Name: Modele myszy do miażdżycy przeszczepów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj protokół przeszczepu naczyń u myszy w modelu miażdżycy przeszczepów, obejmujący preparatykę aorty i anastomozę. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników genetycznych na patogenezę zwężenia tętnic przeszczepionych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH przyznaje R01 HL109420 dla WM i AHA 9320033N dla LY.

Model przeszczepu allogenicznego i przeszczepu syngenicznego u myszy
Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komitety ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania na Uniwersytecie Yale. W przypadku modelu przeszczepu allogenicznego segmenty aorty piersiowej samców, 4-5 tygodniowych myszy WT (C57BL/6J) lub IFN-γR-KO zostały wprowadzone do aorty brzusznej biorczyni w wieku 8-12 tygodni WT przy użyciu kompleksowej techniki zespolenia mikrochirurgicznego (szczegóły poniżej). W przypadku modelu przeszczepu syngenicznego segmenty aorty piersiowej od samców, 4-5 tygodniowych myszy WT zostały wprowadzone do aorty brzusznej samca, 8-12 tygodniowego IFN-γR1-KO przy użyciu kompleksowej techniki zespolenia mikrochirurgicznego. Po 1 tygodniu od operacji zwierzętom zaszczepiono dożylnie Ad5.CMV-mysz IFN-γ lub Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) w dawce 1 x 109 PFU. Poziomy IFN-γ w surowicy myszy mierzono metodą ELISA (eBioscience) po 1 i 5 tygodniach od podania adenowirusa. Niektóre zwierzęta otrzymywały BrdU (Sigma-Aldrich) w dawce 100 mg/kg s.c. przez 2 tygodnie przed uśmierceniem.
Kompleksowa technika zespolenia mikrochirurgicznego (Wideo zostanie nagrane na potrzeby tej części):
1. Procedura dawcy
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy dawców za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).</li>
	<li>Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia umieść myszy dawcy pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu X8-30 na tacy w pozycji leżącej na plecach i użyj podkładki jodowej i podkładki alkoholowej do przygotowania ściany klatki piersiowej.</li>
	<li>Naciąć przednią ścianę klatki piersiowej przez żebra i przeponę, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Otwórz prawy przedsionek, wstrzyknij 10 ml heparynizowanego (100 j./ml) roztworu soli fizjologicznej do lewej komory, aby przepłukać myszy za pomocą 10-milimetrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 25.</li>
	<li>Wyciąć serce i płuca, aby odsłonić całą długość aorty piersiowej.</li>
	<li>Dokładnie wypreparuj aortę piersiową, aby zminimalizować bezpośredni uraz, jednocześnie identyfikując, podwiązując i dzieląc gałęzie drewna za pomocą szwu 11-0 w pobliżu aorty.</li>
	<li>Gdy aorta piersiowa jest wolna od otaczających tkanek, należy wyciąć całą aortę piersiową do przeszczepu.</li>
	<li>Przepłukać odcięty koniec aorty dawcy heparynizowanym (100 j./ml) roztworem soli fizjologicznej i przechowywać go w tym samym roztworze na lodzie (do 6 godzin) do czasu przeszczepu.</li>
</ol>
2. Procedura odbiorcy
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszom biorcom ip ketoprofen (5 mg / kg) w celu znieczulenia, a następnie znieczulić myszy ip ketaminą (50 mg / kg) i ksylazyną (10 mg / kg). Myszy biorcy są głęboko znieczulone w ciągu 10 minut przez 60-90 minut. Podczas zabiegu poziom znieczulenia ocenia się co 15 minut, ściskając przednią ścianę brzucha lub stopę za pomocą kleszczy. Jeśli zwierzę zareaguje na szkodliwe bodźce w dowolnym momencie podczas operacji, dodatkowa dawka ketaminy i ksylazyny (1/4 lub 1/3 dawki pierwotnej) zostanie podana przez s.c. lub domięśniowo.</li>
