Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Procedura ta polega na kolonizacji nosogardzieli murn za pomocą paciorkowcowego zapalenia płuc, a następnie ekstrakcji bakterii kolonizujących, a także komórek przylegających lub rekrutowanych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie inokulum bakteryjnego zapalenia płuc typu S. Szczep zainteresowania.

Żywe bakterie są następnie podawane donosowo znieczulonym myszom, gdy znajdują się one w aparacie ograniczającym Po pożądanej długości kolonizacji myszy są następnie eutanazyjne, a płukanie nosa wykonuje się poprzez kaniulowanie ich odsłoniętych tchawic i wypłukiwanie zawartości przez nas. Liczbę bakterii obecnych w płukankach nosowych można określić ilościowo za pomocą technik mikrobiologicznych. Alternatywnie, odpowiedzi immunologiczne można oznaczyć przy użyciu technik cytometrii przepływowej w celu fenotypu rekrutowanych komórek lub ilościowych technik PCR.

Aby zmierzyć poziomy wyrażonego mRNA przed rozpoczęciem, należy przygotować mysie środki ograniczające do części procedury kolonizacji donosowej oraz kaniulowane igły do płukania nosa. Ogranicznik myszy można przygotować po prostu odcinając zwężającą się końcówkę 50-mililitrowej rurki sokoła. Po utworzeniu otworu upewnij się, że używasz nożyczek, aby wypolerować wszelkie ostre końce.

Do przygotowania igieł kaniulowanych potrzebne będą następujące rurki polietylenowe PE 20 o średnicy wewnętrznej 0,38 milimetra. Jedna strzykawka jest pokryta 26 i trzema igłami ze skosem o rozmiarze 8 mm, parą ostrych, cienkich tęczówek, nożyczkami i parą kleszczy. Przetnij rurkę PE 20 cienkimi nożyczkami na kawałki o długości około 2.5 centymetra lub jednego cala, upewniając się, że każdy koniec ma ściętą końcówkę.

Za pomocą kleszczy ostrożnie wsuń jeden z tych kawałków na końcówkę igły. Unikając przebicia strony rurki, igły kaniulowane można przechowywać w 70% etanolu do czasu potrzeby i przepłukać PBS bezpośrednio przed użyciem. Do donosowej kolonizacji myszy z S pmo zalecamy stosowanie stężenia od 10 do dziewięciu jednostek tworzących kolonie na promil dostarczonych w 10 mikrolitrach.

Aby uzyskać ostateczną dawkę od 10 do siedmiu jtk, należy trzymać inokulum na lodzie do momentu tuż przed użyciem i upewnić się, że mieszasz pomiędzy każdą kolonizacją. Oprócz inokulum potrzebne będzie również wysterylizowane końcówki do pipet P 10 lub P 20 oraz ogranicznik do myszy. Odizoluj pojedynczą mysz za ogon i unieruchom, umieszczając ją we wcześniej przygotowanym aparacie powstrzymującym myszy.

Jeśli masz problemy z skierowaniem myszy do ogranicznika, pomocne może być ustawienie jej z przodu i nad myszą, umożliwiając zwierzęciu czołganie się w górę. Gdy mysz znajdzie się w uchwycie, zabezpiecz go za podstawę ciała, delikatnie popychając go do góry, tak aby jej nos wyłonił się ze zwężającego się końca ogranicznika. Za pomocą pipety P 10 lub P 20 zaszczepij każdą mysz, umieszczając 10 mikrolitrów przygotowanej kultury, równomiernie rozprowadzając ją między obiema myszy. Nozdrza.

Pozwól, aby inokulum wpłynęło do nosa, pulsując szczepionką stopniowo, biorąc czas niezbędny myszy do wdychania inokulum. Mysz może kichnąć część inokulum przez nos, czego można się spodziewać. Należy pamiętać, że myszy powinny być znieczulone do tej procedury, aby upewnić się, że bakterie pozostają zlokalizowane w nosogardzieli i nie rozprzestrzeniają się na dolne drogi oddechowe.

