Name: Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania RNA z ludzkich próbek siatkówki chirurgicznych przy użyciu gradientu chlorku cezu. Ta technika umożliwia analizę transkryptomiczną odwarstwienia siatkówki bez zanieczyszczeń DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sacha Reichman i Dominique Santiard-Baron za pomoc w edycji protokołu oczyszczania RNA.

1. jouRNAl: Procedura odzyskiwania próbek z bloku chirurgicznego
W laboratorium
<ol>
	<li>Uzyskaj umowę importową od firmy spedycyjnej zajmującej się ekspresową wysyłką.</li>
	<li>Wypełnij 10 (lub 25) formularzy wysyłkowych adresem pocztowym laboratorium, wskazując osobę kontaktową w laboratorium (numer telefonu i adres e-mail).</li>
	<li>Przygotować 10 (lub 25) formularzy próbek ponumerowanych od 1 do 10 (lub 25). Formularze te zawierają dedykowane miejsca, w których można poinformować o: a) anonimowej identyfikacji pacjenta, b) dacie zabiegu oraz c) wszelkich dodatkowych uwagach, które chirurg chciałby dodać. Przygotuj 10 (lub 25) wyściełanych kopert (150 x 210 mm).</li>
	<li>Przygotowane przy użyciu odczynników wolnych od RNAzy: 25 (lub 65) ml 6 M chlorku guanidyny wH2O(GHCl) poddanym działaniu ditylopirowęglanu (DEPC).</li>
	<li>Napełnij 10 lub 25 ponumerowanych 5 ml sterylnych probówek z polietylenu o okrągłym dnie 2,4 ml roztworu GHCl.</li>
	<li>Użyto argonu gazowego do wypełnienia górnej części tych rurek, a następnie mocno dociśnij nakrętkę, aby zapobiec utlenianiu roztworu GHCl przez kilka lat przechowywania w gabinecie chirurgicznym.</li>
	<li>Wprowadzać probówki o pojemności 5 ml do sterylnej probówki ze stożkowym dnem z polipropylenu o pojemności 50 ml z zakrętką. Użyj kawałka czystej chusteczki papierowej, aby przytrzymać probówkę o pojemności 5 ml do probówki o pojemności 50 ml, zamknij probówkę.</li>
	<li>Umieść probówki o pojemności 50 ml na styropianowym stojaku, a stojak w kartonowym pudełku z wyściełanymi kopertami, formularzami wysyłkowymi i formularzami próbek.</li>
	<li>Wklej instrukcje (patrz : 1.12-1.19) wewnątrz pokrywy pudełka kartonowego, aby ułatwić ich odczytanie.</li>
	<li>Wyślij karton pocztą do osoby kontaktowej w szpitalu.</li>
</ol>
W szpitalu
<ol start="11">
	<li>Przynieś karton z szafki operacyjnej na salę operacyjną. Uwaga: jeśli zabieg obejmuje pacjenta z obniżoną odpornością, karton nie powinien być wnoszony na salę operacyjną.</li>
	<li>Podczas zabiegu należy umieścić wycinek siatkówki w numerowanym 5 ml sterylnego polipropylenu wypełnionego roztworem GHCl. Zamknij szczelnie rurkę.</li>
	<li>Zwróć rurkę na krótko.</li>
	<li>Umieść probówkę na zaworze probówki z krwią na 10 minut.</li>
	<li>Wypełnij załączony przykładowy formularz z numeracją.</li>
	<li>Podać numer identyfikacyjny na odpowiedniej ponumerowanej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wprowadzić probówkę o pojemności 5 ml z wycikiem chirurgicznym do probówki o pojemności 50 ml, wymienić papierową chusteczkę i przykręcić rurkę.</li>
	<li>Wprowadź do niej probówkę i wypełnioną próbkę w jednej z dołączonych wyściełanych kopert. Zamknij to.</li>
	<li>Zadzwoń do ekspresowej firmy spedycyjnej w celu odbioru.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie RNA
W laboratorium
<ol>
	<li>Homogenizować próbkę w 5 ml probówce z polipropylenu z roztworem GHCl z homogenizatorem przez 1 minutę, przesuwając probówkę w górę iw dół.</li>
	<li>Dodać 270 μl 2 M octanu potasu o pH 5,0. Wstrząsać energicznie przez 10 minut, umieszczając probówkę na wytrząsarce w pozycji poziomej (420 min-1).</li>
	<li>Wirować 10 minut przy 5.000 obr./min (6.500 x g) w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Płynnie zasysać frakcję rozpuszczalną, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Przenieść do sterylnej probówki o pojemności 14 ml.</li>
	<li>Dodać 5,3 ml 100 mM Tris pH 8,0, N-lauroilosarkozyny 1%.</li>
	<li>Dodać 3,2 g chlorku cezu (CsCl) i wymieszać probówkę przez wirowanie.</li>
	<li>Dodać 1,8 ml CsCl / kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do sterylnej probówki wirówkowej z polialomera o pojemności 11 ml.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 10 ml przenieś roztwór RNA na 1,8 ml CsCl/EDTA, przesuwając powoli po krawędzi probówki, aby uniknąć naruszenia poduszki gęstości.</li>
	<li>Umieścić probówki (drugą probówkę zawierającą bez siatkówki, jeśli to konieczne) w wirniku.</li>
