Name: Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy przy użyciu FITC-inuliny i modelu dwufazowego zaniku wykładniczego. Technika umożliwia nieinwazyjną, wysokoprzepustową ocenę funkcji nerek bez konieczności chirurgii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję dr Jessice Dominguez Rieg za krytyczne przeczytanie tego rękopisu. Prace te były wspierane przez Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne (Scientist Development Grant 10SDG2610034), grant badawczy Carla W. Gottschalka Amerykańskiego Towarzystwa Nefrologicznego, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases O'Brien Center for Acute Kidney Injury Research (P30DK079337) oraz Departament ds. Weteranów.

1. Rozwiązania
<ol>
	<li>0,85% NaCl: 8,5 g NaCl/1 l ddH2O (8,5 g/L).</li>
	<li>0,5 mol/L HEPES pH 7,4 (rozpuścić 59,6 g HEPES w 0,5 l ddH20 i dostosować pH do 7,4 za pomocą 10 N NaOH).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań FITC-inuliny
<ol>
	<li>Zważyć FITC-inulinę, aby przygotować 5% roztwór i rozpuścić w 0,85% NaCl (zwykle 100 mg/2 ml 0,85% NaCl), ogrzewając do temperatury 90 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Zważyć rozpuszczony roztwór inuliny FITC i zanotować wagę.</li>
	<li>Wyciąć 20-centymetrowy kawałek membrany dializacyjnej (granica masy cząsteczkowej: 1 000) i umieścić w ddH2O na 30 minut, aby usunąć resztki NaN3 z membrany, a następnie kilkakrotnie przepłukać.</li>
	<li>Wlej rozpuszczoną inulinę FITC do membrany dializacyjnej i odpowiednio uszczelnij za pomocą zamknięć.</li>
	<li>Zważyć całą membranę dializacyjną.</li>
	<li>Umieścić membranę dializacyjną w 1 l 0,85% roztworze NaCl i mieszać powoli chroniony przed światłem przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zważyć całą błonę dializacyjną i obliczyć nowe stężenie (woda osmotycznie przemieści się do membrany, a niezwiązany FITC lub związana FITC-inulina <1000 masa cząsteczkowa wysunie się z błony; w ten sposób stężenie FITC-inuliny znacznie się zmniejszy).</li>
	<li>Nowe stężenie inuliny FITC (c) oblicza się przy użyciu następującego wzoru: c = n/V, gdzie n = początkowa ilość inuliny FITC, V = nowa objętość (różnica w masie rurki dializacyjnej przed i po dializie plus objętość początkowego roztworu FITC-inuliny).</li>
	<li>Przed użyciem wysterylizować dializowany roztwór inuliny FITC przez filtrację przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
	<li>Przechowywać FITC-inulinę przed światłem (folia aluminiowa) w temperaturze 4 °C. Dializowaną i sterylizowaną FITC-inulinę można stosować do 2 tygodni. Uczestnicząca w nim inulina FITC może być rozpuszczona przez ponowne ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez kilka minut.</li>
</ol>
Uwaga: jeśli używasz FITC-sinistrin 16-18, która nie wymaga dializy, wszystkie kroki wymagane do dializy można pominąć.
3. Iniekcja i pobieranie krwi
<ol>
	<li>Weź masę ciała (m.c.) myszy przed eksperymentem.</li>
	<li>Znieczulenie myszy na krótko izofluranem.</li>
	<li>W przypadku wysokiej przepustowości 6 myszy należy postępować zgodnie z protokołem przedstawionym na rysunku 3.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl/g bw dializowanej inuliny FITC do splotu zaoczodołowego 24 za pomocą igły G30 1/2 cala (usunąć pęcherzyki powietrza ze 100 μl strzykawki Hamiltona, najpierw używając igły G26 1/2 cala, a następnie zmieniając igłę na G30 1/2 cala do wstrzykiwań).</li>
	<li>Odetnij 1 mm ogona myszy nożyczkami raz i zbierz krew po 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 i 75 minutach od wstrzyknięcia do minikapilar Na-heparyny. Uszczelnij mininaczynia włosowate po pobraniu krwi za pomocą Châ-seal.</li>
	<li>Próbki należy chronić przed światłem.</li>
	<li>Umieść zamknięte minikapilary w naczyniach włosowatych hematokrytu i odwiruj przez 5 minut.</li>
	<li>Rozbij minikapilary za pomocą frezu diamentowego i przenieś całe osocze przez pipetowanie do probówki o pojemności 0,2 ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć w stosunku 1:10, używając 2 μl osocza i 18 μl 0,5 mol/l HEPES (pH 7,4) w nowej probówce o pojemności 0,2 ml (próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w celu pomiarów fluorescencji).</li>
	<li>Zmierzyć 2 μl rozcieńczonej próbki za pomocą NanoDrop 3300 w dwóch egzemplarzach. Opis i zastosowanie tego instrumentu opisane jest tutaj 5.</li>
</ol>
4. Przygotowanie standardów
<ol>
	<li>Zebrać krew od myszy tego samego szczepu tła w naczyniach włosowatych pokrytych heparyną, odwirować i rozcieńczyć w stosunku 1:10 z 0,5 mol/l HEPES (pH 7,4); zwykle 80 μl osocza + 720 μl HEPES.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór iniekcji inuliny FITC rozcieńczonym osoczem myszy, aby uzyskać następujące standardowe rozcieńczenia: 
	1:10: 10 μl nierozcieńczonego roztworu FITC-inuliny + 90 μl rozcieńczonego osocza myszy 
	1:100: 10 μl (1:10) roztwór + 90 μl rozcieńczonego osocza myszy 
	1:1 000: 10 μl (1:100) roztworu + 90 μl rozcieńczonego osocza myszy 
	1:2 000: 30 μl (1:1) roztworu + 30 μl rozcieńczonego mysiego osocza 
	1:10 000: 10 μl (1:5) roztworu + 40 μl rozcieńczonego osocza myszy 
	1:20 000: 20 μl (1:1) roztwór + 20 μl rozcieńczonego mysiego osocza 
	1:100 000: 10 μl (1:5) roztwór + 40 μl rozcieńczonego osocza myszy 
	Stężenie wzorców będzie zależało od dializy i zawsze będzie różne dla każdego preparatu FITC-inuliny. Za każdym razem konieczne jest wprowadzanie nowego stężenia dla krzywej standardowej.</li>
	<li>Przeanalizuj dane, aby obliczyć GFR za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. GraphPad Prism) przy użyciu dwufazowej funkcji rozkładu wykładniczego, jak opisano tutaj 15, 20 i pokazano w sekcji Reprezentatywne wyniki.</li>
</ol>

