Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Metoda ta pomaga zrozumieć różnice fenotypowe komórek RP w całej ludzkiej siatkówce. Technika preparacji, którą opracował Davide Ortolan, jest wysoce powtarzalna w generowaniu oderwania między RP a siatkówką. A oprogramowanie REShAPE jest naprawdę przydatne w analizie dużych obrazów płaskich mocowań RP.

Metoda, którą opracował Davide, może być wykorzystana do badania regionalnych różnic w fenotypie RP u pacjentów z różnymi typami chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Aby rozpocząć, odetnij stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów nieco poniżej znaku 5 mililitrów. Za pomocą gorącego kleju przymocuj końcówkę rurki do dna łodzi ważącej.

Następnie wymieszaj dwa składniki zestawu elastomeru silikonowego w stosunku 10 do 1, unikając uwięzienia powietrza. Wlej mieszaninę do łodzi wagowej zawierającej ten kulisty kawałek rurki o okrągłym dnie. Utwardź silikon w temperaturze pokojowej przez noc.

Wyjmij łódkę wagową i rurkę z okrągłym dnem z utwardzonej formy silikonowej. Najpierw napełnij strzykawkę o pojemności 1 mililitra 1700 milimolami roztworu D-Mannitolu i podłącz ją do igły o rozmiarze 21. Wbić igłę przez pars plana, aby uniknąć przebicia przedniej komory oka i wstrzyknąć 400 mikrolitrów roztworu do ciała szklistego.

Pozostaw oko w temperaturze pokojowej na 45 minut. Za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy rozetnij przednią komorę na poziomie pars plana. Wypełnij tylną komorę oka DPBS zawierającym wapń i magnez.

Pod mikroskopem stereoskopowym zlokalizuj plamkę żółtą uwidocznioną jako żółtą plamkę na siatkówce. Pokrój oko na ćwiartki, a mianowicie nosowe, skroniowe, górne i dolne, upewniając się, że zachowasz obszar plamki żółtej. Usuń igły, jeśli przeszkadzają.

Przenieś motyla do tylnej komory oka na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą DPBS z wapniem i magnezem. Przed usunięciem siatkówki zaznacz płatek zawierający plamkę żółtą, wykonując nacięcie w kształcie litery V na brzegu rzęskowym. Podnieś i odetnij całe ciało szkliste, które leży na siatkówce.

Odetnij siatkówkę od brzegów rzęsek we wszystkich płatkach, uważając, aby nie zarysować RPE. Umieść tkankę w 4% PFA i inkubuj przez godzinę. Przemyć trzykrotnie DPBS zawierającym wapń i magnez.

Przenieś tkankę do pojemnika wypełnionego tym samym buforem i przechowuj ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie przenieś próbkę na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą DPBS z wapniem i magnezem. Wybij głowę nerwu wzrokowego za pomocą 1,5-milimetrowego stempla biopsyjnego.

Zbierz siatkówkę i przechowuj ją w tym samym buforze w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby usunąć twardówkę z naczyniówki RPE, delikatnie unieś warstwę naczyniówki RPE z obrzeża. Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas przetnij naczynia naczyniówkowe i tkankę łączną, które znajdują się między twardówką a RPE.

Po całkowitym oddzieleniu od twardówki zbierz warstwę naczyniówki RPE. Przenieś tkankę do pojemnika wypełnionego DPBS zawierającym wapń i magnez i przechowuj ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieś naczyniówkę RPE do jednego dołka na płytce sześciodołkowej.

Zablokować i przepuszczalnie próbkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować próbkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z falloidyną sprzężoną z fluoroforem 647 w rozcieńczeniu 1 do 250 w buforze permeabilizacyjnym. Umyć trzy razy w DPBS zawierającym wapń i magnez.

Przenieść próbkę naczyniówki RPE na szkiełko podstawowe o wymiarach 50 x 75 milimetrów i spłaszczyć je. Pokrój każdy płatek na dwie części, aby próbka była bardziej płaska. Narysuj kontur płaskiego uchwytu za pomocą hydrofobowego pisaka.