	<li>Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia należy zgolić sierść w przedniej części brzucha za pomocą golarki elektrycznej, oczyścić skórę za pomocą Jodine Prep Pad i Alcohol Prep Pad, zakryć oczy maścią okulistyczną. Podczas operacji zostaną zastosowane następujące techniki aseptyki, w tym czyszczenie stołu operacyjnego 10% wybielaczem, noszenie sterylnych rękawiczek i używanie wysterylizowanych narzędzi mikrochirurgicznych (narzędzia sterylizowane parą na początku operacji, a następnie narzędzia sterylizowane gorącymi szklanymi kulkami między wieloma operacjami itp.).</li>
	<li>Umieść myszy biorców pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu X8-30 na tacy w pozycji leżącej.</li>
	<li>Naciąć ścianę brzucha na linii środkowej od ksylfoidalności do kości łonowej i rozsunąć ścianę brzucha za pomocą mikroretraktora, aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
	<li>Cofnij jelita wyżej i owiń gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Myszy biorcy zostają wychłodzone przez utratę ciepła przez uzewnętrznione jelita. Ważne jest, aby utrzymać ciepło zwierząt. Jednak płyta grzewcza nie jest używana podczas operacji, ponieważ umiarkowana hipotermia jest korzystna w zapobieganiu urazom kręgosłupa podczas niedrożności przepływu krwi w aorcie, a także występuje nieefektywny transfer ciepła przy braku przepływu krwi do dolnej połowy ciała myszy.</li>
	<li>Przesuń narządy rozrodcze niżej, owiń obszary brzucha myszy biorców gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej i użyj jej do cofnięcia odbytnicy na prawą stronę brzucha. Odsłonięte tkanki są okresowo nawadniane roztworem soli fizjologicznej podczas przeszczepu.</li>
	<li>Dokładnie wypreparuj tępo odcinek aorty podnerkowej między naczyniem nerkowym a rozwidleniem aorty dystalnie i oddzielnie od żyły głównej dolnej (IVC).</li>
	<li>Zidentyfikuj i podwiąż wszystkie małe gałęzie pochodzące z tego segmentu aorty brzusznej za pomocą nici monofilamentowej z poliamidu 11-0.</li>
	<li>Zacisnąć krzyżowo izolowany segment aorty brzusznej za pomocą dwóch zacisków naczyniowych oddalonych od siebie o 5 mm, po jednym na każdym końcu.</li>
	<li>Przeciąć aortę brzuszną między zaciskami za pomocą ostrych mikronożyczek, aby utworzyć miejsca zespolenia.</li>
	<li>Należy wyciąć mały odcinek aorty brzusznej (do 0,4 mm długości) z jednego odciętego końca przeciętej aorty biorcy, aby pomieścić przeszczep aorty dawcy.</li>
	<li>Przepłukać segmenty aorty między zaciskami za pomocą heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć pozostałą krew. Odcinki aorty między klamrami a przeszczepem aorty dawcy są okresowo przepłukiwane heparynizowanym (100 U/ml) roztworem soli fizjologicznej (do 40 ml/kg) podczas zespolenia.</li>
	<li>Przeciąć obie strony aorty dawcy ostrymi mikronożyczkami, aby utworzyć segment przeszczepu o długości 2,5 mm do przeszczepu.</li>
	<li>Umieścić przeszczep aorty dawcy w pozycji ortotopowej, zespoleć bliższy i dalszy koniec przeszczepu dawcy z bliższym i dalszym końcem cięcia biorcy odpowiednio z bliższym i dalszym końcem cięcia aorty brzusznej, z wzorem od końca do końca przy użyciu nici z monofilamentu poliamidowego 11-0.</li>
	<li>W przypadku szwów ciągłych najpierw umieść szwy rozwleczone w pozycjach godziny 3 i 9. Pomiędzy dwoma szwami odciągowymi po każdej stronie przeszczepu, zespol obie krawędzie cięcia w 3-4 szwach za pomocą szwów biegnących i zawiąż szwy biegnące, aby szwy pozostały podwójnym węzłem. Ponieważ obie warstwy zamknięcia są ciągłe, zwiększa się ryzyko rozejścia się. Przeszczep aorty dawcy powinien mieć odpowiednią długość, aby połączyć proksymalny i dystalny koniec aorty brzusznej biorcy.</li>
