Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl
14 sierpnia 2013
Użyliśmy próbek siatkówki z retinektomii do transkryptomicznej analizy odwarstwienia siatkówki. Opracowaliśmy procedurę, która pozwala na zachowanie RNA między blokami operacyjnymi a laboratorium. Ustandaryzowaliśmy protokół oczyszczania RNA za pomocą ultrawirowania chlorku cezu, aby upewnić się, że oczyszczone RNA nadają się do analizy mikromacierzy.
Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczenie RNA z ludzkich próbek chirurgicznych siatkówki do analizy transkryptomu w odwarstwieniu siatkówki. Za pomocą dziennika odczynniki i materiały potrzebne do pobrania próbki chirurgicznej są przygotowywane w laboratorium i wysyłane do szpitala. Podczas zabiegu chirurgicznego próbka jest pobierana i zwracana do laboratorium.
RNA jest następnie oczyszczane przy użyciu standaryzowanej procedury gradientu chlorku cezu i oceniana jest jakość oczyszczonego RNA. Ostatecznie. Analiza ekspresji mRNA pokazuje, że zarówno stan zapalny, jak i zwyrodnienie fotoreceptorów są zaangażowane w odwarstwienie siatkówki, na co wskazują zmiany w ekspresji kluczowych genów. W tych procesach zidentyfikowanych za pomocą analizy transkryptomicznej, główną przewagą czasopisma nad istniejącymi oczyszczaniami orny, takimi jak chlor GTIN z ekstrakcji, znany również jako ole, jest to, że orna nie jest zanieczyszczona DNA.
Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie odwarstwienia siatkówki, ponieważ zapewnia ona środki techniczne do opracowania nowych terapii uzupełniających. Dla każdej próbki, która ma zostać pobrana, użyj pipety wolnej od RNA, aby napełnić pięciomililitrową sterylną probówkę z polietylenu o okrągłym dnie 2,4 mililitra roztworu chlorku gwinei wolnego od sześciomolowego RNA. Użyj argonu do napełnienia górnej części rurek.
Następnie szybko umieść nakrętkę, mocno dociskając, aby upewnić się, że jest szczelna. Zapobiegnie to utlenianiu chlorku gwinizmu przez kilka lat przechowywania w gabinecie chirurgicznym. Następnie umieść każdą z pięciu mililitrowych probówek w sterylnej polipropylenowej probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 mililitrów.
Po dodaniu chusteczki i przykręceniu nakrętki umieść 50-mililitrowe rurki w styropianowym stojaku. Następnie umieść stojak i przygotowane koperty wraz z przygotowanymi formularzami wysyłkowymi w kartonie w szpitalu. Przynieś karton z szafki operacyjnej na salę operacyjną.
Podczas zabiegu należy umieścić wycinek siatkówki w probówce wypełnionej pewną ilością i roztworem chlorku. Zamknij szczelnie rurkę. Krótko wymieszaj probówkę.
Następnie umieść probówkę na zaworze rurki z krwią na 10 minut. Wypełnij dołączony formularz próbny, podając dane identyfikacyjne pacjenta, datę operacji i ewentualne dodatkowe uwagi. Następnie napisz numer identyfikacyjny na odpowiedniej ponumerowanej tubie o pojemności 50 mililitrów.
Następnie umieść pięciomililitrową rurkę z próbką chirurgiczną w 50-mililitrowej tubce. Wymień papierową chusteczkę i zakryj tubę. Następnie umieść 50-mililitrową probówkę i formularz pobierania próbki w odpowiedniej wyściełanej kopercie i zamknij ją.
Po otrzymaniu próbki w laboratorium homogenizuj próbkę w pięciomililitrowej probówce za pomocą homogenizatora poly tron TM na maksymalnym ustawieniu przez jedną minutę, przesuwając probówkę w górę iw dół. Po homogenizacji próbki, w celu wyekstrahowania polisacharydów, dodaj 270 mikrolitrów dwóch molowych octanów potasu i umieść probówkę na wytrząsarce w pozycji poziomej. Wstrząsać energicznie przez 10 minut, a następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 6,500 G w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Po wirowaniu użyj pipety, aby ostrożnie zassać rozpuszczalną frakcję, nie naruszając osadu. Przenieść supernatant do 14-mililitrowej sterylnej probówki wolnej od RNA. Obok supernatantu dodaj 5,3 mililitra 1% i Laurel Sarcosine w 100, milimolowym tri i 3,2 grama chlorku cezu.
