Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie chorobotwórczych drożdży w połączeniu z komórkami gospodarza bez posiewania jednostek tworzących kolonie. Najpierw zainfekuj komórki makrofagów kapsułką H lub komórkami drożdży C albicans, wybarwij zakażone komórki makrofagów pomarańczą aine i jodkiem propidyny, aby podkreślić żywotne komórki drożdży. Następnie za pomocą cytometru obrazującego uchwyć serię obrazów i przeanalizuj parametry wielkości i kształtu, aby dokładnie policzyć komórki drożdży.

Wyniki cytometrii obrazowej mogą być skutecznie wykorzystane do ilościowego oznaczania patogennych drożdży w połączeniu z komórkami gospodarza. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody podczas prowadzenia badań w dziedzinie patogenezy grzybów, w których musiałem wielokrotnie płytkować i liczyć jednostki tworzące kolonie w celu ilościowego określenia torebki chorobotwórczego grzyba Histoplasma. Główną przewagą cytometrii obrazowej nad standardową metodą oznaczania liczby CFU jest jej zwiększona szybkość, ponieważ eliminuje pracochłonne i czasochłonne etapy posiewu, inkubacji i liczenia wielokrotnych seryjnych rozcieńczeń CFU przy porównywaniu wzrostu szczepów typu dzikiego i zmutowanych w komórkach gospodarza.

Metoda ta eliminuje potencjalny błąd systematyczny wynikający z różnych zdolności do inicjowania wzrostu jakości na podłożach stałych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą być kwestionowane przez cytometrię obrazową. Oprzyrządowanie i oprogramowanie.

Rozpocznij procedurę od hodowli makrofagów w pożądanej gęstości. W 24-dołkowych płytkach dodaj komórki grzyba w fazie logarytmicznej, a następnie inkubuj przez 90 minut, aby umożliwić fagocytozę. Następnie przemyj makrofagi trzykrotnie PBS w celu usunięcia grzybów zewnątrzkomórkowych, inkubuj przez eksperymentalnie zdefiniowane punkty czasowe przed analizą próbki przy niskiej wielokrotności infekcji, zakażone komórki makrofagów pozostają żywotne przez kilka dni, a próbki można analizować mniej więcej co 12 do 24 godzin.

Po trzech przemyciach PBS dodaj 0,5 mililitra sterylnej wody do zakażonych komórek makrofagów. Inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby uwolnić grzyby z komórek makrofagów. Następnie zbierz lizat do sterylnej probówki i trzymaj na lodzie.

Przenieś 20 mikrolitrów lizatu do osobnej probówki. Dodaj 20 mikrolitrów roztworu jodku propidium pomarańczy do natychmiastowej analizy cytometrycznej obrazu. Przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenie lizatów w pożywce.

Następnie rozłożyć na płytkę 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia w dwóch egzemplarzach. Na tabliczkach HMM aros. Inkubuj płytki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez siedem do ośmiu dni.

Ręcznie policz kolonie na tabliczkach, wyświetlając co najmniej 100 i maksymalnie 1000 odrębnych kolonii. Aby zebrać żywe makrofagi, umyj komórki trzykrotnie PBS. Następnie dodaj 0,5 mililitra PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usunąć makrofagi z dołków do hodowli tkankowych za pomocą delikatnego pipetowania. Przenieś płyn do sterylnej probówki i przechowuj na lodzie. Aby skonfigurować przyrząd akcelerometru, włóż moduły optyki fluorescencyjnej do systemu i upewnij się, że są zablokowane na swoim miejscu.

Włącz cytometr obrazowy w menu rozwijanym testu oprogramowania. Wybierz wstępnie ustawiony typ testu i typ komórki dla żywotności. Test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania pomarańczy aine i jodku propidyny w celu wykrycia zakażenia Candida albicans.

Test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania GFP. Teraz otwórz kartę opcji i kliknij zrób obraz tła Po zakończeniu operacji kliknij podgląd obrazu w jasnym polu, aby zmierzyć żywotność A OPI. Wymieszaj 20 mikrolitrów próbki z 20 mikrolitrami OPI i pipetuj do komory obliczeniowej pod kątem szybkości infekcji Candida albicans.

Dobrze wymieszać próbkę i pipetować ją bezpośrednio do komory zliczającej. Po ustabilizowaniu się komórek w komorze włóż komorę zliczającą do cytometru obrazowego w celu uzyskania obrazu. Ustaw ostrość próbki, a następnie kliknij przycisk liczba.

Po zakończeniu operacji akwizycji obrazu wyjmij jednorazową komorę zliczającą i zutylizuj ją w odpowiedni sposób. W przypadku pomiaru OPI wyniki stężenia i żywotności są wyświetlane na stronie wyników zliczania w celu określenia wskaźnika infekcji Candida albicans. Po uzyskaniu wyników zliczania kliknij eksport.

Następnie wyślij dane do FCS express four w celu analizy populacji komórek GFP. W FCS express zaimportuj plik danych i wykreśl wyniki w histogramie fluorescencji. Następnie zastosuj bramkę populacji komórek do histogramu, aby określić procentową populację komórek zakażonych Candida albicans.

Eksperyment ten monitoruje wzrost komórek makrofagów zakażonych drożdżami Lotum hcaps w określonych punktach czasowych. Próbki są barwione i analizowane za pomocą cytometrii opartej na obrazie. Uwolnione komórki drożdży z makrofagów są identyfikowane przez oprogramowanie Soter vision.

W tym przypadku bezwzględna liczba wykrytych żywych drożdży jest większa niż drożdży zdolnych do tworzenia kolonii na pożywce stałej. Dane te podkreślają obecność znacznej liczby żywotnych, ale nienadających się do uprawy komórek. Te makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego zostały zakażone komórkami drożdży C albican wykazującymi ekspresję białka zielonej fluorescencji pod kontrolą promotora A DH one.

Wielokrotność infekcji w zakresie od 0,1 do 10 powodowała stopniowy wzrost intensywności GFP w zakażonych makrofagach, a także całkowitego odsetka zakażonych makrofagów po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu zaledwie kilku minut na próbkę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ustawieniu parametrów w taki sposób, aby liczone były tylko komórki grzybów, a nie komórki gospodarza.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania drożdży chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza. Nie zapominaj, że praca z chorobotwórczymi grzybami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego noś środki ochrony osobistej i postępuj zgodnie z odpowiednimi procedurami usuwania odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.