Name: Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj cytometrię obrazową do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w makrofagach. Ta metoda zastępuje czasochłonne pomiary CFU, przyspieszając badania nad patogenezą grzybiczą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Zakażenie makrofagów H. capsulatum, C. albicans
<ol>
	<li>16 godzin przed infekcją wysiewaj makrofagi o pożądanej gęstości na płytkach 24-dołkowych. W tym protokole zastosowano gęstość 3,0 x 105 komórek/studzienkę.</li>
	<li>Dodaj komórki grzybów we wzroście w fazie logarytmicznej przy pożądanej wielokrotności infekcji (MOI). Ten protokół może obsługiwać zakres MOI (0,2 - 5,0). Do zakażenia makrofagów RAW264.7 H. capsulatum użyliśmy MOI 0,2.</li>
	<li>Po 1,5 godziny, aby umożliwić fagocytozę, przemyj makrofagi trzykrotnie PBS, aby usunąć grzyby zewnątrzkomórkowe.</li>
	<li>Inkubować przez żądaną liczbę godzin przed analizą próbki. Przy niskim MOI (0,2 w naszym eksperymencie) zakażone komórki makrofagów pozostają żywotne przez kilka dni, a próbki można analizować mniej więcej co 12-24 godziny.</li>
</ol>
2. Liza makrofagów
<ol>
	<li>Aby uwolnić grzyby z komórek makrofagów, usuń pożywkę, przemyj 3 razy PBS i dodaj 0,5 ml sterylnej wody. W tych warunkach makrofagi ulegną lizie, a komórki grzybów pozostaną nienaruszone.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś lizat do sterylnej probówki, trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Przenieść 20 μl lizatu do osobnej probówki, a następnie dodać 20 μl roztworu AO/PI. Przejdź bezpośrednio do kroku 5: "Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej obrazu"</li>
</ol>
3. Poszycie CFU
<ol>
	<li>Przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenie lizatów (od kroku 2.3) w pożywce.</li>
	<li>Umieścić 100 μl każdego rozcieńczenia, w dwóch egzemplarzach, na płytkach HMM-agarozy. Inkubować płytki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 7-8 dni.</li>
	<li>Ręcznie policz kolonie na tabliczkach wyświetlających co najmniej 100 i maksymalnie 1,000 odrębnych kolonii.</li>
</ol>
4. Wizualizacja grzybów w żywych makrofagach
<ol>
	<li>Aby zebrać żywe makrofagi, umyj komórki 3 razy PBS. Dodać 0,5 ml PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby usunąć makrofagi z dołków hodowli tkankowych, delikatnie pipetuj w górę iw dół kilka razy. Przenieś płyn do sterylnej probówki, trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Przenieść próbkę o objętości 20 μl do osobnej probówki, a następnie dodać 20 μl roztworu AO/PI. Przejdź bezpośrednio do kroku 5: "Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej obrazu".</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej obrazu
<ol>
	<li>Dokładnie odpipetować próbkę docelową, a następnie przenieść 20 μl próbki do jednorazowej komory zliczania komórek.</li>
	<li>Pozwól komórkom osiąść w komorze przez 30 sekund.</li>
	<li>Włóż komorę zliczającą do cytometru obrazowego.</li>
</ol>
6. Ustawienia instrumentu do celometru
<ol>
	<li>Włóż moduły optyki fluorescencyjnej: VB-535-402 i VB-660-502 do systemu i upewnij się, że są zablokowane na swoim miejscu.
	<ol>
		<li>VB-535-402 (wzbudzenie przy 475 nm, emisja przy 535 nm) służy do wykrywania oranżu akrydynowego i GFP.</li>
		<li>VB-660-502 (wzbudzenie przy 540 nm, emisja przy 660 nm) służy do detekcji jodku propidyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz cytometr obrazowy i otwórz dołączone oprogramowanie.</li>
</ol>
7. Konfiguracja oprogramowania wiolometru
<ol>
	<li>Wybierz ustawienie wstępne "Typ testu" i "Typ komórki" z menu rozwijanego testu.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić żywotność, test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania oranżu akrydynowego i jodku propidyny.</li>
		<li>W celu wykrycia zakażenia Candida albicans test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania GFP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz "Opcje" u góry i kliknij "Weź obraz tła" i poczekaj na zakończenie operacji.</li>
	<li>Kliknij "Podgląd obrazu w jasnym polu".</li>
</ol>
8. Procedura pozyskiwania obrazu
<ol>
	<li>Włóż przygotowaną komorę na próbkę do cytometru obrazowego.</li>
	<li>Użyj pokrętła ostrości i wyreguluj ostrość.</li>
	<li>Po ustawieniu ostrości kliknij "Policz" i poczekaj, aż operacja akwizycji obrazu zostanie zakończona.</li>
	<li>Wyjmij jednorazową komorę liczącą i zutylizuj w odpowiedni sposób.</li>
</ol>
9. Analiza danych obrazu
<ol>
	<li>Pomiar koncentracji i żywotności
	<ol>
		<li>Po zakończeniu liczenia stężenie i żywotność komórek docelowych są wyświetlane na stronie wyników.</li>
		<li>Kliknij "Eksportuj", aby wyeksportować dane do FCS Express 4 w celu analizy populacji komórek GFP w eksperymencie infekcji Candida albicans.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza FCS Express komórek zakażonych Candida albicans
	<ol>
		<li>Zaimportuj plik ". NXDAT" do FCS Express 4 i wykreślić wyniki na histogramie fluorescencji.</li>
		<li>Zastosuj bramkę populacji komórek do histogramu, aby określić procentową populację komórek zakażonych Candida albicans.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li>
<li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li>
<li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+yeast%3A+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li>
<li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li>
<li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis%2C+mitochondrial+potential%2C+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
<li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micro.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