<ol><li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li>
<li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatinine%3A+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li>
<li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li>
<li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%22true%22+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li>
<li>NanoDrop 3300 Fluorospectrometer - www.nanodrop.com [Internet]. , Thermo Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Productnd3300overview.aspx">http://www.nanodrop.com/Productnd3300overview.aspx</a> (2013).</li>
<li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li>
<li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
<li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li>
<li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li>
<li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats%3A+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li>
<li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+creatinine+and+renal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li>
<li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice%3A+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li>
<li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li>
<li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li>
<li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li>
<li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li>
<li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li>
<li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li>
<li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin%3A+a+comparison+of+estimation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li>
<li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+%5Bcorrected%5D+type+1+diabetes+mellitus%3A+a+tubulo-centric+view%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li>
<li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li>
<li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+A%281%29+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
</ol>

Autor otrzymał dofinansowanie na pokrycie kosztów tej publikacji od firmy Thermo Fisher Scientific.

W niniejszym badaniu opisano technikę oznaczania GFR u przytomnych myszy przez wstrzyknięcie pojedynczego bolusa i analizę fluorescencji w 8 próbkach krwi przez dwufazowy rozpad wykładniczy. Pomiar GFR u 1 myszy trwa 75 minut. Dzięki zastosowaniu specjalnego schematu blokowego możliwe jest zmierzenie GFR 6 myszy w ciągu 130 minut. Możliwe jest powtórzenie tego protokołu schematu blokowego do 4 razy dziennie i zmierzenie GFR u 24 myszy. Zmodyfikowaliśmy tę metodę tak, aby możliwe było pobranie krwi z małego wycięcia ogona, a nie z nakłucia żyły ogonowej, co jest szybsze i łatwiejsze do wykonania przez badaczy w porównaniu z nakłuciem żyły ogonowej. Dzięki zastosowaniu 10 μl naczyń włosowatych hematokrytu i rozcieńczeniu 1:10 możliwe jest zmniejszenie całkowitej ilości potrzebnej krwi do <100 μl. Na koniec fluorescencję mierzy się za pomocą fluorospektrometru NanoDrop 3300, który umożliwia oznaczenie fluorescencji w 1-2 μl rozcieńczonej próbki. Ta metoda da zainteresowanemu badaczowi rzeczywistą wartość GFR. W przeciwieństwie do tego, pomiary kreatyniny u myszy mają kilka słabości, w tym "ślepy zakres kreatyniny" i trudności związane ze specyficznym i czułym oznaczaniem. "Ślepy zakres kreatyniny" ogranicza jej funkcję jako markera GFR, ponieważ kreatynina w surowicy pozostaje w normalnym zakresie do momentu utraty 50% funkcji nerek. Ponieważ kilku badaczy wykorzystuje genetycznie zmodyfikowane myszy w swoich badaniach do badania fizjologii i patofizjologii nerek, rodzi to następujący problem: zakładając, że mysz z nokautem genu X miałaby znacznie niższy GFR (o 40%) w porównaniu z myszą typu dzikiego, proste badanie przesiewowe poprzez porównanie kreatyniny w osoczu nie wykryłoby tej różnicy. Potrzeba dobrej, dokładnej metody oznaczania GFR staje się tym bardziej krytyczna, im mniejsze stają się różnice w GFR.