	<li>W przypadku przerwanych szwów należy najpierw wykonać cztery zespolenia na godzinie 3 i 9 po obu stronach przeszczepu, a następnie zespoleć oba przecięte krawędzie w 3-4 szwach między dwoma szwami podciągowymi po każdej stronie przeszczepu.</li>
	<li>Zwolnij dystalny zacisk, aby umożliwić wsteczny przepływ do przeszczepu, zidentyfikuj miejsca krwawienia i wykonaj dodatkowe szwy w ciągu 3 minut.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że hemostaza jest zadowalająca, zwolnij proksymalny zacisk.</li>
	<li>Potwierdzić drożność przeszczepu przez obecność energicznej pulsacji w przeszczepie i bliższym sąsiednim segmencie natywnej aorty brzusznej, w szczególności w dystalnym sąsiednim odcinku aorty brzusznej i tętnicy krezkowej dolnej. Należy rozważyć zakrzepicę w miejscach zespolenia, jeśli pulsacja zmniejsza się w ciągu kilku minut po przywróceniu przepływu krwi.</li>
	<li>Wróć jelita do jamy brzusznej.</li>
	<li>Szew zamyka ścianę brzucha za pomocą nylonowego szwu 5-0 odpowiednio w warstwie mięśniowej i warstwie skóry.</li>
	<li>Umieść myszy biorcy w czystej klatce na poduszce grzewczej i odczekaj 1-2 godziny, aż myszy odzyskają przytomność i dojdą do siebie po znieczuleniu. Ważne jest, aby podczas rekonwalescencji utrzymać zwierzę w odpowiednim cieple. Trzymaj myszy w ciepłej i suchej klatce, zanim zwierzę obudzi się ze znieczulenia.</li>
	<li>Oceń funkcję motoryczną kończyn tylnych po wyzdrowieniu myszy i ponownie drugiego dnia. Udana operacja przeszczepu zostanie potwierdzona, jeśli w drugim dniu nie zaobserwuje się dysfunkcji kończyn tylnych u myszy biorców.</li>
	<li>Podawać myszom biorcy ketoprofen w wodzie pitnej (5 mg/kg/d = 27 ug/ml w wodzie pitnej) przez 48 godzin. Jeśli którakolwiek z myszy biorców cierpi z powodu bólu, którego nie złagodziły pooperacyjne leki przeciwbólowe, o czym świadczy utrata mobilności, brak pielęgnacji, nieprawidłowa postawa itp., zostaną poddane eutanazji. Zwierzęta zostaną poddane eutanazji w określonych punktach końcowych po 1-60 dniach.</li>
</ol>
Analiza przeszczepu
Przeszczepy tętnic w alloprzeszczepie zostały pobrane po 4 tygodniach, a przeszczepy w modelu przeszczepu syngenicznego były 6 tygodni po operacji (5 tygodni po infekcji wirusowej) i przeanalizowane za pomocą standardowych technik histologicznych dla barwienia Elastica-van Gieson (EVG), barwienia hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwienia immunofluorescencyjnego. Zdjęcia wykonano przy użyciu mikroskopu immunofluorescencyjnego (Zeiss). Liczenie komórek w jądrach otoczonych dodatnim barwieniem immunologicznym przeprowadzono w dużym powiększeniu i uśredniono z 5 przekrojów dla każdego przeszczepu. Pomiary powierzchni przeszczepu światła (w obrębie śródbłonka), błony wewnętrznej (między śródbłonkiem a wewnętrzną blaszką elastyczną, IEL), pożywki (między IEL a zewnętrzną blaszką elastyczną, EEL), grubości ścianki (między śródbłonkiem a zewnętrzną blaszką elastyczną) i całego naczynia (w obrębie EEL) obliczono na podstawie 5 szeregowych przekrojów poprzecznych w odległości 150 μm od siebie dla każdego przeszczepu, przy użyciu wspomaganej komputerowo analizy obrazu i obrazu NIH 1.60 (<a href="http://rsbweb.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/nih-image</a>).
Analiza statystyczna
Wszystkie dane są wyrażone jako średnia ± SEM. Dwustronne, sparowane testy t oraz dwukierunkowa analiza ANOVA zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania Prism (GraphPad Software). Różnice w stosunku do P<0,05 uznano za wskazujące na istotność statystyczną.

