Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybka aktywacja lub wyciszenie genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów w fizjologicznie istotnej skali czasowej. Osiąga się to poprzez dostarczenie wektora wirusowego przenoszącego transgeny, które kodują neuron niebieskiego światła aktywujący kanał opsyny lub neuron zielonego światła wyciszający opsynę halla do genetycznie zdefiniowanych neuronów. W drugim kroku budowana jest droga operacyjna emitująca światło, która składa się ze światłowodu przymocowanego do elektrody rejestrującej, co pozwala na jednoczesne dostarczanie światła i rejestrację elektryczną.

Następnie TRO jest umieszczany nad i opuszczany do obszaru mózgu transdukowanego przez Opsynę. W celu wywołania odpowiedzi za pośrednictwem opsyny kanałowej i opsyny ha, uzyskuje się wyniki, które pokazują indukowaną światłem aktywację i hamowanie neuronów transdukowanych kanałowo czerwoną i ha halliną w oparciu o technikę zapisu pojedynczej jednostki, która umożliwia rejestrację pojedynczych neuronów. Metoda ta odpowiada na fundamentalną potrzebę neurobiologii, pozwalając nam dokładnie określić, jak skuteczne może być światło w sterowaniu aktywnością neuronalną z rozdzielczością milisekundową i w określonych podtypach neuronalnych, a zademonstrowanie tego będzie przez Chin Nakamurę.

Staż podoktorski w moim laboratorium Upewnij się, że podczas przygotowywania i obchodzenia się z wirusem przestrzegane są procedury pierwszego poziomu bezpieczeństwa biologicznego oraz że przestrzegane są wszystkie lokalne i rządowe wytyczne dotyczące zwierząt. Przed wstrzyknięciem stereotaktycznym należy odczekać, aż porcja wirusa rozmrozi się na lodzie, a następnie na krótko odwirować. W wirówce stołowej powoli napełnij szklaną strzykawkę i igłę Hamiltona niewielką ilością silikonu lub oleju mineralnego.

Upewnij się, że w cylindrze strzykawki nie ma widocznych pęcherzyków powietrza. Włóż strzykawkę do pompy z mikrowtryskiwaczem i przymocuj pompę bezpośrednio do pionowego ramienia stereotaktycznego. Po ustawieniu probówki z podwielokrotnością wirusa w stabilnej pozycji, opuść ramię stereotaktyczne, aż końcówka igły dotknie dna probówki z podwielokrotnością wirusa.

Użyj sterownika pompy mikrowtryskiwacza, aby pobrać żądaną objętość wirusa. Po znieczuleniu szczura ketaminą i ksylazyną należy sprawdzić odruchową reakcję na uszczypnięcie palca u nogi, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia przy użyciu standardowych metod aseptycznych. Umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym po wykonaniu nacięcia w linii środkowej skóry na szczycie czaszki zwierzęcia za pomocą małych nożyczek chirurgicznych lub skalpela.

Delikatnie oddziel tkankę łączną i oczyść górną część czaszki małym skrobakiem do kości. Opuść wskazówkę i sprawdź, czy współrzędne Z dla bgma i lambda są równe, aby ustalić, że głowa jest wypoziomowana. Następnie przesuń ramię stereotaktyczne do współrzędnych odpowiadających interesującej nas strukturze mózgu.

Zaznaczyć zamierzone miejsce wstrzyknięcia pisakiem chirurgicznym. Użyj ręcznej wiertarki, aby ostrożnie przerzedzić czaszkę nad obszarem docelowym. Zatrzymaj się, gdy wiertło dotrze do dna czaszki i użyj pary bardzo cienkich kleszczy, aby usunąć przerzedzoną kość.

Po odsłonięciu opony twardej umieść igłę strzykawki nad obszarem docelowym i opuść igłę, aż dotknie opony twardej. I użyj tego punktu, aby obliczyć z. Skoordynuj teraz bardzo powoli opuść igłę do wstrzykiwania do mózgu, aż do osiągnięcia właściwej pozycji Z.