	<li>Wirować 24 godziny przy 32 000 obr./min (225 000 x g) w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Usunąć górną część roztworu za pomocą sterylnej pipety Pasteura i wyrzucić ją.</li>
	<li>Usuwaj stopniowo, sprawdzając moment, w którym DNA (lepkie) jest odsysane drugą sterylną pipetą Pasteura i wyrzuć je.</li>
	<li>Usunąć pozostały roztwór, uważając, aby nie uwolnić osadu RNA za pomocą trzeciej sterylnej pipety Pasteura.</li>
	<li>Pokrój spód probówki skalpelem wysterylizowanym płomieniem, a następnie połóż pozostałą część probówki do góry nogami na sterylnym spojrzeniu.</li>
	<li>Odwróć probówkę i delikatnie spłucz 160 μl GHCl.</li>
	<li>Pozostaw granulat do wyschnięcia na 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad w 150 μl (10 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA - 0,1% SDS).</li>
	<li>Przenieść roztwór do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, a następnie zebrać pozostały osad za pomocą 30 μl (10 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA - 0,1% SDS).</li>
	<li>Dodać 150 μl (10 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA).</li>
	<li>Dodać 30 μl 3 M octanu sodu o pH 5,0, przemieszać probówkę.</li>
	<li>Dodać 900 μl etanolu 100% (-20 °C), przemieszać rurkę.</li>
	<li>Umieść probówkę na 30 minut w topniejącym lodzie.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 30 minut przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie odessać frakcję rozpuszczalną i wyrzucić ją.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 70% etanolu (RT), wymieszaj rurkę.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 20 minut przy 15 000 obr./min (18 000 x g) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz etap płukania (70% etanolu).</li>
	<li>Krótko odwirować i usunąć pozostały etanol za pomocą pipety P200.</li>
	<li>Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad w 50 μl H2O poddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>Mieszaj energicznie, wirując.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 45 °C w łaźni wodnej.</li>
</ol>
3. Analiza RNA metodą elektroforezy żelowej
<ol>
	<li>Wlej żel agarozowy do okapu chemicznego.</li>
	<li>W sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 2 μl RNA do analizy i 6,4 μl buforu do przygotowania próbki.</li>
	<li>Do drugiej probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 3 μl wzorców RNA i 9,6 μl buforu do przygotowywania próbek.</li>
	<li>Podgrzej rurki przez 15 minut w temperaturze 65 °C, połóż je na lodzie.</li>
	<li>Dodać 1 μl buforu ładującego bromek etydyny (EB) bez barwnika do probówki z próbką RNA i 1 μl buforu ładującego EB z barwnikiem do probówki z wzorcami RNA.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 80 - 100 V Wewnątrz kaptura chemicznego w buforze do biegania, aż jeden z barwników (błękit bromofenolowy) dotrze do 2/3 dna żelu.</li>
	<li>Spłucz żel dwa razy po 15 minut 250 ml de DEPC 2x SSC.</li>
	<li>Zrób zdigitalizowane zdjęcie w świetle UV.</li>
	<li>Oblicz stosunek między górnym pasmem (23S rRNA) a dolnym pasmem (16S rRNA).</li>
</ol>
4. Końcowe oczyszczanie RNA
<ol>
	<li>Dostosować objętość próbki RNA do 100 μl za pomocą H2O poddanego działaniu DEPC (jeśli to konieczne).</li>
	<li>Dodać 100 μl kwaśnego fenolu (1 ml fenolu nasyconegoH2Opoddanego działaniu DEPC + 130 μl 50 mM octanu sodu, pH 5,2), energicznie mieszać.</li>
	<li>Odwirować przez 10 minut przy 13 000 obr./min (15 000 x g) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odzyskać i przenieść fazę wodną (fazę górną) do nowej, sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 10 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 250 μl etanolu 100% (-20 °C).</li>
	<li>Inkubować probówkę przez 30 minut w topniejącym lodzie.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 30 minut przy 14 000 obr./min (18 000 x g) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać rozpuszczalną frakcję i wyrzucić ją.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 70% etanolu (temperatura pokojowa) i przekręć rurkę.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 20 minut przy 14 000 obr./min (18 000 x g) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz etap płukania (70% etanolu).</li>
	<li>Krótko odwirować i usunąć pozostały etanol za pomocą pipety P200.</li>