<ol><li>George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+mouse+models+and+the+molecular+mechanisms+of+post-transplant+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease.</a> J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).</li>
<li>Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+minor+histocompatibility+antigens+in+the+development+of+allograft+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).</li>
<li>Libby, P., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Chronic rejection.</a> Immunity. 14, 387-397 (2001).</li>
<li>Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allogeneic+vascular+rejection+after+arterial+transplantation+and+peripheral+lymphoid+reconstitution+in+severe+combined+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice.</a> Transplantation. 67, 897-903 (1999).</li>
<li>Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracardiac+progenitor+cells+repopulate+most+major+cell+types+in+the+transplanted+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart.</a> Circulation. 112, 2951-2958 (2005).</li>
<li>Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allograft+arteriopathy%3A+pathogenesis+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Allograft arteriopathy: pathogenesis update.</a> Cardiovasc. Pathol. 13, 33-40 (2004).</li>
<li>Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+vascular+disease%3A+immune+response+meets+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall.</a> Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).</li>
<li>Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteriosclerosis+after+T-cell-mediated+injury+in+transplanted+mouse+hearts%3A+role+of+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma.</a> Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).</li>
<li>Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+deficiency+prevents+coronary+arteriosclerosis+but+not+myocardial+rejection+in+transplanted+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts.</a> J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).</li>
<li>Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+transplant+arteriosclerosis+in+murine+cardiac+allografts+placed+in+interferon-gamma+knockout+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients.</a> Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).</li>
<li>Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Coronary+Transplantation-Associated+Arteriosclerosis+-+Evidence+for+a+Chronic+Immune+Reaction+to+Activated+Graft+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells.</a> Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).</li>
<li>Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+some+females+reject+males%3F+The+molecular+basis+for+male-specific+graft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection.</a> J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).</li>
<li>Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+bone-marrow+cells+are+a+source+of+donor+intimal+smooth-+muscle-like+cells+in+murine+aortic+transplant+arteriopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy.</a> Nat. Med. 7, 738-741 (2001).</li>
<li>Tellides, G., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+axis+in+graft+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis.</a> Circ. Res. 100, 622-632 (2007).</li>
<li>Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+elicits+arteriosclerosis+in+the+absence+of+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes.</a> Nature. 403, 207-211 (2000).</li>
<li>Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloimmunity+and+nonimmunologic+risk+factors+in+cardiac+allograft+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy.</a> Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+induces+human+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion+by+phosphatidylinositol+3-kinase+dependent+mammalian+target+of+rapamycin+raptor+complex+1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation.</a> Circ. Res. 101, 560-569 (2007).</li>
<li>Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+plays+a+nonredundant+role+in+mediating+T+cell-dependent+outward+vascular+remodeling+of+allogeneic+human+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries.</a> Faseb J. 18, 606-608 (2004).</li>
<li>Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+vascular+rejection%3A+histologic+comparison+between+two+murine+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models.</a> Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).</li>
<li>Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenic+activity+of+interferon+gamma+on+growth-arrested+human+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells.</a> Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).</li>
<li>Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP1+prevents+graft+arteriosclerosis+by+inhibiting+IFN-%CE%B3-dependent+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cir.+Res%22%5BJournal%5D)">AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion.</a> Cir. Res. 109, 418-427 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisane protokoły koncentrują się na mysich modelach GA. Procedury te mogą być stosowane do innych modeli przeszczepów przeszczepów. Modele te obejmują humanizowany ksenoprzeszczep (tj. ludzkie segmenty tętnicy wieńcowej umieszczone w aorcie podnerkowej myszy z niedoborem odporności) oraz mysi model GA z ostrym odrzuceniem (tj. aorta myszy z jednego szczepu genetycznego do innego biorcy szczepu genetycznego). Opisane przez nas modele myszy są bardziej zbliżone do zamykania zmian w ludzkim GA na. Pierwsz...