Autorzy, Leo Li-Ying Chan i Benjamin Paradis są pracownikami Nexcelom Bioscience LLC.

Cytometria obrazowa pozwala użytkownikowi na uchwycenie wysokiej jakości obrazów i za pomocą specjalistycznego oprogramowania szybkie określenie ilościowe komórek. Jednym z potencjalnych wyzwań związanych z zastosowaniem cytometrii obrazowej w dziedzinie patogenezy drobnoustrojów jest to, że drobnoustroje, które mają być policzone, są obecne w mieszanej populacji komórek, w tym w komórkach gospodarza ssaków. Tutaj pokazujemy, że cytometria obrazowa może być stosowana do ilościowego oznaczania żywotnych drożdży chorobotwó...

Badania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z ich gospodarzami i/lub komórkami gospodarza często wymagają ilościowego określenia żywotnych komórek grzybów w czasie lub w różnych warunkach infekcji. Wyliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest standardową metodą, za pomocą której mierzy się liczbę żywotnych komórek grzybów, jednak technika ta ma kilka wad i ograniczeń. Po pierwsze, wiele gatunków grzybów rośnie powoli. Wzrost widocznych kolonii na pożywkach stałych może trwać 1-2 tygodnie, co znacznie spowalnia tempo badań. Po drugie, manipulowanie próbkami podczas posiewu CFU jest pracochłonnym procesem, ponieważ należy posiać kilka rozcieńczeń, aby zapewnić policzalną liczbę kolonii. Po trzecie, liczba CFU jest zwykle niższa niż liczba żywotnych organizmów posianych, ponieważ wydajność posiewu jest znacznie poniżej 100%. Na przykład skuteczność posiewu dimorficznego patogenu grzybowego Histoplasma capsulatum może wynosić nawet 90%, ale zwykle wynosi zaledwie 30%, a jest jeszcze niższa (10%) w przypadku pokrewnego dimorfu grzyba Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Skuteczność posiewu Candida albicans również podlega zmienności 3. Wreszcie, analiza CFU uwzględnia tylko żywe i aktywnie dzielące się komórki zdolne do rozpoczęcia wzrostu na pożywkach stałych, podczas gdy w wielu sytuacjach przydatne byłoby określenie obecności i stężenia martwych i/lub metabolicznie nieaktywnych komórek.
Poprzednio, metody cytometrii przepływowej do oznaczania ilościowego kilku gatunków grzybów chorobotwórczych zostały opisane 4-6. Jednak ze względu na problemy związane z ograniczaniem bezpieczeństwa biologicznego związane ze stosowaniem patogenów na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) lub BSL3 na cytometrach ze wspólnym przepływem, zastosowanie tej techniki było ograniczone. Podobnie jak cytometria przepływowa, cytometria obrazowa jest czułą i szybką metodą oznaczania ilościowego komórek. Jednak cytometrię obrazową można wykonać za ułamek kosztów z porównywalnymi wynikami 7-11. W tym miejscu opisano metody wykonywania cytometrii obrazowej grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza. Demonstrujemy nasze metody z wykorzystaniem dwóch ludzkich patogenów grzybiczych: Histoplasma capsulatum i Candida albicans. H. capsulatum jest dymorficznym patogenem grzybiczym, który powoduje choroby układu oddechowego; U ludzi rośnie jako pączkujące drożdże i replikuje się w makrofagach pęcherzykowych. Candida albicans to ludzki gatunek komensalny, który czasami powoduje kandydozę. Pokazujemy, że cytometria obrazowa pozwala na szybkie określenie ilościowe tych drożdży, wraz z możliwością wizualizacji.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td> Life <td>Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór AO/PI</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa komora licząca</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Software</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Badania mechanizmów patogenezy komórkowej chorobotwórczych drożdży, takich jak Candida albicans, Histoplasma capsulatum, i Cryptococcus neoformans, często wykorzystują infekcję gospodarzy ssaków lub komórek gospodarza (np. makrofagów), a następnie kwantyfikację drożdży za pomocą analizy jednostek tworzących kolonie lub cytometrii przepływowej. Podczas gdy liczenie jednostek tworzących kolonie jest najczęściej stosowaną metodą w tej dziedzinie, technika ta ma wady i ograniczenia, w tym powolny wzrost niektórych gatunków grzybów na pożywkach stałych oraz niską i/lub zmienną wydajność posiewu, co jest szczególnie niepokojące przy porównywaniu wzrostu szczepów typu dzikiego i zmutowanych. Cytometria przepływowa może dostarczyć szybkich informacji ilościowych na temat żywotności drożdży, jednak zastosowanie wykrywania metodą cytometrii przepływowej dla drożdży chorobotwórczych było ograniczone z wielu powodów praktycznych, w tym ze względu na wysokie koszty i bezpieczeństwo biologiczne. Tutaj demonstrujemy metodologię cytometryczną opartą na obrazie przy użyciu Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) do ilościowego oznaczania żywotnych drożdży chorobotwórczych we wspólnej hodowli z makrofagami. Nasze badania koncentrują się na wykrywaniu dwóch patogenów grzybiczych człowieka: Histoplasma capsulatum i Candida albicans. H. capsulatum kolonizuje makrofagi pęcherzykowe poprzez replikację w fagosomie makrofagów, a tutaj ilościowo oceniamy wzrost drożdży H. capsulatum w makrofagach RAW 264.7 za pomocą barwienia pomarańczą akrydynową/jodkiem propidyny w połączeniu z cytometrią obrazową. Nasza metoda wiernie odwzorowuje trendy wzrostu mierzone tradycyjnym liczeniem jednostek tworzących kolonie, ale ze znacznie zwiększoną czułością. Dodatkowo bezpośrednio oceniamy zakażenie żywych makrofagów szczepem C. albicans wykazującym ekspresję GFP. Nasza metodologia oferuje szybkie, dokładne i ekonomiczne środki do wykrywania i ilościowego oznaczania ważnych patogenów grzybiczych u ludzi w połączeniu z komórkami gospodarza.

Do monitorowania wzrostu H. capsulatum w makrofagach wykorzystaliśmy cytometr obrazowy Cellometer Vision. Komórki RAW 264.7 zainfekowano komórkami drożdżowymi H. capsulatum, a w wybranych punktach czasowych próbki poddano barwieniu AO/PI, a następnie analizie cytometrycznej opartej na obrazowaniu. Równolegle próbki analizowano za pomocą tradycyjnego oznaczania CFU. W każdym punkcie czasowym próbki inkubowano w wodzie w celu lizy makrofagów, a uwolnione komórki drożdżowe identyfikowano za pomocą oprogram...