Myszy mają wysokie stężenia chromagenów niekreatyninowych w osoczu i moczu, które zakłócają dostępne na rynku testy kreatyniny. W związku z tym testy oparte na reakcji Jaffégo alkalicznego pikratu zawyżają stężenie kreatyniny w osoczu w porównaniu z oznaczaniem metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) 6, 13. Innym ograniczeniem jest to, że stężenie kreatyniny w surowicy jest poniżej limitów wykrywalności kilku dostępnych na rynku testów w porównaniu z oznaczaniem HPLC. Jednak za pomocą reakcji enzymatycznych badacze byli w stanie określić stężenie kreatyniny w osoczu u myszy 10, 22.
GFR w podobnym zakresie stwierdzono u przytomnych myszy przy użyciu porównywalnej metody wstrzyknięcia w pojedynczym bolusie, a także klirensu FITC-inuliny z moczem 14. W przeciwieństwie do ich protokołu, nasz protokół z użyciem wycinka ogonowego nie wymaga specjalnych środków ostrożności w celu zachowania integralności naczynia w porównaniu z nakłuciem żyły ogonowej lub odpiszczelowej. W celu uzyskania klirensu FITC-inuliny na podstawie moczu/osocza konieczne jest chirurgiczne wszczepienie dwóch minipomp osmotycznych. Dwie pompy są niezbędne do osiągnięcia wystarczająco wysokich stężeń FITC-inuliny w osoczu w stanie ustalonym, które są wyraźnie odróżnialne od tła. Wymaga to również użycia klatek metabolicznych do pełnego i czasowego zbierania moczu. Koszyki muszą zostać przepłukane w celu uwzględnienia utraty 25–37 % FITC-inuliny, która w przeciwnym razie występuje bez płukania.
Pułapki związane ze stosowaniem tej metody FITC-inulina są ograniczone. Badacze powinni być świadomi następujących kwestii: (i) upewnić się, że w strzykawce używanej do wstrzykiwania roztworu FITC nie ma pęcherzyków powietrza, (ii) należy wykonać pełne wstrzyknięcie zagałkowe, ponieważ ilość wstrzykniętego roztworu określa obliczony GFR, oraz (iii) myszy najprawdopodobniej oddadzą mocz podczas 75-minutowego eksperymentu GFR, więc należy unikać zanieczyszczania próbek krwi moczem, który będzie miał bardzo wysokie stężenie inuliny FITC w wyniku zdolności koncentracji nerek.
Ogólne zalety tej metody FITC-inuliny obejmują: (i) jest to technika nieradioaktywna, (ii) możliwe jest wielokrotne powtarzanie pomiarów na tej samej myszy, (iii) test można przeprowadzić na przytomnych myszach, (iv) nie jest wymagane pobieranie moczu oraz (v) można zastosować opcję o wysokiej przepustowości. Do wad pojedynczego wstrzyknięcia bolusa należy konieczność dializy FITC-inuliny, którą można przezwyciężyć za pomocą lepszego markera FITC, FITC-sinistrin, który jest już dostępny i może być mierzony przezskórnie za pomocą specjalnego zminiaturyzowanego urządzenia 18. Mimo że GFR jest mierzony, nie jest możliwe zmierzenie frakcyjnych wydalin płynu lub jonów tą metodą.
Podsumowując, metoda ta zapewnia wykonalność wysokoprzepustowej metody pomiaru GFR u świadomych myszy. W związku z tym technika ta może być interesująca dla innych badaczy, którzy są zainteresowani określeniem funkcji nerek u myszy.

