Name: Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę kolonizacji nosogardła myszy Streptococcus pneumoniae i izolacji komórek immunologicznych. Technika umożliwia analizę odpowiedzi zapalnej oraz ilościową ocenę bakterii in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Jeffery'emu Weiserowi z University of Pennsylvania za jego dar w postaci klinicznych szczepów Streptococcus pneumoniae. Praca ta została sfinansowana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem. CV zostało sfinansowane przez stypendium M. G. DeGroote i stypendium Kanadyjskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej. Praca ta została sfinansowana przez Ontario Lung Association i Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Prace w laboratorium Bowdisha są częściowo wspierane przez Centrum Badań nad Chorobami Zakaźnymi im. Michaela G. DeGroote'a oraz Centrum Badań nad Immunologią McMaster.

<ol><li>Bogaert, D., de Groot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).</li>
<li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).</li>
<li>McCool, T. L., Cate, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li>
<li>Nelson, A., Roche, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsule+enhances+pneumococcal+colonisation+by+limiting+mucus-mediated+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance.</a> Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).</li>
<li>van Rossum, A., Lysenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+bacterial+factors+contributing+to+the+clearance+of+colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model.</a> Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).</li>
<li>Barocchi, M. A., Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumococcal+pilus+influences+virulence+and+host+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).</li>
<li>Malley, R., Henneke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+pneumolysin+by+Toll-like+receptor+4+confers+resistance+to+pneumococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).</li>
<li>McCool, T. L., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+antibody+in+clearance+of+Streptococcus+pneumoniae+in+a+murine+model+of+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization.</a> Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).</li>
<li>Gingles, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+genetic+resistance+in+invasive+pneumococcal+infection%3A+identification+and+study+of+susceptibility+and+resistance+in+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains.</a> Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).</li>
<li>Jeong, D., Jeong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+in+resistance+to+Streptococcus+pneumoniae+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+Res%22%5BJournal%5D)">Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice.</a> Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).</li>
<li>Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position.</a> Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).</li>
<li>Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Murine+Intranasal+Dosing+Efficiency+Using+Luminescent+Francisella+tularensis%3A+Effect+of+Instillation+Volume+and+Form+of+Anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia.</a> PLoS ONE. 7 (2), (2012).</li>
<li>Briles, D. E., Novak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+Colonization+with+Streptococcus+pneumoniae+includes+subpopulations+of+surface+and+invasive+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci.</a> Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).</li>
<li>Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Mo, Y., Wan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+reverse+transcription-PCR+and+real-time+PCR+in+nanotoxicity+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research.</a> Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).</li>
<li>Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nasopharyngeal+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of nasopharyngeal lymphoid tissue.</a> Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).</li>
<li>Zhang, Q., Leong, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+regulatory+T+cells+in+nasal+associated+lymphoid+tissue+in+children%3A+relationships+with+pneumococcal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization.</a> PLoS Pathog. 7, (2011).</li>
<li>Briles, D. E., Novak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+colonization+with+Streptococcus+pneumoniae+includes+subpopulations+of+surface+and+invasive+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci.</a> Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).</li>
<li>Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+capsular+polysaccharide+structure+predicts+serotype+prevalence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence.</a> PLoS Pathog. 5, (2009).</li>
<li>Bryant, W. P., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+Pneumococcal+Serogroups+Cause+the+Most+Invasive+Disease%3A+Implications+for+Conjugate+Vaccine+Formulation+and+Use%2C+Part+I.%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.</a> Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+differences+among+pneumococcal+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiological differences among pneumococcal serotypes.</a> Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).</li>
<li>Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Relationships+between+Invasive+and+Carriage+Streptococcus+pneumoniae+and+Serotype+and+Clone+Specific+Differences+in+Invasive+Disease+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential.</a> J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).</li>
<li>Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+strain-dependent+lung+inflammatory+responses+in+a+murine+model+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia.</a> Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).</li>
<li>Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effectors+mediating+Th17-dependent+clearance+of+pneumococcal+colonization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice.</a> J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).</li>
<li>Parker, D., Martin, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+DNA+initiates+type+I+interferon+signaling+in+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract.</a> MBio. 2, (2011).</li>
<li>Haya, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Nakamura, S., Favis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+type+I+interferons+during+influenza+virus+coinfection+promotes+Streptococcus+pneumoniae+colonization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).</li>
<li>Kim, J. O., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+intrastrain+phase+variation+in+quantity+of+capsular+polysaccharide+and+teichoic+acid+with+the+virulence+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).</li>
<li>Roche, A. M., King, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+Streptococcus+pneumoniae+strains+induce+serotype-independent+mucosal+and+systemic+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice.</a> Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).</li>
<li>Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+contributions+against+invasive+Streptococcus+pneumoniae+pneumonia+of+antibody+and+Th17-Cell+responses+to+nasopharyngeal+colonisation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation.</a> PLoS One. 6 (10), (2011).</li>
<li>Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+contributions+against+invasive+Streptococcus+pneumoniae+pneumonia+of+antibody+and+Th17-Cell+responses+to+nasopharyngeal+colonisation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation.</a> PLoS One. 6 (10), (2011).</li>
<li>Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunising+effect+of+pneumococcal+nasopharyngeal+colonisation%3B+protection+against+future+colonisation+and+fatal+invasive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease.</a> Immunobiology. , 215-251 (2010).</li>
<li>Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Avery%27s+virulent+serotype+2+strain+D39+of+Streptococcus+pneumoniae+and+comparison+with+that+of+unencapsulated+laboratory+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6.</a> J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li>
<li>Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptional+analysis+of+clpP+mutations+of+type+2+Streptococcus+pneumoniae+and+their+effects+on+physiology+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and.</a> 184, 3508-3520 (2002).</li>
<li>Orihuela, C. J., Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+contributions+of+pneumococcal+virulence+factors+to+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis.</a> J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).</li>
<li>Orihuela, C. J., Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+models+of+Streptococcus+pneumoniae+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Infect.+D%22%5BJournal%5D)">Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease.</a> Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu przedstawiono szczegółowe metody kolonizacji donosowej myszy przy użyciu klinicznego izolatu szczepu Streptococcus pneumoniae, a następnie izolacji i charakterystyki komórek odpornościowych rekrutowanych do nosogardzieli w odpowiedzi na bakterie. Pokazaliśmy, w jaki sposób inokulum bakteryjne może być hodowane w pożywkach bogatych w składniki odżywcze i wykorzystywane do ustalenia zdarzenia kolonizacji u myszy, które początkowo ogranicza się do nosogardzieli. Następnie pokazaliśmy, w jaki sposób re...

