Name: Ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Poznaj metody inokulacji grzybem Beauveria bassiana jako endofitem w fasoli zwyczajnej Phaseolus vulgaris. Protokół obejmuje sterylizację nasion, przygotowanie inokulum oraz aplikację oprysków liściowych i doglebowych w celu biologicznej ochrony roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Produkcja i eksperymentalna praca przedstawiona tutaj odzwierciedlają oddaną i entuzjastyczną pomoc Reynaldo Pareja. Projekt został sfinansowany przez kolumbijski Departament Administracyjny ds. Nauki, Technologii i Innowacji (Colciencias) oraz z grantu Fundacji Billa i Melindy Gatesów w ramach inicjatywy Grand Challenges Explorations.

1. Rośliny
<ol>
 <li>Zdezynfekuj powierzchnię nasion fasoli (cv. Calima), zanurzając je na dwie minuty w 0,5% podchlorynie sodu i na dwie minuty w 70% etanolu. Przepłucz nasiona trzykrotnie w sterylnej wodzie destylowanej.</li>
 <li>Oceń skuteczność sterylizacji, wysiewając 100 μl wody z ostatniego płukania na podłoże PDA (potato dextrose agar) i inkubując płytkę przez 10 dni w temperaturze 25 °C. W przypadku stwierdzenia jakiegokolwiek wzrostu na płytce przerwij i rozpocznij eksperyment od nowa.</li>
 <li>Posadź nasiona w grupach po trzy w doniczkach zawierających sterylną mieszankę ziemi i piasku w stosunku 2:1. Przenieś doniczki do komory wzrostowej w temperaturze 25 °C, przy wilgotności względnej ok. 50% RH i 12-godzinnym fotoperiodzie. Tydzień po kiełkowaniu usuń dwie najsłabsze siewki. Podlewaj co 2-3 dni sterylną wodą destylowaną i nawoź w 10. oraz 20. dniu po posadzeniu wodnym roztworem nawozu NPK 15-15-15 o stężeniu 6 g/L.</li>
</ol>
2. Grzyb
<ol>
 <li>Należy pozyskać komercyjny preparat Beauveria bassiana szczep GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Kolumbia).</li>
 <li>Aby wytworzyć kulturę wyjściową z pojedynczego zarodnika, należy zawiesić ok. jednej pętli szczepiącej konidiów w 1 ml 0,1% wodnego roztworu Triton-X 100 i mieszać w wirówce typu vortex przez 10 s. Następnie 100 μl zawiesiny należy wysiać na agar Noble 2,5% i inkubować przez 24 h w temperaturze 25 °C. Pojedyncze kiełkujące konidium należy przenieść na płytkę 100 mm zawierającą PDA i hodować do momentu pokrycia całej powierzchni płytki (ok. 3-4 tygodnie).</li>
 <li>W warunkach sterylnych należy zebrać wzrost grzyba z powierzchni podłoża i zawiesić go w 10 ml sterylnego 0,1% Triton-X 100. Mieszać w wirówce typu vortex przez jedną minutę. Następnie zawiesinę należy przefiltrować przez sterylną gazę w celu usunięcia strzępek i uzyskania zawiesiny wyjściowej.</li>
 <li>Do oszacowania stężenia konidiów w zawiesinie wyjściowej należy użyć hemocytometru. Aby ułatwić liczenie konidiów, należy przygotować 10 000-krotne rozcieńczenie seryjne roztworu wyjściowego, przenosząc za każdym razem 100 μl zawiesiny konidialnej do 900 μl 0,1% Triton-X 100 i mieszając w wirówce typu vortex przez 10 s przed kolejnym rozcieńczeniem.</li>
 <li>W celu przygotowania inokulum należy dostosować zawiesinę wyjściową do końcowego stężenia 108 konidia/ml, korzystając ze wzoru: 
 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="Wzór na objętość końcową, równanie: Objętość roztworu wyjściowego x Stężenie roztworu wyjściowego/10^8, obliczenie analityczne." fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="równanie 1"> </li>
 <li>Aby ocenić żywotność konidiów, należy wysiać 100 μl 10 000-krotnego rozcieńczenia na agar Noble 2,5% i inkubować przez 24 h w temperaturze 25 °C. Następnie należy zbadać trzy losowe grupy po 100 konidiów, aby oszacować procent kiełkowania. Konidium uznaje się za wykiełkowane, gdy wyrasta z niego widoczna rurka kiełkowa o długości przekraczającej połowę średnicy konidium. Zawiesiny należy używać tylko wtedy, gdy średni procent kiełkowania przekracza 90%.</li>
</ol>
3. Inokulacja
<ol>
 <li>Inokuluj rośliny, gdy osiągną stadium pierwszego prawdziwego liścia (ok. 14 dni po posadzeniu). Na 24 h przed inokulacją podlej rośliny sterylną wodą destylowaną do pełnej pojemności wodnej gleby.</li>
 <li>W metodzie oprysku liści użyj ręcznego atomizera, aby nanieść zawiesinę konidiów (próba) lub 0,1% Triton-X 100 (kontrola) na powierzchnię adaksjalną (górną) liści, aż do ich nasycenia. Przykryj górną część doniczki folią aluminiową, aby zapobiec spływaniu konidiów do gleby. Po oprysku przykryj rośliny plastikowym workiem na 24 h, aby utrzymać wysoką wilgotność sprzyjającą inwazji grzyba.</li>
 <li>W metodzie aplikacji doglebowej użyj cylindra miarowego, aby nanieść 10 ml zawiesiny konidiów (próba) lub 0,1% Triton-X 100 (kontrola) na powierzchnię gleby u podstawy rośliny.</li>
 <li>Po inokulacjach przenieś rośliny z powrotem do komór wzrostowych, rozmieszczając je zgodnie z randomizowanym układem blokowym. W tym samym eksperymencie należy utworzyć co najmniej cztery dodatkowe bloki eksperymentalne, aby umożliwić ocenę wzrostu roślin obok oceny kolonizacji endofitycznej.</li>
</ol>
4. Oceny
<ol>
 <li>Oceniaj eksperyment pojedynczo dla każdego bloku, wybierając bloki w losowej kolejności. Jest to szczególnie istotne w przypadku dużych eksperymentów, których nie można ocenić w ciągu jednego dnia.</li>
 <li>Przed przetworzeniem rośliny zmierz i zapisz jej wysokość od podstawy do merystemu wierzchołkowego. Następnie ostrożnie wyrwij roślinę i dokładnie wypłucz w bieżącej wodzie z kranu.</li>
 <li>Z każdej rośliny pobierz próbki dwóch listków, dwóch fragmentów korzenia i dwóch fragmentów łodygi. Próbki listków wybieraj losowo z pierwszego prawdziwego liścia rośliny. Następnie pobierz dwie próbki łodygi, każda o długości 3 cm, z części środkowej rośliny oraz z okolic powierzchni gleby. Na koniec pobierz dwie próbki korzenia palowego, również o długości 3 cm każda, z części środkowej korzenia oraz z odległości 1 cm od czubka korzenia. Umieść próbki w trzech oddzielnych papierowych torebkach i odpowiednio je opisz.</li>
 <li>Po umyciu i pobraniu próbek ze wszystkich roślin w bloku, rozpocznij od przetwarzania liści, następnie korzeni, a na końcu łodyg.</li>
 <li>Przeprowadź sterylizację powierzchni tkanek w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, zgodnie z punktem 1.1 powyżej. Każdą próbkę wypłucz trzykrotnie poprzez zanurzenie w sterylnej wodzie destylowanej i pozostaw do wyschnięcia na sterylnym ręczniku papierowym. Następnie odetnij i odrzuć zewnętrzne krawędzie, gdzie endofity mogły zostać wyeliminowane w wyniku kontaktu z dezynfekcjami.</li>
 <li>Pokrój przyciętą próbkę na sześć sekcji, średnio 6x6 mm dla liści i 6 mm długości dla łodyg oraz korzeni. Wyłóż sześć sekcji na płytkę Petriego o średnicy 60 mm z podłożem PDA uzupełnionym antybiotykami: tetracykliną, streptomycyną i penicyliną w stężeniu 2 mg/L każdego z nich. Uszczelnij płytkę parafilmem i inkubuj w ciemności w temperaturze 25 °C. Z każdej rośliny otrzymuje się sześć płytek, po dwie na każdą część rośliny.</li>
 <li>Wymień wodę do płukania po przetworzeniu każdego bloku danej części rośliny. Przed wylaniem zużytej wody do płukania, wyłóż próbkę 100 μl na podłoże PDA i inkubuj przez 10 dni w temperaturze 25 °C, aby ocenić skuteczność sterylizacji. Jeśli pojawi się wzrost grzyba, nie uwzględniaj odpowiadających im próbek w analizach.</li>
 <li>Kontroluj płytki co 2-3 dni przez okres 20 dni, aby obserwować i zapisywać wzrost grzybów. Wycinaj i przenoś sekcje roślin wykazujące obecność endofitów grzybowych na płytki zawierające świeże podłoże PDA. Zapobiegnie to kontaminacji sąsiednich sekcji roślin na oryginalnej płytce.</li>
 <li>Zapisz wzrost B. bassiana z sekcji roślin. Beauveria bassiana można zidentyfikować po charakterystycznej, białej, gęstej grzybni, która na brzegach staje się kremowa lub bladożółta. W razie wątpliwości zamontuj preparat w kropli wody i obejrzyj pod mikroskopem, szukając kulistych konidiów i zygzakowatych konidioforów, charakterystycznych dla tego gatunku.</li>
 <li>Wykorzystaj dodatkowe bloki eksperymentalne do oceny wpływu zabiegów na biomasę roślin. Najpierw zmierz ich wysokość od podstawy do szczytu merystemu wierzchołkowego. Następnie ostrożnie wyrwij i umyj rośliny w wodzie z kranu, a potem pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 45 °C przez trzy dni, aby określić ich suchą masę.</li>
</ol>