	<li>Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad w 50 μlH2O, poddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>Inkubować, a następnie probówkę przez 15 minut w temperaturze 45 °C.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję (Abs) przy 260 nm i 280 nm na 2 μl próbki RNA. Obliczono stosunek Abs260/Abs280.</li>
	<li>Przechowywać próbkę RNA w temperaturze -80 °C (stabilnej przez kilka lat).</li>
</ol>
5. Roztwory i procedury czyszczenia
<ol>
	<li>Octan potasu 2 M, pH 5,0: Rozpuścić 19,6 g octanu potasu w 70 ml H2O nasączony DEPC. Wyczyść sondę pH-metru, zanurzając ją w 1M NaOH przez 15 minut, a następnie przepłucz 5 razy 2 O. Dostosuj do pH 5,0 kwasem octowym, a następnie dostosuj objętość do 100 ml za pomocą H2O poddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-lauroilsarkozyna 1%: Rozpuścić 2 g N-lauroilosarkozyny (pod kapturem) w 40 ml 0,5 M Tris-base pH 8,0. Dostosować objętość do 200 ml za pomocą H2O. poddanego działaniu DEPC) CsCl/EDTA: 96 g CsCl w 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 przygotowanym w autoklawie H2O. poddanym działaniu DEPC i dostosować objętość do 100 ml za pomocą 2 O. Sprawdzić pH <7,5.</li>
	<li>Żel agarozowy 1%: Umieść 1 g agarozy w 62 ml H2O. Gotuj w kuchence mikrofalowej. Dodaj 18 ml 12,3 M formaldehydu, 20 ml 5x MOPS. Wlej do okapu chemicznego.</li>
	<li>Bufor do przygotowania próbki: Do przygotowania dodatkowego. Wymieszaj w kapturze chemicznym 8 μl 5x MOPS, 16 μl 12,3 M formaldehydu i 40 μl formamidu.</li>
	<li>Bufor ładujący EB (bez barwnika): Do przygotowania dodatkowego. Dodać 4 μl 10 mg/ml bromku etydyny do 20 μl 80% glicerolu przygotowanego zH2Opoddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>Bufor ładujący EB (z barwnikiem): Do przygotowania dodatkowego. Dodać 2 μl 10 mg/ml bromku etydyny do 10 μl 80% glicerolu zawierającego 0,25% cyjanolu ksylenowego, 0,25% błękitu bromofenolowego zH2Opoddanym działaniu DEPC.</li>
	<li>Bufor do biegania: Do 60 ml 5x MOPS dodać 54 ml 12,3 M formaldehydu i 186 ml H2O poddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>H2O poddane działaniu DEPC: Inkubować wodę destylowaną z 0,1% v/v dietylopirowęglanem przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, mieszając. Sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Czyszczenie homogenizatora: Dodać 25 ml roztworu czyszczącego (RBS) do 1 lH2Opoddanego działaniu DEPC i zanurzyć oś na 1 minutę, mieszając. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 60 °C. Dokładnie spłukać środkiem H2Onasączonym DEPC Owinąć instrument w aluminium i włożyć do pudełka na instrumenty. Owiń pudełko. Sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Czyszczenie urządzenia do elektroforezy: Umyj urządzenie, tacę i grzebień z 15 dołkami. Inkubować 15 minut w 3% nadtlenku wodoru. Spłucz raz 100% etanolem. Suszyć na powietrzu.</li>
	<li>Czyszczenie szklanych naczyń: Szklane naczynia RBS 2% należy czyścić przez całą noc, a następnie spłukać wodą destylowaną przed sterylizacją w temperaturze 200 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment%3A+geographical+variation+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).</li>
<li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710(2010).</li>
<li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633(1974).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663(1990).</li>
<li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315(1975).</li>
<li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261(1981).</li>
<li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791(2011).</li>
<li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RETINOBASE%3A+a+web+database%2C+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208(2008).</li>
<li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425(2007).</li>
<li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases%3A+from+clinic+to+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16(2010).</li>
<li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowanie procedury odzyskiwania tkanek z bloku chirurgicznego miało zasadnicze znaczenie dla analizy transkryptomu odwarstwienia siatkówki. Należy zauważyć, że ten rodzaj chirurgii jest praktykowany w nagłych wypadkach i że operujący okuliści mają mało czasu na udział w biologicznym programie badawczym podczas operacji. Ta retinektomia jest również wykonywana stochastycznie w każdej usłudze, dzięki czemu łatwiejszym sposobem na osiągnięcie liczb statystycznych jest praca z siecią. W takiej sieci standaryzacja pobieran...

