Name: Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj techniki barwienia fluorescencyjnego do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych, w tym Trichoderma atroviride i Neurospora crassa. Metoda umożliwia śledzenie dynamiki błon i biosyntezy ścian komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania należą się Tyrolskiemu Funduszowi Naukowemu (TWF) za udzielenie grantu #256524 dla AL, Wiedeńskiemu Funduszowi Nauki i Technologii (WWTF) za udzielenie grantu #LS13-086 dla SZ oraz Funduszowi Publikacji Uniwersytetu w Innsbrucku za wsparcie publikacji w otwartym dostępie. Autorzy dziękują również Wydziałowi Zoologii Uniwersytetu w Innsbrucku za udostępnienie konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Leica TCS SP5 II.

1. Przygotowanie próbek grzybów
<ol>
	<li>Wstępne kultury grzybów
	<ol>
		<li>Zaszczepić pożądany szczep na odpowiednim stałym podłożu agarowym, takim jak agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) w przypadku Trichoderma atroviride lub Vogel's Minimal Medium (VMM) w przypadku Neurospora crassa. Dodaj odpowiedni znacznik wyboru podczas pracy z odkształceniami transformacyjnymi.</li>
		<li>Inkubuj kulturę wstępną w optymalnej temperaturze organizmu. Na przykład, T. atroviryd w temperaturze 25 °C i N. crassa w temperaturze 30 °C, oraz 12 godzin/12 godzin cykli światła/ciemności, aż rozwinie się grzybnia zarodnikująca, ale jeszcze nie osiągnęła krawędzi płytki. Na standardowej wielkości szalce Petriego (9,2 cm Ø) T. atroviryd typu dzikiego występuje średnio po 4–6 dniach, podczas gdy dziki typ N. crassa osiąga ten etap średnio po 3–4 dniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa kolonii grzybów
	<ol>
		<li>Używając sterylnego skalpela, odetnij mały blok agaru o wymiarach 3 mm x 3 mm przenoszący grzybnię niezarodnikującą z krawędzi kolonii kultury wstępnej.</li>
		<li>Umieść blok agaru na środku świeżej, stałej płytki pożywki, aby zaszczepić eksperymentalną kulturę.</li>
		<li>Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład T. atroviryd typu dzikiego potrzebuje 20–22 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kolonie o średnicy około 2 cm na PDA, podczas gdy N. crassa typu dzikiego osiąga średnicę kolonii około 4 cm po 14–16 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności na VMM. 
		UWAGA: Inkubacja w ciemności zapobiega tworzeniu się pigmentów, które mogą wprowadzać autofluorescencję. W celu wyeliminowania fluorescencji tła pożywki z hodowli doświadczalnej, należy zastąpić agar 1,5% w/v przezroczystego środka zestalającego (patrz Tabela Materiałów), a dowolne złożone podłoże określoną pożywką minimalną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa stałych kultur kiełkujących
	<ol>
		<li>Użyj 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% w/v NaCl), aby zebrać zarodniki konidialne z płytki przed hodowlą i zebrać powstałą zawiesinę zarodników w probówce z nakrętką o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Zawiesinę zarodników dobrze wymieszać przez energiczne wirowanie, a następnie przefiltrować ją przez pasek sterylnej tkaniny filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 5 cm (patrz Tabela materiałów) lekko włożony do końcówki pipety o pojemności 1 ml (zarówno zmontowanej, jak i wcześniej autoklawowanej) do świeżej sterylnej probówki.</li>
		<li>Określić gęstość zarodników za pomocą komory do liczenia komórek i przygotować zawiesinę zarodników 1 x 107 komórek/ml z roztworem soli fizjologicznej. 
		UWAGA: Zawiesinę zarodników można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
		<li>Przygotuj szalkę Petriego o standardowej wielkości (Ø 9,2 cm) z 20 ml stałego podłoża i dodaj 15–20 sterylnych szklanych koralików (Ø 3 mm) na wierzch.</li>
		<li>Pobrać pipetą 200 μl zawiesiny przetrwalników na pożywkę i równomiernie rozprowadzić komórki na całej płytce, delikatnie wstrząsając. Zbierz szklane koraliki do zlewki z 70% etanolem do ponownego użycia.</li>
		<li>Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład dziki typ T. atroviride wymaga 5–6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kiełki konidialne na PDA, podczas gdy dziki typ N. crassa rozwija kiełki konidialne po 3–4 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności na VMM. 