<ol><li>Vega, F. E., Meyling, N. V., Luangsa-ard, J. J., Blackwell, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVega%2C+FE+%22Fungal+entomopathogens+in+Insect+Pathology%22">Fungal entomopathogens in Insect Pathology</a>. Vega, F. E., Kaya, H. K. , Elsevier. San Diego. 171-220 (2012).</li>
<li>Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathology+and+fungal+endophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Insect pathology and fungal endophytes.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 277-279 (2008).</li>
<li>Sasan, R. K., Bidochka, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect-pathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii+%28Clavicipitaceae%29+is+also+an+endophyte+that+stimulates+plant+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+botany%22%5BJournal%5D)">The insect-pathogenic fungus Metarhizium robertsii (Clavicipitaceae) is also an endophyte that stimulates plant root development.</a> American journal of botany. 99, 101-107 (2012).</li>
<li>Elena, G. J., Beatriz, P. J., Alejandro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+%28Metschnikoff%29+Sorokin+promotes+growth+and+has+endophytic+activity+in+tomato+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+biological+research%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin promotes growth and has endophytic activity in tomato plants.</a> Advances in biological research. 5, 22-27 (2011).</li>
<li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Ostrinia+nubilalis+%28H%C3%BCbner%29%28Lepidoptera%3A+Pyralidae%29+by+endophytic+Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+entomology%22%5BJournal%5D)">Suppression of Ostrinia nubilalis (Hübner)(Lepidoptera: Pyralidae) by endophytic Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin.</a> Environmental entomology. 20, 1207-1211 (1991).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+Beauveria+bassiana+in+banana+%28Musa+spp.%29+reduces+banana+weevil+%28Cosmopolites+sordidus%29+fitness+and+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+protection%22%5BJournal%5D)">Endophytic Beauveria bassiana in banana (Musa spp.) reduces banana weevil (Cosmopolites sordidus) fitness and damage.</a> Crop protection. 27, 1437-1441 (2008).</li>
<li>Gurulingappa, P., Sword, G. A., Murdoch, G., McGee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+crop+plants+by+fungal+entomopathogens+and+their+effects+on+two+insect+pests+when+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">Colonization of crop plants by fungal entomopathogens and their effects on two insect pests when in planta.</a> Biological. 55, 34-41 (2010).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+endophytic+Beauveria+bassiana+on+populations+of+the+banana+weevil%2C+Cosmopolites+sordidus%2C+and+their+damage+in+tissue-cultured+banana+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+experimentalis+et+applicata%22%5BJournal%5D)">Effect of endophytic Beauveria bassiana on populations of the banana weevil, Cosmopolites sordidus, and their damage in tissue-cultured banana plants.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 129, 157-165 (2008).</li>
<li>Ownley, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauveria+bassiana%3A+Endophytic+colonization+and+plant+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Beauveria bassiana: Endophytic colonization and plant disease control.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 267-270 (2008).</li>
<li>Ownley, B. H., Gwinn, K. D., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+fungal+entomopathogens+with+activity+against+plant+pathogens%3A+ecology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens: ecology and evolution.</a> BioControl. 55, 113-128 (2010).</li>
<li>Akello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin+as+an+endophyte+in+tissue+culture+banana+%28Musa+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin as an endophyte in tissue culture banana (Musa spp.).</a> Journal of invertebrate pathology. 96, 34-42 (2007).</li>
<li>Gómez-Vidal, S., Lopez-Llorca, L. V., Jansson, H. B., Salinas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+colonization+of+date+palm+%28Phoenix+dactylifera+L.%29+leaves+by+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Endophytic colonization of date palm (Phoenix dactylifera L.) leaves by entomopathogenic fungi.</a> Micron. 37, 624-632 (2006).</li>
<li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29+as+an+endophyte+in+cocoa+seedlings+%28Theobroma+cacao%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte in cocoa seedlings (Theobroma cacao).</a> Mycologia. 97, 1195-1200 (2005).</li>
<li>Tefera, T., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inoculation+method+and+plant+growth+medium+on+endophytic+colonization+of+sorghum+by+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Effect of inoculation method and plant growth medium on endophytic colonization of sorghum by the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana.</a> BioControl. 54, 663-669 (2009).</li>
<li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+and+colonization+of+coffee+seedlings+%28Coffea+arabica+L.%29+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoscience%22%5BJournal%5D)">Inoculation and colonization of coffee seedlings (Coffea arabica L.) with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales.</a> Mycoscience. 47, 284-289 (2006).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Beauveria+bassiana+dose+and+exposure+duration+on+colonization+and+growth+of+tissue+cultured+banana+%28Musa+sp.%29+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">The effects of Beauveria bassiana dose and exposure duration on colonization and growth of tissue cultured banana (Musa sp.) plants.</a> Biological. 49, 6-10 (2009).</li>
<li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+research%22%5BJournal%5D)">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Mycological research. 111, 748-757 (2007).</li>
<li>Brownbridge, M., Reay, S. D., Nelson, T. L., Glare, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29+as+an+endophyte+following+inoculation+of+radiata+pine+seed+and+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+control%22%5BJournal%5D)">Persistence of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte following inoculation of radiata pine seed and seedlings.</a> Biological control. 61, 194-200 (2012).</li>
<li>Posada, F. J., Chaves, F. C., Gianfagna, T. J., Pava-Ripoll, M., Hebbar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+an+endophyte+in+cocoa+pods+%28Theobroma+cacao+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+U.D.C.A.+actualidad+%26+divulgaci%C3%B3n+cient%C3%ADfica%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as an endophyte in cocoa pods (Theobroma cacao L.).</a> Revista U.D.C.A. actualidad & divulgación científica. 13, 71-78 (2010).</li>
<li>Quesada-Moraga, E., Landa, B. B., Muñoz-Ledesma, J., Jiménez-Díaz, R. M., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+colonisation+of+opium+poppy%2C+Papaver+somniferum%2C+by+an+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Endophytic colonisation of opium poppy, Papaver somniferum, by an entomopathogenic Beauveria bassiana strain.</a> Mycopathologia. 161, 323-329 (2006).</li>
<li>Biswas, C., Dey, P., Satpathy, S., Satya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+a+season+long+endophyte+in+jute+%28Corchorus+olitorius%29+and+its+rapid+detection+using+SCAR+marker%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as a season long endophyte in jute (Corchorus olitorius) and its rapid detection using SCAR marker.</a> BioControl. , 1-7 (2011).</li>
<li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+the+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin+in+different+tillage+regimes+and+in+Zea+mays+L.+and+virulence+towards+Ostrinia+nubilalis+%28H%C3%BCbner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%2C+ecosystems+%26+environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence of the entomopathogen Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in different tillage regimes and in Zea mays L. and virulence towards Ostrinia nubilalis (Hübner).</a> Agriculture, ecosystems & environment. 45, 147-156 (1993).</li>
<li>Akello, J., Sikora, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+acropedal+influence+of+endophyte+seed+treatment+on+Acyrthosiphon+pisum+and+Aphis+fabae+offspring+development+and+reproductive+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">Systemic acropedal influence of endophyte seed treatment on Acyrthosiphon pisum and Aphis fabae offspring development and reproductive fitness.</a> Biological. 61, 215-221 (2012).</li>
<li>Reddy, N. P., Ali Khan, A. P., Devi, U. K., Sharma, H. C., Reineke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+millet+crop+plant+%28Sorghum+bicolor%29+with+the+entomopathogenic+fungus+%28Beauveria+bassiana%29+to+combat+infestation+by+the+stem+borer%2C+Chilo+partellus+Swinhoe+%28Lepidoptera%3A+Pyralidae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Asia+Pacific%22%5BJournal%5D)">Treatment of millet crop plant (Sorghum bicolor) with the entomopathogenic fungus (Beauveria bassiana) to combat infestation by the stem borer, Chilo partellus Swinhoe (Lepidoptera: Pyralidae.</a> Journal of Asia Pacific. 12, 221(2009).</li>
<li>Quesada-Moraga, E., Muñoz-Ledesma, F. J., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+protection+of+Papaver+somniferum+L.+against+Iraella+luteipes+%28Hymenoptera%3A+Cynipidae%29+by+an+endophytic+strain+of+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+entomology%22%5BJournal%5D)">Systemic protection of Papaver somniferum L. against Iraella luteipes (Hymenoptera: Cynipidae) by an endophytic strain of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Environmental entomology. 38, 723-730 (2009).</li>
<li>Cherry, A. J., Banito, A., Djegui, D., Lomer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+stem-borer+Sesamia+calamistis+%28Lepidoptera%3B+Noctuidae%29+in+maize+following+seed+dressing%2C+topical+application+and+stem+injection+with+African+isolates+of+Beauveria+bassiana%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pest+management%22%5BJournal%5D)">Suppression of the stem-borer Sesamia calamistis (Lepidoptera; Noctuidae) in maize following seed dressing, topical application and stem injection with African isolates of Beauveria bassiana.</a> International journal of pest management. 50, 67-73 (2004).</li>
<li>Gurulingappa, P., McGee, P. A., Sword, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+Lecanicillium+lecanii+and+Beauveria+bassiana+reduce+the+survival+and+fecundity+of+Aphis+gossypii+following+contact+with+conidia+and+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+protection%22%5BJournal%5D)">Endophytic Lecanicillium lecanii and Beauveria bassiana reduce the survival and fecundity of Aphis gossypii following contact with conidia and secondary metabolites.</a> Crop protection. 30, 349-353 (2011).</li>
<li>van Schoonhoven, A., Voysest, O. Common beans in Latin America and their constraints in Bean production problems in the tropics. Schwartz, H. F., Pastor-Corrales, M. A. , Second, CIAT. Cali. 33-57 (1989).</li>
<li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+and+no-choice+assays+for+testing+the+resistance+of+A.+thaliana+to+chewing+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Choice and no-choice assays for testing the resistance of A. thaliana to chewing insects.</a> J. Vis. Exp. (15), e683(2008).</li>
<li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms%3A+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047(2011).</li>
<li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wiele czynników może wpływać na konkretny wynik eksperymentu mającego na celu ustalenie entomopatogenu grzyba jako endofitu. Nasze wyniki pokazują, że metoda inokulacji jest jedną z nich. Czynniki biologiczne, z którymi należy eksperymentować, obejmują wybrany gatunek rośliny uprawnej lub odmianę oraz zastosowany szczep lub izolat gatunku entomopatogenu grzyba. Inne czynniki, które należy wziąć pod uwagę, to stężenie inokulum, wiek rośliny podczas inokulacji oraz warunki wzrostu rośliny. 
Idealnie byłoby, gdyby metoda inokulacji powodowała ogólnoustrojową kolonizację roślin przez entomopatogen grzyba14,17,18,21. Zamiast tego wydaje się, że metody inokulacji mają tendencję do faworyzowania określonego wzorca lokalnej kolonizacji. Na przykład w przypadku kawy opryski dolistne sprzyjają kolonizacji liści, podczas gdy zraszanie gleby sprzyja kolonizacji korzeni17. Znaleźliśmy ten sam wzór w przypadku fasoli zwyczajnej. Ostatecznie wybór metody inokulacji powinien być podyktowany zamierzoną lokalizacją endofitu w roślinie, przypuszczalnie pasującą do niszy docelowego roślinożercy lub patogenu roślinnego. 
Chociaż jest to powszechnie stosowane, wykrywanie endofitów i oznaczanie ilościowe na podstawie kultur pożywek może być kosztowne, trudne i podatne na błędy. Na przykład, w sumie 10 800 sekcji roślin (posianych na 1 800 szalkach Petriego) zostało ocenionych w eksperymencie mającym na celu optymalizację inokulacji B. bassiana na bananie16. Spośród nich 4496 sekcji zostało skolonizowanych przez domniemanego B. bassiana, zidentyfikowanego głównie na podstawie morfologii kolonii. Oczywiste jest, że mikroskopijna weryfikacja gatunków dla każdej kolonii byłaby pożądanym, ale nieosiągalnym krokiem. Z drugiej strony, 1176 sekcji zostało skolonizowanych przez inne grzyby i zostało odrzuconych i potraktowanych jako brakujące dane16. Istnieje jednak prawdopodobieństwo, że B. bassiana był słabym konkurentem lub wolniej się rozwijał i mógł w końcu wyłonić się z tych sekcji, gdyby dano mu wystarczająco dużo czasu. W związku z tym metody wykrywania endofitów oparte na posiewach są podatne na wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne. W związku z tym opracowanie bardziej wiarygodnych metod wykrywania i kwantyfikacji, na przykład opartych na testach reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)20,21,24, jest dobrze uzasadnione. 
Ostatecznym celem eksperymentów z inokulacją powinno być opracowanie skutecznego leczenia, które zapewni trwałą ogólnoustrojową odporność na roślinożerność i/lub choroby. Prawdopodobna, ale jak dotąd nieprzetestowana, hipoteza głosi, że zakres kolonizacji endofitycznej powinien korelować dodatnio z zakresem oporności za pośrednictwem endofitów. Naturalnym kolejnym krokiem po udoskonaleniu metod inokulacji może być zatem zbadanie tej korelacji. Kilka protokołów wideo może pomóc naukowcom w zaprojektowaniu odpowiedniego testu odporności dla docelowego szkodnika lub patogenu29-31. Ostatecznie to właśnie ten test zadecyduje o powodzeniu metody inokulacji i związanym z nią potencjale endofitycznej kontroli biologicznej.