Miażdżyca tętnic (GA), zwana również waskulopatią alloprzeszczepu, jest zmianą patologiczną, która rozwija się przez miesiące lub lata w przeszczepionych narządach, charakteryzującą się rozlanym, obwodowym zwężeniem całego drzewa naczyniowego przeszczepu 7. Wczesne stadia mogą powodować zwężenia ekscentryczne i ogniskowe, które są bardziej widoczne w tętnicach, a tym samym bardziej przypominają zwężenia obserwowane w konwencjonalnej miażdżycy. Utrata światła naczyń przeszczepu wynika z rozszerzenia błony wewnętrznej w wyniku infiltracji limfocytów T gospodarza i makrofagów, a zwłaszcza akumulacji macierzy zewnątrzkomórkowej i komórek przypominających mięśnie gładkie pochodzących z przeszczepu, gospodarza lub obu 5, 13, 19, które nie są odpowiednio kompensowane przez przebudowę naczynia na zewnątrz. W przeszczepach allogenicznych serca najbardziej istotnymi klinicznie zmianami są te w tętnicach wieńcowych nasierdziowych i wewnątrzmięśniowych. Ostatecznie GA tętnic wieńcowych spowoduje niedokrwienną niewydolność serca. GA jest główną przyczyną późnej utraty przeszczepu serca. Zwężenia GA zatrzymują się na liniach szwów, silnie sugerując odpowiedź gospodarza na alloantygeny przeszczepu w jego patogenezie i prowadząc nas do sklasyfikowania GA jako formy przewlekłego odrzucenia 3. Jednak inne formy uszkodzenia tętnic mogą zwiększać ryzyko GA, albo poprzez zwiększenie obciążenia netto urazem, albo poprzez intensyfikację i/lub modulację odpowiedzi alloimmunologicznej. Wyściółka komórek śródbłonka (EC) tętnic przeszczepowych jest zachowana w ludzkim GA, a najbardziej powierzchowne obszary błony wewnętrznej przylegające do wyściółki EC są miejscem najsilniej naciekanym przez limfocyty T i makrofagi wytwarzające IFN-γ pochodzące od gospodarza 11; u niektórych pacjentów GA jest związane z rozwojem alloprzeciwciał specyficznych dla dawcy, które wiążą się z przeszczepem EC 16, ale naczynia wykazują niewiele dowodów na martwicę fibrynoidu, która jest charakterystyczna dla ostrego odrzucenia za pośrednictwem przeciwciał 11.
Najbardziej krytycznym składnikiem patogenezy GA jest proliferacja komórek podobnych do mięśni gładkich w obrębie błony wewnętrznej; jeśli ten proces może zostać zatrzymany, jest mało prawdopodobne, aby GA postępowało. Wcześniejsze prace naszej grupy wykazały, że błony wewnętrzne ludzkich segmentów tętnic wieńcowych umieszczone w aorcie podnerkowej myszy z niedoborem odporności rozszerzają się w odpowiedzi na adoptywnie przeniesione ludzkie limfocyty T allogeniczne do dawcy tętnicy i że proces ten można zahamować przez neutralizację ludzkiego IFN-γ 18. Ponadto egzogenny ludzki IFN-γ może powodować proliferację komórek mięśni gładkich naczyń wewnętrznych (i przyśrodkowych) w tych przeszczepach tętniczych przy braku ludzkich limfocytów T 15, 17. (Ważne jest, aby pamiętać, że człowiek i mysz IFN-γ nie krzyżują gatunków, co wyklucza pośredni wpływ na mysiego gospodarza w tym eksperymentalnym systemie). Te humanizowane modele mysie mają tę zaletę, że rekapitulują interakcje między ludzkimi komórkami T a komórkami naczyniowymi, a zmiany w błonie wewnętrznej są w dużej mierze zbudowane z komórek ludzkich (tj. pochodzących ze szczepu), jak zaobserwowano w próbkach klinicznych, ale nie podsumowują w pełni sytuacji klinicznej, ponieważ ignorują rolę makrofagów gospodarza i prawdopodobnie innych typów komórek zaangażowanych w kliniczne zmiany po przeszczepie. Konwencjonalny mysi model tego procesu mógłby teoretycznie rozwiązać ten problem, uzupełniając ograniczenia humanizowanego modelu poprzez zaangażowanie kompletnego układu odpornościowego gospodarza i zapewniając dodatkową korzyść w postaci umożliwienia zastosowania mocy mysich podejść genetycznych do GA. Dwa najczęściej stosowane modele mysie obejmują heterotopowy przeszczep serca i przeszczep tętnicy ortotopowej 1. Zmiany, które rozwijają się w tętnicach heterotopowych przeszczepów serca, składają się w dużej mierze z komórek gospodarza, prawdopodobnie pochodzących ze szpiku kostnego, podczas gdy komórki wewnętrzne tętnic w przeszczepach ludzkiego serca są głównie pochodzenia przeszczepowego 5, 13, 19. Jest to znaczące wyróżnienie, które skłoniło nas do opracowania alternatywnych modeli myszy. Wprowadzenie aorty myszy z jednego szczepu do innego biorcy szczepu myszy jest jeszcze bardziej ograniczone jako model przewlekłego odrzucenia u ludzi, ponieważ ostra reakcja odrzucenia za pośrednictwem