		UWAGA: W celu wyeliminowania jakiejkolwiek fluorescencji tła podłoża z hodowli doświadczalnej, należy zastąpić agar przezroczystym środkiem zestalającym o stężeniu 1,5% w/v, a wszelkie złożone podłoża określoną pożywką minimalną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa płynnych kultur kiełkujących
	<ol>
		<li>Wlać 190 μl płynnej pożywki hodowlanej do każdego dołka 8-dołkowego mikroszkiełka.</li>
		<li>Dodać 10 μl roztworu przetrwalników o stężeniu 1 x 107 komórek/ml (przygotowanego w krokach 1.4.1–1.4.3) i wymieszać, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wynikowa całkowita liczba komórek wynosi 1 x 105 na studzienkę.</li>
		<li>Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład dziki typ T. atroviryd wymaga 5–6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kiełki konidialne w bulionie z dekstrozy ziemniaczanej (PDB), podczas gdy dziki typ N. crassa rozwija kiełki konidialne po 3–4 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności w płynnym VMM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów roboczych barwnika
<ol>
	<li>Aby zagwarantować pełną rozpuszczalność każdego barwnika, należy przygotować 2 mM roztwory podstawowe w dimetylosulfotlenku (DMSO), dodając odpowiednią ilość (patrz dokładna waga w Tabeli 1) do 1 ml 100% DMSO i dobrze wymieszać przez wirowanie. 
	UWAGA: Upewnij się, że bierzesz DMSO z butelki z uszczelką przegrodową; Powinien to być klarowny, przezroczysty płyn. W kontakcie z powietrzem DMSO brązowieje - prawdopodobnie z powodu utleniania śladowych zanieczyszczeń - i może negatywnie wpływać na wzrost komórek lub barwienie barwnikiem.</li>
	<li>Filtr Wysterylizuj roztwór podstawowy przez filtr membranowy strzykawkowy 0,2 μm do świeżej sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Aby zminimalizować wybielanie barwnikiem, owiń tubkę folią aluminiową. 
	UWAGA: Podstawowy roztwór barwnika można podzielić na mniejsze objętości, aby uniknąć cykli rozmrażania/zamrażania, i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 20 μM wodny roztwór roboczy barwnika, rozpuszczając 2 μl roztworu podstawowego barwnika w 198 μl sterylnej wody destylowanej w świeżej sterylnej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Aby zminimalizować wybielanie barwnikiem, owiń tubkę folią aluminiową. 
	UWAGA: Roztwór roboczy barwnika powinien być przygotowany na świeżo w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Podczas montowania próbki (patrz sekcja 3) roztwór roboczy barwnika zostanie standardowo rozcieńczony w stosunku 1:10, co spowoduje końcowe stężenie barwnika 2 μM i końcowe stężenie DMSO 0,1% w/v. 
	UWAGA: Wybór różnych współczynników rozcieńczenia poprzez prostą zmianę stosunku objętości między roztworem roboczym barwnika a cieczą montażową pozwala łatwo dostosować pożądane końcowe stężenie barwnika. 
	UWAGA: Aby zapobiec niepożądanym skutkom spowodowanym toksycznością barwnika lub DMSO, współczynnik rozcieńczenia nie powinien spaść poniżej 1:4, aby uzyskać maksymalne końcowe stężenia barwnika 5 μM i 0,4% w/v DMSO. Wyższe stężenia barwnika szybko nasycą system i uniemożliwią wiarygodną kwantyfikację sygnału, podczas gdy więcej niż 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO może upośledzać rozwój komórek38.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki do mikroskopii
<ol>
	<li>Pobrać próbki z kolonii grzybów (krok 1.2) lub stałych kultur kiełkujących (krok 1.3) metodą odwróconych bloków agarowych.
	<ol>
		<li>Przygotuj czyste szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm (#1 = 0,13–0,16 mm grubości) i dodaj 18 μl płynnego minimalnego podłoża (VMM lub M9) lub roztworu soli fizjologicznej na środek.</li>
		<li>Dodać 2 μl roztworu roboczego barwnika o stężeniu 20 μM do 18 μl płynu i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, unikając przy tym powstawania pęcherzyków powietrza. 