Entomopatogeny grzybów są ważnymi regulatorami populacji owadów o znacznym potencjale jako mykopestycydy1. Dopiero niedawno wykazano jednak, że entomopatogeny grzybów występują jako endofity, zarówno naturalnie, jak i w odpowiedzi na różne metody inokulacji2. Funkcja ekologiczna entomopatogenów grzybów endofitycznych pozostaje w dużej mierze nieznana, ale niektóre badania wskazują na ich udział we wzroście roślin3,4, odporności roślinożerców5-8 i odporności na choroby9,10. Ogólnym celem przedstawionych tu metod jest wprowadzenie entomopatogenu grzyba jako endofitu, w ramach przygotowań do późniejszych ocen endofitycznej kontroli biologicznej. 
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) jest najlepiej zbadanym entomopatogenem endofitycznego grzyba5-9,11-19 i jest dostępny jako komercyjny mykopestycyd. Metody inokulacji testowane w celu ustalenia B. bassiana jako endofitu obejmują zraszanie gleby14,17, otoczki nasienne18 i zanurzenia14, opatrunki korzonkowe13,15, zanurzenia korzeni i kłączy11,16,18, iniekcje łodyg17, opryski dolistne14,17,20 i opryski kwiatowe19. Korzystając z tych metod, naukowcy wprowadzili B. bassiana do bananów11, fasoli7, kakao13, kawy17, kukurydzy7, bawełny7, palmy daktylowej12, juty21, maku lekarskiego20, dyni7, sosny radiata18, sorgo14, pomidora7 i pszenicy7. Najnowsze dowody sugerują, że endofityczny B. bassiana może chronić rośliny nie tylko przed szkodnikami stawonogów5-7,22-27, ale także przed niektórymi patogenami roślin9. 
Fasola zwyczajna (Phaseolus vulgaris) należy do upraw najbardziej narażonych na szkodniki i choroby. Może być dotknięty przez ponad 400 szkodników i 200 patogenów, których atak jest uważany za najbardziej ograniczający czynnik produkcji fasoli w regionach28. W związku z tym fasola zwyczajna może być doskonałą uprawą modelową do zbadania pełnego spektrum endofitycznej kontroli biologicznej przez B. bassiana. Jako pierwszy krok w tym kierunku, artykuł ten opisuje opryski dolistne i zraszanie gleby jako metody inokulacji w celu wprowadzenia B.bassiana jako endofitu do fasoli zwyczajnej.

