Name: Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj metody badania plastyczności synaptycznej i mechanizmów znakowania oraz przechwytywania w neuronach piramidalnych CA1 przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni. Technika ta umożliwia zrozumienie procesów konsolidacji pamięci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten artykuł wideo jest sponsorowany przez Cerebos Pacific Limited. Praca ta jest wspierana przez National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) oraz Ministerstwo Edukacji Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02).

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Singapuru.
1. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
<ol>
	<li>Przygotować ACSF składający się z (w mM) 124 NaCl, 3,7 KCl, 1,0 MgSO, 4,7H2O, 2,5CaCl, 2,2H2O, 1,2 KH2PO4, 24,6 NaHCO3 i 10 D-glukozy. Upewnij się, że pH ACSF wynosi od 7,2 do 7,4 po bąbelkach do nasycenia mieszaniną 95%O2 i 5% CO2 (karbogen). 21 Tego ACSF należy używać zarówno do preparacji, przygotowania plastrów, jak i do perfuzji podczas zapisów elektrofizjologicznych. 
	UWAGA: Do pomiaru i trzymania ACSF używaj czystej aparatury. Używanie nieczystej aparatury może prowadzić do mętnych roztworów lub tworzenia się osadów. Do wszystkich preparatów używaj wody dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotować w kolbie miarowej 2 l zapasu 10x ACSF, z wyłączeniemNaHCO3 i D-glukozy. Dodaj odczynniki do wody dejonizowanej w następującej kolejności: NaCl (144,96 g), KCl (5,52 g), MgSO4,7H 20 (4,92 g), CaCl 2,2H20 (7,56 g), KH2PO4 (3,28 g) i uzupełnij do objętości 2 L. Mieszaj nieprzerwanie przez co najmniej 30 minut za pomocą mieszadła magnetycznego, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są rozpuszczone. Przechowywać wywar w temperaturze 4 oC i zużyć w ciągu 2 tygodni.</li>
	<li>Przed sekcją i doświadczeniami rozcieńczyć materiał ACSF w kolbie miarowej wraz z dodaniem wymaganych ilościNaHCO3 i D-glukozy. Na 1 l roztworu rozcieńczyć 100 ml bulionu do 1 l po dodaniu 2,07 gNaHCO3 i 1,802 g D-glukozy. ACSF powinien być klarownym roztworem wolnym od jakichkolwiek osadów lub nierozpuszczonych cząstek.</li>
	<li>Schłodzić około 200-300 ml ACSF na lodzie, do użycia podczas sekcji. Upewnij się, że ACSF używany do rozwarstwienia ma temperaturę między 2-4 °C. Użyj pozostałej ACSF do eksperymentów elektrofizjologicznych. Wszystkie roztwory ACSF należy w sposób ciągły nasycać karbogenem (5%CO2, 95%O2). Czekając, aż ACSF ostygnie, przygotuj obszar rozwarstwienia i komorę plastrów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory interfejsu 
UWAGA: Komora interfejsu z wycinkami mózgu, używana do inkubacji wycinków i utrzymywania ich podczas zapisów elektrofizjologicznych (Rysunek 2B), składa się z dwóch komór. Dolna komora zawiera wodę destylowaną utrzymywaną w temperaturze 32 °C przez regulator temperatury i stale bąbelkowaną karbogenem.
<ol>
	<li>Włączyć regulator temperatury i ustawić go na 32 °C. Myć górną komorę przez 10 do 15 minut, przepuszczając wodę destylowaną przez rurkę doprowadzającą. Upewnij się, że górna komora jest czysta przed umieszczeniem siatki. Sprawdź, czy poziom wody w dolnej komorze jest w około 70% wypełniony wodą destylowaną.</li>
	<li>Umieść siatkę w górnej komorze, aby zapewnić powierzchnię spoczynkową dla plastrów (Rysunek 2C). Wyreguluj rurkę odpływową, aby upewnić się, że poziom roztworu wystarczająco zwilża całą powierzchnię siatki. Umieść pokrywę nad siatką, aby utrzymać nawilżoną atmosferę karbogenu w górnej komorze.</li>
	<li>Dostosować natężenie przepływu do 1 ml/min. Utrzymać to natężenie przepływu przez cały okres inkubacji plastrów i eksperymentu. Rozpocznij karbonowanie świeżo przygotowanego 1x ACSF i zanurz rurkę dopływową w ACSF. Odczekaj 20 minut, aż ACSF zostanie nasycony karbogenem i aby górna komora została nim wypełniona.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ostrych plastrów hipokampa 
UWAGA: Protokół sekcji składa się z (1) usunięcia mózgu zwierzęcia do zimnego ACSF oraz (2) izolacji i pokrojenia hipokampa. Aby neurony pozostały żywotne, należy szybko wyizolować i umieścić mózg w zimnym ACSF i zakończyć cały proces, w tym krojenie, w ciągu 3-5 minut.
<ol>
	<li>Usunięcie mózgu do zimnego ACSF
	<ol>
		<li>Rozłóż narzędzia do preparowania w sposób pokazany na rysunku 1A. Ułóż narzędzia zgodnie z kolejnością użycia, aby ułatwić proces sekcji. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania są gotowe.</li>
		<li>Zamontuj żyletkę, oczyszczoną octanem etylu, absolutnym etanolem i wodą destylowaną, na ręcznym rozdrabniaczu do tkanek (Rysunek 1B), zabezpiecz ją mocno i upewnij się, że krawędź tnąca jest równomiernie wyrównana. Przetestuj siekanie kawałka bibuły filtracyjnej, aby upewnić się, że ostrze jest mocno zamocowane. Ustaw przesuwny mikrometr noniusza w pozycji wyjściowej.</li>
		<li>Poddaj zwierzę eutanazji za pomocą dwutlenku węgla (CO2 ) w komorze indukcyjnej i odetnij głowę nożyczkami do bandaży lub gilotyną. Za pomocą nożyczek do tęczówki usuń skórę i futro nad czaszką. Wykonaj nacięcie przez tył, aby usunąć pień mózgu. Wykonaj małe nacięcie po prawej stronie czaszki i dłuższe nacięcie po lewej stronie. 
		OSTROŻNOŚĆ! Wykonaj tylko małe nacięcie po stronie, która jest używana do eksperymentów, aby uniknąć jej uszkodzenia. Podczas wkładania nożyczek upewnij się, że przyłożona siła jest skierowana w górę, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.</li>
		<li>Ostrożnie usuń czaszkę za pomocą kostnego rongeura, zaczynając od lewej do prawej strony czaszki, aby odsłonić korę. Widoczna jest również cienka warstwa opony twardej. Ostrożnie zdejmij przednie płyty za pomocą rongeur. Usuń większość opony twardej wraz z płytami czołowymi. 
		OSTROŻNOŚĆ! Uważaj, aby opona twarda nie przecięła tkanki mózgowej.</li>
		<li>Usuń pozostałą oponę twardą, jeśli występuje, szczególnie w połączeniu między korą a móżdżkiem za pomocą płaskiego końca szpatułki. W przypadku kroków 3.1.5 i 3.1.6 utrzymuj nacisk w górę, tj. z dala od mózgu, aby uniknąć jego uszkodzenia. Za pomocą szpatułki delikatnie przełóż mózg na szalkę Petriego wypełnioną zimnym i karbonogennym ACSF (2-4 °C), umieszczoną na aluminiowym bloku chłodzącym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja hipokampa
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela wykonaj proste cięcie, aby usunąć móżdżek i kolejne cięcie, aby usunąć przednią część mózgu (około jednej czwartej). Wykonaj płytkie cięcie wzdłuż linii środkowej.</li>
		<li>Ostrożnie usuń korę za pomocą skalera sierpowatego, zaczynając od linii środkowej, aby odsłonić grzbietowy hipokamp. Usuń warstwę kory nad hipokampem. Użyj palców lub kleszczy pod kątem, aby podeprzeć mózg. Wykonaj małe nacięcie spoidła hipokampa. Delikatnie usuń hipokamp za pomocą skalera sierpowatego, zaczynając od hipokampa grzbietowego, wykonując ruchy toczenia. 