<table><tbody><tr><td>Anty-mysz Ly6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly6G PE</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 Antic</td><td>APC eBioscience</td><td>17-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Myszy CD11b PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Mysz CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Mysz CD4 eFluor 605NC</td><td>eBioscience</td><td>93-0041-42</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa Intramedic - PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Strzykawka</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 26 G 3/8 Śródskórny skos</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Difco Tryptic Soy Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Defibrynowana krew owcza</td><td>PML Microbiologicals</td><td>A0404</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Odwrotna transkryptaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Kolonizacja nosogardzieli przez Streptococcus pneumoniae jest warunkiem wstępnym do inwazji na płuca lub krwioobieg1. Organizm ten jest zdolny do kolonizacji powierzchni błony śluzowej nosogardzieli, gdzie może przebywać, rozmnażać się i ostatecznie pokonać mechanizmy obronne gospodarza, aby zaatakować inne tkanki gospodarza. Pojawienie się infekcji w normalnie dolnych drogach oddechowych powoduje zapalenie płuc. Alternatywnie, bakterie mogą rozprzestrzeniać się do krwiobiegu, powodując bakteriemię, która wiąże się z wysoką śmiertelnością2, lub prowadzić bezpośrednio do rozwoju pneumokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Zrozumienie kinetyki i odpowiedzi immunologicznej na kolonizację nosogardzieli jest ważnym aspektem modeli infekcji S. pneumoniae.
Nasz mysi model kolonizacji wewnątrznosowej jest zaadaptowany z modeli ludzkich3 i był używany przez wiele grup badawczych w badaniu odpowiedzi gospodarz-patogen w nosogardzieli4-7. W pierwszej części modelu używamy klinicznego izolatu S. pneumoniae, aby ustalić samoograniczającą się kolonizację bakteryjną, która jest podobna do zdarzeń nosicielstwa u dorosłych ludzi. Procedura opisana w niniejszym dokumencie polega na przygotowaniu inokulum bakteryjnego, a następnie ustaleniu zdarzenia kolonizacyjnego poprzez dostarczenie inokulum drogą donosową. Makrofagi rezydentne są dominującym typem komórek w nosogardzieli w stanie stacjonarnym. Zazwyczaj u niezakażonych myszy występuje niewiele limfocytów8, jednak kolonizacja błony śluzowej doprowadzi do stanu zapalnego o niskim lub wysokim stopniu (w zależności od zjadliwości gatunku bakterii i szczepu), który spowoduje odpowiedź immunologiczną, a następnie rekrutację komórek odpornościowych gospodarza. Komórki te można wyizolować przez płukanie treści tchawicy przez nozdrza i skorelować z gęstością bakterii kolonizacyjnych, aby lepiej zrozumieć kinetykę infekcji.