		UWAGA: Podczas pracy z kilkoma próbkami zaleca się przygotowanie głównej mieszanki płynnego roztworu barwnika dla wszystkich, aby zapewnić równe stężenie barwnika podczas całego eksperymentu.</li>
		<li>Za pomocą czystego skalpela wyciąć próbkę o wymiarach 15 mm x 15 mm z obrzeży kolonii lub stałej kultury zarodkowej i umieścić ją pionowo obok kropli pożywki na szkiełku nakrywkowym.</li>
		<li>Używając skalpela do podparcia górnej krawędzi bloku i palca do przytrzymania tylnej strony bloku na miejscu, powoli opuść stronę przenoszącą grzybnię lub kiełki na płyn. Próbka jest teraz gotowa do przeniesienia na stolik mikroskopowy. 
		UWAGA: Konieczne jest, aby robić to powoli i bardzo ostrożnie, aby zminimalizować naprężenia mechaniczne ogniw i uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza między próbką a szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj płynne kultury zarodkowe z kroku 1.4. 
	UWAGA: Najwygodniej, płynne kultury kiełkujące w komorowych szkiełkach mikrodołkowych mogą być bezpośrednio przenoszone i dalej manipulowane na stoliku mikroskopowym.
	<ol>
		<li>Dodać 22 μl roztworu roboczego barwnika do 200 μl płynnego podłoża, aby uzyskać standardowe końcowe stężenia 2 μM barwnika i 0,1% w/v DMSO. 
		UWAGA: Płynne kultury kiełkujące mają tę wielką zaletę, że barwniki fluorescencyjne (lub inne chemikalia, takie jak inhibitory) mogą być dodawane w dowolnym momencie eksperymentu, również podczas nagrywania. W takim przypadku należy zachować szczególną ostrożność, aby podawać krople płynu bardzo powoli, aby nie przeszkadzać komórkom. Drgania systemu i ruchy Browna mogą już wprowadzać pewne ruchy komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia żywych komórek
<ol>
	<li>Dostosuj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu. Poniższe ustawienia akwizycji obrazu pozwalają uchwycić dynamikę barwienia w poszczególnych strzępkach i mają zastosowanie do obu następujących testów
	<ol>
		<li>Zastosuj 5–10% mocy lasera z 20% pełnej mocy wyjściowej urządzenia.</li>
		<li>Użyj obiektywu Plan Apo 60x–63x do zanurzenia w glicerolu lub w wodzie o dużej aperturze numerycznej ≥ 1,2.</li>
		<li>Ogranicz obszar akwizycji obrazu do konturu strzępek, ustawiając rozmiar obrazu 1024 x 256 pikseli i używając współczynnika powiększenia optycznego 2–3.</li>
		<li>Użyj skanowania dwukierunkowego z częstotliwością odświeżania 400 Hz. Dostosuj rozmiar otworu do 1 jednostki Airy.</li>
		<li>Ustaw wzmocnienie najbardziej czułego detektora na 100%.</li>
		<li>W przypadku nagrywania poklatkowego należy rozpocząć akwizycję obrazu od jednej klatki co 15 s, aby zapewnić rozsądną rozdzielczość czasową bez powodowania wybielania barwnika lub stresu fotograficznego.</li>
		<li>W przypadku nagrywania 3D należy ustawić górną i dolną granicę przestrzenną na granicy strzępek i przestrzennych odcinków optycznych w odległości 1 μm od siebie, aby zapewnić rozsądną rozdzielczość przestrzenną. 
		UWAGA: Ze względu na szybki wzrost strzępek, wysoka rozdzielczość przestrzenna w osi Z była często poświęcana na rzecz wysokiej rozdzielczości czasowej na osi X/Y lub na odwrót. Tylko bardzo nowoczesne konfokalne laserowe mikroskopy skaningowe są wystarczająco szybkie, aby spełnić oba wymagania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy wychwytu endocytozy
	<ol>
		<li>Zapoznaj się z Rysunek 1 i Tabela 1, aby zidentyfikować najlepsze ustawienia wzbudzenia/emisji dla FM 1-43 i/lub FM 4-64 dostępne w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować. 