Na potrzeby tej demonstracji zaszczepiamy PBS, ale za każdym razem, gdy pracujemy z żywymi bakteriami, upewnij się, że przeprowadzasz procedurę zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez instytut. Na przykład większość instytucji będzie wymagać, aby kolonizacja była prowadzona w kapturze na poziomie bezpieczeństwa biologicznego drugiego. Jeśli używasz wskaźników wagi jako części sposobu monitorowania punktów końcowych, MA natychmiast po kolonizacji, monitoruj myszy co 12 do 24 godzin pod kątem objawów klinicznych, takich jak letarg, potargana sierść i utrata wagi.

Gdy myszy zostaną skolonizowane, trzymaj je przez pożądany okres czasu. Pod koniec tego okresu myszy zostaną poddane eutanazji i zostanie przeprowadzone płukanie nosa, ponieważ zwichnięcie szyjki macicy może potencjalnie uszkodzić tchawicę. Należy unikać tej metody eutanazji.

Przed wykonaniem płukania nosa upewnij się, że masz pod ręką następujące elementy. Wcześniej przygotowane igły kaniulowane, 70% wodny etanol, para kleszczy, para ostrych nożyczek do cienkiej tęczówki, fosforan, buforowana sól fizjologiczna, bufor do lizy RNA i jedna probówka mil einor. Gdy będziesz gotowy, aby zacząć, połóż zwierzę płasko na grzbiecie i za pomocą 70% wodnego etanolu wysterylizuj przód jego futra, szczególnie okolice szyi.

Uważanie, aby etanol nie dostał się do nozdrzy. Wykonaj pojedyncze podłużne cięcie wzdłuż linii środkowej szyi zwierzęcia, pozwalając sobie stworzyć otwór, aby wyobrazić sobie tchawicę. Ostrożnie odklej skórę po obu stronach, odsłaniając tkankę szyi pod spodem.

W tym momencie tchawica powinna być widoczna otoczona mięśniami podłużnymi po obu stronach. Ostrożnie je odetnij, aby zapewnić wyraźny widok samej tchawicy, uważając, aby nie przeciąć otaczającego naczynia krwionośnego. W przypadku, gdy przypadkowo przetniesz naczynia krwionośne, a krew będzie obecna w okolicy przed kontynuowaniem.

Poczekaj, aż krwawienie się zatrzyma, a następnie kilkakrotnie oczyść obszar, dozując sterylny PBS i używając sterylnej gazy, aby delikatnie wchłonąć nadmiar wilgoci. Gdy tchawica jest odpowiednio odsłonięta, wykonaj poprzeczne półksiężycowate nacięcie w tchawicy mniej więcej do połowy. Wrzuć sterylny PBS do kaniulowanej strzykawki.

Włóż kaniulę do tchawicy w kierunku nosa, trzymając ściętą krawędź skierowaną w dół, aby ułatwić wprowadzanie. Gdy kaniula znajdzie się na miejscu, obróć ją o 180 stopni i delikatnie sonduj w górę, aż poczujesz lekki opór. Umieść probówkę EEND DPH przeznaczoną do pobierania próbek tuż pod noskiem myszy.

Przetestuj prawidłowe umieszczenie kaniuli, dozując minimalną ilość płynu do płukania PBS. Następnie wokół NAS myszy powinna uformować się kropla płynu, jeśli kaniula jest prawidłowo umieszczona. Jeśli badany PBS wyłania się bezpośrednio z pyska zwierzęcia, pociągnij kaniulę do tyłu i ponownie ją ułożyj, delikatnie sondując do przodu, aż poczujesz bardzo niewielki opór.