Głównym celem terapeutycznym w odwarstwieniu siatkówki (RD) jest znalezienie sposobu na ograniczenie uszkodzeń komórek fotoreceptorów i zapalenia siatkówki wynikającego z oddzielenia fotoreceptorów od komórek nabłonka barwnikowego siatkówki. Podczas RD komórki RPE są aktywowane, migrują, odróżnicowują się i namnażają na powierzchni odłączonej siatkówki, wywierając siły skurczowe prowadzące do powikłań. Analiza transkryptomiczna RD jest sposobem identyfikacji docelowych genów ze zmodyfikowaną ekspresją po RD, a tym samym przyszłych cząsteczek terapeutycznych, które mogą poprawić ostateczny wynik wizualny w połączeniu z operacją. Powszechnie wiadomo, że kwas rybonukleinowy (RNA) nie jest stabilny, podobnie jak kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), który jest szeroko stosowany do badań genetycznych, jego stabilność pozwoliła na sekwencjonowanie genomu neandertalczyka z próbek paleontologicznych sprzed ponad 30 000 lat. Transkrypcja DNA genów z genomu na informacyjny RNA jest głównym procesem ekspresji genów, a mRNA jest labilne, aby stanowić sygnał. RNA są bardzo szybko degradowane przez enzymy RNAzy, które przerywają sygnał. Kiedy tkanki są izolowane z organizmu, RNA bardzo często ulegają degradacji, zanim ekspresja zostanie zbadana w laboratorium badawczym. Zdegradowane RNA nie nadaje się do analizy ekspresji genów. Ponieważ personel laboratoryjny nie może uczestniczyć w operacji, opracowaliśmy procedurę, która jest łatwa i wymaga jedynie od chirurga odzyskania tkanek do odpowiedniego roztworu wolnego od RNAzy. RNA tkanek jest stabilne i może być analizowane bez żadnych oznak degradacji po 72 godzinach w temperaturze pokojowej w tym roztworze. RNA z próbek są oczyszczane znormalizowaną metodą obejmującą ultrawirowanie na gradiencie chlorku cezu po przeniesieniu do laboratorium 3. Następnie jakość RNA ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i RT-PCR. Protokół oczyszczania RNA ma tę zaletę, że oddziela cząsteczki zgodnie z ich gęstością, która jest różna dla DNA i RNA, i zapewnia, że RNA nie jest zanieczyszczone cząsteczkami DNA, które będą generować fałszywe sygnały w badaniach ekspresji genów. Ponadto transferowe RNA (tRNA), które są ilościowo najliczniejszym RNA w komórce, są oddzielane zgodnie z tą samą właściwością fizyczną od rybosomalnego RNA (rRNA) i informacyjnego RNA (mRNA), przy czym te dwa ostatnie są produktem końcowym procesu oczyszczania. Usunięcie tRNA z preparatu jest użyteczne, ponieważ większość protokołów analitycznych mikromacierzy obejmowała użycie odwrotnej transkryptazy i polimeraz RNA, które są hamowane przez tRNA 4-6. Oczyszczone RNA z próbek chirurgicznych są znakowane przy użyciu standardowego protokołu i hybrydyzowane z chipem mikromacierzy, a wyniki są analizowane przy użyciu dwóch uzupełniających się metod, metody wskaźnika fałszywych odkryć oraz przy użyciu nowatorskiej metody opartej na wzajemnych informacjach i wizualizowanej na serwerze internetowym Retinobase 7,8.

