Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie innym badaczom, jak określić czynność nerek u obudzonych myszy. Osiąga się to poprzez pierwszą dializę, izotiocyjanian fluoresceiny lub inulinę FSE przez 24 godziny i określenie jej stężenia do wstrzyknięcia. Drugim krokiem jest zważenie myszy, przygotowanie dokładnych objętości fitzy inuliny do wstrzyknięcia dogałkowego i znieczulenie myszy.

Następnie wykonuje się wstrzyknięcie inuliny Fitzy Retrobulbar i pobiera się osiem próbek krwi w ciągu 75 minut. Ostatnim krokiem jest pomiar Fitz Nulin za pomocą spektrometru fluorowego o mikroobjętości i obliczenie funkcji nerek przy użyciu dwufazowego modelu rozpadu wykładniczego. Ostatecznie połączenie czułości metody wstrzykiwania pojedynczego bolusa Fiti Nulin z możliwością mikroobjętości spektrometru fluorowego pozwala na wykrycie różnic w funkcji nerek spowodowanych modyfikacjami genetycznymi u myszy, zmianami w diecie lub stosowaniem leków.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ciągły napar i stany znieczulenia, implantacja mini pomp osmotycznych przy użyciu radioaktywnej inuliny, jest to, że nie jest potrzebna operacja. Nie jest to eksperyment terminalny. Nie trzeba pobierać moczu i można zmierzyć do 24 M dziennie.

Zademonstruję tę procedurę razem z Marią Azimo, pracownikiem naukowym z mojego laboratorium, aby przygotować roztwór do wstrzykiwań Fitzy Nulin. Zważyć wystarczającą ilość inuliny ZI na dwa mililitry 5% roztworu, rozpuść oznakowaną inulinę w 0,85% roztworze chlorku sodu, podgrzewając do 90 stopni Celsjusza, aż do całkowitego rozpuszczenia. Umieść kawałek 20-centymetrowej membrany dializacyjnej w podwójnie destylowanej wodzie na 30 minut, aby usunąć resztki kwasu sodowego z membrany, następnie przepłucz membranę kilka razy, napełnij membranę dializacyjną rozpuszczoną fitzy inuliną, odpowiednio zamknij zamknięciami, a następnie zważ całą membranę.

Pozostawić rozpuszczoną inulinę fitzy do dializacji w jednym litrze 0,85% roztworu chlorku sodu i powoli mieszać, chroniąc przed światłem przez 24 godziny w temperaturze pokojowej po dializie, ponownie zważyć całą membranę dializacyjną i obliczyć nowe stężenie. Woda będzie osmotycznie przemieszczać się do membrany, a niezwiązany FSI wydostanie się z membrany. W ten sposób stężenie inuliny FSI znacznie się zmniejszy.

Obliczyć nowe stężenie inuliny fit e, korzystając z tego wzoru, gdzie C jest nowym stężeniem. N to początkowa ilość inuliny E, a V to nowa objętość, która jest różnicą w masie rurki do dializy przed i po dializie plus objętość początkowego roztworu inuliny fitzy. Następnie wysterylizuj dializowany roztwór przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona.

Pamiętaj, aby zawsze chronić inulinę fitzy przed światłem, aby uniknąć fotowybielania przed eksperymentem. Weź masę ciała myszy po krótkim znieczuleniu myszy czterema do 5% fluorem ISO. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu toin, odessać dwa mikrolitry na gram masy ciała dializowanego fitzy nulin za pomocą 100-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona z igłą o długości pół cala i rozmiarze 26, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie zmień na igłę o długości pół cala i rozmiarze 30 do wstrzykiwań.

Przystąp do wstrzykiwania dializowanej fitzy inuliny do splotu zaoczodołowego. Pozwól myszom spontanicznie dojść do siebie w ich domowej klatce. Raz przyłóż nożyczkami jeden milimetr ogona myszy i zbierz krew w wielu punktach czasowych po wstrzyknięciu do mini naczyń włosowatych heparyny sodu.

Uszczelnij mini naczynia włosowate po pobraniu krwi za pomocą pieczęci cha i chroń próbki przed światłem. Umieść uszczelnione mini kapilary w naczyniach włosowatych hematokrytu i odwiruj przez pięć minut po odwirowaniu. Rozbij mini kapilary za pomocą frezu diamentowego i przenieś całe osocze przez pipetowanie do probówki o pojemności 0,2 mililitra.

Wykonaj rozcieńczenie od jednego do 10, używając dwóch mikrolitrów osocza i 18 mikrolitrów 0,5 mola na litr w nowej probówce o pojemności 0,2 mililitra. Następnie zmierz dwa mikrolitry rozcieńczonej próbki za pomocą NanoDrop 3, 300 w duplikatach, aby uzyskać wysoką przepustowość sześciu myszy. Należy postępować zgodnie z protokołem schematu blokowego zawartym w protokole tekstowym, aby zmierzyć GFR całej nerki metodą pojedynczego wstrzyknięcia w bolusie, należy pobrać osiem próbek krwi w ciągu 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 i 75 minut po wstrzyknięciu FSE nulin.

Na tym schemacie blokowym liczby wskazują punkty czasowe pobierania, podczas gdy liczby w nawiasach wskazują punkty czasowe liczby próbek na lewo od pionowej czerwonej linii, a punkty czasowe wstrzyknięcia. Każda mysz oznaczona jest innym kolorem. Aby uzyskać sekwencyjne pobieranie krwi, postępuj zgodnie ze strzałkami.

Szare pola wskazują, kiedy następna mysz musi być przygotowana do znieczulenia fluorowego przed wstrzyknięciem przy użyciu tego protokołu. Minimalny czas między dwoma pobraniami krwi od różnych myszy to jedna minuta rozcieńczonego roztworu do wstrzykiwań fitzy nulin z rozcieńczonym osoczem myszy, aby uzyskać standardowe rozcieńczenia wymienione w protokole tekstowym. Stężenie wzorców będzie zależało od dializy i zawsze będzie różne dla każdego preparatu FSI nulin.

Dlatego za każdym razem konieczne jest wprowadzanie stężenia dla krzywej wzorcowej. Analizuj dane, aby obliczyć szybkość filtracji kłębuszkowej lub GFR za pomocą odpowiedniego oprogramowania, używając dwufazowej funkcji rozpadu wykładniczego, jak opisano szczegółowo w protokole tekstowym do pomiaru GFR u świadomych myszy. Kinetyka osocza inuliny ZI po podaniu pojedynczej dawki dożylnej jest wykorzystywana do obliczania GFRA: model dwukompartmentowy jest stosowany w modelu dwukompartmentowym.

Początkowa faza szybkiego rozpadu reprezentuje redystrybucję fitzy inuliny z przedziału wewnątrznaczyniowego do płynu zewnątrzkomórkowego. Późniejsza faza z wolniejszym rozpadem stężenia fitzy inuliny odzwierciedla głównie ogólnoustrojowy klirens z osocza. Cukrzyca typu pierwszego była wywołana przez dootrzewnowe podanie streptozotocyny.

GFR oznaczono przed i pięć tygodni po indukcji cukrzycy typu pierwszego, zwierzęta z cukrzycą typu 1 wyraźnie wykazują hiperfiltrację kłębuszkową. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć GFR u dużych myszy przy użyciu techniki pojedynczego wstrzyknięcia bolusa i stosując dwufazowy wykładniczy model DK.