Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczenie RNA z ludzkich próbek chirurgicznych siatkówki do analizy transkryptomu w odwarstwieniu siatkówki. Za pomocą dziennika odczynniki i materiały potrzebne do pobrania próbki chirurgicznej są przygotowywane w laboratorium i wysyłane do szpitala. Podczas zabiegu chirurgicznego próbka jest pobierana i zwracana do laboratorium.

RNA jest następnie oczyszczane przy użyciu standaryzowanej procedury gradientu chlorku cezu i oceniana jest jakość oczyszczonego RNA. Ostatecznie. Analiza ekspresji mRNA pokazuje, że zarówno stan zapalny, jak i zwyrodnienie fotoreceptorów są zaangażowane w odwarstwienie siatkówki, na co wskazują zmiany w ekspresji kluczowych genów. W tych procesach zidentyfikowanych za pomocą analizy transkryptomicznej, główną przewagą czasopisma nad istniejącymi oczyszczaniami orny, takimi jak chlor GTIN z ekstrakcji, znany również jako ole, jest to, że orna nie jest zanieczyszczona DNA.

Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie odwarstwienia siatkówki, ponieważ zapewnia ona środki techniczne do opracowania nowych terapii uzupełniających. Dla każdej próbki, która ma zostać pobrana, użyj pipety wolnej od RNA, aby napełnić pięciomililitrową sterylną probówkę z polietylenu o okrągłym dnie 2,4 mililitra roztworu chlorku gwinei wolnego od sześciomolowego RNA. Użyj argonu do napełnienia górnej części rurek.

Następnie szybko umieść nakrętkę, mocno dociskając, aby upewnić się, że jest szczelna. Zapobiegnie to utlenianiu chlorku gwinizmu przez kilka lat przechowywania w gabinecie chirurgicznym. Następnie umieść każdą z pięciu mililitrowych probówek w sterylnej polipropylenowej probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 mililitrów.

Po dodaniu chusteczki i przykręceniu nakrętki umieść 50-mililitrowe rurki w styropianowym stojaku. Następnie umieść stojak i przygotowane koperty wraz z przygotowanymi formularzami wysyłkowymi w kartonie w szpitalu. Przynieś karton z szafki operacyjnej na salę operacyjną.

Podczas zabiegu należy umieścić wycinek siatkówki w probówce wypełnionej pewną ilością i roztworem chlorku. Zamknij szczelnie rurkę. Krótko wymieszaj probówkę.

Następnie umieść probówkę na zaworze rurki z krwią na 10 minut. Wypełnij dołączony formularz próbny, podając dane identyfikacyjne pacjenta, datę operacji i ewentualne dodatkowe uwagi. Następnie napisz numer identyfikacyjny na odpowiedniej ponumerowanej tubie o pojemności 50 mililitrów.

Następnie umieść pięciomililitrową rurkę z próbką chirurgiczną w 50-mililitrowej tubce. Wymień papierową chusteczkę i zakryj tubę. Następnie umieść 50-mililitrową probówkę i formularz pobierania próbki w odpowiedniej wyściełanej kopercie i zamknij ją.

Po otrzymaniu próbki w laboratorium homogenizuj próbkę w pięciomililitrowej probówce za pomocą homogenizatora poly tron TM na maksymalnym ustawieniu przez jedną minutę, przesuwając probówkę w górę iw dół. Po homogenizacji próbki, w celu wyekstrahowania polisacharydów, dodaj 270 mikrolitrów dwóch molowych octanów potasu i umieść probówkę na wytrząsarce w pozycji poziomej. Wstrząsać energicznie przez 10 minut, a następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 6,500 G w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Po wirowaniu użyj pipety, aby ostrożnie zassać rozpuszczalną frakcję, nie naruszając osadu. Przenieść supernatant do 14-mililitrowej sterylnej probówki wolnej od RNA. Obok supernatantu dodaj 5,3 mililitra 1% i Laurel Sarcosine w 100, milimolowym tri i 3,2 grama chlorku cezu.

Sakozyna rozpuszcza błonę, a chlorek cezu jest używany do generowania gradientu. Wymieszaj probówkę, wirując przez jedną minutę. Dodaj 1,8 mililitra chlorku cezu EDTA do sterylnej 11-mililitrowej polimerowej probówki wirówkowej.