W tym protokole celem jest obszar przedlimbiczny przyśrodkowej kory przedczołowej. Wstrzyknij wirusa w tempie 0,1 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 10 minut przed wyjęciem igły, aby uniknąć cofania się wirusa na powierzchnię mózgu.

Po użyciu szwu do szycia z dołączoną igłą w celu uszczelnienia skóry, nałóż antybiotyki na ranę. Najpierw przymocuj elektrodę wolframową o impedancji od 1,5 megaoma do szklanej rurki kapilarnej za pomocą superglue. Następnie użyj narzędzia do zdejmowania izolacji z włókien, aby odsłonić goły koniec światłowodu wielomodowego i bardzo delikatnie wyczyść końcówkę światłowodu etanolem.

Naciąć końcówkę włókna diamentowym nożem w kształcie klina i za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie usunąć nadmiar włókna. Włókno powinno łatwo się rozszczepiać przy nacięciu. Użyj miernika mocy optycznej, aby zmierzyć intensywność lasera na końcówce światłowodu.

W przypadku nagrań in vivo natężenie światła wynoszące zaledwie 20 do 100 miliwatów na milimetr kwadratowy może niezawodnie wywołać odpowiednio aktywację lub wyciszenie aktywności neuronalnej za pośrednictwem kanału redsin lub halliny. Następnie włóż światłowód do rurki kapilarnej. Umieść końcówkę włókna około 500 mikronów nad końcówką elektrody wolframowej i zawiąż cienką nić szwu dwukrotnie w kilku punktach w pobliżu końcówki, tak aby elektroda i włókno były proste.

Upewnij się, że odległość między końcówką elektrody a najbliższym węzłem jest wystarczająco duża, aby można było wprowadzić ją do obszaru docelowego, jak pokazano tutaj. Przygotuj zwierzę do operacji jak poprzednio. Następnie użyj początkowej kraniotomii jako przewodnika, aby zrobić nowe, czyste, małe okienko w czaszce.

Do pozycjonowania tro. Użyj cienkiej igły, aby wykonać małe nacięcie na oponie twardej. Ostrożnie opuść TRO przez okienko czaszki i do mózgu do transdukowanego obszaru za pomocą manipulatora mikrom.

Następnie powoli przesuwaj teren w krokach od 10 do 50 mikronów, aż pojawi się komórka reagująca na światło. W tym przypadku niestandardowy interfejs użytkownika oprogramowania napisany w widoku laboratoryjnym służy do sterowania laserem z pojedynczą diodą oraz do wizualizacji i rejestrowania bieżącej aktywności neuronalnej. Nagrane sygnały są przechwytywane za pomocą wzmacniacza ex AMP 20 K filtrowanego w paśmie od 0,3 do ośmiu kiloherców i karty analogowo-cyfrowej krajowego instrumentu.

Interfejs użytkownika neuro lux Pro umożliwia wybór wejść analogowych i wyjść cyfrowych. Wybierz dwa kanały analogowe dla logiki tranzystora neuronalnego i tranzystorowego lub sygnału TTL. Ustaw częstotliwość próbkowania na 20 kiloherców, podstawowy okres przed oświetleniem na dwie sekundy, a okres po oświetleniu na dwie sekundy.

Następnie ustaw szerokość, częstotliwość i okres stymulacji laserowej stymulacji laserowej TTL. Tutaj częstotliwość wynosi 20 Hz, a okres stymulacji wynosi 500 milisekund, co oznacza, że dostarczanych jest 10 impulsów laserowych o określonej szerokości impulsu. Użytkownik może wybrać albo ciągłe dostarczanie światła, albo powtarzające się nagrania.

Mogą wybrać odstęp między impulsami i liczbę odkształceń impulsów. Dane można uzyskać z nagrywaniem na płytę lub bez niej Po nagraniu. Zwierzę jest uśmiercane zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, a tkanka mózgowa jest przetwarzana w celu sprawdzenia rozmieszczenia erozji i ekspresji opsyny, jak pokazano tutaj.