Rysunek 1 przedstawia schemat ogólny podsumowujący główne etapy protokołu. Rysunki 2-3 zapewniają wizualizację metodologii mikrobiologicznej właściwej dla opisanych w niniejszym dokumencie protokołów. Rysunek 4 przedstawia prawidłowe ułożenie myszy w celu przeprowadzenia kolonizacji donosowej, natomiast Rysunek 5 obrazuje typowe zmiany masy ciała myszy skolonizowanych szczepem P1547 S. pneumoniae. Rysunki 6-7 przedstawiają konkr...

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Procedura ta polega na kolonizacji nosogardzieli myszy szczepem Streptococcus pneumoniae oraz późniejszej ekstrakcji kolonizujących bakterii, a także komórek przylegających lub zrekrutowanych. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie inokulum bakteryjnego odpowiedniego szczepu S. pneumoniae.Następnie żywe bakterie podaje się donosowo znieczulonym myszom umieszczonym w aparacie do unieruchamiania. Po pożądanym czasie kolonizacji myszy są uśmiercane, a następnie przeprowadza się płukanie nosa poprzez kaniulację odsłoniętej tchawicy i wypłukiwanie treści przez nos. Liczbę bakterii obecnych w płuczydłach nosowych można określić za pomocą metod mikrobiologicznych. Alternatywnie można ocenić odpowiedzi immunologiczne, wykorzystując techniki cytometrii przepływowej do fenotypowania zrekrutowanych komórek lub techniki ilościowego PCR.Aby zmierzyć poziomy ekspresji interesującego mRNA przed rozpoczęciem, należy przygotować stabilizatory dla myszy do etapu kolonizacji donosowej oraz kaniulowane igły do płukania nosa. Stabilizator dla myszy można przygotować, po prostu odcinając zwężoną końcówkę probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Po wykonaniu otworu należy użyć nożyczek, aby wygładzić wszystkie ostre krawędzie.Do przygotowania kaniulowanych igieł będą potrzebne: rurki polietylenowe PE 20 o średnicy wewnętrznej 0,38 mm, strzykawka 1 ml z założoną igłą skośną o rozmiarze 26G i 38G, para ostrych, precyzyjnych nożyczek irydowych oraz pęseta. Za pomocą precyzyjnych nożyczek potnij rurki PE 20 na odcinki o długości około 2,5 cm (1 cala), upewniając się, że każdy koniec posiada ścięte, skośne zakończenie.Za pomocą pęsety ostrożnie nasuń jeden z tych elementów na końcówkę igły. Unikając przebicia ścianek rurki, igły kaniulowane można przechowywać w 70% etanolu do momentu użycia i przepłukać PBS bezpośrednio przed zastosowaniem. W celu kolonizacji donosowej myszy S pmo zalecamy stosowanie stężenia 10⁹ jednostek tworzących kolonie na ml, podawanych w objętości 10 µL.Aby uzyskać dawkę końcową rzędu 10⁷ CFU, przechowywać inokulum w lodzie do momentu bezpośredniego użycia i pamiętać o mieszaniu pomiędzy kolejnymi kolonizacjami. Oprócz inokulum będą potrzebne pipeta P10 lub P20, sterylne końcówki do pipety oraz stabilizator dla myszy. Odizolować pojedynczą mysz, chwytając ją za ogon, a następnie unieruchomić ją, umieszczając w wcześniej przygotowanym stabilizatorze dla myszy.Jeśli pojawiają się trudności z wprowadzeniem myszy do restrainera, pomocne może być umieszczenie go przed myszą i nieco powyżej, aby zwierzę mogło wejść do niego, wspinając się do góry. Gdy mysz znajdzie się wewnątrz restrainera, unieruchom ją, delikatnie pchając ją w górę u podstawy ciała, tak aby nos wystawał poza zwężany koniec urządzenia. Używając pipety P 10 lub P 20, zaszczep każdą mysz, podając 10 µL przygotowanej hodowli, rozdzielając ją równomiernie pomiędzy oba otwory nosowe.Pozwól szczepionce spływać do nosa, pulsując powoli i poświęcając czas niezbędny, aby mysz mogła wciągnąć szczepionkę. Mysz może kichnąć częścią szczepionki z nosa, co jest zjawiskiem oczekiwanym. Należy pamiętać, że myszy powinny zostać znieczulone do tego zabiegu, aby zapewnić lokalizację bakterii w nosogardle i zapobiec ich rozprzestrzenianiu się do dolnych dróg oddechowych.Na potrzeby niniejszej demonstracji przeprowadzamy inokulację za pomocą PBS, jednak podczas pracy z żywymi bakteriami należy upewnić się, że procedura jest wykonywana zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez instytut. Przykładowo, większość instytucji wymaga, aby kolonizacja była przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Jeśli w ramach monitorowania punktu końcowego wykorzystuje się wskaźniki masy ciała, należy natychmiast po kolonizacji monitorować myszy co 12 do 24 godzin pod kątem objawów klinicznych, takich jak letarg, zmierzwione futro i utrata masy ciała.Po skolonizowaniu myszy należy utrzymywać je przez pożądany czas. Po zakończeniu tego okresu myszy zostaną uśmiercone, a następnie zostanie wykonane płukanie nosa, ponieważ zwichnięcie szyi może potencjalnie uszkodzić tchawicę. Należy unikać tej metody eutanazji.Przed przystąpieniem do płukania jam nosowych należy upewnić się, że dostępne są następujące materiały: wcześniej przygotowane igły kanulowane, 70%aqueous ethanol, pęseta, ostre nożyczki irydowe o cienkich ostrzach, phosphate, buffered saline, bufor do lizy RNA oraz probówki typu einor o pojemności one mil. Po przygotowaniu wszystkich materiałów ułożyć zwierzę na plecach, a następnie za pomocą 70%aqueous ethanol zdezynfekować