		OSTROŻNOŚĆ! Bądź delikatny, aby uniknąć rozciągania i rozrywania hipokampa.</li>
		<li>Usuń całą korę i tkanki łączne wokół izolowanego hipokampa za pomocą skalera sierpowatego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krojenie tkanki hipokampa i przenoszenie plastrów do komory interfejsu
	<ol>
		<li>Umieść kawałek bibuły filtracyjnej nasączonej ACSF (klasa 1, 30 mm) na etapie krojenia ręcznej krajalnicy. Zgarnij i umieść tkankę hipokampa na bibule filtracyjnej. Przesuń bibułę filtracyjną, aby wyrównać hipokamp we właściwej orientacji w stosunku do ostrza krajalnicy, tak aby hipokamp został pokrojony pod kątem około 70o do fimbrii.</li>
		<li>Osusz nadmiar roztworu otaczającego tkankę hipokampa złożoną bibułą filtracyjną (stopień 1, 85 mm), pozostawiając hipokamp lekko wilgotny. Zacznij kroić hipokamp poprzecznie. Pokrój i wyrzuć tkankę ze skrajnego końca hipokampa, gdzie morfologia wycinka nie jest jasna.</li>
		<li>Pozostałą tkankę pokrój w plastry o grubości 400 μm. Delikatnie podnieś plastry hipokampa z ostrza za pomocą szczotki z miękkim włosiem, wykonując delikatne ruchy machające i umieść plastry w małej zlewce wypełnionej zimnym karbogennym ACSF. Kroki 3.3.1-3.3.3 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, ponieważ tkanka hipokampa jest wystawiona na działanie powietrza. 
		UWAGA: Generalnie dwie trzecie hipokampa jest krojone w plastry i można przygotować 4-6 plasterków o wyraźnej morfologii.</li>
		<li>Delikatnie przenieś plastry na siatkę w komorze na plastry za pomocą czystej plastikowej pipety Pasteura z szeroką końcówką (wykonaną przez odcięcie 2-3 cm końcówki). Ostrożnie wyreguluj położenie plastrów na siatce za pomocą małej strzykawki z wygiętą końcówką. Umieść plastry w sposób ułatwiający lokalizację i rejestrację elektrody. Sprawdź, czy plastry są wystarczająco otoczone ACSF, ale nie są zanurzone ani pływające (Rysunek 2C-D). Przykryj komorę i inkubuj plastry przez 2-3 godziny. 
		UWAGA: Warstwa komórek piramidalnych w zdrowych plasterkach powinna wykazywać pewną przezroczystość.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Rejestracja odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 
UWAGA: Konfiguracja elektrofizjologiczna używana do rejestracji potencjału pola jest pokazana na rysunku 2A. Klatka Faradaya jest zdecydowanie zalecana, jeśli zakłócenia elektryczne są poza kontrolą po prawidłowym uziemieniu ustawień elektrycznych. Na rynku dostępnych jest wiele różnych typów komór zanurzeniowych i międzywystrojowych. Jednak komory interfejsu są preferowane, ponieważ plastry wykazują w nich silniejsze odpowiedzi synaptyczne.
<ol>
	<li>Umiejscowienie elektrod
	<ol>
		<li>Włącz aparaturę elektryczną (stymulatory i wzmacniacze), która ma być używana. Zamontuj i zabezpiecz elektrody stymulujące i rejestrujące w uchwytach z pleksi mikromanipulatorów. 
		UWAGA: Używamy monopolarnych, lakierowanych elektrod ze stali nierdzewnej o rezystancji 5 MΩ zarówno do celów stymulacyjnych, jak i rejestracyjnych.</li>
		<li>Przed użyciem włóż te elektrody do wyciągniętych szklanych kapilar i zabezpiecz klejem epoksydowym, odsłaniając tylko niewielką część końcówki elektrody (rysunek 2E). Daje to wytrzymałość skądinąd smukłym elektrodom i pomaga je mocno zamocować w uchwytach elektrod.</li>
		<li>Prowadzony pod mikroskopem, umieść elektrodę (elektrody) stymulujące w warstwie promieniowej obszaru CA1, aby stymulować włókna poboczne Schaffera, a elektrodę rejestrującą w wierzchołkowym obszarze dendrytycznym CA1, aby zarejestrować odpowiedzi field-EPSP (fEPSP). 
		UWAGA: Zbliżenie się elektrodami do powierzchni cieczy nad plasterkiem daje dźwięk, który pomaga szybko zlokalizować powierzchnię plastra (pod warunkiem, że amplifier jest podłączony do głośnika).</li>
		<li>W eksperymentach z tagowaniem i wychwytywaniem synaptycznym, w zależności od potrzeb eksperymentu, umieść dwie lub trzy elektrody stymulujące (S1, S2 lub S3) po obu stronach elektrody rejestrującej, aby stymulować dwa lub więcej niezależnych, ale nakładających się na siebie wejść. Umieść elektrody stymulujące i rejestrujące w odległości około 200 μm od siebie.</li>
		<li>W razie potrzeby zlokalizuj inną elektrodę rejestrującą w warstwie piramidalnej w celu zarejestrowania skoku populacji (rysunek 3A). Gdy obie elektrody dotkną plasterka, za pomocą oprogramowania do akwizycji, przeprowadź stymulację testową, aby zapewnić prawidłowy sygnał fEPSP. 
		UWAGA: Do stymulacji testowej używamy dwufazowych, stałoprądowych impulsów (czas trwania impulsu 0,1 ms/półfala).</li>
		<li>Po uzyskaniu odpowiedniego sygnału fEPSP ostrożnie opuść elektrody na głębokość około 200 μm za pomocą precyzyjnych pokręteł ruchowych manipulatorów. Odczekaj 20 minut, aż plastry się zregenerują. Przetestuj niezależność szlaku za pomocą protokołu ułatwiania sparowanych impulsów27,28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Relacja wejścia-wyjścia
	<ol>
		<li>Określ zależność wejść-wyjść (stymulacja aferentna vs nachylenie fEPSP) dla każdego wejścia, mierząc wartość nachylenia w zakresie natężeń prądu. Wykonaj to w zakresie od 20 μA do 100 μA. Następnie ustaw intensywność stymulacji dla każdego wejścia, aby uzyskać 40% maksymalnego nachylenia fEPSP. Utrzymuj tę wartość na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
		<li>Po 15-20 minutach rozpocznij nagrywanie linii bazowej. W tym okresie należy uważnie monitorować nachylenie fEPSP i zresetować intensywność bodźca, jeśli nachylenie waha się o więcej niż 10% od ustawionej wartości i rozpocząć nową linię bazową. Przed kontynuowaniem zapisz co najmniej 30 minut lub 1 godzinę stabilnej linii bazowej. 