<table><tr><tbody><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr>Nazwa <td>firmy</td> zajmującej się <td>odczynnikiem/materiałem</td><td>Numer</td><td></td>katalogowy</tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Agar szlachetny</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>szalka Petriego Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>(100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Zwykły wybielacz (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Potrójna pigwa (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DM LB</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana to entomopatogen grzybów ze zdolnością do endofitycznej kolonizacji roślin. Jako endofit, B. bassiana może odgrywać rolę w ochronie roślin przed roślinożernością i chorobami. Protokół ten przedstawia dwie metody inokulacji w celu endofitycznego ustalenia B. bassiana w fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris), w ramach przygotowań do kolejnych ocen endofitycznej kontroli biologicznej. Rośliny są uprawiane z nasion sterylizowanych powierzchniowo przez dwa tygodnie przed otrzymaniem zabiegu B. bassiana 10,8 konidiów/ml (lub wody) stosowanego jako oprysk dolistny lub zraszanie gleby. Dwa tygodnie później rośliny są zbierane, a ich liście, łodygi i korzenie pobierane są w celu oceny endofitycznej kolonizacji grzybów. W tym celu próbki są indywidualnie sterylizowane powierzchniowo, cięte na wiele sekcji i inkubowane w pożywce z agoderem z dekstrozy ziemniaczanej przez 20 dni. Pożywka jest sprawdzana co 2-3 dni w celu zaobserwowania wzrostu grzybów związanych z sekcjami roślin i zarejestrowania występowania B. bassiana w celu oszacowania zakresu jego kolonizacji endofitycznej. Analizy skuteczności inokulacji porównują występowanie B. bassiana w danej części rośliny (tj. liściach, łodygach lub korzeniach) w różnych zabiegach i kontrolach. Oprócz metody inokulacji, konkretny wynik doświadczenia może zależeć od docelowego gatunku lub odmiany uprawy, użytego szczepu lub izolatu gatunku entomopatogenu grzyba oraz warunków wzrostu rośliny.