przednią część futra, w szczególności obszar szyi.Należy zadbać o to, aby etanol nie dostał się do nozdrzy. Wykonać pojedyncze cięcie podłużne wzdłuż linii środkowej szyi zwierzęcia, tworząc otwór umożliwiający uwidocznienie tchawicy. Ostrożnie odsunąć skórę na obie strony, odsłaniając znajdującą się pod nią tkankę szyi.Na tym etapie tchawica powinna być widoczna, otoczona z obu stron mięśniami podłużnymi. Należy je ostrożnie przeciąć, aby uzyskać wyraźny widok na samą tchawicę, dbając o to, by nie uszkodzić otaczających naczyń krwionośnych. W przypadku przypadkowego przecięcia naczyń i obecności krwi w tym obszarze, należy ją usunąć przed kontynuowaniem procedury.Odczekaj do zatrzymania krwawienia, a następnie kilkukrotnie oczyść obszar, aplikując sterylny PBS i delikatnie osuszając nadmiar wilgoci za pomocą sterylnej gazy. Po odpowiednim odsłonięciu tchawicy wykonaj w niej poprzeczne cięcie półksiężycowate mniej więcej w połowie jej długości. Nalej sterylny PBS do strzykawki z kaniulą.Wprowadź kaniulę do tchawicy w kierunku nosa, kierując ściętą krawędź w dół, aby ułatwić wprowadzenie. Po umieszczeniu kaniuli obróć ją o 180 stopni i delikatnie przesuwaj w górę, aż poczujesz lekki opór. Umieść rurkę EEND DPH przeznaczoną do pobierania próbek tuż pod nosem myszy.Sprawdź poprawność umiejscowienia kaniuli, podając minimalną ilość płynu do przemywania PBS. Jeśli kaniula została umieszczona prawidłowo, wokół NAS myszy powinna uformować się kropla płynu. Jeśli testowy PBS wypływa bezpośrednio z pyska zwierzęcia, wycofaj kaniulę i ustaw ją ponownie, delikatnie przesuwając ją do przodu, aż poczujesz lekki opór.Należy uważać, aby nie wsunąć kaniuli zbyt głęboko poza ten punkt oporu, gdyż może ona przejść przez podniebienie nosowe do jamy ustnej. Po potwierdzeniu prawidłowego umiejscowienia kaniuli należy szybko podać 200 µL PBS, aby pomóc w wypłukaniu i zebraniu maksymalnej liczby komórek. Treść powinna wypłynąć przez nozdrza myszy do probówki zbiorczej.Natychmiast umieść próbkę w lodzie. Próbki te mogą być następnie poddane analizie w celu oznaczenia ładunku bakteryjnego oraz rekrutacji komórkowej. Aby pobrać próbki do analizy RNA, użyj oddzielnej kaniulowanej igły zawierającej 500 µL buforu do lizy RNA w celu przeprowadzenia wtórnego płukania nosa.Należy pamiętać, że bufor do lizy RNA usunie nabłonek i zniszczy otaczające tkanki. Należy zatem zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z takimi organami jak płuca. Jeśli pożądane jest zachowanie tych tkanek w celu ilościowego oznaczenia ładunku bakteryjnego w nosogardle, będą Państwo potrzebować następujących elementów.Probówki Epicor, płytki mikrobiologiczne zawierające agar sojowo-kaszowy z dodatkiem 5% krwi owczej. Mieszadło wortex, sterylne końcówki do pipet PBS oraz pipety P 20 i P 200. W pierwszej kolejności, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL 2, należy przygotować serię rozcieńczeń dla każdej próbki płukania nosa u myszy.Zazwyczaj oczekuje się, że stężenia S pneumoniae w nosogardzieli wynoszą od zera do 10⁴ CFU. W związku z tym należy przeprowadzić trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne, dodając 10 µL niezakonserwowanej próbki płukania nosa do pierwszej probówki, aby uzyskać stężenie 10⁻¹ CFU/ml, a następnie kontynuować proces aż do uzyskania trzech rozcieńczeń; między każdym etapem należy dokładnie wymieszać próbki w wirówce typu vortex. Uwaga: niniejszy film służy wyłącznie celom demonstracyjnym.Należy zawsze przestrzegać właściwej techniki laboratoryjnej, w tym wymiany końcówek pipet między rozcieńczeniami. Za pomocą markera podziel płytkę do wysiewu na cztery kwadranty i opisz każdy z nich zgodnie z odpowiadającym mu rozcieńczeniem, które ma zostać na niej naniesione. Na płytkę z agarem nanieś trzy krople próbek o objętości 10 µL z każdego z przygotowanych rozcieńczeń. Pozostaw je do wyschnięcia na 15 do 30 minut bez przykrycia, a następnie przykryj płytki i umieść je odwrócone dnem do góry w inkubatorze bakteriologicznym w optymalnych warunkach dla wzrostu pneumokoków, zazwyczaj 37 °C i 5% CO2.Inkubuj płytki przez 24 do 48 godzin. Po tym czasie wyjmij płytki i określ liczbę kolonizujących bakterii, obliczając średnią liczbę kolonii powstałych na płytce. Dla każdego rozcieńczenia kolonie animo można zidentyfikować po ich charakterystycznym beżowym kolorze oraz strefach alfa-hemolizy, które są małymi otoczkami wokół każdej kolonii, powstającymi w wyniku bakteryjnego trawienia suplementu krwi w agarze.I wreszcie, przez niewielkie wgłębienia w centrum każdej kolonii, co nadaje im wygląd erytrocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ustanowić kolonizację nosogardzielną u myszy, jak izolować bakterie i komórki z nosogardzieli myszy po kolonizacji, stosując płukanie nosa, oraz jak określić odpowiednią liczbę bakterii przy użyciu technik mikrobiologicznych. Mamy nadzieję, że metody opisane w tym filmie zachęcą Państwa do wykorzystania donosowego modelu kolonizacji w celu zbadania odpowiedzi gospodarza na patogeny w kontekście tego niedostatecznie opracowanego regionu.