		UWAGA: Do testu lub stymulacji wyjściowej używamy czterech przemiatania dwufazowych, stałych impulsów prądu 0,2 Hz (0,1 ms na polaryzację) podawanych co 5 minut. Średnie nachylenie tych czterech odpowiedzi jest następnie traktowane jako jedno powtórzenie. Sygnały są filtrowane i wzmacniane przez wzmacniacz różnicowy, digitalizowane za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego i monitorowane online za pomocą specjalnie przygotowanego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja LTP/LTD za pomocą protokołów stymulacji 
	UWAGA: Zarówno LTP, jak i LTD zostały sklasyfikowane jako wczesne i późne LTP/LTD w oparciu o wymagania syntezy białek; ten ostatni wymaga tłumaczenia i/lub transkrypcji ze względu na jego późne utrzymanie [do wglądu patrz4]. Różne paradygmaty stymulacji elektrycznej mogą specyficznie indukować różne formy LTP i LTD.
	<ol>
		<li>WTET: 100 Hz, 21 dwufazowych impulsów prądu stałego (0,2 ms na fazę).</li>
		<li>STET: Trzy serie po 100 impulsów przez jedną sekundę (100 Hz) co 10 minut (szerokość impulsu 0,2 ms na fazę).</li>
		<li>900 serii w ciągu 15 minut. 1 seria składa się z 3 impulsów (szerokość 0,2 ms) o interwale międzyimpulsowym 50 ms (20 Hz). Interwał między impulsami wynosi 1 sekundę (całkowita liczba impulsów 2,700).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Czyszczenie komory plastrów i systemu perfuzyjnego
<ol>
	<li>Po zakończeniu nagrywania zbierz plastry hipokampa do dalszej analizy biochemicznej lub odpowiednio wyrzuć. Wyłącz zasilanie karbogenu i regulator temperatury. Umyj bełkotkę karbogeniczną w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Dokładnie wyczyść siatkę szczotką i wodą destylowaną. Myj wiertło przez 15-20 minut wodą destylowaną o większym natężeniu przepływu. Raz na 3-4 dni wymieniaj wodę destylowaną w dolnej komorze komory, a także regularnie czyść komorę 3% roztworem nadtlenku wodoru, aby uniknąć rozwoju grzybów.</li>
</ol>

<ol><li>Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+model+of+memory%3A+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361, 31-39 (1993).</li>
<li>Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+synaptic+plasticity%3A+LTP+and+LTD.%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Learning-related synaptic plasticity: LTP and LTD.</a> Current Opinion in Neurobiology. 1, 113-120 (1991).</li>
<li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual review of neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+and+LTD%3A+An+Embarrassment+of+Riches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LTP and LTD: An Embarrassment of Riches.</a> Neuron. 44, 5-21 (2004).</li>
<li>Krug, M., Lossner, B., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisomycin+blocks+the+late+phase+of+long-term+potentiation+in+the+dentate+gyrus+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research+bulletin%22%5BJournal%5D)">Anisomycin blocks the late phase of long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats.</a> Brain research bulletin. 13, 39-42 (1984).</li>
<li>Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisomycin+blocks+an+inhibitor+of+protein+synthesis%2C+blocks+late+phases+of+LTP+phenomena+in+the+hippocampal+CA1+region+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Anisomycin blocks an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro.</a> Brain research. 452, 57-65 (1988).</li>
<li>Otani, S., Marshall, C. J., Tate, W. P., Goddard, G. V., Abraham, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+long-term+potentiation+in+rat+dentate+gyrus+requires+protein+synthesis+but+not+messenger+RNA+synthesis+immediately+post-tetanization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maintenance of long-term potentiation in rat dentate gyrus requires protein synthesis but not messenger RNA synthesis immediately post-tetanization.</a> Neuroscience. 28, 519-526 (1989).</li>
<li>Frey, U., Frey, S., Schollmeier, F., Krug, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+actinomycin+D%2C+a+RNA+synthesis+inhibitor%2C+on+long-term+potentiation+in+rat+hippocampal+neurons+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of actinomycin D, a RNA synthesis inhibitor, on long-term potentiation in rat hippocampal neurons in vivo and in vitro.</a> The Journal of physiology. 490 (3), 703-711 (1996).</li>
<li>Nguyen, P. V., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+synthesis-dependent+late+phase+of+long-term+potentiation+requiring+cAMP+in+the+medial+perforant+pathway+of+rat+hippocampal+slices%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A macromolecular synthesis-dependent late phase of long-term potentiation requiring cAMP in the medial perforant pathway of rat hippocampal slices).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 3189-3198 (1996).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Kulla, A., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+translation+but+not+transcription+for+the+maintenance+of+long-term+depression+in+the+CA1+region+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Requirement of translation but not transcription for the maintenance of long-term depression in the CA1 region of freely moving rats.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 8572-8576 (2000).</li>
<li>Frey, U., Morris, R. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and long-term potentiation.</a> Nature. 385, 533-536 (1997).</li>
<li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+before+strong%3A+dissociating+synaptic+tagging+and+plasticity-factor+accounts+of+late-LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Weak before strong: dissociating synaptic tagging and plasticity-factor accounts of late-LTP.</a> Neuropharmacology. 37, 545-552 (1998).</li>
<li>Redondo, R. L., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+memories+last%3A+the+synaptic+tagging+and+capture+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Making memories last: the synaptic tagging and capture hypothesis.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 17-30 (2011).</li>
<li>Martin, K. C., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+--+who%27s+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging -- who's it?</a> Nature reviews. Neuroscience. 3, 813-820 (2002).</li>
<li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging%3A+implications+for+late+maintenance+of+hippocampal+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging: implications for late maintenance of hippocampal long-term potentiation.</a> Trends in neurosciences. 21, 181-188 (1998).</li>
<li>Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+during+synapse-specific+long-term+facilitation+of+Aplysia+sensory-motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+learning+and+memory%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging during synapse-specific long-term facilitation of Aplysia sensory-motor neurons.</a> Neurobiology of learning and memory. 78, 489-497 (2002).</li>
<li>Shires, K. L., Da Silva, B. M., Hawthorne, J. P., Morris, R. G., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+capture+in+the+living+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and capture in the living rat.</a> Nature communications. 3, (2012).</li>
<li>Ramachandran, B., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+the+actin+network+and+its+effect+on+long-term+potentiation+and+synaptic+tagging+in+hippocampal+CA1+neurons+in+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interfering with the actin network and its effect on long-term potentiation and synaptic tagging in hippocampal CA1 neurons in slices in vitro.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12167-12173 (2009).</li>
<li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compartment-+and+process-specific+molecules+required+for+%27synaptic+tagging%27+during+long-term+potentiation+and+long-term+depression+in+hippocampal+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of compartment- and process-specific molecules required for 'synaptic tagging' during long-term potentiation and long-term depression in hippocampal CA1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 5068-5080 (2007).</li>
<li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Sacktor, T. C., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+cross-tagging%3A+the+role+of+protein+kinase+Mzeta+in+maintaining+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and cross-tagging: the role of protein kinase Mzeta in maintaining long-term potentiation but not long-term depression.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 5750-5756 (2005).</li>
