Ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

Hi.My nazywam się Ush Parsa i jestem entomologiem w SEA w Międzynarodowym Centrum Rolnictwa Tropikalnego. Nazywam się ViiV Artiz i również pracuję w Międzynarodowym Centrum Rolnictwa Tropikalnego, a nazywam się Fernando Vega i pracuję w Departamencie Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, w jaki sposób ułatwić i zweryfikować przekształcenie grzyba w patogen.

Jako endofit, w przyrodzie często można znaleźć owada lub roztocza zarażonego chorobotwórczym grzybem i istnieje długa historia stosowania tych grzybowych patogenów ando jako biologicznych pestycydów. Ostatnio od czasu do czasu stwierdzono, że patogeny grzybowe ando infekują rośliny, ale nie wywołując żadnych widocznych objawów ich obecności. Odkrycie to sygnalizuje ich potencjalne zastosowanie jako endofitów ochronnych przed szkodnikami rolniczymi.

Aby zbadać ten potencjał, konieczne jest najpierw opracowanie metody inokulacji, która niezawodnie ustanawia patogen grzybowy jako endofit w uprawie docelowej. B Bassiana jest jednym z najlepiej przebadanych patogenów grzybowych i jest łatwo dostępny jako komercyjny pestycyd. Grzyb ten został wykryty jako endofit w wielu gatunkach roślin, w tym w bananach, kawie i buzdyganku muszkatołowym.

Najnowsze dowody sugerujące, że B bassiana może potencjalnie chronić rośliny nie tylko przed szkodnikami stawonogów, ale także przed niektórymi patogenami roślin. Mechanizmy wyjaśniające tak szerokie spektrum ochrony są słabo poznane. Nadal w obszarze zastawki tikowej może być obiecujący dla upraw pozbawionych genetycznej odporności na szkodnika lub patogen, ale w przypadku upraw, które zazwyczaj cierpią z powodu jednoczesnego ataku wielu wrogów, powszechnym przykładem jest fas vulgaris.

Może być dotknięty przez ponad 400 szkodników i 200 patogenów, których atak jest uważany za najbardziej ograniczający czynnik produkcji fasoli w różnych regionach. Z tego powodu uważamy, że roślina pospolita może być dobrym kandydatem do zbadania chronionego potencjału Endo bbar. Jako pierwszy krok w tym kierunku, Arvid demonstruje skuteczność oprysków dolistnych i zraszania gleby jako metod inokulacji w celu ustalenia Bana jako endofitu.

W fasoli zwyczajnej nasiona fasoli o nazwie TOMA są sterylizowane powierzchniowo przez dwuminutowe zanurzenie w 0,5% podchlorynie sodu, a następnie dwuminutowe zanurzenie w 70% etanolu i trzy płukania w sterylnej wodzie destylowanej do powodzenia teorii. Stumikrolitrową próbkę wody do płukania umieszcza się na 100-milimetrowej płytce Petriego z pożywką PDA i inkubuje w ciemności przez 10 dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Eksperyment należy przerwać i wznowić, jeśli w tych kontrolach zaobserwowany jest wzrost.

Nasiona są szyte w grupach po trzy w doniczkach o szerokości 11,5 centymetra, zawierających sterylizowaną parą wodną mieszaninę gleby i piasku w stosunku dwa do jednego. Rośliny są uprawiane w kontrolowanych warunkach w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wilgotności względnej 50% i 12-godzinnym okresie fotograficznym o natężeniu światła 9 200 luksów tydzień po wykiełkowaniu. Rośliny są cienkie do jednej na doniczkę, aby zapewnić wigor i wyeliminować konkurencję.

Są nawadniane w razie potrzeby co dwa do trzech dni i nawożone 10 i 20 dni po posadzeniu roztworem wodnym nawozu NPK o stężeniu sześciu tysięcy na litr. Aby zapewnić jednorodność genetyczną naszych grzybów, izolaty powinny być hodowane z pojedynczych kultur kanadyjskich. Jeśli źródłem grzyba jest owad z grzybicą, zabieramy próbkę do okapu z przepływem laminarnym i używamy pętli zaszczepiającej, aby przenieść małą próbkę grzyba zarodnikującego DYS na pożywkę PDA.

Późniejsze przeniesienia na nowe płytki pożywki mogą być konieczne w celu usunięcia zanieczyszczeń, gdy docelowy grzyb wyrośnie i rozprzestrzeni się w czystej kulturze. Mała próbka edii zawieszona w jednym mililitrze 0,1% roztworu wodnego Triton X 100 i vortex tritton Exus jest środkiem powierzchniowo czynnym, który zmniejsza napięcie powierzchniowe wody i umożliwia dyspersję kedia. Porcja tej zawiesiny o objętości 100 mikrolitrów jest rozprowadzana na 100-milimetrowej płytce Petriego zawierającej cienką warstwę 2,5% akra szlachetnego, co pozwoli na wizualizację kedii na ich stereoskopie.

