Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Procedura ta polega na kolonizacji nosogardzieli myszy szczepem Streptococcus pneumoniae oraz późniejszej ekstrakcji kolonizujących bakterii, a także komórek przylegających lub zrekrutowanych. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie inokulum bakteryjnego odpowiedniego szczepu S. pneumoniae.

Następnie żywe bakterie podaje się donosowo znieczulonym myszom umieszczonym w aparacie do unieruchamiania. Po pożądanym czasie kolonizacji myszy są uśmiercane, a następnie przeprowadza się płukanie nosa poprzez kaniulację odsłoniętej tchawicy i wypłukiwanie treści przez nos. Liczbę bakterii obecnych w płuczydłach nosowych można określić za pomocą metod mikrobiologicznych. Alternatywnie można ocenić odpowiedzi immunologiczne, wykorzystując techniki cytometrii przepływowej do fenotypowania zrekrutowanych komórek lub techniki ilościowego PCR.

Aby zmierzyć poziomy ekspresji interesującego mRNA przed rozpoczęciem, należy przygotować stabilizatory dla myszy do etapu kolonizacji donosowej oraz kaniulowane igły do płukania nosa. Stabilizator dla myszy można przygotować, po prostu odcinając zwężoną końcówkę probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Po wykonaniu otworu należy użyć nożyczek, aby wygładzić wszystkie ostre krawędzie.

Do przygotowania kaniulowanych igieł będą potrzebne: rurki polietylenowe PE 20 o średnicy wewnętrznej 0,38 mm, strzykawka 1 ml z założoną igłą skośną o rozmiarze 26G i 38G, para ostrych, precyzyjnych nożyczek irydowych oraz pęseta. Za pomocą precyzyjnych nożyczek potnij rurki PE 20 na odcinki o długości około 2,5 cm (1 cala), upewniając się, że każdy koniec posiada ścięte, skośne zakończenie.

Za pomocą pęsety ostrożnie nasuń jeden z tych elementów na końcówkę igły. Unikając przebicia ścianek rurki, igły kaniulowane można przechowywać w 70% etanolu do momentu użycia i przepłukać PBS bezpośrednio przed zastosowaniem. W celu kolonizacji donosowej myszy S pmo zalecamy stosowanie stężenia 10⁹ jednostek tworzących kolonie na ml, podawanych w objętości 10 µL.

Aby uzyskać dawkę końcową rzędu 10⁷ CFU, przechowywać inokulum w lodzie do momentu bezpośredniego użycia i pamiętać o mieszaniu pomiędzy kolejnymi kolonizacjami. Oprócz inokulum będą potrzebne pipeta P10 lub P20, sterylne końcówki do pipety oraz stabilizator dla myszy. Odizolować pojedynczą mysz, chwytając ją za ogon, a następnie unieruchomić ją, umieszczając w wcześniej przygotowanym stabilizatorze dla myszy.

Jeśli pojawiają się trudności z wprowadzeniem myszy do restrainera, pomocne może być umieszczenie go przed myszą i nieco powyżej, aby zwierzę mogło wejść do niego, wspinając się do góry. Gdy mysz znajdzie się wewnątrz restrainera, unieruchom ją, delikatnie pchając ją w górę u podstawy ciała, tak aby nos wystawał poza zwężany koniec urządzenia. Używając pipety P 10 lub P 20, zaszczep każdą mysz, podając 10 µL przygotowanej hodowli, rozdzielając ją równomiernie pomiędzy oba otwory nosowe.

Pozwól szczepionce spływać do nosa, pulsując powoli i poświęcając czas niezbędny, aby mysz mogła wciągnąć szczepionkę. Mysz może kichnąć częścią szczepionki z nosa, co jest zjawiskiem oczekiwanym. Należy pamiętać, że myszy powinny zostać znieczulone do tego zabiegu, aby zapewnić lokalizację bakterii w nosogardle i zapobiec ich rozprzestrzenianiu się do dolnych dróg oddechowych.

Na potrzeby niniejszej demonstracji przeprowadzamy inokulację za pomocą PBS, jednak podczas pracy z żywymi bakteriami należy upewnić się, że procedura jest wykonywana zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez instytut. Przykładowo, większość instytucji wymaga, aby kolonizacja była przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Jeśli w ramach monitorowania punktu końcowego wykorzystuje się wskaźniki masy ciała, należy natychmiast po kolonizacji monitorować myszy co 12 do 24 godzin pod kątem objawów klinicznych, takich jak letarg, zmierzwione futro i utrata masy ciała.

Po skolonizowaniu myszy należy utrzymywać je przez pożądany czas. Po zakończeniu tego okresu myszy zostaną uśmiercone, a następnie zostanie wykonane płukanie nosa, ponieważ zwichnięcie szyi może potencjalnie uszkodzić tchawicę. Należy unikać tej metody eutanazji.

Przed przystąpieniem do płukania jam nosowych należy upewnić się, że dostępne są następujące materiały: wcześniej przygotowane igły kanulowane, 70%aqueous ethanol, pęseta, ostre nożyczki irydowe o cienkich ostrzach, phosphate, buffered saline, bufor do lizy RNA oraz probówki typu einor o pojemności one mil. Po przygotowaniu wszystkich materiałów ułożyć zwierzę na plecach, a następnie za pomocą 70%aqueous ethanol zdezynfekować przednią część futra, w szczególności obszar szyi.

Należy zadbać o to, aby etanol nie dostał się do nozdrzy. Wykonać pojedyncze cięcie podłużne wzdłuż linii środkowej szyi zwierzęcia, tworząc otwór umożliwiający uwidocznienie tchawicy. Ostrożnie odsunąć skórę na obie strony, odsłaniając znajdującą się pod nią tkankę szyi.