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli. Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie patogennych drożdżaków w powiązaniu z komórkami gospodarza bez konieczności wysiewania jednostek tworzących kolonie. Najpierw należy zainfekować makrofagi komórkami drożdżaków H capsulation lub C albicans, a następnie zabarwić zainfekowane makrofagi acridine orange i jodkiem propidyny, aby uwidocznić żywe komórki drożdżaków. Następnie, używając cytometru obrazującego, należy zarejestrować serię obrazów i przeanalizować parametry wielkości oraz kształtu w celu dokładnego policzenia komórek drożdżaków.Wyniki cytometrii obrazowej mogą być skutecznie wykorzystywane do ilościowego oznaczania drożdży patogennych w powiązaniu z komórkami gospodarza. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas prowadzenia badań nad patogenezą grzybów, w których wielokrotnie musiałem wysiewać i liczyć jednostki tworzące kolonie w celu kwantyfikacji patogennego grzyba Histoplasma capsule. Główną zaletą cytometrii obrazowej w stosunku do standardowej metody liczenia CFU jest zwiększona szybkość, ponieważ eliminuje ona pracochłonne i czasochłonne etapy wysiewania, inkubacji oraz liczenia wielu rozcieńczeń seryjnych CFU podczas porównywania wzrostu szczepów typu dzikiego i mutantów wewnątrz komórek gospodarza.Metoda ta eliminuje potencjalne obciążenie wynikające z różnic w zdolności do inicjowania wysokiej jakości wzrostu na pożywkach stałych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności związane z cytometrią obrazową, oprzyrządowaniem oraz oprogramowaniem.Procedurę należy rozpocząć od hodowli makrofagów o pożądanej gęstości. Do płytek 24-dołkowych dodać komórki grzybów w fazie logarytmicznego wzrostu, a następnie inkubować przez 90 minut, aby umożliwić fagocytozę. Następnie makrofagi należy przemyć trzykrotnie PBS w celu usunięcia grzybów pozakomórkowych; inkubować przez określone eksperymentalnie punkty czasowe przed analizą próbek. Przy niskiej wielokrotności infekcji zainfekowane komórki makrofagów pozostają żywotne przez kilka dni, a próbki można analizować mniej więcej co 12 do 24 godzin.Po trzykrotnym przemyciu buforem PBS, dodaj 0,5 milliliters sterylnej wody do zainfekowanych makrofagów. Inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby uwolnić grzyby z komórek makrofagów. Następnie zbierz lizat do sterylnej probówki i przechowuj w lodzie.Przenieś 20 µL lizatu do oddzielnej probówki. Dodaj 20 µL roztworu barwnika pomarańczowego z jodkiem propidium do natychmiastowej analizy cytometrycznej obrazowej. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie lizatów w pożywce.Następnie 100 µL każdego rozcieńczenia nanosi się podwójnie na płytki HMM aros. Płytki inkubuje się w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide przez siedem do ośmiu dni.Ręcznie policz kolonie na płytkach, wybierając te, które zawierają od minimum 100 do maksimum 1000 wyraźnych kolonii. Aby zebrać żywe makrofagi, przemyj komórki trzy razy PBS. Następnie dodaj 0,5 milliliters PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze four degrees Celsius.Usuń makrofagi z dołków hodowli tkankowej, delikatnie pipetując. Przenieś ciecz do sterylnej probówki