Płytkę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w ciemności, po czym pojedynczą pożywkę z kiełkującego pisaka przenosi się na płytkę z PDA i pozostawia do wzrostu przez trzy do czterech tygodni, aż pokryje całą płytkę i rozleje się. Ta metoda zapewnia czystą kulturę grzyba do kolejnych eksperymentów. Do tej demonstracji używamy czystej kultury Bavaria Bassiana, szczepu GH HA, uzyskanego z komercyjnego produktu Microt.

Inokulum przygotowuje się w sterylnych warunkach. W okapie z przepływem laminarnym używamy sterylnej szpatułki, aby zeskrobać około jednego grama narośli grzyba z powierzchni podłoża i zawiesić w 10 mililitrach sterylnego 0,1% Tritona X. Zawiesina jest wirowana przez jedną minutę i filtrowana przez sterylną gazę w celu oddzielenia kanady od Hy-Vee. Ten krok daje zablokowaną zawiesinę, którą należy dostosować do końcowego stężenia od 10 do ośmiu kedia na mililitr do inokulacji.

Po pierwsze, stężenie surowca jest szacowane w seryjnym rozcieńczeniu, które ułatwia liczenie kedia. W cytometrze hema 100 mikrolitrów bulionu rozcieńcza się w 900 mikrolitrach 0,1% Triton X i wiruje, co daje rozcieńczenie jeden na 10. Procedurę powtarza się seryjnie trzy dodatkowe razy, aby uzyskać rozcieńczenie jeden na 10 000.

Kedia będzie obecna w bardzo dużych ilościach w pierwszym rozcieńczeniu i w małych ilościach, które można łatwo policzyć w ostatnim rozcieńczeniu. Każda z dwóch komór cytometru Hema jest ładowana 10 mikrolitrami rozcieńczenia jeden na 10 000 i umieszczana pod mikroskopem w celu policzenia kedia. Obszar rządzący cytometru Hema składa się z dziewięciu dużych kwadratów, z których każdy zawiera odpowiednio 100 nanolitrów lub 0,0001 mililitra.

Aby oszacować stężenie ED w próbce, liczymy i uśredniamy ED w czterech dużych kwadratach narożnych każdej komory i dzielimy tę średnią przez 0,0001. Pomnożenie tego stężenia przez nasz współczynnik rozcieńczenia 10 000 daje teraz stężenie bulionu, aby obliczyć końcową objętość, do której należy go dostosować. Aby uzyskać 10 38 edia na mililitr inokulum, stosujemy formułę.

Objętość końcowa równa się objętości zapasów pomnożonej przez koncentrację zapasów w stosunku do stężenia końcowego. W naszej demonstracji bulion musi zostać dostosowany do końcowej objętości 195,5 mililitra, aby uzyskać pożądane stężenie. Przed użyciem inokulum ważne jest, aby przeprowadzić test kiełkowania oceniający żywotność kanału.

W tym teście umieszczamy 100 mikrolitrów rozcieńczenia jeden na 10 000 na 100 milimetrowej płytce Petriego z 2,5% szlachetnym jajkiem lub pożywką. Próbkę rozprowadza się za pomocą sterylnego szklanego pręta na powierzchni podłoża i inkubuje w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Żywotność oceniono pod mikroskopem, szacując procent kedii z rosnącą rurką zarodkową.

W przypadku trzech losowych próbek po 100 Kanadyjczyków, kanadyjska zawiesina może być stosowana do inokulacji tylko wtedy, gdy średnie kiełkowanie przekracza 90%W tej demonstracji stwierdzamy średnie kiełkowanie 97%Zademonstrujemy dwie metody inokulacji, opryski dolistne i zraszanie gleby, oba stosowane, gdy rośliny osiągają pierwsze prawdziwe stadium liści. Około 14 dni po posadzeniu metodę opryskiwania dolistnego wykonuje się za pomocą ręcznego rozpylacza, kierując zawiesinę cial na al-lub górną powierzchnię liści, aż do ich nasycenia. Wierzch każdej doniczki jest pokryty folią aluminiową, aby uniknąć spływania stożka do gleby Po oprysku każda roślina jest przykrywana plastikową torbą na 24 godziny, aby utrzymać wysoki poziom wilgotności ułatwiający inwazję grzybów.

Metodę inokulacji zraszającej glebę przeprowadza się przy pojemności wodnej gleby. Około 24 godziny po podlaniu roślin do nasycenia gleby na powierzchnię gleby nakłada się 10 mililitrów zawiesiny cialnej. U podstawy kontrolowanej rośliny otrzymują sterylny 0,1% Tritton X stosowany w taki sam sposób, jak w odpowiednich zabiegach.

Rośliny są zwracane do komór wzrostowych i układane w losowy, kompletny projekt blokowy z trzema powtórzeniami na zabieg. Oceniliśmy zakład dwa tygodnie po szczepieniach, blok po bloku. Rośliny są starannie zbierane i indywidualnie myte pod bieżącą wodą z kranu z każdej rośliny.

Pobieramy próbki z dwóch listków, dwóch kawałków korzenia i dwóch kawałków łodygi są losowo wybierane z pierwszego prawdziwego liścia rośliny i przycinane do kwadratowej łodygi. Próbki o długości około trzech centymetrów pobiera się ze środka rośliny i z okolic powierzchni gleby. Próbki korzeni palowych o podobnej długości uzyskuje się ze środka korzenia i z jednego centymetra za wierzchołkiem korzenia.