B. bassiana była w stanie kolonizować endofitycznie P. vulgaris w odpowiedzi na zastosowane zabiegi inokulacji (Rycina 1). Zarówno opryski liści, jak i aplikacje doglebowe doprowadziły do kolonizacji endofitycznej przez B. bassiana u ponad 80% traktowanych roślin (Rycina 2). Jednak zakres kolonizacji zależał od ocenianej części rośliny oraz zastosowanej metody inokulacji. Liście najlepiej reagowały na inokulację metodą oprysku. Z kolei korzenie reagowały wyłącznie na inokulację doglebową. Łodygi reagowały podobnie na obie metody inokulacji. B. bassiana nie została wykryta w żadnym z fragmentów roślin kontrolnych.
Niezależnie od zastosowanej kuracji, endofity inne niż B. bassiana wyrosły z 15% ocenianych fragmentów roślin, lecz zostały one usunięte z płytek z pożywką przed tym, jak zdołałyby zainfekować sąsiednie sekcje i wpłynąć na wyniki.
Rośliny traktowane i kontrolne były widocznie nieodróżnialne dwa tygodnie po inokulacjach. Nie stwierdzono różnic w ich suchej masie ani w ich wysokości.
<img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Eksperyment na szalce Petri dotyczący wzrostu grzybów na liściach, mikroskopia ujawnia struktury strzępek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywne wyniki zabiegów inokulacji w celu kolonizacji endofitycznej roślin fasoli (Phaseolus vulgaris cv. Calima) przez Beauveria bassiana. Górny lewy róg: płytki kontrolne bez wzrostu. Górny prawy róg: endofit grzybowy z przekroju rośliny kontaminujący całą płytkę. Dolny lewy róg: B. bassiana rosnący z dwóch przekrojów rośliny. Dolny prawy róg: endofityczne konidia i konidiofory B. bassiana widoczne pod mikroskopem.
<img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Wykres procentowej kolonizacji roślin; porównanie liści, korzeni i łodyg; układ kontrolny eksperymentu." fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wpływ zabiegów inokulacji na kolonizację endofityczną roślin fasoli (Phaseolus vulgaris cv. Calima) przez Beauveria bassiana, dwa tygodnie po inokulacjach szczepem GHA. Procent kolonizacji reprezentuje liczbę skolonizowanych fragmentów roślin podzieloną przez liczbę fragmentów poddanych hodowli.

Ten protokół demonstruje dwie metody inokulacji w celu wprowadzenia entomopatogenu grzyba Beauveria bassiana jako endofitu do fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris), w ramach przygotowań do kolejnych ocen endofitycznej kontroli biologicznej.

Ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

Witajcie. Nazywam się Ush Parsa i jestem entomologiem w SEA w Międzynarodowym Centrum Rolnictwa Tropikalnego. Jestem ViiV Artiz, również z Międzynarodowego Centrum Rolnictwa Tropikalnego, a ja jestem Fernando Vega z Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie sposobu ułatwienia i weryfikacji ustanowienia patogenu grzybowego.Jako endofity, owady lub roztocza zainfekowane grzybem patogennym są często spotykane w naturze, a stosowanie tych patogenów grzybowych jako biologicznych pestycydów ma długą historię. W ostatnim czasie odnotowano przypadki infekowania roślin przez patogeny grzybowe, które nie wywoływały jednak żadnych widocznych objawów swojej obecności. Odkrycie to wskazuje na ich potencjał do wykorzystania jako ochronnych endofitów przeciwko szkodnikom rolniczym.Aby zbadać ten potencjał, niezbędne jest najpierw opracowanie metody inokulacji, która niezawodnie wprowadza patogen grzybowy jako endofit do rośliny uprawnej. B Bassiana jest jednym z najlepiej przebadanych patogenów grzybowych i jest łatwo dostępny jako komercyjny pestycyd. Grzyb ten został wykryty jako endofit u wielu gatunków roślin, w tym u bananowców, kawowców i muszkatołowca.Niedawne dowody sugerują, że B bassiana ma potencjał do ochrony roślin nie tylko przed szkodnikami z rzędu stawonogów, ale także przed niektórymi patogenami roślin. Mechanizmy wyjaśniające to szerokie spektrum ochronne są słabo poznane. Niemniej jednak, w obszarze zaworu tkankowego, może to stanowić obiecujące rozwiązanie dla upraw pozbawionych genetycznej odporności na szkodnika lub patogen, a w przypadku roślin, które zazwyczaj cierpią z powodu jednoczesnego ataku wielu przeciwników, czego głównym przykładem jest fas vulgaris.Może ona zostać zaatakowana przez ponad 400 szkodników i 200 patogenów, których wpływ uznaje się za najbardziej ograniczający czynnik produkcji fasoli w różnych regionach. Z tego powodu uważamy, że fasola zwyczajna może być odpowiednią rośliną uprawną do zbadania potencjału ochronnego Endo bbar. Jako pierwszy krok w tym kierunku, Arvid demonstruje skuteczność oprysków dolistnych oraz aplikacji doglebowych jako metod inokulacji w celu ustanowienia Bana jako endofita.Nasiona fasoli zwyczajnej odmiany TOMA są sterylizowane powierzchniowo poprzez dwuminutowe zanurzenie w 0,5% podchlorynie sodu, a następnie dwuminutowe zanurzenie w 70% etanolu i trzykrotne płukanie w sterylnej wodzie destylowanej w celu weryfikacji skuteczności sterylizacji. Próbkę 100 µL wody z płukania wysiewa się na 100 mm płytkę Petri z podłożem PDA i inkubuje w ciemności przez 10 dni w temperaturze 25 °C. W przypadku stwierdzenia wzrostu w tych kontrolach eksperyment należy przerwać i rozpocząć od nowa.Nasiona wysiewa się w grupach po trzy do doniczek o szerokości 11,5 cm, zawierających sterylizowaną parą wodną mieszankę gleby i piasku w stosunku dwa do jednego. Rośliny są hodowane w kontrolowanych warunkach w temperaturze 25 °C, przy wilgotności względnej 50% i 12-godzinnym fotoperiodzie o natężeniu światła 9 200 luksów tydzień po kiełkowaniu. Następnie rośliny są przerywane do jednej sztuki na doniczkę, aby zapewnić ich wigor i wyeliminować konkurencję.Rośliny nawadniano w razie potrzeby co dwa do trzech dni, a nawożono 10 i 20 dni po posadzeniu roztworem nawozu NPK w stężeniu 6 g/L. Aby zapewnić jednorodność genetyczną grzybów, izolaty należy hodować z pojedynczych kultur czystych. Jeśli źródłem grzyba jest owad z mykozą, okaz przenosimy do komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą pętli do szczepienia przenosimy niewielką próbkę sporulującego grzyba DYS na podłoże PDA.Kolejne przeniesienia na nowe płytki z pożywką mogą być konieczne w celu usunięcia zanieczyszczeń po tym, jak docelowy grzyb urośnie i rozprzestrzeni się w czystej kulturze. Małą próbkę zarodników zawieszono w jednym mililitrze 0,1% wodnego roztworu Triton X 100 i wymieszano w wortexie; Triton X 100 jest surfaktantem, który zmniejsza napięcie powierzchniowe wody i umożliwia dyspersję zarodników. Alikwot 100 µL tej zawiesiny rozprowadza się na 100 mm płytce Petri zawierającej cienką warstwę 2,5% agaru, co pozwoli na wizualizację zarodników pod stereomikroskopem.Płytkę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w ciemności, po czym pojedyncze podłoże z kiełkującym pędem przenosi się na płytkę z podłożem PDA i pozostawia do wzrostu przez trzy do czterech tygodni, aż pokryje całą płytkę i sporuluje. Metoda ta pozwala na uzyskanie czystej kultury grzyba do dalszych eksperymentów. W niniejszej demonstracji wykorzystujemy czystą kulturę Beauveria bassiana, szczep GH HA, pozyskaną z produktu komercyjnego Microt.Inokulum przygotowuje się w warunkach sterylnych. W komorze z laminarnym przepływem powietrza za pomocą sterylnej szpatułki zeskrobujemy około jednego grama wzrostu grzybni z powierzchni podłoża i zawieszamy go w 10 mililitrach sterylnego 0,1% Triton X. Zawiesinę mieszamy w wstrząsaciu vortex przez jedną minutę i filtrujemy przez sterylną gazę, aby oddzielić konidia od strzępek. Ten etap pozwala uzyskać gęstą zawiesinę, którą należy dostosować do końcowego stężenia 10⁸ konidiów na mililitr w celu przeprowadzenia inokulacji.W pierwszej kolejności szacuje się stężenie roztworu zapasowego w serii rozcieńczeń, co ułatwia liczenie kedia. W komorze Hema Cytometer 100 µL roztworu zapasowego rozcieńcza się w 900 µL 0,1% Triton X, a następnie miesza w wirówce (vortex), otrzymując rozcieńczenie 1:10. Procedurę tę powtarza się seryjnie jeszcze trzy razy, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10 000.Kedia będą występować w ekstremalnie wysokiej liczbie w pierwszym rozcieńczeniu oraz w niskiej liczbie, którą można łatwo policzyć, w ostatnim rozcieńczeniu. Każda z dwóch komór cytometru Hema jest wypełniana 10 µL rozcieńczenia 1:10 000 i umieszczana pod mikroskopem w celu policzenia kedia. Pole pomiarowe cytometru Hema składa się z dziewięciu dużych kwadratów, z których każdy mieści odpowiednio 100 nL lub 0,0001 mL.Aby oszacować stężenie ED w próbce, zliczamy i wyciągamy średnią liczbę ED w czterech dużych kwadratach narożnych każdej komory, a następnie dzielimy tę średnią przez 0,0001. Pomnożenie tego stężenia przez nasz czynnik rozcieńczenia 10 000 daje stężenie roztworu zapasu, co pozwala teraz obliczyć końcową objętość, do której należy dostosować roztwór zapasu. Aby uzyskać inokulum o stężeniu 10 38 edia na mililitr, stosujemy wzór.Objętość końcowa jest równa objętości roztworu zapasu pomnożonej przez stężenie roztworu zapasu i podzielonej przez stężenie końcowe. W naszej demonstracji roztwór zapasu musi zostać doprowadzony do objętości końcowej 195.5 milliliters, aby uzyskać pożądane stężenie. Przed użyciem inokulum ważne jest przeprowadzenie testu kiełkowania w celu oceny żywotności kanałów.W tym teście 100 