Na tym etapie tchawica powinna być widoczna, otoczona z obu stron mięśniami podłużnymi. Należy je ostrożnie przeciąć, aby uzyskać wyraźny widok na samą tchawicę, dbając o to, by nie uszkodzić otaczających naczyń krwionośnych. W przypadku przypadkowego przecięcia naczyń i obecności krwi w tym obszarze, należy ją usunąć przed kontynuowaniem procedury.

Odczekaj do zatrzymania krwawienia, a następnie kilkukrotnie oczyść obszar, aplikując sterylny PBS i delikatnie osuszając nadmiar wilgoci za pomocą sterylnej gazy. Po odpowiednim odsłonięciu tchawicy wykonaj w niej poprzeczne cięcie półksiężycowate mniej więcej w połowie jej długości. Nalej sterylny PBS do strzykawki z kaniulą.

Wprowadź kaniulę do tchawicy w kierunku nosa, kierując ściętą krawędź w dół, aby ułatwić wprowadzenie. Po umieszczeniu kaniuli obróć ją o 180 stopni i delikatnie przesuwaj w górę, aż poczujesz lekki opór. Umieść rurkę EEND DPH przeznaczoną do pobierania próbek tuż pod nosem myszy.

Sprawdź poprawność umiejscowienia kaniuli, podając minimalną ilość płynu do przemywania PBS. Jeśli kaniula została umieszczona prawidłowo, wokół NAS myszy powinna uformować się kropla płynu. Jeśli testowy PBS wypływa bezpośrednio z pyska zwierzęcia, wycofaj kaniulę i ustaw ją ponownie, delikatnie przesuwając ją do przodu, aż poczujesz lekki opór.

Należy uważać, aby nie wsunąć kaniuli zbyt głęboko poza ten punkt oporu, gdyż może ona przejść przez podniebienie nosowe do jamy ustnej. Po potwierdzeniu prawidłowego umiejscowienia kaniuli należy szybko podać 200 µL PBS, aby pomóc w wypłukaniu i zebraniu maksymalnej liczby komórek. Treść powinna wypłynąć przez nozdrza myszy do probówki zbiorczej.

Natychmiast umieść próbkę w lodzie. Próbki te mogą być następnie poddane analizie w celu oznaczenia ładunku bakteryjnego oraz rekrutacji komórkowej. Aby pobrać próbki do analizy RNA, użyj oddzielnej kaniulowanej igły zawierającej 500 µL buforu do lizy RNA w celu przeprowadzenia wtórnego płukania nosa.

Należy pamiętać, że bufor do lizy RNA usunie nabłonek i zniszczy otaczające tkanki. Należy zatem zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z takimi organami jak płuca. Jeśli pożądane jest zachowanie tych tkanek w celu ilościowego oznaczenia ładunku bakteryjnego w nosogardle, będą Państwo potrzebować następujących elementów.

Probówki Epicor, płytki mikrobiologiczne zawierające agar sojowo-kaszowy z dodatkiem 5% krwi owczej. Mieszadło wortex, sterylne końcówki do pipet PBS oraz pipety P 20 i P 200. W pierwszej kolejności, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL 2, należy przygotować serię rozcieńczeń dla każdej próbki płukania nosa u myszy.

Zazwyczaj oczekuje się, że stężenia S pneumoniae w nosogardzieli wynoszą od zera do 10⁴ CFU. W związku z tym należy przeprowadzić trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne, dodając 10 µL niezakonserwowanej próbki płukania nosa do pierwszej probówki, aby uzyskać stężenie 10⁻¹ CFU/ml, a następnie kontynuować proces aż do uzyskania trzech rozcieńczeń; między każdym etapem należy dokładnie wymieszać próbki w wirówce typu vortex. Uwaga: niniejszy film służy wyłącznie celom demonstracyjnym.

Należy zawsze przestrzegać właściwej techniki laboratoryjnej, w tym wymiany końcówek pipet między rozcieńczeniami. Za pomocą markera podziel płytkę do wysiewu na cztery kwadranty i opisz każdy z nich zgodnie z odpowiadającym mu rozcieńczeniem, które ma zostać na niej naniesione. Na płytkę z agarem nanieś trzy krople próbek o objętości 10 µL z każdego z przygotowanych rozcieńczeń. Pozostaw je do wyschnięcia na 15 do 30 minut bez przykrycia, a następnie przykryj płytki i umieść je odwrócone dnem do góry w inkubatorze bakteriologicznym w optymalnych warunkach dla wzrostu pneumokoków, zazwyczaj 37 °C i 5% CO2.

Inkubuj płytki przez 24 do 48 godzin. Po tym czasie wyjmij płytki i określ liczbę kolonizujących bakterii, obliczając średnią liczbę kolonii powstałych na płytce. Dla każdego rozcieńczenia kolonie animo można zidentyfikować po ich charakterystycznym beżowym kolorze oraz strefach alfa-hemolizy, które są małymi otoczkami wokół każdej kolonii, powstającymi w wyniku bakteryjnego trawienia suplementu krwi w agarze.

I wreszcie, przez niewielkie wgłębienia w centrum każdej kolonii, co nadaje im wygląd erytrocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ustanowić kolonizację nosogardzielną u myszy, jak izolować bakterie i komórki z nosogardzieli myszy po kolonizacji, stosując płukanie nosa, oraz jak określić odpowiednią liczbę bakterii przy użyciu technik mikrobiologicznych. Mamy nadzieję, że metody opisane w tym filmie zachęcą Państwa do wykorzystania donosowego modelu kolonizacji w celu zbadania odpowiedzi gospodarza na patogeny w kontekście tego niedostatecznie opracowanego regionu.