		UWAGA: Przy zalecanym stężeniu 2 μM wprowadzenie barwnika FM do błony plazmatycznej jest natychmiastowe w normalnych, zdrowych komórkach. Cały proces od wstępnego barwienia błony plazmatycznej do pojawienia się barwnika w wakuolach rurkowych jest zwykle zakończony w ciągu 30–45 minut w temperaturze pokojowej. Zwiększenie stężenia barwnika FM zwiększa stosunek sygnału do szumu, a tym samym szybciej tworzy obrazy o wyższym kontraście. Przyspiesza to jednak również proces etykietowania, utrudniając rozróżnienie chronologicznej kolejności barwienia organelli.</li>
		<li>Rozpocznij nagrywanie obrazu, korzystając z powyższych zalecanych podstawowych ustawień akwizycji obrazu i oceń wyniki.</li>
		<li>Zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu dynamiki błony plazmatycznej lub endocytozy, na którym koncentruje się eksperyment.</li>
		<li>Na przykład, aby uchwycić bardzo szybką dynamikę w X/Y, zmniejsz ogólny rozmiar obrazu, zobrazuj tylko jedną płaszczyznę ogniskową i zwiększ szybkość skanowania do 1 kl./s. Aby uzyskać wyższą rozdzielczość w osi Z, zmniejsz rozdzielczość w X/Y, zmniejsz rozmiar obrazu i zmniejsz odległość między sekcjami optycznymi do 0,5 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dynamika ściany komórkowej
	<ol>
		<li>Zapoznaj się z Rysunek 4 i Tabela 1, aby zidentyfikować najlepsze ustawienia wzbudzenia/emisji dla zastosowanego barwnika ściany komórkowej dostępnego w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować. 
		UWAGA: Ze względu na ich szerokie widma emisyjne, CFW i SPF nie nadają się do jednoczesnego obrazowania z innymi fluoroforami, głównie GFP. Niektóre ograniczenia dotyczą nawet metod obrazowania sekwencyjnego z użyciem tych barwników, a zatem muszą być optymalizowane indywidualnie.</li>
		<li>Rozpocznij rejestrowanie obrazu przy użyciu powyższych zalecanych podstawowych ustawień akwizycji obrazu i oceń wyniki. 
		UWAGA: Przy zalecanym stężeniu 2 μM wprowadzanie barwnika do ściany komórkowej niekoniecznie jest natychmiastowe, ale dość szybkie. Na przykład cały proces tworzenia przegrody trwa średnio około 5–7 minut w temperaturze pokojowej20. Zwiększenie stężenia barwnika w ścianie komórkowej zwiększa stosunek sygnału do szumu, a tym samym szybciej tworzy obrazy o wyższym kontraście. Jednak szybko wprowadza również artefakty z powodu indukowanej naprawy uszkodzeń ściany komórkowej.</li>
		<li>Zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu morfogenezy ściany komórkowej, na którym koncentruje się eksperyment, jak opisano w sekcji 4.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i nie mają nic do ujawnienia.

Artykuł ten jest kontynuacją przełomowych prac, które ustaliły zastosowanie różnych barwników fluorescencyjnych jako ważnych markerów organelli dla grzybów strzępkowychna początku lat 2000 2,4,43 i próbują omówić fotofizyczne i biologiczne właściwości komórek barwników FM i wybranych barwników ściany komórkowej bardziej szczegółowo niż wcześniej. Zwłaszcza w odniesieniu do niepożądanych efektów komórkowych, takich jak nasycenie błony lub uszkodzenie ściany komórkowej, które występują powyżej pewnych stężeń barwnika. To, co wcześniej było uważane za nietoksyczne na poziomie komórkowym, teraz jest uważane za toksyczne na poziomie molekularnym. Nawet jeśli efekty te mogą być bardzo subtelne i nie są bezpośrednio widoczne w oczywistych zmianach w zachowaniu organelli lub komórek, wszelkie możliwe zakłócenia w stosowaniu barwnika inne niż wizualizacja muszą być zminimalizowane w celu zbadania natywnej funkcji molekularnej. Na szczęście zwiększona czułość i wydajność kwantowa nowoczesnych detektorów, takich jak detektory fotodiod lawinowych krzemowych (Si-APD)44 czy detektor obszarowy Airyscan45, ułatwiają stosowanie jeszcze mniejszych ilości barwnika niż dotychczas. Kolejnym kluczowym celem artykułu jest zilustrowanie właściwości współobrazowania tych barwników z innymi fluoroforami, a przede wszystkim z GFP jako najczęściej stosowanym białkiem fluorescencyjnym w biologii. Powinno to pomóc w projektowaniu eksperymentów obrazowych, które mają na celu skorelowanie dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek fuzyjnych z dynamiką ściany komórkowej grzyba, błony komórkowej lub szlaku endo- i egzocytozy itp.