<li>Redondo, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Tagging+and+Capture%3A+Differential+Role+of+Distinct+Calcium%2FCalmodulin+Kinases+in+Protein+Synthesis-Dependent+Long-Term+Potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic Tagging and Capture: Differential Role of Distinct Calcium/Calmodulin Kinases in Protein Synthesis-Dependent Long-Term Potentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 4981-4989 (2010).</li>
<li>Sajikumar, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-associativity%2C+synaptic+tagging%2C+and+the+role+of+dopamine+during+LTP+and+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+learning+and+memory%22%5BJournal%5D)">Late-associativity, synaptic tagging, and the role of dopamine during LTP and LTD.</a> Neurobiology of learning and memory. 82, 12-25 (2004).</li>
<li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis-dependent+long-term+functional+plasticity%3A+methods+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques.</a> Current Opinion in Neurobiology. 15, 607-613 (2005).</li>
<li>Villers, A., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+preparation+and+preservation+of+hippocampal+mouse+slices+for+a+very+stable+and+reproducible+recording+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>Pohle, W., Reymann, K., Jork, R., Malisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+experimental+conditions+on+the+morphological+preservation+of+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedica+biochimica+acta%22%5BJournal%5D)">The influence of experimental conditions on the morphological preservation of hippocampal slices in vitro.</a> Biomedica biochimica acta. 45, 1145-1152 (1985).</li>
<li>Reymann, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+duration+of+long-term+potentiation+in+the+CA1+region+of+the+hippocampal+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research+bulletin%22%5BJournal%5D)">The duration of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampal slice preparation.</a> Brain research bulletin. 15, 249-255 (1985).</li>
<li>Sajikumar, S., Korte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+compartments+of+apical+CA1+dendrites+have+different+plasticity+thresholds+for+expressing+synaptic+tagging+and+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Different compartments of apical CA1 dendrites have different plasticity thresholds for expressing synaptic tagging and capture.</a> Learning & Memory. 18, 327-331 (2011).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Synapses+Strong%3A+Metaplasticity+Prolongs+Associativity+of+Long-Term+Memory+by+Switching+Synaptic+Tag+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Making Synapses Strong: Metaplasticity Prolongs Associativity of Long-Term Memory by Switching Synaptic Tag Mechanisms.</a> Cerebral Cortex. 24, 353-363 (2014).</li>
<li>Sajikumar, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisomycin+inhibits+the+late+maintenance+of+long-term+depression+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro.</a> Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).</li>
<li>Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+neuropsin+%28KLK8%29-dependent+synaptic+associativity+in+the+hippocampal+pyramidal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron.</a> The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).</li>
<li>Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropsin+%28KLK8%29-dependent+and+-independent+synaptic+tagging+in+the+Schaffer-collateral+pathway+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).</li>
<li>Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+recently+potentiated+synaptic+inputs+reveals+a+winner-take-all+phase+of+synaptic+tagging+and+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).</li>
<li>Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+IV-specific+phosphodiesterase+inhibitor+rolipram+and+its+effect+on+hippocampal+long-term+potentiation+and+synaptic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).</li>
<li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nature. 14, 1413-1415 (2011).</li>
<li>Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cAMP+Simulate+a+Late+Stage+of+LTP+in+Hippocampal+CA1+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons.</a> Science. 260, 1661-1664 (1993).</li>
<li>Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+global+ischemia+and+recirculation+of+rat+brain+on+protein+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Brain+Dis%22%5BJournal%5D)">The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro.</a> Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).</li>
<li>Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+and+energy+metabolism+in+hippocampal+slices+during+extended+%2824+hours%29+recovery+following+different+periods+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Brain+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia.</a> Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).</li>
<li>Park, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-dependent+long-term+potentiation+comprises+a+family+of+temporally+overlapping+forms+of+synaptic+plasticity+that+are+induced+by+different+patterns+of+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131(2014).</li>
</ol>

Otwarty dostęp do tego artykułu wideo jest sponsorowany przez Cerebos Pacific Limited.

Ostry wycinek hipokampa jest doskonałym systemem modelowym do badania LTP i innych procesów plastyczności funkcjonalnej, takich jak STC i przechwytywanie krzyżowe. Zachowuje dużą część laminarnej sieci strukturalnej obwodów hipokampa, umożliwia precyzyjne lokalizowanie elektrod i oferuje wraz z otwartą platformą do szybkiej manipulacji neurofarmakologicznej bez bariery krew-mózg.
W artykule opisano metodologię przygotowania żywotnych ostrych wycinków hipokampa od młodych dorosłych szczurów i wykorzystania ich do badania STC i znakowania krzyżowego. Wcześniejsze badania podkreślały, że płeć i wiek zwierząt są ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu w badaniach elektrofizjologicznych. 27,28 Dlatego wykorzystuje się młode dorosłe zwierzęta z w pełni wyrażonymi dorosłymi funkcjami receptorowymi (samce szczurów rasy Wistar w wieku 5-7 tygodni). 23 U gryzoni zaobserwowano asymetrie w połączeniach między lewym i prawym hipokampem29, a także duże różnice w ekspresji receptora NMDA 34. Użyliśmy odpowiedniego hipokampa, aby zachować spójność z naszymi poprzednimi badaniami LTP. 23,32 Jednak każdy z hipokampów może być używany, o ile zachowana jest spójność.
Jak w każdym protokole, bardzo ważne jest, aby szybko wykonać procedury izolacji i krojenia, ale uważając, aby tkanka nie została rozciągnięta, uszkodzona, wysuszona lub niedotleniona. Różnice w pH, temperaturze i składzie jonowym roztworów mogą mieć ogromny wpływ na żywotność plastrów i wyniki. Dlatego należy unikać takich zmian. Zaobserwowano, że zależne od receptora glutaminianu uwalnianie wapnia zachodzące na etapach przygotowania może nieodwracalnie wpływać na syntezę białek w tkance nerwowej 35,36,37. Korzystanie z ręcznych krajalnic do tkanek może pomóc zminimalizować ten problem, umożliwiając bardzo szybkie zakończenie procesu w porównaniu z krajalnicami wibracyjnymi. Jednak wiele laboratoriów również skutecznie stosuje wibraslicery z zachowaniem niezbędnych środków ostrożności, aby zachować żywotność plastrów. Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest długi okres inkubacji przed rozpoczęciem eksperymentów. Zauważono, że jest to bardzo kluczowe dla osiągnięcia stabilności stanu metabolicznego i poziomów aktywacji kinaz w wycinkach po zakłóceniach spowodowanych podczas przygotowania 23. Taka stabilność jest niezbędna dla spójności w długoterminowych nagraniach. Ponownie kładziemy nacisk na tę obserwację i sugerujemy długie godziny inkubacji wynoszące około 3 godzin.
Wiadomo, że różne parametry stymulacji indukują LTP, ale mechanizmy molekularne wywoływane w każdym przypadku mogą nie być takie same (w celu zapoznania się z przeglądem, patrz 38). Może to wpływać na trwałość i inne cechy LTP, które z kolei mogą wpływać na wyniki eksperymentów z tagowaniem synaptycznym i przechwytywaniem. Dlatego ważne jest, aby zwalidować paradygmaty stymulacji i charakterystykę wywołanego LTP w warunkach laboratorium wykonującego i zachować spójność.
Generalnie nie bierzemy pod uwagę eksperymentów z bardzo dużymi presynaptycznymi salwami światłowodowymi i z maksymalnymi fEPSP mniejszymi niż 0,5 mV, a eksperymenty obejmujące istotne zmiany w salwie światłowodowej podczas nagrań są również odrzucane. Ponadto, podczas wykonywania eksperymentów dwu- lub trzyścieżkowych, ważne jest, aby zapewnić niezależność od ścieżki. Można to przeprowadzić za pomocą protokołu ułatwiania sparowanych impulsów28.