Szybkość tworzenia ultrafiltratu osocza w kłębuszkach nerkowych stała się podstawą do oceny funkcji nerek (szybkość filtracji kłębuszkowej, GFR). Idealny marker do określenia GFR powinien być swobodnie filtrowany, ani wydzielany, ani ponownie wchłaniany i nie powinien być metabolizowany. Stwierdzono, że takie zachowanie jest prawdziwe w przypadku inuliny, a klirens inuliny stał się złotym standardem w oznaczaniu GFR 3. Podczas gdy klirens kreatyniny jest szeroko stosowany jako miara GFR u ludzi i zwierząt, kreatynina nie spełnia wymagań idealnego markera GFR. Około 10 - 40% klirensu kreatyniny u ludzi jest konsekwencją aktywnego wydzielania kanalikowego 1, 11, a nerkowe wydzielanie kreatyniny jest również widoczne u myszy i szczurów 4, 7, 9, 22. Wiadomo, że dysfunkcja nerek zwiększa kanalikowe wydzielanie kreatyniny, co ogranicza jej wartość jako markera GFR 1, 2. Wcześniej wykazaliśmy, że organiczny transporter anionów izoforma 3 (OAT3) przyczynia się do mysiego nerkowego wydzielania kreatyniny 22. Jednak klirens inuliny zazwyczaj wymaga użycia radioaktywnej znakowanej inuliny (3H lub 14C). Radioaktywne oznaczanie inuliny może być stosowane zarówno u znieczulonych, jak i przytomnych myszy, ale ma wady w postaci licznych przepisów bezpieczeństwa i ścisłych problemów związanych ze stosowaniem izotopów promieniotwórczych. W związku z tym przygotowania do oznaczenia GFR są czasochłonne, a także mają charakter terminalny. W 1999 roku Lorenz i wsp.12 wprowadzili inulinę FITC jako marker GFR pojedynczego nefronu u znieczulonych myszy. Pięć lat później Qi i wsp. 15 określili GFR całej nerki u przytomnych myszy za pomocą FITC-inuliny. Alternatywne protokoły wykorzystują obecnie inulinę FITC jako egzogenny marker do pomiaru GFR u przytomnych i znieczulonych myszy. Protokoły te zachowują czułość radioaktywnej inuliny poprzez zastosowanie detekcji fluorescencji i obejście wad pracy z markerem znakowanym radioaktywnie. Test FITC-inulina został zmodyfikowany przez innych 7, 8 i nas 22, 23, aby wykorzystać zdolność fluorospektrometru NanoDrop 3300 do mikroobjętości. Pozwala to na zmniejszenie całkowitej objętości próbki potrzebnej do <100 μl krwi na pomiar GFR.
Dzięki metodzie i protokołowi wysokiej przepustowości przedstawionemu w tej publikacji, pokazujemy możliwość pomiaru GFR u maksymalnie 24 świadomych myszy dziennie. Technika ta może być przydatna dla innych badaczy badających mysi GFR i mamy nadzieję, że zastąpi mniej dokładne metody jako wskaźniki czynności nerek, takie jak kreatynina i azot mocznikowy we krwi.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>FITC-inulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7706</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Webster Weterynaryjna</td><td>78366551</td><td></td></tr><tr><td>membrana do dializy (MWCO 1000)</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132636</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięcie membrany</td><td>Spectrum Laboratoria</td><td>132736</td><td></td></tr><tr><td>80 &mu; l Kapilary hematokrytu</td><td>Drummond Scientific</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do hematokrytu</td><td>IEC</td><td>Micro-MB</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l Na+-Heparyna minicaps</td><td>Hirschmann</td><td>9000210</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (100 &mu; l)</td> Spektrometr <td>fluoroskopowy Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtr Thermo-Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 3300</td><td></td></tr><tr><td>(0,22 &mu; m)</td> <td>Spectrum Laboratories</td><td>880-26464-UE</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz</td><td>Ch&#226;-uszczelnienie</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>igieł (G26 &frac12; i G30&frac12;)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305111 & 305106</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem w ocenie funkcji nerek. Obecnie badacze określają GFR, mierząc poziom endogennego biomarkera kreatyniny lub egzogennie stosowanej radioaktywnej znakowanej radioaktywnej inuliny (3H lub 14C). Kreatynina ma istotną wadę polegającą na tym, że wydzielina proksymalnym kanalikowym stanowi ~50% całkowitego wydalania kreatyniny przez nerki, a zatem kreatynina nie jest wiarygodnym markerem GFR. W zależności od przeprowadzonego eksperymentu, klirens inuliny można określić przez dożylne wstrzyknięcie w pojedynczym bolusie lub infuzję ciągłą (minipompa dożylna lub osmotyczna). Oba podejścia wymagają pobrania osocza lub odpowiednio osocza i moczu. Inne wady radioaktywnej inuliny znakowanej radioaktywnie to stosowanie izotopów, czasochłonne przygotowanie chirurgiczne zwierząt oraz wymóg przeprowadzenia końcowego eksperymentu. Tutaj opisujemy metodę, która wykorzystuje pojedyncze wstrzyknięcie bolusa inuliny znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i pomiar jej fluorescencji w 1-2 μl rozcieńczonego osocza. Dzięki zastosowaniu modelu dwukomorowego, z 8 pobraniami krwi na mysz, możliwe jest zmierzenie GFR u maksymalnie 24 myszy dziennie przy użyciu specjalnego protokołu przepływu pracy. Ta metoda wymaga jedynie krótkiego znieczulenia izofluranem, a wszystkie próbki krwi są pobierane u nieskrępowanej i wybudzonej myszy. Kolejną zaletą jest to, że możliwe jest obserwowanie myszy przez okres kilku miesięcy i leczenia (tj. przeprowadzanie eksperymentów w parach ze zmianami w diecie lub aplikacjami leków). Mamy nadzieję, że ta technika pomiaru GFR jest przydatna dla innych badaczy badających funkcję nerek myszy i zastąpi mniej dokładne metody szacowania czynności nerek, takie jak kreatynina w osoczu i azot mocznikowy we krwi.

