Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, wychwytywanie i znakowanie krzyżowe w neuronach parametalicznych CA one przy użyciu wycinków hipokampa Q od gryzoni. Osiąga się to poprzez najpierw preparację mózgu i szybkie odizolowanie hipokampa do zimnego, natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego. Drugim krokiem jest przygotowanie ostrych wycinków hipokampa za pomocą ręcznej krajalnicy do tkanek i inkubacja ich w komorze interfejsu.

Następnie dwie elektrody stymulujące i dwie elektrody rejestrujące umieszcza się w jednym regionie CA w celu zarejestrowania odpowiedzi pola EPSP i skoków populacji z dwóch wejść synaptycznych. Ostatnim krokiem jest wywołanie przejściowej formy plastyczności w jednym wejściu synaptycznym i trwałej formy plastyczności w innym wejściu w określonym oknie czasowym. Ostatecznie, odpowiedzi EPSP w terenie z obu danych wejściowych są rejestrowane przez dłuższy czas w celu zbadania mechanizmów wychwytywania i przechwytywania krzyżowego znakowania synaptycznego.

Znakowanie i przechwytywanie synaptyczne stanowi koncepcyjną podstawę do tego, jak pamięć krótkotrwała przekształca się w pamięć długotrwałą w określonym przedziale czasowym. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy eksperymentalne są trudne do nauczenia, ponieważ obejmują stymulację i rejestrację z wielu wejść synaptycznych. Procedurę zademonstrują Mahesh Shira, maczeta i maima Sharma, absolwenci z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj płyn mózgowo-rdzeniowy i napełnij go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla. Napełnij dno komory interfejsu wodą destylowaną do około 70% jej pojemności. Następnie włącz regulator temperatury ustawiony na 32 stopnie Celsjusza.

Następnie myj górną komorę przez 10 do 15 minut, przepuszczając wodę destylowaną przez rurkę dopływową o wysokim natężeniu przepływu przed przełączeniem na A CSF przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Następnie umieść siatkę w górnej komorze, aby zapewnić powierzchnię spoczynkową dla plastrów. Uruchom karbogen dolną komorę, zanurz rurkę dopływową w płynie mózgowo-rdzeniowym, który jest stale karbonizowany.

Odczekaj 20 minut, aż płyn mózgowo-rdzeniowy A zostanie nasycony karbogenem i wypełni górną komorę. Na tym etapie zamontuj żyletkę na rozdrabniaczu do tkanek i upewnij się, że krawędź tnąca jest równomiernie wyrównana. Przetestuj, siekając małą bibułę filtracyjną, aby upewnić się, że ostrze jest dobrze zamocowane.

Następnie ustaw przesuwny mikrometr noniusza w pozycji wyjściowej. Teraz zdobądź głowę szczura poddanego eutanazji i za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj przecięcie tylnej części czaszki, aby usunąć pień mózgu. Następnie wykonaj małe nacięcie po prawej stronie czaszki i dłuższe nacięcie po lewej stronie.

Ostrożnie usuń czaszkę za pomocą kości UR, zaczynając od lewej strony i przechodząc do prawej strony czaszki. Aby odsłonić korę i pokrywającą ją cienką warstwę opony twardej, ostrożnie usuń oponę twardą cienką szpatułką, a następnie usuń płytki czołowe z kością. Następnie usuń pozostałą oponę twardą, szczególnie w połączeniu między korą a móżdżkiem za pomocą płaskiego końca szpatułki i unikaj uszkodzenia mózgu, utrzymując ciśnienie w górę.

Za pomocą szpatułki delikatnie nabierz mózg na szalkę Petriego na aluminiowym bloku chłodzącym wypełnionym zimnym i gazowanym płynem rdzeniowym A, aby wyizolować hipokamp za pomocą skalpela numer 11, wykonaj proste cięcie, aby usunąć móżdżek i kolejne cięcie, aby usunąć jedną czwartą przedniej części mózgu. Następnie wykonaj płytkie cięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej. Zaczynając od linii środkowej.

Ostrożnie usuń korę za pomocą skalera sierpowatego, aby odsłonić grzbietowy hipokamp. Następnie usuń warstwę kory nad hipokampem. Wykonaj małe nacięcie spoidła hipokampa.

Delikatnie usuń hipokamp za pomocą skalera sierpowatego, zaczynając od końca grzbietowego, wykonując ruchy toczenia. Następnie usuń wszelką korę i tkanki łączne wokół izolowanego hipokampa za pomocą zakrzywionego końca skalera sierpowatego. Aby przeciąć tkankę hipokampa, umieść kawałek nasączonej płynem mózgowo-rdzeniowym 30-milimetrowej bibuły filtracyjnej watmana na etapie krojenia ręcznej krajalnicy.

Przenieś tkankę hipokampa na bibułę filtracyjną. Używając płaskiego końca skalora sierpowatego, przesuń bibułę filtracyjną, aby wyrównać hipokamp we właściwej orientacji w stosunku do ostrza krajalnicy, tak aby hipokamp został przecięty pod kątem około 70 stopni do fia. Następnie osusz nadmiar roztworu otaczającego tkankę hipokampa.

Za pomocą złożonej bibuły filtracyjnej pokrój hipokamp poprzecznie i wyrzuć tkankę ze skrajnego końca hipokampa, gdzie morfologia plastra nie jest jasna. Następnie pokrój pozostałą tkankę na plastry o grubości 400 mikronów, regulując mikrometr noniusza po każdej rundzie krojenia. Po każdym cięciu delikatnie przenieś plasterek z ostrza za pomocą pędzla z miękkim włosiem do małej zlewki wypełnionej zimnym gazowanym płynem CSF.

