Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie długoterminowej plastyczności oraz procesów asocjacyjnych, takich jak tagowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowe tagowanie w neuronach obszaru CA1 hipokampa, z wykorzystaniem skrawków hipokampa gryzoni. Cel ten osiąga się poprzez najpierw przeprowadzenie sekcji mózgu i szybką izolację hipokampa w zimnym, natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Drugim krokiem jest przygotowanie ostrych skrawków hipokampa przy użyciu ręcznego slicera do tkanek i ich inkubacja w komorze interfejsowej.

Kolejne dwie elektrody stymulujące i dwie elektrody rejestrujące są umieszczane w obszarze CA1 w celu rejestracji fEPSP oraz odpowiedzi w postaci kolców populacyjnych z dwóch wejść synaptycznych. Ostatnim krokiem jest indukowanie przejściowej formy plastyczności w jednym wejściu synaptycznym oraz trwałej formy plastyczności w drugim wejściu w określonym oknie czasowym. Ostatecznie rejestrowane są odpowiedzi fEPSP z obu wejść przez dłuższy czas, aby zbadać mechanizmy przechwytywania znaczników synaptycznych (synaptic tagging capture) oraz przechwytywania krzyżowego (cross capture).

Oznaczanie i przechwytywanie synaptyczne (synaptic tagging and capture) stanowią podstawę koncepcyjną procesu przekształcania pamięci krótkotrwałej w pamięć długotrwałą w określonym przedziale czasowym. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki eksperymentalne są trudne do opanowania ze względu na konieczność stymulacji i rejestracji sygnałów z wielu wejść synaptycznych. Procedurę zaprezentują studenci studiów doktoranckich z mojego laboratorium: Mahesh Shira, machete i maima Sharma.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować A CSF i napowietrzyć go mieszaniną 95% oxygen i 5% carbon dioxide. Dno komory interfejsowej należy wypełnić wodą destylowaną do około 70% jej pojemności. Następnie należy włączyć kontroler temperatury ustawiony na 32 °C.

Następnie płucz górną komorę przez 10 do 15 minut, przepuszczając wodę destylowaną przez przewód dopływowy z wysokim natężeniem przepływu, a następnie przełącz na A CSF z natężeniem przepływu 1 ml/min. Następnie umieść siatkę w górnej komorze, aby zapewnić powierzchnię spoczynkową dla skrawków. Rozpocznij przepływ karbogenu do dolnej komory i zanurz przewód dopływowy w A CSF, który jest stale napowietrzany karbogenem.

Odczekać 20 minut, aż A CSF zostanie nasycony karbogenem i wypełni górną komorę. Na tym etapie zamontować ostrze brzytwy w przecinarce do tkanek i upewnić się, że krawędź tnąca jest równo wyrównana. Sprawdzić działanie, przecinając mały kawałek papieru filtracyjnego, aby upewnić się, że ostrze jest mocno zamocowane.

Następnie ustaw przesuwny mikrometr z noniuszem w pozycji początkowej. Teraz pobierz głowę uśpionego szczura i za pomocą nożyczek irydowych wykonaj cięcie przez tylną część czaszki, aby usunąć pień mózgu. Następnie wykonaj małe nacięcie wzdłuż prawej strony czaszki oraz dłuższe nacięcie po lewej stronie.

Ostrożnie usuń czaszkę za pomocą narzędzia do usuwania kości (bone UR), zaczynając od lewej strony i przesuwając się w stronę prawą. Aby odsłonić korę oraz cienką warstwę pokrywającej ją opony twardej, ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą cienkiej szpatułki, a następnie usuń płytki czołowe za pomocą narzędzia do usuwania kości (bone Ro). Następnie usuń pozostałą oponę twardą, szczególnie w miejscu połączenia kory z móżdżkiem, za pomocą płaskiego końca szpatułki, unikając uszkodzenia mózgu poprzez utrzymywanie nacisku skierowanego ku górze.

Za pomocą szpatułki delikatnie przenieś mózg do szalki Petriego umieszczonej na aluminiowym bloku chłodzącym wypełnionym zimnym i nasyconym dwutlenkiem węgla A CSF. Aby wyizolować hipokamp, użyj skalpela nr 11 i wykonaj proste cięcie w celu usunięcia móżdżku oraz kolejne cięcie, aby usunąć jedną czwartą przedniej części mózgu. Następnie wykonaj płytkie cięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej, zaczynając od linii środkowej.

Ostrożnie usuń korę za pomocą skalera w kształcie sierpa, aby odsłonić grzbietową część hipokampa. Następnie usuń warstwę kory znajdującą się nad hipokampem. Wykonaj niewielkie nacięcie w obrębie spójki hipokampa.

Delikatnie usuń hipokamp za pomocą skrobaka w kształcie sierpa, zaczynając od końca grzbietowego i wykonując ruchy obrotowe. Następnie usuń korę oraz tkanki łączną wokół wyizolowanego hipokampa, używając zakrzywionego końca skrobaka. Aby pokroić tkankę hipokampa, umieść kawałek 30 milimetrowego papieru filtracyjnego Watman nasączonego CSF na platformie tnącej manualnej mikrotomii.

Przenieś tkankę hipokampa na papier filtracyjny. Używając płaskiego końca skalpela w kształcie sierpa, przesuń papier filtracyjny tak, aby ustawić hipokamp w odpowiedniej orientacji względem ostrza szaika, tak aby hipokamp został przekrojony pod kątem około 70 stopni względem osi fia. Następnie osusz nadmiar roztworu otaczającego tkankę hipokampa.