Obrazowanie w naturalnych i bezstresowych warunkach jest kluczem do uzyskania wiarygodnych danych. Niektóre praktyczne rozważania dotyczące pożywki hodowlanej i przygotowania próbki mają na celu zapewnienie punktu wyjścia do znalezienia optymalnych warunków, które umożliwią wolną od artefaktów, długotrwałą obserwację zdrowych, niezestresowanych komórek o najwyższym możliwym stosunku S/N dla danej próbki. Nie ma uniwersalnego sposobu na uzyskanie wiarygodnych i miarodajnych wyników obrazowania. Nieodłącznym elementem tego podejścia jest to, że biologiczna zmienność próbki, subiektywność i oczekiwania mikroskopisty, a także przetwarzanie obrazu po przetworzeniu mają znaczący wpływ odpowiednio na pozyskiwanie i interpretację danych. W związku z tym praktyczne doświadczenie mikroskopisty, jego/jej dogłębna wiedza na temat biologii komórki badanego grzyba, a także umiejętne przygotowanie próbki w celu stworzenia warunków jak najbardziej "naturalnych" i niezakłóconych w warunkach laboratoryjnych, mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania i oceny danych obrazowych, które wiernie odzwierciedlają badane zjawiska komórkowe. Z reguły występowaniu niepożądanych skutków ubocznych barwników fluorescencyjnych, począwszy od subtelnej, a zatem nie widocznej w oczywisty sposób aktywacji szlaków reakcji na stres błony komórkowej lub ściany komórkowej, aż po prostą cytotoksyczną indukcję autolizy komórek, można bezpiecznie zapobiec tylko poprzez zastosowanie niskich stężeń barwnika ≤2 μM.
Aplikacja barwników fluorescencyjnych jest prosta, jednak ich specyfika jest słabo scharakteryzowana. Kluczową zaletą stosowania barwników fluorescencyjnych jest przygotowawcza prostota protokołów eksperymentalnych. Uprawa i pobieranie próbek grzyba, dodawanie barwnika (barwników) i montaż na stoliku mikroskopowym są (przy wprawie) proste. Regulacja podstawowych ustawień obrazowania, w tym długości fal wzbudzenia i emisji, czasów naświetlania, ustawień przebiegu czasowego itp., odbywa się zgodnie z prostymi zasadami biofizyki mikroskopu i zasadami biologicznymi stosowanych barwników fluorescencyjnych wewnątrz komórek. Tabela 1 ma na celu ułatwienie identyfikacji najodpowiedniejszego barwnika lub kombinacji barwników do celów doświadczalnych. Co więcej, barwniki fluorescencyjne są przystępne cenowo, łatwo dostępne i zapewniają niezawodnie wysoką jakość, a tym samym zapewniają wysoce powtarzalną aplikację.
Dwa główne ograniczenia stosowania barwników fluorescencyjnych selektywnych dla błony lub ściany komórkowej to (często) ograniczona wiedza na temat ich precyzyjnych właściwości barwiących, które w większości przypadków są niespecyficzne na poziomie organelli i molekularnym, oraz ich zależne od stężenia niepożądane skutki uboczne. Barwniki FM są specyficzne dla dwuwarstw lipidowych uczestniczących w endo- i egzocytozie. Jednak dokładne znakowanie organelli subkomórkowych w badanych warunkach nie jest od razu oczywiste i wymaga porównania różnych wariantów barwnika FM oraz wspólnego znakowania z dodatkowymi markerami specyficznymi dla organelli. Jednym z przykładów jest preferencja FM 1-43 dla błon mitochondrialnych w porównaniu do FM 4-64. Barwniki selektywne w ścianie komórkowej wykazują różną specyficzność dla trzech głównych polimerów ściany komórkowej grzyba. Uważa się, że CFW jest niespecyficznym barwnikiem dla β-glukanów i chityny, SPF jest uważany za najbardziej selektywny dla β-1,4-glukanów, a CR jest uważany za wysoce selektywny dla α- i β-chityny. Informacje na temat swoistości wiązania PFS z polisacharydami ściany komórkowej grzybów nie są obecnie dostępne. W jakim stosunku polimer ściany komórkowej grzyba jest najskuteczniej znakowany przy danym stężeniu barwnika w badanych gatunkach grzybów, nie jest łatwo odpowiedzieć, a zastosowanie szczegółowych pomiarów uzyskanych in vitro lub in vivo na innych organizmach lub innych gatunkach grzybów musi być bardzo dokładnie przemyślane. Niestety, informacje te są skąpe i mocno rozproszone w literaturze 35,42,46. Nowsze zapisy, które byłyby zgodne z poprzednimi badaniami33, aby dostarczyć nowych informacji na temat precyzyjnych właściwości barwiących prezentowanych barwników, szczególnie w grzybach, nie są obecnie dostępne.
