasera, aby uniknąć nasycenia jakichkolwiek pikseli.

Oceń głębokość, na której barwienie jest równe, a następnie ustaw oprogramowanie tak, aby uzyskiwało stosy obrazów o co najmniej ośmiu równoodległych płaszczyznach 250 nm. Następnie weź trzy sąsiadujące ze sobą reprezentatywne obrazy ułożone w stosy z tego samego obszaru zainteresowania na wycinek. Powtórzyć pobieranie w co najmniej trzech plasterkach na warunek i od sześciu do ośmiu zwierząt na grupę badaną.