i przechowuj na lodzie. Aby przygotować akcelerometr, włóż moduły optyki fluorescencyjnej do systemu i upewnij się, że są one zablokowane na miejscu.W menu rozwijanym oprogramowania w sekcji testów (assay) włącz cytometr obrazowy. Wybierz zaprogramowany typ testu oraz typ komórek dla badania żywotności. Test jest zoptymalizowany pod kątem detekcji z zastosowaniem acridine orange i jodku propidynymu w celu wykrycia zakażenia Candida albicans.Test został zoptymalizowany pod kątem detekcji GFP. Teraz otwórz kartę opcji i kliknij „take background image”. Po zakończeniu operacji kliknij „preview brightfield image” dla pomiaru żywotności A OPI. Wymieszaj 20 mikrolitrów próbki z 20 mikrolitrami A OPI i przenieś pipetą do komory zliczającej w celu oznaczenia wskaźnika infekcji Candida albicans.Dokładnie wymieszaj próbkę i pipetą przenieś ją bezpośrednio do komory liczącej. Po opadnięciu komórek w komorze, włóż ją do cytometru obrazowego w celu akwizycji obrazu. Ustaw ostrość obrazu próbki, a następnie kliknij przycisk count.Po zakończeniu procesu akwizycji obrazu należy wyjąć jednorazową komorę liczbową i poddać ją utylizacji zgodnie z obowiązującymi przepisami. W przypadku pomiaru A OPI wyniki stężenia i żywotności są wyświetlane na stronie z wynikami zliczania w celu określenia wskaźnika zakażenia Candida albicans. Po uzyskaniu wyników zliczania należy kliknąć eksportuj.Następnie prześlij dane do programu FCS express 4 w celu analizy populacji komórek GFP. W programie FCS express zaimportuj plik z danymi i przedstaw wyniki w postaci histogramu fluorescencji. Następnie zastosuj bramkowanie populacji komórek na histogramie, aby określić procentowy udział populacji komórek zainfekowanych Candida albicans.W tym doświadczeniu monitoruje się wzrost komórek makrofagów zainfekowanych drożdżakami hcaps Lotum w określonych punktach czasowych. Próbki są barwione i analizowane za pomocą cytometrii obrazowej. Uwolnione komórki drożdżaków z zainfekowanych makrofagów są identyfikowane przez oprogramowanie Soter vision.W tym przypadku bezwzględna liczba wykrytych żywych drożdży jest większa niż liczba drożdży zdolnych do tworzenia kolonii na podłożu stałym. Dane te wskazują na obecność znacznej liczby komórek żywotnych, lecz niezdolnych do hodowli. Te makrofagi pochodzące z szpiku kostnego zostały zainfekowane komórkami drożdżowymi C albicans wykazującymi ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora A DH one.Wielokrotności zakażenia (MOI) w zakresie od 0,1 do 10 skutkowały stopniowym wzrostem intensywności GFP w zakażonych makrofagach, a także całkowitego odsetka zakażonych makrofagów. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje zaledwie kilka minut na próbkę, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ustawieniu parametrów w taki sposób, aby zliczane były wyłącznie komórki grzybów, a nie komórki gospodarza.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania patogennych drożdżaków w powiązaniu z komórkami gospodarza. Prosimy pamiętać, że praca z grzybami patogennymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy stosować środki ochrony osobistej i przestrzegać odpowiednich procedur utylizacji odpadów biologicznie niebezpiecznych.