komórek w tym modelu mysim całkowicie eliminuje wszystkie komórki naczyniowe pochodzące od dawcy z przeszczepu w ciągu dwóch-trzech tygodni. W związku z tym późniejsze zmiany obserwowane w segmencie naczynia wstawionego są wyłącznie reakcją komórek gospodarza, które ponownie zasiedliły rusztowanie naczynia zdekomórkowego, tworząc wysoce sztuczną sytuację o ograniczonym znaczeniu jako model zmian w naczyniach przeszczepu, które zachodzą w klinice. Niedawno opracowaliśmy dwa nowe modele myszy, aby obejść te problemy 21. Pierwszy model polega na wprowadzeniu segmentu naczynia od samca myszy do samicy biorczyni tego samego szczepu wsobnego (C57BL/6J). Drugi model polega na wprowadzeniu odcinka tętnicy od dawcy myszy C57BL/6J typu dzikiego do myszy gospodarza tego samego szczepu i płci, która nie ma receptora dla IFN-γ (IFN-γR-KO), a następnie podanie mysiego IFN-γ (dostarczonego w wyniku zakażenia wątroby myszy wektorem adenowirusowym). Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły i zalety naszych modeli GA myszy.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6J (H-2b)</td> <td>Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td> <td>000664</td><td>Dawca (5 tygodni) Biorca (8-12 tygodni)</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań </td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td>Roztwór do przechowywania (50 mg / ml) Roztwór roboczy (5 mg / ml)</td></tr><tr><td> Sterylny roztwór ksylazyny</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td>Roztwór do przechowywania (100 mg / ml) Roztwór roboczy (1 mg / ml)</td></tr> <tr><td>Ketoprofen</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td>Roztwór do przechowywania (100 mg / ml) Roztwór roboczy - doustnie (0,027 mg / ml)</td></tr> <tr><td>Heparyna Sodium</td><td>Sagent Pharmaceticals</td><td>NDC 25021-400</td><td>Roztwór do przechowywania (1000 U / ml) Roztwór roboczy (100 U / ml)</td></tr> <tr><td>Roztwór soli fizjologicznej (sterylne 0,9% Chlorek sodu)</td><td>CareFusion</td><td>AL4109</td><td></td></tr><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td>Aby przygotować znieczulającą </td></tr><tr><td>wazelinę Maść oftalmiczna </td><td>Dechra Produkty weterynaryjne</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Jodowe podkładki przygotowawcze </td><td>Triada jednorazowe, Inc.</td><td>NDC 50730-3201-1</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki do przygotowywania alkoholu</td><td>McKesson Corp.</td><td>NDC 68599-5805-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5693</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>FST</td><td>15009-08</td><td>Do transekcji aorty dawcy lub biorcy </td></tr><tr><td>Bardzo wąskie nożyczki</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły/kleszcze</td><td>MICRINS</td><td>MI1542</td><td>Do trzymania igły</td></tr><tr><td>Kleszcze drobne</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>LANCASTER Wziernik do oczu</td><td>Zepf Medical Instruments</td><td>42-1209-07</td><td></td></tr><tr><td>Klips do mikronaczyń krwionośnych</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-6472</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Nakładanie kleszczy z zamkiem</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5440</td><td></td></tr><tr><td>poliamidowy szew monofilamentowy</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>Cat #T4A10Q07</td><td>10-0 szew, igła = 70 mikronów</td></tr><tr><td>monofilamentowy nylonowy szew</td><td>syneturowy (Covidien)</td><td>SN-1956</td><td>6-0 szew</td></tr><tr><td>włókninowy Songes</td><td>McKesson Corp.</td><td>Numer 94442000</td><td></td></tr> 1 ml <tr><td>Strzykawka</td><td></td> BD <td>REF 309659</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>REF 309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>REF 309604</td><td></td></tr><tr><td>18G 1 1/2, Igła podskórna</td><td>BD</td><td>REF 305196</td><td></td></tr><tr><td>25G 7/8, Igła podskórna</td><td>BD</td><td>REF 305124</td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2, Igła podskórna</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td></td></tr><tr><td>30G 1/2, igła podskórna</td><td>BD</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Hearting Pad</td><td>Sunbeam</td><td>Z-1228-001</td><td></td></tr><tr><td>Trymer</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Specjalne odczynniki i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