µL rozcieńczenia 1:10 000 nanosimy na 100 mm płytkę Petri z 2,5% agaru jajecznicy lub pożywki. Próbkę rozprowadzamy po powierzchni pożywki za pomocą sterylnej szklanej rozprowadzalnika i inkubujemy w ciemności w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Żywotność oceniamy pod mikroskopem, szacując procent zarodników z rozwijającą się rurką kiełkową.W przypadku trzech losowych próbek po 100 zarodników, zawiesina może być użyta do inokulacji tylko wtedy, gdy średnia kiełkowalność przekracza 90%. W niniejszej demonstracji średnia kiełkowalność wynosi 97%. Przedstawimy dwie metody inokulacji: oprysk liści oraz polewanie gleby, obie stosowane w momencie, gdy rośliny osiągną stadium pierwszego prawdziwego liścia. Około 14 dni po posadzeniu wykonuje się oprysk liści za pomocą ręcznego atomizera, kierując zawiesinę na powierzchnię liści aż do ich nasycenia. Góra każdej doniczki zostaje przykryta folią aluminiową, aby uniknąć spływania zawiesiny do gleby. Po oprysku każdą roślinę przykrywa się plastikową torebką na 24 godziny, aby utrzymać wysoką wilgotność ułatwiającą inwazję grzyba.Metoda inokulacji poprzez podlewanie gleby (soil drench) jest przeprowadzana przy pojemności wodnej gleby. Około 24 godziny po podlaniu roślin do stanu nasycenia gleby, na powierzchnię podłoża nanosi się 10 mililitrów zawiesiny komórkowej. Rośliny kontrolne u podstawy otrzymują sterylną 0,1% roztwór Triton X, nanoszony w ten sam sposób co w odpowiadających im wariantach doświadczalnych.Rośliny przeniesiono z powrotem do komór wzrostowych i rozmieszczono zgodnie z randomizowanym schematem blokowym z trzema powtórzeniami dla każdej grupy badawczej. Stopień zakorzenienia oceniano dwa tygodnie po inokulacji, analizując po jednym bloku na raz. Rośliny ostrożnie zebrano i każdą z nich indywidualnie wypłukano pod bieżącą wodą z kranu.Pobieramy próbki dwóch liści pocztowych, dwóch fragmentów korzenia i dwóch fragmentów łodygi. Liście pocztkowe są wybierane losowo z pierwszego liścia właściwego rośliny i przycinane do kształtu kwadratów. Próbki łodygi o długości około trzech centymetrów pobiera się z części środkowej rośliny oraz z obszaru blisko powierzchni gleby. Próbki korzenia palowego o podobnej długości pobiera się z części środkowej korzenia oraz z miejsca oddalonego o jeden centymetr od wierzchołka korzenia.Każdą próbkę sterylizuje się powierzchniowo indywidualnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza w 0,5% podchlorynu sodu przez dwie minuty, następnie w 70% etanolu przez dwie minuty i płucze trzykrotnie sterylną wodą destylowaną przed pozostawieniem do wyschnięcia. Następnie, na sterylnym ręczniku papierowym, wysterylizowaną próbkę ostrożnie sekcjonuje się, aby usunąć jej krawędzie zewnętrzne, z których endofity mogły zostać wyeliminowane w wyniku kontaktu z dezynfekcjami. Przyciętą próbkę tnie się następnie na mniejsze fragmenty o średniej wielkości 6×6 mm w przypadku liści oraz o długości 6 mm w przypadku łodyg i korzeni.Przekroje wysiewa się na płytki Petri o średnicy 60 mm zawierające podłoże PDA uzupełnione o antybiotyki: tetracyklinę, streptomycynę oraz penicylinę w stężeniu 2 mg/L każdego z nich. Na koniec płytki uszczelnia się parafiną i inkubuje w ciemności w temperaturze 25 °C. Wodę do płukania wymienia się po przetworzeniu każdego bloku, jednak przed wysianiem 100 µL próbki na płytkę Petri o średnicy 100 mm z podłożem PDA i inkubacją przez 10 dni w temperaturze 25 °C w celu sprawdzenia, czy sterylizacja przebiegła pomyślnie.Jeśli w tej kontroli zostanie zauważony jakikolwiek wzrost, blok jest utylizowany i nie jest brany pod uwagę w analizie. Płytki są sprawdzane co dwa do trzech dni przez okres 20 dni w celu obserwacji i rejestracji wzrostu grzyba. Skolonizowane fragmenty roślin są wycinane i przenoszone pojedynczo na nowe płytki z pożywką, aby uniknąć zanieczyszczenia sąsiednich fragmentów.Wzrost B bassiana rejestruje się na podstawie charakterystycznej białej, gęstej grzybni, która na brzegach zmienia barwę na kremową lub bladożółtą. W razie wątpliwości próbkę umieszcza się w kropli wody na szkiełku przedmiotowym i bada pod mikroskopem w celu stwierdzenia obecności global scania oraz zygzakowatych kedia force, które są charakterystyczne dla tego gatunku w dniu oceny kolonizacji. Szacujemy również wpływ naszych zabiegów na wzrost roślin.W pierwszej kolejności mierzymy wysokość rośliny od jej podstawy do wierzchołka punktu wzrostu. Następnie ostrożnie wykarpujemy i płuczemy rośliny w wodzie z kranu, a następnie pozostawiamy je do wysuszenia w temperaturze 45 °C przez trzy dni w celu pomiaru ich suchej masy. Na potrzeby tej demonstracji cały eksperyment przeprowadzono dwukrotnie, aby uzyskać reprezentatywne wyniki.Obie metody inokulacji doprowadziły do fizykalizacji przez Bana w ponad 80% traktowanych roślin. Jednakże stopień kolonizacji zależał od ocenianej części rośliny oraz zastosowanej metody inokulacji. Najlepszą odpowiedź wykazali pędy.Z kolei korzenie reagowały wyłącznie na inokulację metodą polewania, podczas gdy inokulacja metodą oprysku nie przyniosła efektu. Ostatecznie łodygi reagowały podobnie na obie metody inokulacji. Bana nie została wykryta w żadnej z kontrolowanych sekcji roślin niezależnie od zastosowanych endofitów; jedynie Bana stanowiła 15% ocenianych sekcji roślin, lecz zostały one wycięte z szalek z pożywką przed tym, jak mogłyby zainfekować sąsiednie sekcje i wpłynąć na nasze wyniki.Rośliny traktowane i kontrolne były widocznie nieodróżnialne dwa tygodnie po inokulacji; nie stwierdzono istotnych różnic w ich suchej masie ani wysokości. Wiele czynników może wpływać na konkretny wynik eksperymentu mającego na celu ustanowienie patogenu endofitycznego jako efektu końcowego. Jak pokazuje ten film, metoda inokulacji jest jednym z nich. Do czynników biologicznych, które można modyfikować w eksperymentach, należą wybrany gatunek lub odmiana uprawy oraz wybór gatunku lub izolatu patogenu OMA. Inne czynniki, których manipulację należy rozważyć, to stężenie inokulum, wiek rośliny podczas inokulacji oraz warunki wzrostu rośliny.Nadrzędnym celem tych eksperymentów powinno być opracowanie skutecznej metody leczenia, która zapewni trwałą odporność systemiczną przeciwko INE lub chorobie. Gdy będą Państwo gotowi do testowania odporności indukowanej przez endofity, zalecamy obejrzenie filmu charakteryzującego mechanizmy odporności roślin, który został również opublikowany w Journal of Visualized Experiments. Należy pamiętać, że endofity są bardzo powszechne u roślin i mogą wpływać na możliwość trwałego wprowadzenia oraz wykrycia docelowego patogenu grzybowego jako endofita.Mamy nadzieję, że ta prezentacja okaże się pomocna. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ustanawianie grzybowych entomopatogenów jako endofitów: W kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