Następnie delikatnie przenieś plastry na siatkę w komorze na plastry za pomocą czystej plastikowej pipety obok pipety. Za pomocą szerokiej końcówki ostrożnie wyreguluj położenie plasterków w sposób ułatwiający lokalizację elektrody i sprawdzenie zapisu, aby upewnić się, że plastry są wystarczająco otoczone warstwą płynu mózgowo-rdzeniowego, ale nie są całkowicie zanurzone. Następnie przykryj komorę i inkubuj plastry przez dwie do trzech godzin w eksperymentach z tagowaniem synaptycznym i chwytaniem.

Pod mikroskopem umieść dwie elektrody stymulujące w warstwie promienistej atomu CA w jednym obszarze, aby stymulować włókna poboczne Schaffera, a podczas rejestracji elektrody w wierzchołkowym obszarze dendrytycznym około jednego w połowie odległości między elektrodami stymulującymi. Aby nagrać odpowiedzi F-E-P-S-P, umieść kolejną elektrodę rejestrującą w warstwie parid. Warstwa DO do rejestrowania skoku populacji.

Gdy wszystkie elektrody dotkną warstwy, przeprowadź stymulację testową, aby upewnić się, że w obu wejściach można uzyskać odpowiedni sygnał EPSP w polu. Po uzyskaniu odpowiedniego sygnału F-E-P-S-P ostrożnie opuść elektrody o około 200 mikronów dalej za pomocą precyzyjnych pokręteł ruchu manipulatorów. Następnie odczekaj 20 minut, aż plasterek się zregeneruje.

Następnie określ zależność wejściowo-wyjściową, mierząc nachylenie pola EPSP w zakresie natężeń prądu od 20 mikroamperów do 100 mikroamperów. Następnie dla każdego wejścia ustaw intensywność stymulacji, która wywołuje 40% maksymalnego nachylenia pola EPSP, jako stałe bodźce przez cały czas trwania eksperymentu. Po 15 do 20 minutach rozpocznij rejestrację linii bazowej Zapisz stabilną linię bazową co najmniej 30 do 60 minut przed indukcją L-T-P-L-T-D na jednym wejściu, wywołaj wczesny LTP przy użyciu słabego protokołu tetynowego składającego się z pojedynczej stymulacji o wysokiej częstotliwości.

Podczas gdy drugie wejście kontynuuje rejestrowanie linii bazowej 30 minut po wczesnej indukcji LTP, wywołaj późne LTP w wejściu S dwa, używając silnego protokołu tetyny obejmującego powtarzającą się stymulację o wysokiej częstotliwości z interwałem między trenacjami wynoszącym 10 minut. Następnie zapisz odpowiedzi EPSP w polu przez wydłużony czas, aby ujawnić transformację wczesnego LTP w wejściu S jeden do późnego LTP przez znakowanie synaptyczne i przechwytywanie. Podobnie, w eksperymencie przechwytywania krzyżowego, najpierw indukuj wczesny LTP i jedno wejście, a następnie 30 minut później późną indukcję LTD na innym wejściu, używając silnego protokołu stymulacji niskiej częstotliwości składającego się z 900 impulsów w ciągu 15 minut

Następnie rejestruj odpowiedzi EPSP w polu przez dłuższy czas, aby ujawnić transformację wczesnego LTP w wejściu S jeden do późnego LTP przez przechwytywanie krzyżowe. W tej reprezentacji dwie elektrody stymulujące są umieszczone w atomie promienistym warstwy CA w jednym regionie, aby stymulować dwa niezależne, ale nakładające się na siebie wejścia synaptyczne. Na CA jeden neuron parametaliczny dwie zewnątrzkomórkowe elektrody rejestrujące.

Jeden do nagrywania F-E-P-S-P z wierzchołkowego przedziału dendrytycznego. I kolejny, aby zarejestrować skok populacji somatycznej z ciał komórek parametalicznych, znajdują się odpowiednio w warstwie radi atom i warstwie para. Ten rysunek pokazuje tydzień przed silnym paradygmatem do badania znakowania i przechwytywania synaptycznego.

Słabą tetynę stosuje się do S 1 w celu indukcji wczesnego LTP, a następnie silnej tetyny S 2 w 30 minutach w celu indukcji późnego LTP, a rysunek ten pokazuje tydzień przed silnym paradygmatem do badania tagowania krzyżowego. Wczesny LTP jest indukowany przez słabą tetynę w S jeden, a następnie indukcję późnego LTD w S dwa przy użyciu protokołu silnej stymulacji niskiej częstotliwości. Po 30 minutach w S one, wczesny LTP jest przekształcany w późny LTP trwający sześć godzin, pokazując crosstagowanie i przechwytywanie.

Po opanowaniu tę technikę preparacji i przygotowania plastrów można wykonać bardzo szybko w ciągu trzech do pięciu minut. W ten sposób żywotność plasterków może zostać zachowana w przypadku długotrwałych nagrań. Za pomocą tej metody można również przetestować wpływ różnych środków farmakologicznych na procesy znakowania i wychwytywania synaptycznego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać długoterminowe eksperymenty plastyczności funkcjonalnej oraz procesy znakowania i przechwytywania synaptycznego.