Aby ugasić autofluorescencję lipofuscyny, dodaj 500 mikrolitrów roztworu wygaszającego autofluorescencję i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Dokładnie umyć w DPBS zawierającym wapń i magnez. Wyjmij DPBS i dodaj nośnik montażowy.

Umieść szklankę nakrywkową na płaskim uchwycie i uszczelnij lakierem do paznokci. Otwórz oprogramowanie. Na karcie katalogi wybierz foldery wejściowe i wyjściowe.

W katalogu wyjściowym pozwól oprogramowaniu automatycznie zmienić ścieżkę do katalogu wejściowego lub procesu. Alternatywnie zmień katalog wyjściowy ręcznie. Aby wygenerować mapy cieplne, wybierz wszystko z menu rozwijanego w zakładce tworzenia kolorowych obrazów.

Zaznacz pole nie w funkcji Użyj limitów ręcznych, aby umożliwić oprogramowaniu korzystanie z minimalnych i maksymalnych wartości wykrytych na każdym obrazie. Zaznacz pole tak, aby ręcznie dostosować zakres wartości dla każdej mapy cieplnej metryki kształtu. Następnie kliknij przycisk ustaw limity i wstaw wartości w polach tekstowych, aby wybrać zakresy dla poszczególnych parametrów.

Po zmianie interesujących Cię wartości kliknij Zapisz. Kliknij niskie wartości domyślne, aby zresetować wszystkie limity. Aby wybrać próg rozmiaru komórki w polu Mniejszy rozmiar komórki, należy wstawić rozmiar najmniejszej komórki, która ma zostać uwzględniona w analizie.

W polu Górny rozmiar komórki wstaw rozmiar największej komórki, która ma zostać uwzględniona. W obszarze Konwertuj piksele na jednostki rzeczywiste zaznacz opcję nie, aby uruchomić analizę w jednostkach pikseli, zaznacz opcję tak, aby uruchomić analizę w mikrometrach. W polu Długość pikseli paska skali wprowadź wartość piksela w polu tekstowym.

W polu Długość skali mikronów wprowadź odpowiednią odległość w mikrometrach. Aby rozpocząć analizę, naciśnij go, aby to zrobić. Protokół ten daje w wyniku jednopłaszczyznowy obraz płaskiego mocowania, w którym lokalizacja komórki jest identyfikowana przez generowaną przez REShAPE segmentację granic komórek RPE.

Ponadto dla każdej prawidłowo zidentyfikowanej komórki RPE mierzonych jest 30 wskaźników kształtu, w tym powierzchnia poszczególnych komórek RPE. Czarne kafelki powstałe z resztkowych fragmentów siatkówki lub innych jasnych obiektów można usunąć, wybierając jedną z opcji filtrowania dostępnych w menu rozwijanym Filtr RT. Użycie obrazów RBG do analizy przekształcenia spowoduje uzyskanie całkowicie czarnych obrazów binarnych.

W takim przypadku konwersja obrazów RGB na skalę szarości spowoduje utworzenie prawidłowo podzielonych na segmenty obrazów binarnych. Jeśli barwienie nie jest optymalne lub jeśli próbka jest uszkodzona przez zadrapanie, duże skupiska komórek można zidentyfikować jako pojedynczą bardzo dużą komórkę. W takim przypadku duże obiekty można wykluczyć z analizy, zmieniając próg rozmiaru komórki.

Aby uzyskać płaską tkankę, RP i naczyniówkę należy oddzielić od twardówki, nawet jeśli te kroki mogą zająć dużo czasu. Po wygenerowaniu płaskiego mocowania RP możliwe jest barwienie w celu uzyskania dodatkowych znaczników RPE, dzięki czemu można badać różne obszary monowarstwy RP. Korzystając z tej metody, odkryliśmy pięć różnych populacji RP, które są różnie wrażliwe na różne choroby zwyrodnieniowe siatkówki.