Modele myszy do miażdżycy przeszczepów
14 maja 2013
Opisujemy protokoły dla naszych modeli miażdżycy przeszczepów myszy (GA), które polegają na wprowadzeniu segmentu naczynia myszy do biorcy tego samego szczepu wsobnego. Poprzez krzyżowanie wsteczne dodatkowych zmian genetycznych z dawcą naczynia, model może ocenić wpływ określonych genów na GA.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeszczepienie naczynia dawczego do aorty brzusznej biorcy. Pierwszym krokiem jest wypreparowanie aorty piersiowej od myszy dawcy. Kolejne miejsca zespolenia tworzone są w aorcie brzusznej myszy biorcy.
Naczynie dawcze jest następnie wszczepiane do aorty brzusznej biorcy. Ostatecznie, udany przeszczep może być dostępny dzięki nienaruszonej funkcji motorycznej kończyny tylnej myszy biorcy. Ten model pomoże nam zrozumieć patogenezę stwardnienia tętniczego przeszczepu.
I jest to wyzwanie techniczne, które wymaga dużo praktyki i pacjenta, aby był doskonały. Tak więc procedurę zademonstruje dr Chen i asystent Louanne. Na początek potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia u myszy dawcy.
Po znieczuleniu umieść mysz w pozycji leżącej na tacy pod mikroskopem operacyjnym. Oczyść klatkę piersiową wielokrotnym szorowaniem jodu i alkoholu po odsłonięciu serca i przepłukaniu go solą fizjologiczną, usuń serce i płuca, aby odsłonić całą długość aorty piersiowej. Po wizualizacji zacznij ostrożnie wycinać aortę piersiową z dala od otaczającej tkanki.
Po dotarciu do gałęzi lędźwiowych podwiąż je w pobliżu aorty jedwabnym szwem przed ich odcięciem. Po uwolnieniu od otaczającej tkanki wyciąć całą aortę piersiową. Po wyizolowaniu przepłucz aortę dawcy heparynizowaną solą fizjologiczną i przechowuj ją w tym roztworze na lodzie do czasu przeszczepu.
Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia u myszy biorcy, należy zgolić sierść z przedniej części brzucha. Zakryj oczy maścią okulistyczną i oczyść obszar, jak pokazano wcześniej. Gdy będziesz gotowy, umieść mysz w pozycji leżącej na tacy pod mikroskopem operacyjnym.
Naciąć ścianę brzucha na linii środkowej od mieczyka mieczykowatego do łonowego, a następnie użyj retraktora, aby rozsunąć ścianę i odsłonić jamę brzuszną Po odsłonięciu owiń jelita w gazę zwilżoną solą fizjologiczną i wypchnij je do góry i odsuń od jamy brzusznej. Użyj gazy zwilżonej solą fizjologiczną, aby owinąć pozostałe obszary brzucha i użyj jej, aby cofnąć odbytnicę na prawą stronę brzucha. Następnie przesuń narządy rozrodcze niżej.
Pamiętaj, aby odsłonięte tkanki były wilgotne poprzez stosowanie roztworu soli fizjologicznej. Regularnie identyfikuj aortę podnerkową położoną proksymalnie do naczynia nerkowego i dystalnie do rozwidlenia aorty. Dokładnie go rozbior, aby oddzielić go od żyły dolnej cva.
Zidentyfikuj podwiązanie i odetnij wszystkie małe gałęzie pochodzące z tego odcinka aorty. Po odizolowaniu odcinka aorty umieść zacisk naczyniowy na każdym końcu w odległości około pięciu milimetrów od siebie. Następnie utwórz miejsca zespolenia, przecinając aortę brzuszną między zaciskami.
Za pomocą ostrych mikronożyczek wyetnij mały fragment aorty z jednego odciętego końca, aby pomieścić przeszczep aorty dawcy. Przepłukać segmenty aorty między zaciskami za pomocą heparynizowanej soli fizjologicznej, aby usunąć resztki krwi. Należy pamiętać o okresowym przepłukiwaniu obu próbek aorty heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej przez cały czas trwania zabiegu.