Tutaj opisujemy różne etapy związane z opartym na wiedzy rozwojem skutecznego środka mykosektycydowego, w tym izolację, identyfikację, badania przesiewowe i wybór "najlepiej dopasowanego" grzyba entomopatogenicznego, Metarhizium anisopliae, do zwalczania szkodników owadzich w rolnictwie.

Rozwój Metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.

Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Ten protokół przedstawia zoptymalizowany system testów biologicznych z oderwanymi liśćmi do oceny skuteczności grzybów entomopatogenicznych (EPF) przeciwko mszycy musztardowej (Lipaphis erysimi (Kalt.)), owadowi partenogenetycznemu. Metoda ta przedstawia w zarysie proces gromadzenia danych podczas eksperymentów na szalce Petriego, umożliwiając naukowcom konsekwentne mierzenie zjadliwości EPF wobec mszyc musztardowych i innych owadów partenogenetycznych.

Ocena wpływu mszyc grzybów entomopatogenicznych na owada partenogenetycznego, mszycę musztardową, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Opisujemy użycie chromatografii cienkowarstwowej, bezpośredniego testu bioautografii i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas do identyfikacji naturalnych produktów mikrobiologicznych, które wykazują antagonizm wobec patogenów grzybowych, używając patogenu Sclerotinia sclerotiorum i biopestycydowych izolatów Bacillus jako systemu modelowego.

Identyfikacja produktów naturalnych pod kontrolą biologiczną za pomocą chromatografii cienkowarstwowej - bioautografia bezpośrednia

Protokół testu biologicznego z oderwanymi liśćmi został opracowany dla masowej hodowli wciornastków chili przy użyciu zmodyfikowanej metody oderwanych liści w szklanych pojemnikach zawierających agar, zapewniając wysoką przeżywalność i zsynchronizowany rozwój. System ten umożliwia skuteczne badania przesiewowe zjadliwości grzybów entomopatogenicznych przeciwko larwom w drugimstadium rozwojowym i zapewnia niezawodne dostarczanie wciornastków do ocen laboratoryjnych, szklarniowych i terenowych.

Ustanowienie systemu hodowli wciornastków chili (Scirtothrips dorsalis hood) do badań przesiewowych zjadliwości grzybów entomopatogenicznych

Poznaj metody inokulacji grzybem Beauveria bassiana jako endofitem w fasoli zwyczajnej Phaseolus vulgaris. Protokół obejmuje sterylizację nasion, przygotowanie inokulum oraz aplikację oprysków liściowych i doglebowych w celu biologicznej ochrony roślin.

Ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

Przeglądaj więcej filmów