GFR zostanie obliczone przy użyciu następującego wzoru:
GFR = n/(A/K1 + B/K2), gdzie
n = ilość wstrzyknięta (n = c•V, gdzie c = stężenie FITC-inuliny, V = objętość wstrzyknięta) 
A = Span1, punkt przecięcia z osią y dla eliminacji 
K1 = stała rozpadu dla eliminacji 
B = Span2, punkt przecięcia z osią y dla dystrybucji 
K2 = stała rozpadu dla dystrybucji
Uwaga: A, K1, B oraz K2 to skróty przypisane przez program GraphPad Prism; do analizy dwufazowego zaniku wykładniczego można użyć każdego oprogramowania z taką funkcją, jednak inne programy naukowe mogą stosować odmienne oznaczenia.
Stosując dopasowanie dwufazowej krzywej wykładniczego zaniku, opierając się na stężeniach FITC-inuliny w osoczu, należy otrzymać krzywą porównywalną do tej przedstawionej na Rysunku 1. Obliczenie GFR za pomocą powyższego wzoru (oraz zgodnie z opisem tutaj 20) pozwala na wykrycie upośledzenia funkcji nerek 15 lub hiperfiltracji kłębuszkowej 8, 23, co obserwuje się u myszy z cukrzycą typu 1 (Rysunek 2).
<img alt="Wykres spadku stężenia FITC-inuliny; czas względem stężenia; wynik analizy farmakokinetycznej." src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Do pomiaru GFR u myszy w stanie świadomym wykorzystuje się kinetykę osocza FITC-inuliny po jednorazowym wstrzyknięciu dożylnym. Do obliczenia GFR zastosowano model dwukomorowy. W modelu dwukomorowym początkowa faza szybkiego spadku reprezentuje redystrybucję FITC-inuliny z przedziału wewnątrznaczyniowego do płynu pozakomórkowego. Późniejsza faza, charakteryzująca się wolniejszym spadkiem stężenia FITC-inuliny, odzwierciedla głównie systemowy klirens z osocza.
<img alt="Wykres wskaźnika filtracji kłębuszkowej; wykres słupkowy porównujący poziom podstawowy i STZ; analiza funkcji nerek." src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Wykrycie hiperfiltracji cukrzycowej u myszy typu dzikiego. Cukrzycę typu I indukowano poprzez podanie dootrzewnowe streptozotocyny (STZ, 50 mg/kg przez 5 kolejnych dni). GFR określono przed indukcją cukrzycy (poziom podstawowy) oraz 5 tygodni po jej indukcji. Ze względu na sprzężenie cewkowo-kłębuszkowe pierwotny wzrost reabsorpcji proksymalnej powoduje wczesną hiperfiltrację cukrzycową 21, co jest wynikiem powtarzalnym u myszy typu dzikiego (n=10, p&lt;0.01 względem poziomu podstawowego u tej samej myszy).
<img alt="Schemat procesu sekwencyjnego wstrzykiwania, ilustrujący przejścia ścieżek z numerami kroków." src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Schemat pomiaru GFR u grupy 6 myszy. Aby zmierzyć GFR całej nerki metodą pojedynczego bolusa, należy pobrać 8 próbek krwi w 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 i 75 min po wstrzyknięciu FITC-inuliny. Numery wskazują punkty czasowe. Numery w nawiasach wskazują numer próbki. Punkty czasowe po lewej stronie czerwonej linii pionowej wskazują momenty wstrzykiwań (w 0, 11, 22, 33, 44 i 55 min). Każda mysz jest oznaczona innym kolorem. Aby uzyskać sekwencyjne pobieranie krwi, należy podążać za strzałkami. Szare pola wskazują moment, w którym następna mysz musi zostać przygotowana do znieczulenia izofluranem przed wstrzyknięciem. Stosując ten protokół, minimalny czas między dwoma pobraniami krwi od różnych myszy wynosi 1 min.