Ten zrzut ekranu interfejsu oprogramowania Neuro LX Pro skonfigurowanego do jednoczesnego dostarczania światła i nagrywania elektrofizjologicznego pokazuje wywołane przez Halla Roda Dobsona wyciszenie spontanicznej aktywności prelimbicznej komórki parametalowej rap w odpowiedzi na 10 sekund ciągłego dostarczania światła o długości 532 nanometrów. To zdjęcie pokazuje reprezentatywny wyraz hallo redsin w grzbietowej ulu. Schemat po prawej stronie przedstawia miejsce, w którym zostało zrobione zdjęcie.

Grot strzałki wskazuje położenie elektrody wolframowej, a strzałka wskazuje położenie światłowodu. To zdjęcie pokazuje reprezentatywną ekspresję opsyny kanałowej w korze przedlimbicznej. Ponownie, schemat po prawej stronie przedstawia miejsce, w którym zdjęcie zostało zrobione.

Grot strzałki wskazuje położenie elektrody wolframowej, a strzałka wskazuje położenie światłowodu. Ten przykładowy ślad zarejestrowany z kory przedlimbicznej szczura pokazuje kanał czerwony w dwóch wyzwalonych potencjałach czynnościowych w odpowiedzi na dostarczenie 20 herców niebieskiego 473 nanometra, impulsy świetlne przez 10 milisekund każdy, jak wskazuje niebieski pasek. Poniżej. Wykres rastrowy pokazuje indukowany kanałem czerwonozyny skok w sześciu reprezentatywnych neuronach.

Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Ten przykładowy ślad pokazuje indukowane przez opsynę halla tłumienie spontanicznej aktywności podczas ciągłego zielonego oświetlenia światłem o długości 532 nanometrów przez 10 sekund, jak wskazuje zielony pasek w tym samym obszarze mózgu. Wykres rastrowy pokazuje wyciszenie wywołane dozyną Hallera w sześciu reprezentatywnych neuronach.

Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Ten obraz pokazuje powtarzające się 20-kanałowe opsynowe wystrzeliwanie szczurzego neuronu parametalowego przed limpieniem in vivo, ślady napięciowe wywołanego światła, impulsy, uzyskane w punktach czasowych 0, 30, 60, 90 i 120 minut po rozpoczęciu nagrań, są wyświetlane po lewej stronie. Po prawej stronie znajduje się wykres rastrowy przedstawiający wszystkie 61 powtórzeń aktywacji wywołanej światłem.

Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Tutaj in vivo nagrania elektrofizjologiczne z transdukowanego przez Hallera Dosina grzbietowego sicm szczura są pokazane na górze. Przykładowy ślad pokazuje, że 10-sekundowe ciągłe oświetlenie o długości 532 nanometrów, wskazywane przez zielony pasek grzbietowej części ciała wyrażającego Halla Dobsona, eliminuje spontaniczną aktywność.

Poniżej znajdują się średnie przebiegi dwóch zarejestrowanych jednostek z powyższej ścieżki. Próg amplitudy został wykorzystany do identyfikacji dwóch odrębnych neuronów. Wreszcie wykres rastrowy pokazuje pięć powtórzeń wyciszania tych jednostek pod wpływem dozy Hallera.

Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Wreszcie, ten obraz pokazuje powtarzające się 20-kanałowe opsynowe wystrzeliwanie grzbietowego neuronu subularnego szczura in vivo ślady napięciowe wywołanego światła, skokowe, uzyskane w punktach czasowych 0, 30, 60, 90 i 120 minut. Po tym, jak początek nagrań jest pokazany po lewej stronie, wstawka poniżej pokazuje typową aktywność pękania tej komórki.

Wykres rastrowy po prawej stronie pokazuje wszystkie 61 powtórzeń aktywacji wywołanej światłem. Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Ta technika jest ważna, ponieważ pokazuje, że określone podtypy neuronalne mogą być aktywowane lub wyciszane przez długi czas.

W rzeczywistości wykazaliśmy, że możemy aktywować neurony na ponad dwie godziny i zastosować do. Ostatecznie celem byłoby zastosowanie tego do zachowującego się zwierzęcia u zwierząt, które wykonują zadania związane z uwagą lub pamięcią, abyśmy mogli aktywować określone obwody i zobaczyć, jak kontrolują one różne funkcje pamięci.