Jedną z wad systemów rejestracji interfejsowej jest tworzenie się kropelek kondensatu na elektrodach podczas długich godzin nagrywania ze względu na różnice temperatur i wilgotności między komorą a otoczeniem. Kropelki te należy od czasu do czasu ostrożnie osuszać. W przeciwnym razie kropelki mogą kapać na plastry i powodować zakłócenia, a nawet utratę sygnałów. Zwykle radzimy sobie z tym poprzez umiejętne osuszanie kropelek prowadzonych pod mikroskopem za pomocą cienkiego z bibuły filtracyjnej, bez dotykania elektrod. Jednak najlepszym rozwiązaniem byłoby zastosowanie scentralizowanego systemu grzewczego, takiego jak system ETC opracowany przez naukowców z Uniwersytetu w Edynburgu.
Podsumowując, w laboratoriach na całym świecie istnieje wiele metodologii, które są wykorzystywane do przygotowywania wycinków hipokampa do różnych celów eksperymentalnych. Każda z procedur ma pewne zalety w stosunku do drugiej. Należy starannie zoptymalizować najdrobniejsze szczegóły protokołu, aby dopasować je do celu eksperymentu. Mamy nadzieję, że ten artykuł pomoże w ulepszeniu niektórych aspektów metodologii badania procesów późnoasocjacyjnych, takich jak STC i przechwytywanie krzyżowe.

Kodowanie i przechowywanie informacji w mózgu nadal pozostaje najważniejszym i najchętniej poszukiwanym wyzwaniem w neurobiologii. Z biegiem lat długoterminowe wzmocnienie (LTP) i długotrwała depresja (LTD) stały się głównymi korelatami komórkowymi pamięci1,2. Te zmiany zależne od aktywności, które wykazują specyficzność wejściową i asocjację, skutkują stabilizacją śladów pamięciowych w sieciach neuronalnych 1,3,4. Utrzymanie dwóch form plastyczności synaptycznej wymaga syntezy produktów związanych z plastycznością (PRP)5-10. Specyficzność synaps, która obejmuje interakcję nowo zsyntetyzowanego białka tylko ze specyficznymi aktywowanymi synapsami wyrażającymi LTP lub LTD, ma kluczowe znaczenie dla pamięci. Specyfikę tę wyjaśnia koncepcja "Synaptic Tagging and Capture" (STC), w której PRP oddziałują z ostatnio aktywnymi, "oznakowanymi" synapsami11,12. Proces STC oferuje ramy dla asocjacyjnych właściwości wspomnień na poziomie komórkowym. Dostarcza nam ona pojęciowych podstaw do tego, w jaki sposób krótkotrwałe formy plastyczności przekształcają się w długotrwałe formy plastyczności w sposób asocjacyjny i zależny od czasu13.
Podczas procesu STC, silna tetanizacja w jednym wejściu, która prowadzi do zależnej od syntezy białek późnej LTP, skutkuje wzmocnieniem niezależnego od syntezy białek wczesnego LTP indukowanego w innym niezależnym wejściu do tej samej populacji neuronów w trwałą13. Ustawienie lokalnego znacznika synaptycznego przez przejściową aktywność neuronalną i synteza dyfuzyjnych PRP przez silną aktywność neuronalną to dwa kluczowe zdarzenia podczas STC13,14. Wychwytywanie PRP przez niedawno wzmocnione "oznakowane" synapsy ma zasadnicze znaczenie dla utrzymania długoterminowego wzmocnienia. Przeprowadzono wiele badań w celu potwierdzenia istnienia zjawiska STC15-17 i zidentyfikowania kandydatów na "znaczniki"18 i "PRPs"19. Kinaza białkowa zależna od wapnia/kalmoduliny II (CaMKII) i kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym1/2 (ERK1/2); CaMKIV, kinaza białkowa M (PKM) i neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) to tylko niektóre z cząsteczek kandydujących odpowiednio na "tag" i "PRP"19-21. Model znakowania synaptycznego został rozszerzony o pozytywne interakcje asocjacyjne między LTP i LTD - "synaptyczne tagowanie krzyżowe"22. W synaptycznym znakowaniu krzyżowym późne LTP / LTD w jednym wejściu synaptycznym przekształca przeciwne niezależne od syntezy białek wczesne LTD / LTP w niezależne wejście w jego długotrwałą formęlub odwrotnie 22. 
Przygotowanie plastrów hipokampa jest najczęściej używanym modelem w badaniach nad długoterminową plastycznością synaptyczną23,24. Znaczna część wiedzy na temat koncepcji znakowania synaptycznego i krzyżowego wynika z badań przeprowadzonych w regionie CA1 hipokampa, a ze względu na złożoność techniczną wiele laboratoriów nadal nie jest w stanie badać tych procesów. Warunki eksperymentalne przygotowania wycinków hipokampa szczura i rejestrowania stabilnego późnego LTP / LTD przez długie godziny są niezwykle ważne dla badania znakowania synaptycznego / krzyżowego23,25,26. W artykule opisano szczegółowe procedury eksperymentalne do badania długoterminowych procesów plastyczności, takich jak STC i znakowanie krzyżowe w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu stabilnych, długoterminowych zapisów potencjału pola z ostrych wycinków hipokampa szczurów.