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coreder</td><td>Aventi J-E</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JS-5.3</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>LE 80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW41</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Biorad</td><td>Pac 3000</td><td></td></tr><tr><td>PolytronTM</td><td>Kinematica</td><td>PT 2100</td><td>W zestawie z PT-DA 2105:2</td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroforezy w żelu agarozowym</td> System obrazowania <td>Biorad</td><td>MiniGel Cell GT</td><td></td></tr><tr><td>Biorad </td><td></td><td>GelDoc-It Imager</td><td></td></tr><tr><td>5 ml sterylna probówka polietylenowa</td><td>Greiner</td><td>115261</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna probówka wirówkowa z poliallomeru </td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki chemiczne</td><td>Sigma</td><td></td><td>Klasa biologii molekularnej (produkty wolne od RNaz i DNaz)</td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący </td> Mikromacierz <td>RBS firmy VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Affymetrix</td><td>Human U133 plus 2</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu journal

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Odwarstwienie siatkówki (RD) opisuje oddzielenie siatkówki neurosensorycznej od nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). RPE jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania wrażliwych na światło neuronów, fotoreceptorów. Oderwanie siatkówki od RPE tworzy fizyczną lukę, która jest wypełniona płynem zewnątrzkomórkowym. RD inicjuje komórkowe i molekularne zdarzenia niepożądane, które wpływają zarówno na siatkówkę neurosensoryczną, jak i na RPE, ponieważ fizjologiczna wymiana jonów i metabolitów jest poważnie zaburzona. Konsekwencja dla wzroku jest związana z czasem trwania odwarstwienia, ponieważ szybkie ponowne przyłączenie dwóch tkanek powoduje przywrócenie wzroku 1. Leczenie RD jest wyłącznie chirurgiczne. Po usunięciu żelu szklistego (witrektomia) następuje usunięcie nieistotnej części siatkówki wokół odłączonego obszaru, aby sprzyjać odwarstwieniu siatkówki. Usunięte próbki siatkówki są res nullius (nic) i w związku z tym są zwykle odrzucane. Aby odzyskać RNA z tych próbek chirurgicznych, opracowaliśmy procedurę jouRNAl, która umożliwia zachowanie RNA podczas transferu z bloku chirurgicznego do laboratorium. Ustandaryzowaliśmy również protokół oczyszczania RNA za pomocą ultrawirowania chlorku cezu, aby zapewnić, że oczyszczone RNA nadają się do globalnej analizy ekspresji genów. Jakość RNA potwierdzono zarówno za pomocą RT-PCR, jak i analizy mikromacierzy. Analiza danych wskazuje na jednoczesne zaangażowanie stanu zapalnego i zwyrodnienia fotoreceptorów podczas RD.