Kontrole obrazowania są niezbędne do dokładnej oceny wzorców barwienia i odpowiedzi komórkowych. Prawdopodobnie najtrudniejszą częścią jest jednak poznanie biologii komórki grzyba tak dobrze, że zarejestrowane zmiany w subkomórkowej lokalizacji selektywnych barwników fluorescencyjnych błony i ściany komórkowej, zmiany w architekturze komórkowej lub wzorzec wzrostu strzępek mogą być wyłącznie i pewnie powiązane z zamierzonymi efektami eksperymentalnego leczenia. W tym celu ważne jest, aby mieć dobre kontrole wraz z każdym nowym eksperymentem z obrazowaniem żywych komórek. Obejmują one nieleczony typ dziki jako negatywną kontrolę obrazowania w celu wykluczenia autofluorescencji tła i szumu detektora z uzyskanego obrazu oraz posiadania komparatora morfologicznego podczas pracy z mutantami. Ponadto pozytywna kontrola obrazowania, na przykład szczepu, który wykazuje ekspresję GFP lub RFP w cytoplazmie lub innym dobrze znanym białku markera fluorescencyjnego, jest niezbędna do ustawienia intensywności światła wzbudzającego na wymagane minimum i kontroli żywotności komórek. Po ustawieniu tych kontroli, stosowanie barwników fluorescencyjnych nie ogranicza się tylko do zadań wizualizacji, ale ich zależna od stężenia dynamika barwienia, a także skutki uboczne zależne od stężenia mogą być analitycznie wykorzystane; Na przykład do ilościowego monitorowania biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym lub do identyfikacji fenotypów specyficznych dla mutantów w testach wrażliwości47.
Ulepszone przyszłe zastosowania zależą od szczegółowych analiz funkcjonalnych właściwości barwienia barwnikiem. Głównym bieżącym wyzwaniem jest dalsze ulepszanie i automatyzacja ilościowych analiz obrazów w celu przyspieszenia funkcjonalnej oceny subkomórkowej dynamiki selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ściennych w grzybach strzępkowych. W tym celu najpierw wymagane są szeroko zakrojone, ilościowe badania kolokalizacyjne tych barwników ze znanymi markerami polimerowymi organelli i ścian komórkowych w połączeniu ze zmutowanymi szczepami z niedoborem określonych szlaków transportowych lub pozbawionymi określonych składników strukturalnych. Dostępnych jest kilka markerów endocytozy do analiz porównawczych z barwnikami FM48,49, a w odniesieniu do wciąż słabo scharakteryzowanej specyficzności wiązania barwników ściany komórkowej u grzybów, zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał specyficznych dla glukanu50 może stanowić jedną z możliwości rozwiązania tego problemu.