<table><tbody><tr><td>I. Narzędzia</td><td></td><td></td><td></td>preparacyjne</tr><tr><td>1. Nożyczki do bandaży</td><td>KLS Martin, Niemcy</td><td>21-195-23-07</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap, Niemcy</td><td>LX553R</td><td></td></tr><tr><td>2. Nożyczki do tęczówki</td><td>B-Braun / Aesculap, Niemcy</td><td>BC140R,</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>BC100R</td><td></td></tr><tr><td>3. Bone rongeur</td><td>World Precision Instruments (WPI), Niemcy</td><td>14089-G</td><td></td></tr><tr><td>4. Scalpel</td><td>World Precision Instruments (WPI), Niemcy;</td><td>500236-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BB73</td><td></td></tr><tr><td>5. Ostrze skalpela#11</td><td>B-Braun/Aesculap, Niemcy</td><td>BB511</td><td></td></tr><tr><td>6. Skaler sierpowy</td><td>KLS Martin, Niemcy</td><td>38-685-00</td><td></td></tr><tr><td>7. Kleszcze kątowe</td><td>B-Braun/Aesculap, Niemcy</td><td>BD321R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8. Komora anestezjologiczna/indukcyjna</td><td>MIP Anesthesia Technologies (obecnie, Patterson Scientific), Oregon</td><td>AS-01-0530-LG</td><td></td></tr><tr><td>II. Substancje chemiczne</td><td></td><td></td><td></td>wchodzące w skład ACSF</tr><tr><td>1. Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>2. Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>3. Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4,7H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>4. Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>5. Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>6. Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>7. D-glukoza bezwodna (C6H12O6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>III. Instrumenty</td><td></td><td></td><td></td>do elektrofizjologii</tr><tr><td>1. Mikroskop</td><td>Olympus,</td><td>Japonia Model SZ61</td><td></td></tr><tr><td>2. Regulator temperatury</td><td>Scientific Systems Design Inc. Kanada</td><td>PTC03</td><td></td></tr><tr><td>3. Różnicowy wzmacniacz prądu przemiennego</td><td>AM Systems, USA</td><td>Model 1700</td><td></td></tr><tr><td>4. Izolowany stymulator impulsów</td><td>AM Systems, USA</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>5. Oscyloskop</td><td>Rhode & Schwarz</td><td>HM0722</td><td></td></tr><tr><td>6. Przetwornik cyfrowo-analogowy</td><td>Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, Wielka Brytania</td><td>CED-Power 1401-3</td><td></td></tr><tr><td>7. Interfejs Brain Slice Chamber</td><td>Scientific Systems Design Inc. Kanada</td><td>BSC01</td><td></td></tr><tr><td>8. Pompa wężykowa</td><td>Ismatec, Idex Health & Nauka, Niemcy</td><td>REGLO-Analog</td><td></td></tr><tr><td>9. Przepływomierz karbonowy</td><td>Cole-Parmer</td><td>03220-44</td><td></td></tr><tr><td>10. Oświetlacz światła</td><td>światłowodowego Dolan-Jenner Industries</td><td>Fiber Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>11. Mikromanipulatory</td><td>Marzhauser Wetzlar, Niemcy</td><td>00-42-101-0000 (MM-33)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>00-42-102-0000 (MM-32)</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Znakowanie i przechwytywanie synaptyczne (STC) oraz tagowanie krzyżowe to dwa ważne mechanizmy na poziomie komórkowym, które wyjaśniają, w jaki sposób specyficzność synaps i łączność są osiągane w neuronach w określonym przedziale czasowym. Te długoterminowe procesy związane z plastycznością są wiodącymi modelami kandydującymi do badania podstaw tworzenia i utrzymywania się pamięci na poziomie komórkowym. Zarówno STC, jak i znakowanie krzyżowe obejmują dwa procesy szeregowe: (1) ustawienie znacznika synaptycznego jako wyzwalanego przez określony wzorzec stymulacji oraz (2) przechwytywanie synaptyczne, w którym znacznik synaptyczny oddziałuje z nowo zsyntetyzowanymi białkami związanymi z plastycznością (PRP). Duża część wiedzy na temat koncepcji STC i krzyżowego znakowania wynika z badań przeprowadzonych w regionie CA1 hipokampa, a ze względu na złożoność techniczną wiele laboratoriów nadal nie jest w stanie badać tych procesów. Warunki eksperymentalne przygotowania wycinków hipokampa i rejestrowania stabilnego późnego LTP/LTD są niezwykle ważne dla badania znakowania synaptycznego/krzyżowego. Ten artykuł wideo opisuje procedury eksperymentalne do badania długoterminowych procesów plastyczności, takich jak STC i znakowanie krzyżowe w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu stabilnych, długoterminowych zapisów potencjału pola z ostrych wycinków hipokampa szczurów.

Opisana metodologia była wykorzystywana do badania długotrwałych form LTP/LTD oraz ich oddziaływań asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne (synaptic tagging) i przechwytywanie krzyżowe (cross-capture), w ostrych skrawkach hipokampa dorosłych szczurów.23 Technika ta okazała się skuteczna w eksperymentach zarówno na szczurach (Wistar), jak i na różnych szczepach myszy30,31. Metodologia ta została z sukcesem zastosowana do stabilnych pomiarów LTP trwających do 8-12 h.32
„Znacznik” ustanowiony przez słabą tetanizację jednego wejścia (S1) przechwytuje „PRPs” indukowane przez silną tetanizację innego, niezależnego, lecz nakładającego się wejścia (S2; rycina 3B, pełne koła), przekształcając w ten sposób w S1 zanikającą formę LTP (wczesne LTP) w formę trwałą (rycina 3B, puste koła>) (w celu porównania wczesnego LTP indukowanego przez WTET patrz 20,33). PRPs przechwytywane przez znacznik ustanowiony słabą tetanizacją nie muszą pochodzić z późnego LTP indukowanego przez STET, lecz mogą być również dostarczone przez późne LTD indukowane przez SLFS. Ten rodzaj pozytywnej interakcji asocjacyjnej między LTP a LTD określa się mianem „cross-tagging/capture”. Wczesne LTP indukowane przez WTET w S1 zostaje wzmocnione do postaci późnego LTP (rycina 3C, puste koła>) poprzez przechwycenie PRPs dostarczonych przez późne LTD indukowane przez SLFS w S2 (rycina 3C, pełne koła>). Statystycznie istotna potencjacja lub depresja została utrzymana w S1 i S2 w obu przypadkach w porównaniu z ich własną linią bazową (test Wilcoxona; P &lt; 0.05).
Aby doszło do interakcji tag-PRP, czasowa kolejność dwóch zdarzeń (słaby przed silnym/silny przed słabym) nie jest kluczowa, o ile okno czasowe między tymi zdarzeniami mieści się w przedziale 30-60 minut. Wskazane byłoby uwzględnienie trzeciego, niezależnego, ale nakładającego się wejścia synaptycznego i wykorzystanie go jako kontroli bazowej do monitorowania stabilności rejestracji. Protokoły stymulacji elektrycznej stosowane do indukowania wczesnych i późnych form LTP/LTD muszą zostać zwalidowane w eksperymentach z jednym wejściem pod kątem spójności i niezawodności przed ich zastosowaniem w eksperymentach STC. Chcielibyśmy również podkreślić znaczenie metodologii przygotowania skrawków opisanej w protokole, ponieważ sukces tych eksperymentów w dużym stopniu zależy od jakości skrawków.