Sakozyna rozpuszcza błonę, a chlorek cezu jest używany do generowania gradientu. Wymieszaj probówkę, wirując przez jedną minutę. Dodaj 1,8 mililitra chlorku cezu EDTA do sterylnej 11-mililitrowej polimerowej probówki wirówkowej.
Następnie za pomocą 10-mililitrowej sterylnej pipety pastora nałóż roztwór RNA na roztwór EDTA chlorku cezu, pozwalając mu spłynąć po wewnętrznej powierzchni probówki. Umieść probówki w wirówce. W razie potrzeby użyj drugiej probówki zawierającej bez siatkówki jako równowagi i wiruj przez 24 godziny w temperaturze 225 000 G w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Następnego dnia. Po wirowaniu w górnej części rurki utworzy się warstwa lipidowa. DNA będzie w środku, a RNA zostanie granulowane na dnie probówki.
Użyj sterylnej pipety do pasty, aby ostrożnie usunąć i wyrzucić górną warstwę lipidową za pomocą drugiej sterylnej pipety do pasty. Stopniowo usuwaj roztwór, aż lepkie DNA zostanie odessane. Wyrzuć roztwór i DNA.
Następnie za pomocą trzeciej sterylnej pipety pastora usuń i wyrzuć pozostały roztwór. Uważając, aby nie naruszyć osadu RNA. Teraz za pomocą skalpela wysterylizowanego płomieniem odetnij rurkę, jak pokazano tutaj, i wyrzuć górną część.
Pozostałą część połóż do góry nogami na sterylnej gazie. Odwróć probówkę i za pomocą pipety delikatnie przepłucz ją 160 mikrolitrami chlorku gwinei. Pozostaw granulkę do wyschnięcia na 10 minut.
Po wyschnięciu granulki zawiesić w 150 mikrolitrach tris, E-D-T-A-S-D-S. Następnie dodaj 150 mikrolitrów tris, EDTA i 30 mikrolitrów trzech molowych octanu sodu, a następnie wiruj, aby wytrącić RNA. Dodaj 900 mikrolitrów lodowatego 100% etanolu.
Zwiruj rurkę i umieść ją na topniejącym lodzie na 30 minut. Następnie odwirować probówkę przez 30 minut w temperaturze 18 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu maleńka biała kulka może, ale nie musi być widoczna.
Niezależnie od tego, czy osad jest widoczny, czy nie, delikatnie zassaj supernatant i wyrzuć go. Następnie, aby usunąć nadmiar soli, dodaj 500 mikrolitrów temperatury pokojowej, 70% etanolu i wiruj, wirówkę probówkową, probówkę przez 20 minut w temperaturze 18 000 G w czterech stopniach Celsjusza. Po powtórzeniu mycia i wirowania 70% etanolu użyj pipety P 200, aby usunąć pozostały etanol.
Pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach uzdatnionej wody, energicznie mieszać, wirując przez dwie minuty. Następnie umieść próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza na 15 minut.
Aby całkowicie zawiesić RNA. Na koniec określ stężenie RNA przez absorbancję przy 260 nanometrach i przeanalizuj RNA za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem. W dokumencie towarzyszącym, Aby zbadać transkryptom odwarstwienia siatkówki, procedura dziennika została wykorzystana do odzyskania i analizy RNA siatkówki od 18 pacjentów z odwarstwieniem siatkówki i 18 dopasowanych do wieku osób kontrolnych przygotowanych przy użyciu pośmiertnych siatek.
RNA zostało następnie oczyszczone i przeanalizowane przy użyciu elektroforezy żelowej i zasady rettino, jak opisano w tym raporcie, pokazano tutaj wykresy radarowe przedstawiające ekspresję monocytów chemotaktycznego M CP jednego genu CCL dwóch. Prawa część rysunku oznaczona jako RD odpowiada RNA od pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, podczas gdy lewa część oznaczona N to RNA z kontroli, jak widać tutaj. Odwarstwienie siatkówki powoduje regulację w górę CCL dwa, na co wskazują wysokie wartości C w większości próbek RD po prawej stronie w porównaniu z kontrolnymi po lewej stronie.