Opisana procedura (Rycina 1) pozwala na wyodrębnienie próbek siatkówki z bloku chirurgicznego w celu otrzymania oczyszczonego RNA oraz analizę transkryptomu w przebiegu odwarstwienia siatkówki. Odwarstwienie siatkówki prowadzi do zwiększenia ekspresji genu MCP1 CCL2 kodującego chemotaktyczny czynnik monocytów oraz do spadku ekspresji genu transdukcji fotoreceptorów pręcikowych GNAT1, opsyny czułej na krótkie fale w czopkach OPN1SW oraz genu homeoboksowego CRX (...

Użyliśmy próbek siatkówki z retinektomii do transkryptomicznej analizy odwarstwienia siatkówki. Opracowaliśmy procedurę, która pozwala na zachowanie RNA między blokami operacyjnymi a laboratorium. Ustandaryzowaliśmy protokół oczyszczania RNA za pomocą ultrawirowania chlorku cezu, aby upewnić się, że oczyszczone RNA nadają się do analizy mikromacierzy.

Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oczyszczanie RNA z chirurgicznych próbek ludzkiej siatkówki w celu analizy transkryptomu w odwarstwieniu siatkówki. W tym celu odczynniki i materiały niezbędne do pobrania próbki chirurgicznej są przygotowywane w laboratorium i wysyłane do szpitala. Podczas zabiegu chirurgicznego próbka zostaje pobrana i przekazana z powrotem do laboratorium.RNA jest następnie oczyszczane przy użyciu zestandaryzowanej procedury z gradientem chlorku cezu, a następnie ocenia się jakość oczyszczonego RNA. Ostatecznie analiza ekspresji mRNA wykazuje, że zarówno stan zapalny, jak i degeneracja fotoreceptorów są zaangażowane w odwarstwienie siatkówki, co wskazuje zmiana ekspresji kluczowych genów. W procesach tych zidentyfikowanych za pomocą analizy transkrypcyjnej, główną zaletą tej metody w porównaniu do istniejących metod oczyszczania RNA, takich jak ekstrakcja chloroformowa (znana również jako Trizol), jest to, że otrzymane RNA nie jest zanieczyszczone DNA.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie odwarstwienia siatkówki, ponieważ dostarcza ona środków technicznych do opracowania nowych terapii wspomagających. Dla każdej próbki do pobrania należy użyć pipety wolnej od RNaz, aby napełnić sterylną probówkę z polietylenu o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów 2,4 mililitrów sześciomolarnego roztworu chlorku guanydyny wolnego od RNaz. Do wypełnienia górnej części probówek należy użyć argonu.Następnie szybko załóż zakrętkę, dociskając ją mocno, aby zapewnić szczelność. Zapobiegnie to utlenianiu chlorku guanidyny podczas wieloletniego przechowywania w szafce chirurgicznej. Następnie umieść każdą z probówek o pojemności 5 ml w sterylnej probówce stożkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml.Po dodaniu tkanki i przykręceniu zakrętki, należy umieścić probówki o pojemności 50 mililitrów w statywie polistyrenowym. Następnie statyw oraz przygotowane koperty, wraz z wypełnionymi formularzami wysyłkowymi, należy umieścić w kartonowym pudełku w szpitalu. Przenieś kartonowe pudełko z szafki chirurgicznej do sali operacyjnej.Podczas zabiegu umieść preparat siatkówki w probówce wypełnionej roztworem chlorków o określonej ilości. Szczelnie zamknij probówkę. Krótko wymieszaj zawartość probówki.Następnie umieść probówkę na kołysce do mieszania krwi na 10 minut. Wypełnij dołączony formularz próbki, podając identyfikację pacjenta, datę zabiegu oraz wszelkie dodatkowe uwagi. Następnie zapisz numer identyfikacyjny na odpowiedniej ponumerowanej probówce o pojemności 50 mililitrów.Następnie umieść probówkę 5 ml z materiałem chirurgicznym w probówce 50 ml. Uzupełnij ręczniki papierowe i zakręć probówkę. Następnie włóż probówkę 50 ml oraz formularz przyjęcia próbki do odpowiedniej wyściełanej koperty i zaklej ją.Po otrzymaniu próbki w laboratorium, należy zhomogenizować materiał w probówce o pojemności pięciu mililitrów za pomocą homogenizatora Polytron™ przy maksymalnym ustawieniu przez jedną minutę, poruszając probówką w górę i w dół. Po zhomogenizowaniu próbki, w celu ekstrakcji polisacharydów, należy dodać 270 µL 2 M octanu potasu i umieścić probówkę w pozycji poziomej na wytrząsarce. Intensywnie wytrząsać przez 10 minut, a następnie wirować przez 10 minut przy 6 500 G w temperaturze 20 °C.Po wirowaniu należy ostrożnie odessać pipetą frakcję rozpuszczalną, tak aby nie naruszyć osadu. Należy przenieść nadsącz do sterylnej probówki o pojemności 14 ml wolnej od RNaz. Do nadsączu należy dodać 5,3 ml 1% sarkozyny w 100 mM Tris oraz 3,2 g chlorku cezu.Sarkozyna rozpuści błonę, a chlorek cezu posłuży do wytworzenia gradientu. Wymieszaj zawartość probówki, wirując ją na wstrząsarze Vortex przez jedną minutę. Do