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem oceny funkcji nerek. Tutaj opisujemy metodę wysokoprzepustową, która umożliwia określenie GFR u przytomnych myszy za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia bolusa, oznaczenie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-inuliny w osoczu i obliczenie GFR za pomocą dwufazowego modelu rozpadu wykładniczego.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie innym badaczom, jak oceniać funkcję nerek u budzących się myszy. Osiąga się to poprzez wstępną dializę inuliny znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przez 24 godziny i oznaczenie jej stężenia w celu przygotowania wstrzyknięcia. Drugim krokiem jest zważenie myszy, przygotowanie dokładnych objętości inuliny FITC do iniekcji zaocznej oraz znieczulenie myszy.Następnie wykonuje się podskórne wstrzyknięcie Fitzy inuliny w okolicę zaoczodołową i pobiera osiem próbek krwi w ciągu 75 minut. Ostatnim krokiem jest pomiar poziomu Fitz Nulinu za pomocą mikroobjętościowego spektrometru fluorescencyjnego oraz obliczenie funkcji nerek z wykorzystaniem dwufazowego modelu wykładniczego zaniku. Ostatecznie połączenie czułości metody pojedynczego bolusa Fitzy Nulinu z możliwością analizy mikroobjętości spektrometru fluorescencyjnego pozwala na wykrycie różnic w funkcji nerek spowodowanych modyfikacjami genetycznymi u myszy, zmianami w diecie lub podawaniem leków.Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ciągła infuzja w warunkach znieczulenia, implantacja minipomp osmotycznych czy stosowanie radioaktywnej inuliny, polegają na braku konieczności przeprowadzania zabiegu chirurgicznego. Nie jest to eksperyment terminalny. Nie ma potrzeby zbierania moczu, a możliwe jest wykonanie do 24 pomiarów na dobę.Tę procedurę zaprezentuję wraz z Marią Azimo, pracownikiem naukowym z mojego laboratorium. Aby przygotować roztwór wstrzykiwalny Fitzy Nulin, należy odważyć odpowiednią ilość inuliny ZI dla dwóch mililitrów 5% roztworu, a następnie rozpuścić oznaczoną inulinę w 0,85% roztworze chlorku sodu, podgrzewając do 90 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Kawałek 20 cm membrany dializacyjnej należy umieścić w wodzie dwukrotnie destylowanej na 30 minut, aby usunąć z membrany pozostałości kwasu sodowego, a następnie kilkukrotnie przepłukać membranę. Należy napełnić membranę dializacyjną rozpuszczoną inuliną Fitzy, szczelnie zamknąć ją za pomocą zatyczek, a następnie zważyć całą membranę.Pozostaw rozpuszczoną inulinę fitzy do dializy w jednym litrze 0,85% roztworu chlorku sodu i mieszaj powoli, chroniąc przed światłem, przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po dializie ponownie zważ całą membranę dializacyjną i oblicz nowe stężenie. Woda będzie przemieszczać się osmotycznie do wnętrza membrany, a niezwiązane FSI będą z niej przenikać na zewnątrz. W związku z tym stężenie inuliny FSI ulegnie znacznemu obniżeniu.Oblicz nowe stężenie fitinuliny, korzystając z poniższego wzoru, gdzie C jest nowym stężeniem, N to początkowa ilość fitinuliny, a V to nowa objętość, stanowiąca sumę różnicy masy rurki dializacyjnej przed i po dializie oraz objętości początkowego roztworu fitinuliny. Następnie wysterylizuj zdializowany roztwór poprzez filtrację przez filtr strzykawkowy 0,22 mikrona.Należy pamiętać, aby zawsze chronić fitzy inulinę przed światłem, aby uniknąć fotowyblakania przed eksperymentem. Zmierz masę ciała myszy po krótkim znieczuleniu ich 