Wzrost ten wskazuje na stan zapalny u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, co widać tutaj. Ekspresja genu transdukującego fotoreceptory pręcików GNAT jeden została zmniejszona w przeciwieństwie do CCL dwa, wartości są niskie dla próbek RD po prawej stronie, zaobserwowano również spadek ekspresji stożka krótkofalowego opsyny O PN jeden SW, a także zaobserwowano gen homeo CRX, co sugeruje zwyrodnienie fotoreceptorów zarówno pręcików, jak i czopków u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki Dzięki tej metodzie może zapewnić wgląd w zmiany ekspresji genów po odwarstwieniu siatkówki. Może być również stosowany do innych patologii siatkówki w modelach zwierzęcych, takich jak dziedziczne zwyrodnienia siatkówki.
Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ wymaga ona wiedzy na temat kwasu nukleinowego. Cy.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie jako przeprowadzenie, które RNA po certyfikacji jest trudne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na oczyszczaniu RNA z ludzkich chirurgicznych próbek siatkówki w celu analizy transkryptomu w przypadkach odwarstwienia siatkówki. Zastosowano znormalizowaną procedurę gradientu chlorku cezu, aby zapewnić jakość RNA do dalszej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia siatkówki
- Transkryptomyka
Tło
- Odwarcienie siatkówki może prowadzić do znacznej utraty wzroku.
- Zrozumienie zmian w ekspresji genów jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Jakość RNA jest niezbędna dla dokładnej analizy transkryptomu.
- Istniejące metody oczyszczania RNA mogą prowadzić do kontaminacji.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody oczyszczania RNA z próbek siatkówki.
- Analiza ekspresji mRNA związanej z odwarstwieniem siatkówki.
- Ocena zaangażowania stanu zapalnego i degeneracji fotoreceptorów.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek siatkówki podczas retinotomii.
- Przygotowanie reagentów i materiałów do ekstrakcji RNA.
- Znormalizowana procedura gradientu chlorku cezu do oczyszczania RNA.
- Ocenie jakości RNA na potrzeby analizy mikroarray.
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych zmian w ekspresji genów związanych z odwarcieniem siatkówki.
- Dowód stanu zapalnego i degeneracji fotoreceptorów w analizie transkryptomu.
- Wykazanie, że nowa metoda zapobiega kontaminacji DNA.
- Poprawiona jakość RNA nadająca się do analizy mikroarray.
Wnioski
- Opracowany proces oczyszczania RNA jest skuteczny dla próbek siatkówki.
- Analiza transkryptomu zapewnia wgląd w mechanizmy odwarcenia siatkówki.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do dalszych badań nad chorobami siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Retinal detachment triggers concurrent inflammation and photoreceptor degeneration, creating a complex pathophysiological environment that complicates therapeutic development. The jouRNAl method enables high-fidelity transcriptomic profiling of surgically discarded human retinal specimens, providing a scalable source of disease-relevant tissue for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by linking molecular signatures to clinical phenotypes, informing go/no-go decisions in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous detection of inflammatory and degenerative pathways in human retinal tissue.
- Operational Value: Transforms discarded surgical specimens into validated biological systems, reducing reliance on animal models for early target assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing human-derived expression data on CCL2, GNAT1, OPN1SW, and CRX as biomarkers of RD progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers DNA-free RNA suitable for microarray and RT-PCR, ensuring assay specificity for gene expression readouts.
- Operational Value: Standardized cesium chloride gradient protocol ensures reproducibility across batches and sites, enabling scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified RNA quality validated by gel electrophoresis and absorbance, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by using human retinal specimens to validate findings in animal models of inherited retinal degeneration.
- Biomarker Alignment: Identifies CCL2 upregulation and photoreceptor gene downregulation as translatable signatures for therapeutic monitoring.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic insight into RD progression, informing biomarker-stratified clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The jouRNAl method integrates into the discovery continuum from early target identification through preclinical validation, enabling human tissue-based de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inflammation and degeneration pathways via transcriptomic analysis of human retinal specimens.
- Screening: Delivers standardized, quantitative RNA outputs suitable for high-throughput gene expression profiling.
- Analytics: Generates measurable readouts (e.g., CCL2 upregulation, GNAT1 downregulation) that allow cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects human specimen data to preclinical continuity by enabling comparative analysis in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA extraction from surgical tissues, applicable across retinal pathologies and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct human tissue transcriptomics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cesium chloride purification, minimizing batch variability in multi-site studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-derived molecular evidence, reducing late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concurrent inflammation and degeneration signatures in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and gradient ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to cesium chloride, ultracentrifuges, and RNase-free laboratory infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, pathology, and molecular biology units for specimen tracking.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of homogenization and lysis steps.
- Practical limitation: RNA yield depends on timely specimen transfer and avoidance of RNase exposure during surgical collection.
