Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oczyszczanie RNA z chirurgicznych próbek ludzkiej siatkówki w celu analizy transkryptomu w odwarstwieniu siatkówki. W tym celu odczynniki i materiały niezbędne do pobrania próbki chirurgicznej są przygotowywane w laboratorium i wysyłane do szpitala. Podczas zabiegu chirurgicznego próbka zostaje pobrana i przekazana z powrotem do laboratorium.

RNA jest następnie oczyszczane przy użyciu zestandaryzowanej procedury z gradientem chlorku cezu, a następnie ocenia się jakość oczyszczonego RNA. Ostatecznie analiza ekspresji mRNA wykazuje, że zarówno stan zapalny, jak i degeneracja fotoreceptorów są zaangażowane w odwarstwienie siatkówki, co wskazuje zmiana ekspresji kluczowych genów. W procesach tych zidentyfikowanych za pomocą analizy transkrypcyjnej, główną zaletą tej metody w porównaniu do istniejących metod oczyszczania RNA, takich jak ekstrakcja chloroformowa (znana również jako Trizol), jest to, że otrzymane RNA nie jest zanieczyszczone DNA.

Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie odwarstwienia siatkówki, ponieważ dostarcza ona środków technicznych do opracowania nowych terapii wspomagających. Dla każdej próbki do pobrania należy użyć pipety wolnej od RNaz, aby napełnić sterylną probówkę z polietylenu o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów 2,4 mililitrów sześciomolarnego roztworu chlorku guanydyny wolnego od RNaz. Do wypełnienia górnej części probówek należy użyć argonu.

Następnie szybko załóż zakrętkę, dociskając ją mocno, aby zapewnić szczelność. Zapobiegnie to utlenianiu chlorku guanidyny podczas wieloletniego przechowywania w szafce chirurgicznej. Następnie umieść każdą z probówek o pojemności 5 ml w sterylnej probówce stożkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml.

Po dodaniu tkanki i przykręceniu zakrętki, należy umieścić probówki o pojemności 50 mililitrów w statywie polistyrenowym. Następnie statyw oraz przygotowane koperty, wraz z wypełnionymi formularzami wysyłkowymi, należy umieścić w kartonowym pudełku w szpitalu. Przenieś kartonowe pudełko z szafki chirurgicznej do sali operacyjnej.

Podczas zabiegu umieść preparat siatkówki w probówce wypełnionej roztworem chlorków o określonej ilości. Szczelnie zamknij probówkę. Krótko wymieszaj zawartość probówki.

Następnie umieść probówkę na kołysce do mieszania krwi na 10 minut. Wypełnij dołączony formularz próbki, podając identyfikację pacjenta, datę zabiegu oraz wszelkie dodatkowe uwagi. Następnie zapisz numer identyfikacyjny na odpowiedniej ponumerowanej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Następnie umieść probówkę 5 ml z materiałem chirurgicznym w probówce 50 ml. Uzupełnij ręczniki papierowe i zakręć probówkę. Następnie włóż probówkę 50 ml oraz formularz przyjęcia próbki do odpowiedniej wyściełanej koperty i zaklej ją.

Po otrzymaniu próbki w laboratorium, należy zhomogenizować materiał w probówce o pojemności pięciu mililitrów za pomocą homogenizatora Polytron™ przy maksymalnym ustawieniu przez jedną minutę, poruszając probówką w górę i w dół. Po zhomogenizowaniu próbki, w celu ekstrakcji polisacharydów, należy dodać 270 µL 2 M octanu potasu i umieścić probówkę w pozycji poziomej na wytrząsarce. Intensywnie wytrząsać przez 10 minut, a następnie wirować przez 10 minut przy 6 500 G w temperaturze 20 °C.

Po wirowaniu należy ostrożnie odessać pipetą frakcję rozpuszczalną, tak aby nie naruszyć osadu. Należy przenieść nadsącz do sterylnej probówki o pojemności 14 ml wolnej od RNaz. Do nadsączu należy dodać 5,3 ml 1% sarkozyny w 100 mM Tris oraz 3,2 g chlorku cezu.

Sarkozyna rozpuści błonę, a chlorek cezu posłuży do wytworzenia gradientu. Wymieszaj zawartość probówki, wirując ją na wstrząsarze Vortex przez jedną minutę. Do sterylnej polimerowej probówki wirówkowej o pojemności 11 ml dodaj 1,8 ml EDTA z chlorkiem cezu.

Następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 10 ml nanieś roztwór RNA na roztwór chlorku cezu i EDTA, pozwalając mu spływać po wewnętrznej ściance probówki. Umieść probówki w wirówce. W razie potrzeby użyj drugiej probówki zawierającej bufory bez retiną w celu zbilansowania masy, a następnie wiruj przez 24 godziny przy 225 000 G w temperaturze 20 °C.