4-5% izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofywania łapy. Odessij 2 µL na g masy ciała dializowanej fitzy inuliny, używając strzykawki Hamiltona o pojemności 100 µL z igłą 26G o długości 1/2 cala, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie zmień igłę na 30G o długości 1/2 cala w celu wykonania iniekcji.Następnie wstrzyknij dializowaną inulinę fitzy do splotu zaocznego. Pozostaw myszy do samoistnej rekonwalescencji w klatce domowej. Jednokrotnie utnij nożyczkami fragment ogona myszy o długości jednego milimetra i pobieraj krew w wielu punktach czasowych po iniekcji do minikapilar z heparyną sodową.Po pobraniu krwi uszczelnij minikapilary za pomocą uszczelniacza cha i przechowuj próbki w ciemności. Umieść uszczelnione minikapilary w kapilarach do hematokrytu i wiruj przez pięć minut. Przełam minikapilary za pomocą przecinaka diamentowego i przenieś całą osocze, pipetując je do probówki o objętości 0,2 ml.Przygotuj rozcieńczenie 1:10, mieszając 2 µL osocza i 18 µL HEPES o stężeniu 0,5 mol/L w nowej probówce o pojemności 0,2 ml. Następnie zmierz 2 µL rozcieńczonego roztworu za pomocą NanoDrop 3, 300 w dubletach dla wysokiej przepustowości u sześciu myszy. W celu pomiaru GFR całej nerki metodą pojedynczego bolusa należy postępować zgodnie z protokołem przedstawionym na schemacie blokowym w tekście; należy pobrać osiem próbek krwi w odstępach 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 i 75 minut po wstrzyknięciu inulin FSE.Na tym schemacie liczby wskazują punkty czasowe pobierania próbek, natomiast liczby w nawiasach oznaczają numer próbki; punkty czasowe po lewej stronie czerwonej linii pionowej wskazują momenty iniekcji. Każda mysz jest oznaczona innym kolorem. Aby uzyskać sekwencyjne pobrania krwi, należy podążać za strzałkami.Szare pola wskazują moment, w którym kolejna mysz musi zostać przygotowana do znieczulenia izofluranem przed wstrzyknięciem zgodnie z tym protokołem. Minimalny czas między dwoma pobraniami krwi od różnych myszy wynosi jedną minutę. Rozcieńcz roztwór wstrzykniętego fitzy nulin rozcieńczoną osoczem mysim, aby uzyskać standardowe rozcieńczenia wymienione w protokole tekstowym. Stężenie standardów będzie zależeć od dializy i zawsze będzie inne dla każdej partii FSI nulin.W związku z tym przy każdym pomiarze konieczne jest wprowadzenie stężenia dla krzywej wzorcowej. Dane należy przeanalizować w celu obliczenia współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) za pomocą odpowiedniego oprogramowania, stosując dwufazową funkcję wykładniczego zaniku, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym dotyczącym pomiaru GFR u myszy w stanie świadomym. Do obliczenia GFR wykorzystuje się kinetykę osoczniczą inuliny znakowanej ZI po jednorazowym wstrzyknięciu dożylnym, przyjmując model dwukomorowy.Wstępna faza szybkiego spadku reprezentuje redystrybucję fitzy inuliny z przedziału wewnątrznaczyniowego do płynu pozakomórkowego. Późniejsza faza z wolniejszym spadkiem stężenia fitzy inuliny odzwierciedla głównie systemowy klirens z osocza. Cukrzycę typu 1 indukowano poprzez dożylne podanie streptozotocyny.GFR określono przed oraz pięć tygodni po indukcji cukrzycy; zwierzęta z cukrzycą typu pierwszego wyraźnie wykazują hiperfiltrację kłębkową. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru GFR u myszy poprzez zastosowanie techniki pojedynczego wstrzyknięcia dawką bolusowej oraz wykorzystanie dwufazowego wykładniczego modelu DK.