sterylnej polimerowej probówki wirówkowej o pojemności 11 ml dodaj 1,8 ml EDTA z chlorkiem cezu.Następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 10 ml nanieś roztwór RNA na roztwór chlorku cezu i EDTA, pozwalając mu spływać po wewnętrznej ściance probówki. Umieść probówki w wirówce. W razie potrzeby użyj drugiej probówki zawierającej bufory bez retiną w celu zbilansowania masy, a następnie wiruj przez 24 godziny przy 225 000 G w temperaturze 20 °C.Kolejnego dnia. Po wirowaniu na górze probówki utworzy się warstwa lipidów. DNA znajdzie się w środkowej części, a RNA zostanie osadzone w formie granulatu na dnie probówki.Za pomocą sterylnej pipety Pasteura ostrożnie usuń górną warstwę lipidową, wykorzystując do tego drugą sterylną pipetę Pasteura. Stopniowo odsysaj roztwór, aż do momentu aspiracji lepkiego DNA. Usuń roztwór wraz z DNA.Następnie, używając trzeciej sterylnej pipety Pasteura, należy usunąć i odrzucić pozostałą część roztworu, uważając, aby nie naruszyć osadu RNA. Teraz, używając skalpela wysterylizowanego w płomieniu, należy odciąć probówkę w miejscu pokazanym tutaj i odrzucić jej górną część.Pozostałą część umieść odwróconą do góry dnem na sterylnej gazie. Odwróć probówkę i za pomocą pipety delikatnie wypłucz ją 160 µL chlorku guanidyny. Pozostaw osad do wyschnięcia na 10 minut.Po wysuszeniu osadu, resuspendować go w 150 µL buforu tris-EDTA-SDS. Następnie dodać 150 µL buforu tris-EDTA oraz 30 µL 3 M octanu sodu, a następnie wymieszać w wirówce vortex, aby wytrącić RNA. Dodać 900 µL lodowatego, 100% etanolu.Wymieszaj zawartość probówki w wirówce wortex i pozostaw ją na topniejącym lodzie na 30 minut. Następnie wiruj probówkę przez 30 minut przy 18, 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu może być widoczny, lub nie, niewielki biały osad.Niezależnie od tego, czy osad jest widoczny, delikatnie odessać nadosad i go usunąć. Następnie, aby usunąć nadmiar soli, dodać 500 µL 70% etanolu o temperaturze pokojowej i wymieszać na wirówce typu vortex, a następnie wirować probówkę przez 20 minut przy 18 000 G w temperaturze 4 °C. Po powtórzeniu przemywania 70% etanolem i wirowania, użyć pipety P 200, aby usunąć pozostały etanol.Pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Resuspenduj osad w 50 µL wody destylowanej, mieszając energicznie w wstrząsarze wortex przez dwie minuty. Następnie umieść próbkę w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C na 15 minut.Aby w pełni resuspender RNA. Na koniec należy oznaczyć stężenie RNA za pomocą absorbancji przy 260 nanometrach i przeanalizować RNA metodą elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem. W towarzyszącym dokumencie, w celu zbadania transkryptomu odwarstwienia siatkówki, zastosowano procedurę opisaną w czasopiśmie, aby odzyskać i przeanalizować RNA siatkówki od 18 pacjentów z odwarstwieniem siatkówki oraz 18 kontroli dobranych pod względem wieku, przygotowanych z siatkówek pobranych po śmierci.Następnie RNA poddano oczyszczaniu i analizie za pomocą elektroforezy żelowej oraz analizy na bazie rettino, zgodnie z opisem w niniejszym raporcie; przedstawione tutaj wykresy radarowe obrazują ekspresję genu czynnika chemotaktycznego monocytów MCP-1, CCL2. Prawa część rysunku oznaczona jako RD odpowiada RNA pobranemu od pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, natomiast lewa część oznaczona jako N to RNA z grupy kontrolnej, co widać tutaj. Odwarstwienie siatkówki prowadzi do upregulacji CCL2, o czym świadczą wysokie wartości C w większości próbek RD po prawej stronie w porównaniu do próbek kontrolnych po lewej.Ten wzrost wskazuje na stan zapalny u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki, co można zaobserwować w tym miejscu. Ekspresja genu transdukcyjnego fotoreceptorów pręcikowych GNAT1 była obniżona w przeciwieństwie do CCL2; wartości dla próbek RD po prawej stronie są niskie. Zaobserwowano również spadek ekspresji opsyny krótkofalowej czopków OPN1SW oraz genu homeoboksowego CRX, co sugeruje degenerację zarówno pręcików, jak i czopków u pacjentów z odwarstwieniem siatkówki. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat zmian w ekspresji genów po odwarstwieniu siatkówki. Może ona być również zastosowana w badaniu innych patologii siatkówki w modelach zwierzęcych, takich jak dziedziczne degeneracje siatkówki.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona wiedzy na temat kwasów nukleinowych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa jako pomoc dydaktyczna, ponieważ procesy związane z RNA po certyfikacji są skomplikowane.