Uważaj, aby nie wypchnąć kaniuli zbyt daleko poza ten opór, ponieważ przesuniesz ją przez podniebienie nosowe i do jamy ustnej. Po potwierdzeniu, że kaniula jest prawidłowo umieszczona, przystąp do szybkiego dozowania 200 mikrolitrów PBS, aby pomóc w przemieszczeniu i zebraniu maksymalnej ilości komórek. Zawartość powinna wypłynąć przez nozdrza myszy i do probówki zbiorczej.

Natychmiast umieścić próbkę na lodzie. Próbki te można następnie oznaczyć pod kątem obciążenia bakteryjnego, a także rekrutacji komórkowej. Aby pobrać próbki do analizy RNA, użyj oddzielnej kaniulowanej igły zawierającej 500 mikrolitrów buforu do lizy RNA, aby wykonać wtórne płukanie nosa.

Należy pamiętać, że bufor do lizy RNA zniszczy nabłonek i zniszczy otaczającą tkankę. Dlatego należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z narządami, takimi jak płuca. Jeśli pożądane jest zatrzymanie tych tkanek w celu ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego nosogardzieli, będziesz potrzebować następujących elementów.

Probówki Epicor, płytki mikrobiologiczne zawierające tryptyk jaj sojowych są uzupełnione 5% krwią owczą. Mieszalnik wirowy, sterylne końcówki do pipet PBS oraz pipety P 20 i P 200. Najpierw pracując w dwóch kapturach BSL, przygotuj serię seryjnych rozcieńczeń dla każdej próbki płukania nosa mirin.

Ogólnie rzecz biorąc, można oczekiwać, że stężenia S pneumoniae w nosogardzieli wynoszą od zera do 10 do czterech CFU. Dlatego należy przeprowadzić trzykrotne dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie, dodać 10 mikrolitrów czystej próbki do płukania nosa do pierwszej probówki do stężenia 10 do minus 1 CFU na promil, a następnie kontynuować w dół, aż trzy próbki nadmiernie rozcieńczysz dokładnie wirować między każdym rozcieńczeniem. Należy pamiętać, że ten film służy wyłącznie do celów demonstracyjnych.

Należy zawsze przestrzegać właściwej techniki laboratoryjnej, w tym wymiany końcówek pipet między dilu, używając sharpie, podziel go z powrotem na płytkę logiczną na ćwiartki i oznacz ćwiartki odpowiednim rozcieńczeniem, które należy na nim poszczepić. Na płytce agarowej umieścić trzy krople po 10 mikrolitrów próbek z każdego rozcieńczenia. Pozostaw je do wyschnięcia na 15 do 30 minut bez przykrycia, a następnie przykryj płytki i umieść do góry nogami w inkubatorze bakteryjnym o optymalnych warunkach do rozwoju pneumokoków, zwykle 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Inkubować te płytki przez 24 do 48 godzin. Po tym czasie usuń płytki i określ liczbę bakterii kolonizujących, uśredniając kolonie utworzone na płytce. Dla każdego rozcieńczenia, kolonie animo można zidentyfikować po ich charakterystycznym beżowym kolorze, strefach hemolizy alfa, które są małymi aureolami wokół każdej kolonii, utworzonymi przez bakteryjne trawienie suplementu krwi w agarze.

I wreszcie przez małe wgłębienia w środku każdej kolonii, które nadają jej wygląd erytrocytu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć solidną wiedzę na temat tego, jak ustalić ciśnienie w nosiogardzieli es, kolonizację u myszy, jak wyizolować bakterie i komórki z nosogardzieli myszy po kolonizacji, za pomocą płukania nosa i jak określić ilościowo odpowiednie obciążenie bakteryjne za pomocą technik mikrobiologicznych. Mamy nadzieję, że metody opisane w tym filmie zachęcą Cię do wykorzystania donosowego modelu kolonizacji do zbadania odpowiedzi gospodarza na patogeny w kontekście tego niedostatecznie zbadanego regionu.