<img alt="Surgical instrument setup, dissection and incision method diagram; tools for anatomical research." src="/files/ftp_upload/53008/53008fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1. (A) Narzędzia wykorzystywane podczas dyssekcji hipokampa: (a) Nożyczki opatrunkowe (b) Nożyczki irydologiczne (c) Kleszcze do kości (d) Cienka szpatułka, (e) Skalpel nr 11 (f) Skrobacz w kształcie sierpa (g) Pędzel malarski z miękkim włosiem (h) Plastikowa pipeta Pasteura (i) papier filtracyjny (85 mm) (j) papier filtracyjny (30 mm) (k) Zlewki szklane (l) Aluminiowe bloki chłodzące dopasowane do szalek Petriego i zlewek (m) Szalka Petriego. (B) Ręczny siekacz do tkanek. (a) Platforma (b) Ramie tnące z uchwytem ostrza (c) Mikrometr noniuszowy o rozdzielczości 10 mikronów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Konfiguracja stanowiska do elektrofizjologii; sprzęt do patch-clamp; przygotowanie do analizy neuronów." src="/files/ftp_upload/53008/53008fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Układ elektrofizjologiczny do rejestracji potencjałów polowych składający się z (A) stymulatorów (b) wzmacniacza różnicowego (c) przetwornika analogowo-cyfrowego (d) oscyloskopu (e) komputera z oprogramowaniem akwizycyjnym (f) stołu odpornego na wibracje (g) mikroskopu z powiększeniem &gt;4x (h) komory interfejsowej do przekrojów mózgu (i) systemu perfuzyjnego do podawania ACSF i karbogenu (j) kontrolera temperatury (k) źródła światła (l) manipulatorów z uchwytami elektrod. (B) Komora interfejsowa do przekrojów mózgu. (C) &amp; (D) Przekroje hipokampa w komorze interfejsowej. (E) Elektroda ze stali nierdzewnej zamknięta w kapilarze szklanym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat drogi hipokampa i wykres plastyczności synaptycznej, pomiary polowego EPSP, wyniki elektrofizjologiczne." src="/files/ftp_upload/53008/53008fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. (A) Schematyczna reprezentacja poprzecznego przekroju hipokampa i położenia elektrod do rejestracji potencjałów polowych: Na tym schemacie dwie elektrody stymulujące (S1 i S2) są rozmieszczone w stratum radiatum obszaru CA1 w celu stymulacji dwóch niezależnych, ale nakładających się wejść synaptycznych do neuronów piramidowych CA1. Dwie elektrody rejestrujące zewnątrzkomórkowe, jedna do rejestracji polowego EPSP (pobudzającego potencjału postsynaptycznego) z przedziału dendrytów apikalnych, a druga do rejestracji somatycznego impulsu populacyjnego z ciał neuronów piramidowych, znajdują się odpowiednio w stratum radiatum i stratum pyramidale. CA1 – obszar cornu ammonis 1, CA3 – obszar cornu ammonis 3, DG – zakręt zębaty, SC – włókna kolaterali Schaffera, S1 – elektroda stymulująca 1, S2 – elektroda stymulująca 2. (B) Paradygmat „słaba przed silną” do badania STC: Słaba tetanizacja (WTET) jest przyłożona do S1 (otwarte kółka) w celu wywołania wczesnego LTP, a następnie silna tetanizacja (STET) S2 (pełne kółka) w 30 min w celu wywołania późnego LTP. Wczesne LTP w S1 zostaje wzmocnione do późnego LTP, co wykazuje interakcję znakowania i przechwytywania (n = 6). (C) Paradygmat „słaba przed silną” do badania krzyżowego znakowania (cross-tagging): Wczesne LTP jest wywoływane przez WTET w S1 (otwarte kółka), a następnie wywołuje się późne LTD w S2 (pełne kółka) przy użyciu SLFS po 30 min. W S1 wczesne LTP przekształca się w późne LTP trwające 6 hr, co wykazuje krzyżowe znakowanie i przechwytywanie (n = 6). Pojedyncza strzałka reprezentuje słabą tetanizację zastosowaną w celu wywołania wczesnego LTP. Potrójna strzałka reprezentuje silną tetanizację w celu wywołania późnego LTP. Przerywana strzałka reprezentuje punkt czasowy, w którym SLFS został zastosowany do reprezentatywnego wejścia synaptycznego w celu wywołania późnego LTD. Słupki błędów wskazują SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie długoterminowej plastyczności oraz procesów asocjacyjnych, takich jak tagowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowe tagowanie w neuronach obszaru CA1 hipokampa, z wykorzystaniem skrawków hipokampa gryzoni. Cel ten osiąga się poprzez najpierw przeprowadzenie sekcji mózgu i szybką izolację hipokampa w zimnym, natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Drugim krokiem jest przygotowanie ostrych skrawków hipokampa przy użyciu ręcznego slicera do tkanek i ich inkubacja w komorze interfejsowej.Kolejne dwie elektrody stymulujące i dwie elektrody rejestrujące są umieszczane w obszarze CA1 w celu rejestracji fEPSP oraz odpowiedzi w postaci kolców populacyjnych z dwóch wejść synaptycznych. Ostatnim krokiem jest indukowanie przejściowej formy plastyczności w jednym wejściu synaptycznym oraz trwałej formy plastyczności w drugim wejściu w określonym oknie czasowym. Ostatecznie rejestrowane są odpowiedzi fEPSP z obu wejść przez dłuższy czas, aby zbadać mechanizmy przechwytywania znaczników synaptycznych (synaptic tagging capture) oraz przechwytywania krzyżowego (cross capture).Oznaczanie i przechwytywanie synaptyczne (synaptic tagging and capture) stanowią podstawę koncepcyjną procesu przekształcania pamięci krótkotrwałej w pamięć długotrwałą w określonym przedziale czasowym. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki eksperymentalne są trudne do opanowania ze względu na konieczność stymulacji i rejestracji sygnałów z wielu wejść synaptycznych. Procedurę zaprezentują studenci studiów doktoranckich z mojego laboratorium: Mahesh Shira, machete i maima Sharma.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować A CSF i napowietrzyć go mieszaniną 95% oxygen i 5% carbon dioxide. Dno komory interfejsowej należy wypełnić wodą destylowaną do około 70% jej pojemności. Następnie należy włączyć kontroler temperatury ustawiony na 32 °C.Następnie płucz górną komorę przez 10 do 15 minut, przepuszczając wodę destylowaną przez przewód dopływowy z wysokim natężeniem przepływu, a następnie przełącz na A CSF z natężeniem przepływu 1 ml/min. Następnie umieść siatkę w górnej komorze, aby zapewnić powierzchnię spoczynkową dla skrawków. Rozpocznij przepływ karbogenu do dolnej komory i zanurz przewód dopływowy w A CSF, który jest stale napowietrzany karbogenem.Odczekać 20 minut, aż A CSF zostanie nasycony karbogenem i wypełni górną komorę. Na tym etapie zamontować ostrze brzytwy w przecinarce do tkanek i upewnić się, że krawędź tnąca jest równo wyrównana. Sprawdzić działanie, przecinając mały kawałek papieru filtracyjnego, aby upewnić się, że ostrze jest mocno zamocowane.Następnie ustaw przesuwny mikrometr z noniuszem w pozycji początkowej. Teraz pobierz głowę uśpionego szczura i za pomocą nożyczek irydowych wykonaj cięcie przez tylną część czaszki, aby usunąć pień mózgu. Następnie wykonaj małe nacięcie wzdłuż prawej strony czaszki oraz dłuższe nacięcie po lewej stronie.Ostrożnie usuń czaszkę za pomocą narzędzia do usuwania kości (bone UR), zaczynając od lewej strony i przesuwając się w stronę prawą. Aby odsłonić korę oraz cienką warstwę pokrywającej ją opony twardej, ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą cienkiej szpatułki, a następnie usuń płytki czołowe za pomocą narzędzia do usuwania kości (bone Ro). Następnie usuń pozostałą oponę twardą, szczególnie w miejscu połączenia kory z móżdżkiem, za pomocą płaskiego końca szpatułki, unikając uszkodzenia mózgu poprzez utrzymywanie nacisku skierowanego ku górze.Za pomocą szpatułki delikatnie przenieś mózg do szalki Petriego umieszczonej na aluminiowym bloku chłodzącym wypełnionym zimnym i nasyconym dwutlenkiem węgla A CSF. Aby wyizolować hipokamp, użyj skalpela nr 11 i wykonaj proste cięcie w celu usunięcia móżdżku oraz kolejne cięcie, aby usunąć jedną czwartą przedniej części mózgu. Następnie wykonaj płytkie cięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej, zaczynając