characterization-inflammatory-responses-during-intranasal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji dróg nosowych Streptococcus pneumoniae

Ten film pokazuje proces powstawania infekcji płuc u immunokompetentnego modelu gryzoni poprzez intubację i instalację zawiesin bakteryjnych w płatach płuc. Model ten umożliwia badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych.

Wkraplanie dooskrzelowe Streptococcus pneumoniae w immunokompetentnych modelach gryzoni

Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki oferuje naturalny model nosicielstwa i potencjalny model do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek. Technika ta jest cenna, ale złożona i wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka. Opracowaliśmy szczegółowy protokół.

Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Streptococcus pneumoniae tworzy dyskretne, nieropne, mikroskopijne zmiany w sercu. Przedstawiono protokół mysiego modelu powstawania mikrouszkodzeń serca. Prowadzone są szkolenia dotyczące wizualizacji mikrozmian za pomocą mikroskopii, rozróżniania wczesnych i późnych mikrouszkodzeń oraz metod wykrywania przebudowy serca w sercach rekonwalescentów.

Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Demonstrujemy procedurę dotchawniczego inokulacji Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania szlaków sygnałowych regulujących stan zapalny dróg oddechowych w modelach mysich.

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Haemophilus influenzae wywołuje stan zapalny w drogach oddechowych. W tym artykule skupimy się na zastosowaniu cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej do określenia odpowiedzi immunologicznej fagocytów i limfocytów w odpowiedzi na tę bakterię.

Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Poznaj metodę kolonizacji nosogardła myszy Streptococcus pneumoniae i izolacji komórek immunologicznych. Technika umożliwia analizę odpowiedzi zapalnej oraz ilościową ocenę bakterii in vivo.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Przeglądaj więcej filmów