use-image-cytometry-for-quantification-pathogenic-fungi-association

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego określania patogennych grzybów w związku z komórkami żywiciela

Ten film demonstruje metodę ilościowego oznaczania fagocytozy patogennych zarodników grzybów znakowanych FITC przez ludzkie leukocyty. Zarodniki fagocytozowane są odróżniane od zarodników przylegających do komórek poprzez barwienie przeciwstawne, a następnie analizę cytometryczną przepływową.

Ilościowy pomiar fagocytozy zarodników grzybów metodą cytometrii przepływowej przez ludzkie fagocyty

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Tutaj opisujemy protokół do określania obciążenia grzybami płuc u myszy z inwazyjną aspergilozą poprzez ilościowe zabarwienie srebrem zmodyfikowanej metanaminy Gomoriego w przekrojach histologicznych. Zastosowanie tej metody przyniosło porównywalne wyniki przy mniejszej liczbie zwierząt w porównaniu z oceną obciążenia grzybami za pomocą ilościowej reakcji PCR DNA grzyba płuc.

Kwantyfikacja histologiczna w celu określenia obciążenia grzybicą płuc w eksperymentalnej aspergilozie

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ten protokół zapewnia szybką i niezawodną metodę ilościowego pomiaru fagocytozy konidiów Aspergillus fumigatus przez ludzkie pierwotne fagocyty za pomocą cytometrii przepływowej i do odróżnienia fagocytozy konidiów od zwykłej adhezji do leukocytów.

Pomiar fagocytozy Aspergillus fumigatus Conidia za pomocą ludzkich leukocytów przy użyciu cytometrii przepływowej

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Poznaj cytometrię obrazową do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w makrofagach. Ta metoda zastępuje czasochłonne pomiary CFU, przyspieszając badania nad patogenezą grzybiczą.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Przeglądaj więcej filmów