Następnie należy przeciąć obie strony aorty dawcy, aby utworzyć segment przeszczepu o długości 2,5 milimetra do przeszczepu. Umieść przeszczep aorty dawcy w pozycji wyrównującej bliższy i dalszy koniec dla szwów ciągłych. Najpierw umieść szwy podporowe w pozycjach godziny trzeciej i dziewiątej na obu końcach.
Następnie połącz przycięte krawędzie za pomocą trzech do czterech szwów biegnących i przywiąż szwy biegnące do szwów podporowych podwójnym węzłem dla szwów przerywanych. Zbuduj cztery miejsca zespolenia w pozycjach godziny trzeciej i dziewiątej po obu stronach przeszczepu. Pierwszy. Następnie połącz przycięte krawędzie za pomocą trzech do czterech ściegów umieszczonych między każdym z tych miejsc.
Po założeniu szwów zwolnij dystalny zacisk, aby umożliwić wsteczny przepływ do przeszczepu. Zidentyfikuj wszelkie miejsca krwawienia i wykonaj dodatkowe szwy w ciągu trzech minut. Po osiągnięciu zadowalającej hemostazy zwolnij proksymalny clamp amp.
Drożność przeszczepów można potwierdzić obecnością silnej pulsacji. Jeśli pulsacja zmniejszy się, wstrzyknąć heparynę do naczynia, aby zapobiec zakrzepicy. Gdy będziesz gotowy, włóż jelita z powrotem do jamy brzusznej i zszyj warstwy mięśni i skóry.
Umieść mysz biorcy w ciepłej, czystej klatce i monitoruj przez jedną do dwóch godzin, aż powróci przytomność. Oceń funkcję motoryczną myszy po wyzdrowieniu i ponownie, drugiego dnia, operacja przeszczepu zakończy się sukcesem, jeśli nie zaobserwuje się dysfunkcji kończyn tylnych. Analiza histologiczna przeszczepów tętnic pobranych cztery tygodnie po operacji wykazała zwiększoną grubość ściany naczynia u kobiet, które otrzymały dawcę płci męskiej.
Nie zaobserwowano jednak miażdżycy przeszczepów w grupie mężczyzn do mężczyzn. W tym przykładzie tętnica piersiowa od dawcy płci męskiej została przeszczepiona do myszy z nokautem interferonu gamma z nokautem gamma, a następnie indukowana u myszy biorcy. Przed pobraniem próbek.
Kilka tygodni później analiza histologiczna przeszczepów tętnic wykazała, że w grupie leczonej nie zaobserwowano miażdżycy przeszczepów. Teraz już wiesz, jak wykonać tę operację. Próbuj dalej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokoły dla modelu tętniczego miażdżycy przeszczepu u myszy, koncentrując się na transplantacji naczynia dawcy do myszy biorcy. Model ten ma na celu ocenę wpływu konkretnych zmian genetycznych na miażdżycę tętnicy w przeszczepie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia naczyniowa
- Genetyka
Wstęp
- Stwardnienie tętnic przeszczepu (GA) to stan chorobowy dotykający przeszczepione naczynia krwionośne.
- Zrozumienie czynników genetycznych wpływających na GA może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Modele mysie są niezbędne do badania patogenezy chorób naczyniowych.
- W niniejszym badaniu wykorzystano konkretną linię myszy w celu zapewnienia spójnego tła genetycznego.
Cel badania
- Opracowanie modelu do badania stwardnienia tętnic przeszczepu.
- Ocena wpływu modyfikacji genetycznych na rozwój GA.
- Zwiększenie zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw niewydolności przeszczepów naczyniowych.
Zastosowane metody
- Wypreparowanie aorty piersiowej od myszy dawcy.
- Przygotowanie miejsc anastomozy w aorcie brzusznej myszy biorcy.
- Implantacja naczynia dawcy do aorty brzusznej biorcy.
- Ocena funkcji motorycznych kończyn tylnych w celu zweryfikowania sukcesu transplantacji.
Główne wyniki
- O udanej transplantacji świadczy zachowana funkcja motoryczna kończyn tylnych.
- Model ten umożliwia ocenę wpływów genetycznych na stwardnienie tętnic przeszczepu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia patogenezy GA.