modele myszy do miażdżycy przeszczepów

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Miażdżyca tętnic (GA), zwana także vaskulopatią alloprzeszczepu, jest zmianą patologiczną, która rozwija się przez miesiące lub lata w przeszczepionych narządach, charakteryzującą się rozlanym, obwodowym zwężeniem całego drzewa naczyniowego przeszczepu. Najbardziej krytycznym składnikiem patogenezy GA jest proliferacja komórek przypominających mięśnie gładkie w obrębie błony wewnętrznej. Gdy ludzki odcinek tętnicy wieńcowej zostanie umieszczony w aorcie podnerkowej myszy z niedoborem odporności, błony wewnętrzne mogą zostać rozszerzone w odpowiedzi na adoptywnie przeniesione ludzkie limfocyty T allogeniczne do dawcy tętnicy lub egzogennego ludzkiego IFN-γ przy braku ludzkich limfocytów T. Wprowadzenie aorty myszy z jednego szczepu do innego biorcy szczepu myszy jest ograniczone jako model przewlekłego odrzucenia u ludzi, ponieważ ostra reakcja odrzucenia za pośrednictwem komórki w tym modelu mysim całkowicie eliminuje wszystkie komórki naczyniowe pochodzące od dawcy z przeszczepu w ciągu dwóch-trzech tygodni. Niedawno opracowaliśmy dwa nowe modele myszy, aby obejść te problemy. Pierwszy model polega na wprowadzeniu segmentu naczynia od samca myszy do samicy biorczyni tego samego szczepu wsobnego (C57BL/6J). Odrzucenie przeszczepu w tym przypadku jest skierowane tylko przeciwko niewielkim antygenom zgodności tkankowej kodowanym przez chromosom Y (obecnym u mężczyzny, ale nie u kobiety), a następująca po tym reakcja odrzucenia jest wystarczająco powolna, aby zachować komórki mięśni gładkich pochodzące od dawcy przez kilka tygodni. Drugi model polega na wprowadzeniu odcinka tętnicy od dawcy myszy C57BL/6J typu dzikiego do myszy gospodarza tego samego szczepu i płci, która nie ma receptora dla IFN-γ, a następnie podaniu mysiego IFN-γ (dostarczanego przez zakażenie wątroby myszy wektorem adenowirusowym. W tym przypadku nie ma odrzucenia, ponieważ zarówno myszy dawcy, jak i biorcy są tego samego szczepu i płci, ale komórki mięśni gładkich dawcy proliferują w odpowiedzi na cytokinę, podczas gdy komórki pochodzące od gospodarza, pozbawione receptora dla tej cytokiny, nie reagują. Poprzez krzyżowanie wsteczne dodatkowych zmian genetycznych z dawcą naczynia, oba modele mogą być wykorzystane do oceny wpływu określonych genów na progresję GA. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły dla naszych modeli GA myszy.

Model tętnicowego miażdżycowania allograftu (GA) u myszy: W tym modelu aorta od samca-donora jest przeszczepiana samicy-biorcy, co powoduje indukcję alloreaktywnych odpowiedzi alloimmunologicznych zależnych od limfocytów T przeciwko mniejszemu antygenowi Y (męskiemu specyficznemu mniejszemu antygenowi zgodności tkankowej H-Y) ekspresjonowanemu na przeszczepie 12, a w konsekwencji produkowany przez limfocyty T IFN-γ napędza proliferację VSMC 20, co obserwowano w innych modelach trans...

Opisujemy protokoły dla naszych modeli miażdżycy przeszczepów myszy (GA), które polegają na wprowadzeniu segmentu naczynia myszy do biorcy tego samego szczepu wsobnego. Poprzez krzyżowanie wsteczne dodatkowych zmian genetycznych z dawcą naczynia, model może ocenić wpływ określonych genów na GA.