Kolejnego dnia. Po wirowaniu na górze probówki utworzy się warstwa lipidów. DNA znajdzie się w środkowej części, a RNA zostanie osadzone w formie granulatu na dnie probówki.

Za pomocą sterylnej pipety Pasteura ostrożnie usuń górną warstwę lipidową, wykorzystując do tego drugą sterylną pipetę Pasteura. Stopniowo odsysaj roztwór, aż do momentu aspiracji lepkiego DNA. Usuń roztwór wraz z DNA.

Następnie, używając trzeciej sterylnej pipety Pasteura, należy usunąć i odrzucić pozostałą część roztworu, uważając, aby nie naruszyć osadu RNA. Teraz, używając skalpela wysterylizowanego w płomieniu, należy odciąć probówkę w miejscu pokazanym tutaj i odrzucić jej górną część.

Pozostałą część umieść odwróconą do góry dnem na sterylnej gazie. Odwróć probówkę i za pomocą pipety delikatnie wypłucz ją 160 µL chlorku guanidyny. Pozostaw osad do wyschnięcia na 10 minut.

Po wysuszeniu osadu, resuspendować go w 150 µL buforu tris-EDTA-SDS. Następnie dodać 150 µL buforu tris-EDTA oraz 30 µL 3 M octanu sodu, a następnie wymieszać w wirówce vortex, aby wytrącić RNA. Dodać 900 µL lodowatego, 100% etanolu.

Wymieszaj zawartość probówki w wirówce wortex i pozostaw ją na topniejącym lodzie na 30 minut. Następnie wiruj probówkę przez 30 minut przy 18, 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu może być widoczny, lub nie, niewielki biały osad.

Niezależnie od tego, czy osad jest widoczny, delikatnie odessać nadosad i go usunąć. Następnie, aby usunąć nadmiar soli, dodać 500 µL 70% etanolu o temperaturze pokojowej i wymieszać na wirówce typu vortex, a następnie wirować probówkę przez 20 minut przy 18 000 G w temperaturze 4 °C. Po powtórzeniu przemywania 70% etanolem i wirowania, użyć pipety P 200, aby usunąć pozostały etanol.

Pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Resuspenduj osad w 50 µL wody destylowanej, mieszając energicznie w wstrząsarze wortex przez dwie minuty. Następnie umieść próbkę w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C na 15 minut.

Aby w pełni resuspender RNA. Na koniec należy oznaczyć stężenie RNA za pomocą absorbancji przy 260 nanometrach i przeanalizować RNA metodą elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem. W towarzyszącym dokumencie, w celu zbadania transkryptomu odwarstwienia siatkówki, zastosowano procedurę opisaną w czasopiśmie, aby odzyskać i przeanalizować RNA siatkówki od 18 pacjentów z odwarstwieniem siatkówki oraz 18 kontroli dobranych pod względem wieku, przygotowanych z siatkówek pobranych po śmierci.

Następnie RNA poddano oczyszczaniu i analizie za pomocą elektroforezy żelowej oraz analizy na bazie rettino, zgodnie z opisem w niniejszym raporcie; przedstawione tutaj wykresy radarowe obrazują ekspresję genu czynnika chemotaktycznego monocytów MCP-1, CCL2. Prawa część rysunku oznaczona jako RD odpowiada RNA pobranemu od pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, natomiast lewa część oznaczona jako N to RNA z grupy kontrolnej, co widać tutaj. Odwarstwienie siatkówki prowadzi do upregulacji CCL2, o czym świadczą wysokie wartości C w większości próbek RD po prawej stronie w porównaniu do próbek kontrolnych po lewej.

Ten wzrost wskazuje na stan zapalny u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, co można zaobserwować w tym miejscu. Ekspresja genu transdukcyjnego fotoreceptorów pręcikowych GNAT1 była obniżona w przeciwieństwie do CCL2; wartości dla próbek RD po prawej stronie są niskie. Zaobserwowano również spadek ekspresji opsyny krótkofalowej czopków OPN1SW oraz genu homeoboksowego CRX, co sugeruje degenerację zarówno pręcików, jak i czopków u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat zmian w ekspresji genów po odwarstwieniu siatkówki. Może ona być również zastosowana w badaniu innych patologii siatkówki w modelach zwierzęcych, takich jak dziedziczne degeneracje siatkówki.

Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona wiedzy na temat kwasów nukleinowych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa jako pomoc dydaktyczna, ponieważ procesy związane z RNA po certyfikacji są skomplikowane.