Za pomocą złożonego papieru filtracyjnego należy wykonać poprzeczne skrawki hipokampa, odrzucając tkankę z jego skrajnego końca, gdzie morfologia skrawka nie jest wyraźna. Następnie pozostałą tkankę należy pociąć na skrawki o grubości 400 micron, regulując noniusz mikrometru po każdej serii cięć. Po każdym cięciu należy delikatnie przenieść skrawek z ostrza za pomocą pędzla z miękkim włosiem do małego zlewki wypełnionej zimnym carbonated A CSF.

Następnie delikatnie przenieś plastry na siatkę w komorze do plastrów, używając czystej plastikowej pipety Pasteura. Za pomocą szerkiej końcówki ostrożnie ustaw pozycję plastrów w sposób ułatwiający lokalizację elektrod i sprawdzenie rejestracji, upewniając się, że plastry są w wystarczającym stopniu otoczone warstwą A CSF, ale nie są całkowicie zanurzone. Po tym czasie przykryj komorę i inkubuj plastry przez dwie do trzech godzin w eksperymentach dotyczących znakowania i przechwytywania synaptycznego.

Pod mikroskopem umieść dwie elektrody stymulujące w stratum radiatum obszaru CA1, aby stymulować włókna kolaterali Schaffera, oraz elektrodę rejestrującą w obszarze dendrytów apikalnych CA1, w połowie odległości między elektrodami stymulującymi. Aby zarejestrować odpowiedzi fEPSP, umieść kolejną elektrodę rejestrującą w warstwie stratum pyramidale w celu rejestracji kolca populacyjnego.

Gdy wszystkie elektrody dotkną skrawka, przeprowadź stymulację testową, aby upewnić się, że w obu wejściach można uzyskać prawidłowy sygnał EPSP. Po uzyskaniu odpowiedniego sygnału EPSP ostrożnie obniż elektrody o około 200 mikronów, korzystając z pokręteł precyzyjnego przesuwania manipulatorów. Następnie odczekaj 20 minut, aby skrawek mógł się zregenerować.

Następnie określ relację wejście-wyjście, mierząc nachylenie polowego EPSP w zakresie natężeń prądu od 20 microamps do 100 microamps. Następnie dla każdego wejścia ustaw natężenie stymulacji wywołujące 40% maksymalnego nachylenia polowego EPSP jako stałą stymulację w trakcie całego eksperymentu. Po 15 do 20 minutach rozpocznij rejestrację linii bazowej; zarejestruj stabilną linię bazową przez co najmniej 30 do 60 minut przed indukcją L-T-P-L-T-D w jednym wejściu, a następnie zindukuj wczesne LTP, stosując słaby protokół tetin składający się z pojedynczej stymulacji o wysokiej częstotliwości.

Podczas gdy drugi wejściowy sygnał nadal rejestruje poziom bazowy 30 minut po indukcji wczesnego LTP, wywołaj późne LTP w wejściu S dwa, stosując silny protokół tetin obejmujący powtarzaną stymulację o wysokiej częstotliwości z odstępem między seriami wynoszącym 10 minut. Następnie rejestruj odpowiedzi polowych EPSP przez dłuższy czas, aby wykazać przekształcenie wczesnego LTP w wejściu S jeden w późne LTP poprzez synaptyczne znakowanie i przechwytywanie (synaptic tagging and capture). Podobnie, w eksperymencie z przechwytywaniem krzyżowym, najpierw wywołaj wczesne LTP w jednym wejściu, a następnie po 30 minutach indukuj późne LTD w innym wejściu, stosując silny protokół stymulacji o niskiej częstotliwości składający się z 900 serii w ciągu 15 minut.

Następnie rejestruj odpowiedzi EPSP polowe przez dłuższy czas, aby wykazać przekształcenie wczesnego LTP w wejściu S1 w późne LTP poprzez wzajemne przechwytywanie. W tym układzie dwie elektrody stymulujące są umieszczone w warstwie radiatym (stratum radiatum) obszaru CA1, aby stymulować dwa niezależne, lecz nakładające się wejścia synaptyczne. Do neuronów piramidalnych CA1 wprowadzono dwie zewnątrzkomórkowe elektrody rejestrujące.

Jedna służy do rejestracji F-E-P-S-P z obszaru dystalnych dendrytów, a druga do rejestracji somatycznego potencjału seryjnego z ciał komórek piramidalnych, które znajdują się odpowiednio w stratum radiatum i stratum pyramidale. Rysunek ten przedstawia paradygmat słabej stymulacji poprzedzającej silną w celu badania zjawiska tagowania i przechwytywania synaptycznego.

Słaba tetyzacja jest stosowana w S jeden w celu wywołania wczesnego LTP, po której następuje silna tetyzacja S dwa po 30 minutach w celu wywołania późnego LTP; rycina ta przedstawia schemat słaby przed silnym paradygmatem w celu zbadania przekazywania znaczników (cross tagging). Wczesne LTP jest indukowane przez słabą tetyzację w S jeden, po której następuje indukcja późnego LTD w S dwa przy użyciu silnego protokołu stymulacji o niskiej częstotliwości. Po 30 minutach w S jeden wczesne LTP przekształca się w późne LTP trwające sześć godzin, co wykazuje zjawisko przekazywania i przechwytywania znaczników (cross tagging and capture).

Po opanowaniu, ta technika sekcji i przygotowania plastrów może być wykonana bardzo szybko, w czasie od trzech do pięciu minut. Dzięki temu możliwe jest zachowanie żywotności plastrów do długotrwałych pomiarów. Stosując tę metodę, można również badać wpływ różnych czynników farmakologicznych na procesy znakowania i przechwytywania synaptycznego.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat prowadzenia długoterminowych eksperymentów nad plastycznością funkcjonalną oraz procesów znakowania i wychwytywania synaptycznego.