Dwadzieścia lat temu, sposób, w jaki morfogeneza strzępek i leżąca u jej podstaw molekularna biologia komórki mogły być wizualizowane u grzybów strzępkowych, został zrewolucjonizowany przez zastosowanie membranowego selektywnego barwnika fluorescencyjnego Fei Mao FM 4-641. Później zrealizowano korzyści płynące z barwnika wiążącego chitynę Calcofluor White jako istotnego markera fluorescencyjnego dynamiki ściany komórkowej grzyba2. Od tego czasu zarówno barwniki, jak i ich warianty stały się nieodłączną częścią analiz obrazowania żywych komórek dynamiki organelli u grzybów i nadal dostarczają bezprecedensowych informacji na temat stylu życia grzybów nitkowatych. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie uznanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo- i egzocytozy oraz morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych. Testy śledzenia endocytozy pozwalają na odniesienie się do różnych pytań biologicznych związanych z ogólnym badaniem endocytozy3. W tym celu lokalizacja, szybkość i następstwo barwionych komór po dodaniu barwnika FM są rejestrowane za pomocą mikroskopii poklatkowej i ilościowo porównywane między badanymi szczepami grzybów4. Barwniki ściany komórkowej wyznaczają zewnętrzną granicę komórki i umożliwiają śledzenie zdarzeń morfogenetycznych, w tym spolaryzowanego wzrostu końcówki strzępki2, rozgałęzianie strzępek5, fuzja strzępek6,7 i tworzenie przegrody8. Ponadto ułatwiają ilościowe określanie miejscowego odkładania się ściany komórkowej i identyfikację defektów podczas biogenezy ściany komórkowej9. Ponieważ szczegółowa wiedza na temat właściwości biochemicznych i biofizycznych każdego markera fluorescencyjnego jest podstawowym warunkiem wstępnym jego udanego zastosowania in vivo, cechy te zostały najpierw podsumowane dla sześciu barwników przedstawionych w tym artykule.
Barwniki selektywne membranowe 
Barwniki styrylowe FM (Fei Mao) to małe amfifilowe cząsteczki, które nie mogą przejść, ale odwracalnie łączą się z zewnętrzną ulotką dwuwarstwy lipidowej błon biologicznych10. Są praktycznie niefluorescencyjne w roztworze wodnym, ale stają się intensywnie fluorescencyjne po integracji z błoną plazmatyczną, generując doskonałe proporcje sygnału do szumu (S/N)11. Te właściwości sprawiają, że idealnie nadają się do wizualizacji dynamiki błony plazmatycznej i organelli wewnątrzkomórkowych, w tym śledzenia endo- i egzocytozy12. Zielono-fluorescencyjny FM 1-43 i czerwony-fluorescencyjny FM 4-64 to dwa najczęściej stosowane fluorescencyjne markery membranowe do tych celów. SynaptoGreen C4 i SynaptoRed C2 to generyczne cząsteczki od alternatywnych dostawców, które mogą być stosowane zamiennie zamiast odpowiednio FM 1-43 i FM 4-64.
Barwniki styrylowe składają się z trzech kluczowych obszarów strukturalnych: (1) lipofilowego ogona, który ułatwia wprowadzenie barwnika do dwuwarstwy lipidowej, (2) rdzenia fluoroforowego, który określa właściwości spektralne barwnika i składa się z dwóch pierścieni aromatycznych połączonych jednym do trzech podwójnych wiązań, oraz (3) dodatnio naładowanej hydrofilowej głowicy, która zapobiega całkowitemu wprowadzeniu i przenikaniu barwnika przez membranę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
Im dłuższy lipofilowy ogon, tym wyższa jest hydrofobowość barwnika, a tym samym powinowactwo wiązania z membraną, ale tym niższa jest jego rozpuszczalność w wodzie i szybkość odbarwiania membrany. W związku z tym różne warianty barwnika FM dają różną dynamikę i wzory barwienia. Wyższa hydrofobowość FM 1-43 z ogonem C4 zapewnia silniejszy i bardziej stabilny sygnał fluorescencyjny na błonach plazmatycznych i organellach wewnętrznych szybciej niż krótszy FM 4-64 z ogonem C2, gdy jest stosowany w stężeniach równomolowych (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).
Co ważne, stałe i wysokie wskaźniki asocjacji/dysocjacji obu <barwników FM class="xref">11 ze średnimi czasami retencji 1–6 s na pojedynczą cząsteczkę barwnika13 zmniejszają ryzyko miejscowego zakłócenia funkcji błony, na przykład poprzez modyfikację płynności błony lub wymuszoną stałą interakcję białek błonowych. Jest to prawdopodobnie główny powód, dla którego cząsteczki te mogą być używane jako niezbędne barwniki. Niemniej jednak stężenia barwnika FM powyżej 50 μM są toksyczne dla komórek grzybów i roślin2,14, a dowody z protoplastów tytoniu BY-2 wskazują, że więcej niż 20 μM barwnika FM prowadzi do nasycenia błony plazmatycznej14. Dlatego zaleca się, aby nie przekraczać tego limitu, zwłaszcza biorąc pod uwagę fakt, że doskonałe obrazowanie osiągnięto już przy 2–5 μM15,16.