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza transkryptomowa ludzkich chirurgicznych próbek siatkówki za pomocą jouRNAl

Technika sekcji ilustruje proces usuwania ciała szklistego, siatkówki oraz soczewki z oka myszy, ich rozdzielenie za pomocą wirowania oraz charakterystykę z wykorzystaniem analiz białkowych.

Ewisceracja ciała szklistego i siatkówki myszy do analiz proteomicznych

W pracy opisano uproszczoną technikę wycinania rogówki oraz ewizceracji tkanek siatkówki z gałki ocznej ludzkich dawców pośmiertnych. Opisana tutaj technika pozwala na pobranie wysokiej jakości tkanek do celów transplantacyjnych, chirurgicznych lub badawczych bez uszkadzania pozostałych struktur gałki ocznej.

Uproszczona technika wycięcia rogówki in situ oraz ewakuacji tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej

Techniki wizualizacji cytoarchitektury siatkówki bezpośrednio przylegającej do pojedynczych elektrod w stymulatorze siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Ludzka siatkówka składa się z funkcjonalnie i molekularnie odrębnych regionów, w tym dołka, plamki żółtej i siatkówki obwodowej. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą biopsje stemplowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka w celu wypreparowania i zebrania tych odrębnych obszarów siatkówki do dalszej analizy proteomicznej.

Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę oczyszczania RNA z ludzkich próbek siatkówki chirurgicznych przy użyciu gradientu chlorku cezu. Ta technika umożliwia analizę transkryptomiczną odwarstwienia siatkówki bez zanieczyszczeń DNA.

Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl

Przeglądaj więcej filmów