Każda próbka jest indywidualnie sterylizowana powierzchniowo w sterylnym kapturze w 0,5% podchlorynie sodu przez dwie minuty, a następnie 70% etanolem przez dwie minuty i trzykrotnie płukana sterylną wodą destylowaną przed pozostawieniem do wyschnięcia. W sterylnym papierze ręcznikowym wysterylizowana próbka jest następnie starannie preparowana, aby odrzucić jej zewnętrzną krawędź, gdzie endofity mogły zostać wyeliminowane w wyniku kontaktu z mrówkami dezynfekującymi. Próbka przycięta jest następnie cięta na mniejsze sekcje o średniej długości sześć na sześć milimetrów w przypadku liści i sześć milimetrów w przypadku łodyg i korzeni.

Skrawki są posiewane na 60-milimetrowych płytkach Petriego zawierających PDA uzupełnione antybiotykami tetracykliną w postaci streptomycyny i penicyliny w ilości dwóch miligramów na litr każda. Na koniec płytki są uszczelniane parafiną i inkubowane w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Woda do płukania jest zmieniana po przetworzeniu każdego bloku, ale przed posiewem próbki o objętości 100 mikrolitrów na 100-milimetrowej płytce Petriego, pożywce PDA i inkubacji przez 10 dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w celu ustalenia, czy serializacja się powiodła.

Jeśli w tej kontrolce jest widoczny jakikolwiek wzrost, blok jest odrzucany i nie jest brany pod uwagę do analizy. Płytki są sprawdzane co dwa do trzech dni przez 20 dni w celu obserwacji i zarejestrowania wzrostu grzybów. Skolonizowane sekcje roślin są wycinane i przenoszone pojedynczo na nowe płytki pożywki, aby uniknąć zanieczyszczenia sąsiednich sekcji.

Wzrost B bassiana jest rejestrowany na podstawie charakterystycznej białej, gęstej grzybni, która na brzegu przechodzi w kremową do bladożółtej. W razie wątpliwości próbkę umieszcza się w kropli wody na świetle mikroskopu i bada pod kątem globalnej siły kedii w kształcie zygzaka charakterystycznej dla gatunku w tym samym dniu, w którym oceniana jest kolonizacja. Szacujemy również wpływ naszych zabiegów na wzrost roślin.

Najpierw mierzymy wysokość rośliny od podstawy rośliny do szczytu punktu wzrostu. Następnie ostrożnie wyrywamy i myjemy rośliny w wodzie z kranu i pozostawiamy je do wyschnięcia w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez trzy dni, aby zmierzyć ich suchą wagę. W przypadku tej demonstracji przeprowadziliśmy cały eksperyment dwukrotnie, aby uzyskać reprezentatywne wyniki.

Obie metody inokulacji doprowadziły do unicezolnienia przez Bana w ponad 80% traktowanych roślin. Jednak zakres kolonizacji zależy od ocenianej części rośliny i zastosowanej metody inokulacji. Najlepiej zareagowali potencjalni klienci.

Z drugiej strony korzenie inokulacji w sprayu reagowały tylko na szczepienia zraszające. Ostatecznie łodygi zareagowały podobnie na obie metody inokulacji. Bana nie została wykryta w żadnym z kontrolowanych odcinków roślin niezależnie od endofitów traktowanych innym niż Bana zgrupowana z 15% ocenianych sekcji roślin, ale zostały one wycięte z płytek pożywki, zanim mogły zaatakować sąsiednie sekcje i wpłynąć na nasze wyniki.

Zakłady podsłuchiwania i kontroli były wyraźnie nie do odróżnienia dwa tygodnie po inokulacji i nie wykryto istotnych różnic w ich suchej masie i wzroście. Wiele czynników może wpływać na konkretny wynik eksperymentu na ustalenie patogenu endo jako efektu końcowego. Jak pokazuje ten film, metoda inokulacji jest jednym z czynników biologicznych, z którymi można eksperymentować, w tym wybrany gatunek rośliny uprawnej lub odmiany, wybór gatunku patogenu OMA lub wyizolować inne czynniki, które należy rozważyć, manipulując, obejmują stężenie inokulum, wiek rośliny podczas inokulacji i warunki wzrostu rośliny.

Ostatecznym celem tych eksperymentów powinno być opracowanie skutecznego leczenia, które zapewni trwałą ogólnoustrojową oporność na INE lub chorobę. Kiedy będziesz gotowy do przetestowania odporności zapośredniczonej w walce na końcu, zalecamy obejrzenie filmu charakteryzującego ziołowe mechanizmy odporności, opublikowanego również w Journal of Visualized Experiments. Należy pamiętać, że endofity są bardzo powszechne w roślinach i mogą wpływać na twoją zdolność do trwałego ustanawiania i wykrywania docelowego grzyba na patogen jako walkę endo

Mamy nadzieję, że ta demonstracja okaże się przydatna. Powodzenia w eksperymentach.