Następnie za pomocą 10-mililitrowej sterylnej pipety pastora nałóż roztwór RNA na roztwór EDTA chlorku cezu, pozwalając mu spłynąć po wewnętrznej powierzchni probówki. Umieść probówki w wirówce. W razie potrzeby użyj drugiej probówki zawierającej bez siatkówki jako równowagi i wiruj przez 24 godziny w temperaturze 225 000 G w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Następnego dnia. Po wirowaniu w górnej części rurki utworzy się warstwa lipidowa. DNA będzie w środku, a RNA zostanie granulowane na dnie probówki.

Użyj sterylnej pipety do pasty, aby ostrożnie usunąć i wyrzucić górną warstwę lipidową za pomocą drugiej sterylnej pipety do pasty. Stopniowo usuwaj roztwór, aż lepkie DNA zostanie odessane. Wyrzuć roztwór i DNA.

Następnie za pomocą trzeciej sterylnej pipety pastora usuń i wyrzuć pozostały roztwór. Uważając, aby nie naruszyć osadu RNA. Teraz za pomocą skalpela wysterylizowanego płomieniem odetnij rurkę, jak pokazano tutaj, i wyrzuć górną część.

Pozostałą część połóż do góry nogami na sterylnej gazie. Odwróć probówkę i za pomocą pipety delikatnie przepłucz ją 160 mikrolitrami chlorku gwinei. Pozostaw granulkę do wyschnięcia na 10 minut.

Po wyschnięciu granulki zawiesić w 150 mikrolitrach tris, E-D-T-A-S-D-S. Następnie dodaj 150 mikrolitrów tris, EDTA i 30 mikrolitrów trzech molowych octanu sodu, a następnie wiruj, aby wytrącić RNA. Dodaj 900 mikrolitrów lodowatego 100% etanolu.

Zwiruj rurkę i umieść ją na topniejącym lodzie na 30 minut. Następnie odwirować probówkę przez 30 minut w temperaturze 18 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu maleńka biała kulka może, ale nie musi być widoczna.

Niezależnie od tego, czy osad jest widoczny, czy nie, delikatnie zassaj supernatant i wyrzuć go. Następnie, aby usunąć nadmiar soli, dodaj 500 mikrolitrów temperatury pokojowej, 70% etanolu i wiruj, wirówkę probówkową, probówkę przez 20 minut w temperaturze 18 000 G w czterech stopniach Celsjusza. Po powtórzeniu mycia i wirowania 70% etanolu użyj pipety P 200, aby usunąć pozostały etanol.

Pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach uzdatnionej wody, energicznie mieszać, wirując przez dwie minuty. Następnie umieść próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza na 15 minut.

Aby całkowicie zawiesić RNA. Na koniec określ stężenie RNA przez absorbancję przy 260 nanometrach i przeanalizuj RNA za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem. W dokumencie towarzyszącym, Aby zbadać transkryptom odwarstwienia siatkówki, procedura dziennika została wykorzystana do odzyskania i analizy RNA siatkówki od 18 pacjentów z odwarstwieniem siatkówki i 18 dopasowanych do wieku osób kontrolnych przygotowanych przy użyciu pośmiertnych siatek.

RNA zostało następnie oczyszczone i przeanalizowane przy użyciu elektroforezy żelowej i zasady rettino, jak opisano w tym raporcie, pokazano tutaj wykresy radarowe przedstawiające ekspresję monocytów chemotaktycznego M CP jednego genu CCL dwóch. Prawa część rysunku oznaczona jako RD odpowiada RNA od pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, podczas gdy lewa część oznaczona N to RNA z kontroli, jak widać tutaj. Odwarstwienie siatkówki powoduje regulację w górę CCL dwa, na co wskazują wysokie wartości C w większości próbek RD po prawej stronie w porównaniu z kontrolnymi po lewej stronie.

Wzrost ten wskazuje na stan zapalny u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, co widać tutaj. Ekspresja genu transdukującego fotoreceptory pręcików GNAT jeden została zmniejszona w przeciwieństwie do CCL dwa, wartości są niskie dla próbek RD po prawej stronie, zaobserwowano również spadek ekspresji stożka krótkofalowego opsyny O PN jeden SW, a także zaobserwowano gen homeo CRX, co sugeruje zwyrodnienie fotoreceptorów zarówno pręcików, jak i czopków u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki Dzięki tej metodzie może zapewnić wgląd w zmiany ekspresji genów po odwarstwieniu siatkówki. Może być również stosowany do innych patologii siatkówki w modelach zwierzęcych, takich jak dziedziczne zwyrodnienia siatkówki.

Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ wymaga ona wiedzy na temat kwasu nukleinowego. Cy.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie jako przeprowadzenie, które RNA po certyfikacji jest trudne.