od linii środkowej.Ostrożnie usuń korę za pomocą skalera w kształcie sierpa, aby odsłonić grzbietową część hipokampa. Następnie usuń warstwę kory znajdującą się nad hipokampem. Wykonaj niewielkie nacięcie w obrębie spójki hipokampa.Delikatnie usuń hipokamp za pomocą skrobaka w kształcie sierpa, zaczynając od końca grzbietowego i wykonując ruchy obrotowe. Następnie usuń korę oraz tkanki łączną wokół wyizolowanego hipokampa, używając zakrzywionego końca skrobaka. Aby pokroić tkankę hipokampa, umieść kawałek 30 milimetrowego papieru filtracyjnego Watman nasączonego CSF na platformie tnącej manualnej mikrotomii.Przenieś tkankę hipokampa na papier filtracyjny. Używając płaskiego końca skalpela w kształcie sierpa, przesuń papier filtracyjny tak, aby ustawić hipokamp w odpowiedniej orientacji względem ostrza szaika, tak aby hipokamp został przekrojony pod kątem około 70 stopni względem osi fia. Następnie osusz nadmiar roztworu otaczającego tkankę hipokampa.Za pomocą złożonego papieru filtracyjnego należy wykonać poprzeczne skrawki hipokampa, odrzucając tkankę z jego skrajnego końca, gdzie morfologia skrawka nie jest wyraźna. Następnie pozostałą tkankę należy pociąć na skrawki o grubości 400 micron, regulując noniusz mikrometru po każdej serii cięć. Po każdym cięciu należy delikatnie przenieść skrawek z ostrza za pomocą pędzla z miękkim włosiem do małego zlewki wypełnionej zimnym carbonated A CSF.Następnie delikatnie przenieś plastry na siatkę w komorze do plastrów, używając czystej plastikowej pipety Pasteura. Za pomocą szerkiej końcówki ostrożnie ustaw pozycję plastrów w sposób ułatwiający lokalizację elektrod i sprawdzenie rejestracji, upewniając się, że plastry są w wystarczającym stopniu otoczone warstwą A CSF, ale nie są całkowicie zanurzone. Po tym czasie przykryj komorę i inkubuj plastry przez dwie do trzech godzin w eksperymentach dotyczących znakowania i przechwytywania synaptycznego.Pod mikroskopem umieść dwie elektrody stymulujące w stratum radiatum obszaru CA1, aby stymulować włókna kolaterali Schaffera, oraz elektrodę rejestrującą w obszarze dendrytów apikalnych CA1, w połowie odległości między elektrodami stymulującymi. Aby zarejestrować odpowiedzi fEPSP, umieść kolejną elektrodę rejestrującą w warstwie stratum pyramidale w celu rejestracji kolca populacyjnego.Gdy wszystkie elektrody dotkną skrawka, przeprowadź stymulację testową, aby upewnić się, że w obu wejściach można uzyskać prawidłowy sygnał EPSP. Po uzyskaniu odpowiedniego sygnału EPSP ostrożnie obniż elektrody o około 200 mikronów, korzystając z pokręteł precyzyjnego przesuwania manipulatorów. Następnie odczekaj 20 minut, aby skrawek mógł się zregenerować.Następnie określ relację wejście-wyjście, mierząc nachylenie polowego EPSP w zakresie natężeń prądu od 20 microamps do 100 microamps. Następnie dla każdego wejścia ustaw natężenie stymulacji wywołujące 40% maksymalnego nachylenia polowego EPSP jako stałą stymulację w trakcie całego eksperymentu. Po 15 do 20 minutach rozpocznij rejestrację linii bazowej; zarejestruj stabilną linię bazową przez co najmniej 30 do 60 minut przed indukcją L-T-P-L-T-D w jednym wejściu, a następnie zindukuj wczesne LTP, stosując słaby protokół tetin składający się z pojedynczej stymulacji o wysokiej częstotliwości.Podczas gdy drugi wejściowy sygnał nadal rejestruje poziom bazowy 30 minut po indukcji wczesnego LTP, wywołaj późne LTP w wejściu S dwa, stosując silny protokół tetin obejmujący powtarzaną stymulację o wysokiej częstotliwości z odstępem między seriami wynoszącym 10 minut. Następnie rejestruj odpowiedzi polowych EPSP przez dłuższy czas, aby wykazać przekształcenie wczesnego LTP w wejściu S jeden w późne LTP poprzez synaptyczne znakowanie i przechwytywanie (synaptic tagging and capture). Podobnie, w eksperymencie z przechwytywaniem krzyżowym, najpierw wywołaj wczesne LTP w jednym wejściu, a następnie po 30 minutach indukuj późne LTD w innym wejściu, stosując silny protokół stymulacji o niskiej częstotliwości składający się z 900 serii w ciągu 15 minut.Następnie rejestruj odpowiedzi EPSP polowe przez dłuższy czas, aby wykazać przekształcenie wczesnego LTP w wejściu S1 w późne LTP poprzez wzajemne przechwytywanie. W tym układzie dwie elektrody stymulujące są umieszczone w warstwie radiatym (stratum radiatum) obszaru CA1, aby stymulować dwa niezależne, lecz nakładające się wejścia synaptyczne. Do neuronów piramidalnych CA1 wprowadzono dwie zewnątrzkomórkowe elektrody rejestrujące.Jedna służy do rejestracji F-E-P-S-P z obszaru dystalnych dendrytów, a druga do rejestracji somatycznego potencjału seryjnego z ciał komórek piramidalnych, które znajdują się odpowiednio w stratum radiatum i stratum pyramidale. Rysunek ten przedstawia paradygmat słabej stymulacji poprzedzającej silną w celu badania zjawiska tagowania i przechwytywania synaptycznego.Słaba tetyzacja jest stosowana w S jeden w celu wywołania wczesnego LTP, po której następuje silna tetyzacja S dwa po 30 minutach w celu wywołania późnego LTP; rycina ta przedstawia schemat słaby przed silnym paradygmatem w celu zbadania przekazywania znaczników (cross tagging). Wczesne LTP jest indukowane przez słabą tetyzację w S jeden, po której następuje indukcja późnego LTD w S dwa przy użyciu silnego protokołu stymulacji o niskiej częstotliwości. Po 30 minutach w S jeden wczesne LTP przekształca się w późne LTP trwające sześć godzin, co wykazuje zjawisko przekazywania i przechwytywania znaczników (cross tagging and capture).Po opanowaniu, ta technika sekcji i przygotowania plastrów może być wykonana bardzo szybko, w czasie od trzech do pięciu minut. Dzięki temu możliwe jest zachowanie żywotności plastrów do długotrwałych pomiarów. Stosując tę metodę, można również badać wpływ różnych czynników farmakologicznych na procesy znakowania i przechwytywania synaptycznego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat prowadzenia długoterminowych eksperymentów nad plastycznością funkcjonalną oraz procesów znakowania i wychwytywania synaptycznego.

investigation-synaptic-taggingcapture-cross-capture-using-acute

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje metodę rejestrowania odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura. Przedstawiono w nim kroki związane z umieszczeniem elektrod stymulujących i rejestrujących na wycinku hipokampa oraz pomiarem pobudzającego potencjału postsynaptycznego pola (fEPSP) w celu oceny siły odpowiedzi synaptycznej.

Rejestrowanie odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Lokalizacja i dystrybucja białek dostarcza ważnych informacji dla zrozumienia ich funkcji komórkowych. Doskonała rozdzielczość przestrzenna mikroskopii elektronowej (EM) może być wykorzystana do określenia subkomórkowej lokalizacji danego antygenu po immunohistochemii. W przypadku tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zachowanie integralności strukturalnej przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości było szczególnie trudne w badaniach EM. Tutaj przyjmujemy procedurę, która została...

Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Udostępniamy szczegółowy protokół indukcji długotrwałego wzmocnienia w regionie CA1 hipokampa i późniejszej izolacji frakcji wzbogaconych jądrowo z obszaru tetanizowanego wycinka. Podejście to można wykorzystać do określenia zależnego od aktywności importu białek jądrowych w komórkowych modelach uczenia się i pamięci.

Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Poznaj metody badania plastyczności synaptycznej i mechanizmów znakowania oraz przechwytywania w neuronach piramidalnych CA1 przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni. Technika ta umożliwia zrozumienie procesów konsolidacji pamięci.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Przeglądaj więcej filmów