- Potencjalne implikacje w zakresie poprawy przeżywalności i funkcji przeszczepu.
Wnioski
- Model tętniczości przeszczepu u myszy jest cennym narzędziem w badaniach genetycznych.
- Zdobyta wiedza może prowadzić do lepszego zarządzania przeszczepami naczyniowymi.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć wiedzę na temat czynników genetycznych wpływających na GA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Miażdżyca przeszczepu pozostaje główną przyczyną długoterminowego niepowodzenia transplantacji, napędzaną proliferacją komórek mięśni gładkich w intimie przeszczepu. Obecne modele przedkliniczne często zawodzą z powodu szybkiej, immunologicznie zapośredniczonej utraty przeszczepu, co ogranicza badania mechanistyczne. Opisane modele mysie rozwiązują ten problem, umożliwiając długotrwałe przeżycie komórek dawcy oraz patologię zależną od IFN-γ, co wspiera walidację celów i redukcję ryzyka mechanistycznego w badaniach nad przeszczepami naczyniowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie genetycznych i cytokinowych czynników napędzających proliferację komórek o fenotypie mięśni gładkich w przebiegu ludzkiej waskulopatii przeszczepu.
- Wartość operacyjna: Pozwala na zachowanie pochodzących od dawcy komórek naczyniowych przez wiele tygodni, co umożliwia podłużną ocenę modulacji celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia powtarzalny model chirurgiczny do ilościowego określenia pogrubienia intimy jako funkcjonalnego wskaźnika aktywności szlaku sygnałowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowany przeszczep naczynia z mierzalną funkcją kończyny tylnej jako punktem końcowym oceny żywotności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Naśladuje patogenezę tętnicowej miażdżycy przeszczepu u ludzi poprzez zależną od IFN-γ ekspansję mięśni gładkich, bez zakłóceń wynikających z ostrego odrzucenia.
- Wartość operacyjna: Kompatybilna z krzyżowaniem wstecznym w celu oceny specyficznych dla genów efektów w progresji GA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając badania mechanistyczne przyczyn niepowodzeń przeszczepów naczyniowych przed optymalizacją wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników genetycznych i immunomodulacyjnych w patologii przeszczepu.
- Przesiew: Dostarcza ilościowych wyników histologicznych (grubość ściany naczynia) do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Analityka: Umożliwia korelację ekspozycji na IFN-γ lub modyfikacji genetycznych ze zmianami fenotypowymi w naczyniach krwionośnych przeszczepu.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje istotne dla choroby przebudowy naczyniowe w celu przełożenia wyników na ludzką waskulopatię allograftu.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę transplantacji naczyniowej do iteracyjnej oceny celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność zaangażowania celu poprzez mierzalną patologię intimy w kontrolowanym tle genetycznym.
- Wartość operacyjna: Zstandardyzowana procedura mikrochirurgiczna z określonymi kryteriami sukcesu (funkcja kończyny tylnej) i walidacją histologiczną.
- Wartość strategiczna: Skraca czas biologicznego ograniczania ryzyka dzięki umożliwieniu modelowania przewlekłego odrzucania bez ostrej utraty przeszczepu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje go/no-go poprzez wczesne ujawnianie modyfikatorów genetycznych trwałości przeszczepu na etapie odkryć.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii naczyniowej oraz pooperacyjnej opieki nad myszami.
- Zależne od zachowania zasad aseptyki, perfuzji roztworem soli fizjologicznej z heparyną oraz precyzji szycia w celu zachowania drożności przeszczepu.
- Wymaga dopasowania szczepu genetycznego (np. C57BL/6J) oraz podania cytokin za pomocą wektorów adenowirusowych w modelach IFN-γ.
- Ograniczone do transplantacji aorty brzusznej bez niedokrwienia; nieodpowiednie dla modeli koronarnych lub interpozycyjnych tętnic wymagających wyższej tolerancji ciśnienia.
- Analiza histologiczna w 4 tygodniach po transplantacji jest niezbędna do oceny pogrubienia intimy, co wpływa na harmonogram projektu badania.