Modele myszy do miażdżycy przeszczepów

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeszczepienie naczynia donora do aorty brzusznej biorcy. Pierwszym krokiem jest wypreparowanie aorty piersiowej od myszy donora. Następnie w aorcie brzusznej myszy biorcy tworzy się miejsca anastomozy.Następnie naczynie dawcy jest implantowane do aorty brzusznej biorcy. Ostatecznie sukces transplantacji można ocenić na podstawie zachowanej funkcji motorycznej kończyn tylnych myszy biorcy. Ten model pomoże nam zatem zrozumieć patogenezę miażdżycy tętnicy przeszczepu.Jest to wyzwanie techniczne, które wymaga dużej wprawy i cierpliwości, aby osiągnąć perfekcję. Procedurę zaprezentuje dr Chen z pomocą asystentki Louanne. Na początek należy potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia u myszy dawcy.Po znieczuleniu umieść mysz w pozycji grzbietowej na tacy pod mikroskopem operacyjnym. Oczyść klatkę piersiową, wielokrotnie przemywając ją jodyną i alkoholem po odsłonięciu serca i przepłukaniu go solą fizjologiczną, a następnie usuń serce i płuca, aby odsłonić całą długość aorty piersiowej. Po jej zlokalizowaniu rozpocznij ostrożne oddzielanie aorty piersiowej od otaczających tkanek.Po dotarciu do odgałęzień lędźwiowych należy je podwiązać n

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modele myszy przeszczepowego zwężenia tętnic

Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Pokazujemy nowy model podwiązania tętniczego w mięśniu rdzeniowo-trapezowym myszy, w tym procedurę krok po kroku i opis wymaganego oprzyrządowania. Opisujemy operację i istotne pomiary wyników związane z przebudową sieci naczyniowej i funkcjonalnym rozszerzeniem naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii przyżyciowej i konfokalnej.

Mysi model rdzeniowo-trapezowy do oceny wpływu podwiązania tętniczek na funkcję i przebudowę mikrokrążenia

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Opisujemy protokół szczepienia interpozycji aorty u myszy. Celem protokołu jest dostarczenie modelu, za pomocą którego można badać procesy patologiczne i strategie terapeutyczne związane z reakcjami alloimmunologicznymi w tętnicach i wynikającymi z nich zmianami tętniczymi, które przyczyniają się do niewydolności przeszczepu narządu.

Mysi model odrzucenia naczyniowego indukowanego alloimmunologicznie i miażdżycy tętnic po przeszczepie

Prezentujemy model ortotopowego przeszczepu aorty przy użyciu techniki rękawowej u myszy. Jest to bardzo szybka metoda zespolenia, która może być stosowana w badaniach nad chorobami naczyniowymi.

Zastosowanie techniki rękawowej w mysim modelu przeszczepu aorty - film instruktażowy

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

Pokazujemy chemiczne indukowanie dużego rozszerzenia naczyń krwionośnych u myszy jako model do badania dysfunkcji naczyń mózgowych, który może być wykorzystany do modelowania demencji naczyniowej i choroby Alzheimera. Demonstrujemy również wizualizację układu naczyniowego poprzez wstrzykiwanie mieszanki kauczuku silikonowego i zapewnianie jasnych wizualnych wskazówek dotyczących pomiaru zmian wielkości naczyń krwionośnych.

Wizualne podejście do wywoływania dolichoektazji u myszy w celu modelowania dysfunkcji naczyń mózgowych za pośrednictwem dużych naczyń krwionośnych

Metoda igłowa asymetrycznego obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej wspólnej jest proponowana do stworzenia mysiego modelu dla naczyniowego zaburzenia poznawczego i demencji. Skutkuje długoterminowymi wynikami w porównaniu z wcześniej ustalonymi modelami i jest kompatybilny z MRI na żywo. Wizualna reprezentacja przedstawiająca procedurę stanowi wskazówkę do opanowania operacji.

Mysi model naczyniowych zaburzeń poznawczych i otępienia oparty na asymetrycznym obustronnym zwężeniu tętnicy szyjnej wspólnej prowadzonym igłą

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

Poznaj protokół przeszczepu naczyń u myszy w modelu miażdżycy przeszczepów, obejmujący preparatykę aorty i anastomozę. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników genetycznych na patogenezę zwężenia tętnic przeszczepionych.

Modele myszy do miażdżycy przeszczepów

Przeglądaj więcej filmów