a-high-throughput-method-for-measurement-glomerular-filtration-rate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda wysokoprężnościowa do pomiaru szybkości  filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Ten film prezentuje aspirację płynu z mysich kłębuszków nerkowych przy użyciu techniki mikronakłuwania za pośrednictwem dwóch fotonów. Technika ta zapewnia dostęp do kłębuszków nerkowych żywej myszy, a tym samym pomaga uzyskać wgląd w fizjologię nerek.

Aspiracja płynu z kłębuszków nerkowych myszy: metoda odsysania płynu kłębuszkowego od myszy za pomocą mikronakłucia za pośrednictwem dwóch fotonów

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie zasad i technik pomiaru i obliczania szybkości filtracji kłębuszkowej, szybkości przepływu moczu oraz wydalania sodu i potasu u szczura. Ta demonstracja może być wykorzystana do zapewnienia uczniom ogólnego zrozumienia koncepcyjnego, jak mierzyć czynność nerek.

Demonstracja w laboratorium fizjologii: szybkość filtracji kłębuszkowej u szczura

Określenie współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem do oceny ogólnej funkcji nerek. Jednak tradycyjne procedury pomiaru tego parametru są kłopotliwe i wymagają dużej inwestycji czasu. W tym miejscu opisujemy szybszą i minimalnie inwazyjną metodę przezskórnego oznaczania GFR.

Przezskórna ocena czynności nerek u świadomych gryzoni

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Prezentujemy użycie mikroskopii 2-fotonowej do umieszczenia mikropipety w przestrzeni moczowej Bowmana u myszy, łącząc 2 podstawowe techniki fizjologii nerek. Zastosowanie mikroskopii 2-fotonowej pozwala przezwyciężyć krytyczne ograniczenia konwencjonalnej mikroskopii w badaniach fizjologii nerek z mikronakłuciem.

Mikronakłucie przestrzeni Bowmana u myszy ułatwione przez mikroskopię 2-fotonową

Tutaj opisujemy protokół pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) u świadomych, swobodnie poruszających się myszy za pomocą transdermalnego monitora GFR.

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą bardzo czułego, nieradioaktywnego znacznika. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu.

Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Współczynnik filtracji kłębuszkowej (GFR) jest idealnym markerem do oceny funkcji nerek. Jednak standardowa metoda pomiaru polegająca na wstrzykiwaniu inuliny z seryjną analizą krwi i moczu jest niepraktyczna. W artykule przedstawiono praktyczną metodę transdermalnego pomiaru GFR u prosiąt.

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u prosiąt wentylowanych mechanicznie

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Poznaj metodę pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy przy użyciu FITC-inuliny i modelu dwufazowego zaniku wykładniczego. Technika umożliwia nieinwazyjną, wysokoprzepustową ocenę funkcji nerek bez konieczności chirurgii.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Przeglądaj więcej filmów