Warto zauważyć, że właściwości spektralne barwników FM różnią się znacznie w zależności od konkretnego mikrośrodowiska membrany (reviewed14). Ogólnie rzecz biorąc, widma wzbudzenia i emisji barwników FM w czystych roztworach rozpuszczalników (zwykle podawane w informacjach o produkcie) różnią się znacznie od widm w środowiskach komórkowych i w większości przypadków nie można się bezpośrednio konsultować przy wyborze ustawień obrazowania żywych komórek. Na przykład maksima wzbudzenia/emisji FM 1-43 i FM 4-64 ulegają przesunięciu ku błękitowi odpowiednio o 37/46 nm i 43/64 nm po związaniu z błonami grzybowymi w porównaniu z ich roztworami w metanolu (tabela 1).
Przełomowe podstawy użycia FM 4-64 i FM 1-43 do śledzenia błony komórkowej, endo/egzocytozy i dynamiki organelli, w tym Spitzenkörpera i mitochondriów, zostały już kompleksowo udokumentowane dla szerokiej gamy nitkowatych gatunków grzybów2,4,17,18,19. Zalecane ustawienia obrazowania dla obu barwników FM, które działają w różnych gatunkach grzybów nitkowatych, przedstawiono na stronie Rysunek 1B. Ograniczenia techniczne dostępnego sprzętu lub szczególne warunki komórkowe i eksperymentalne, takie jak pożywka hodowlana, pH lub temperatura, mogą jednak wymagać pewnych dostosowań. Na szczęście barwniki FM działają w szerokim zakresie spektralnym, a bardzo dobre wyniki obrazowania osiąga ekscytujący FM 1-43 o długości fali 514 nm lub FM 4-64 o długości fali 488 nm. W związku z tym optymalne ustawienia obrazowania muszą być określane indywidualnie dla każdego typu próbki i zamierzonego zastosowania.
Znaczne przesunięcie Stoke'a o ponad 135 nm FM 4-64 pozwala na doskonałe, jednoczesne obrazowanie z fluoroforami emitującymi zielone światło; jest to często wykorzystywane do oceny wewnątrzkomórkowej dynamiki lokalizacji białek fuzyjnych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) względem błony plazmatycznej i szlaku endocytarnego9,20.
Barwniki selektywne dla ścian komórkowych 
Calcofluor White M2R (CFW), sprzedawany również jako Fluorescencyjny Rozjaśniacz 28, jest prawdopodobnie najbardziej znanym barwnikiem fluorescencyjnym używanym do barwienia ścian komórkowych bakterii, grzybów, glonów, roślin wyższych i owadów. Początkowo stosowany jako optyczny środek wybielający w przemyśle papierniczym, tekstylnym i detergentowym, jego korzyści dla klinicznej diagnostyki infekcji grzybiczych zostały wcześnie dostrzeżone21,22. Ponieważ CFW nieodwracalnie interkaluje się w powstający łańcuch chitynowy, zakłóca normalne składanie mikrofibryli chityny podczas biogenezy ściany komórkowej, generując w ten sposób stres w ścianie komórkowej23. To z kolei uruchamia mechanizm naprawy uszkodzeń ściany komórkowej, prowadzący do miejscowo zwiększonego odkładania się ściany komórkowej w wyniku aktywacji glukanu i syntazy chityny24,25. Zjawisko to może wystąpić w przypadku każdego barwnika, który działa poprzez stabilne wiązanie się z polimerami ściany komórkowej, jest zależny od stężenia i jest najbardziej zauważalny na końcach strzępek, które reprezentują najbardziej płodnie rosnące, a tym samym najbardziej wrażliwe części grzybni (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3). Niedawno udostępniono obszerne podsumowanie maszynerii molekularnej, która reaguje na uszkodzenia ściany komórkowej26.
Przedawkowanie barwnika w połączeniu z fototoksycznością może prowadzić do szybkiej lizy komórek w przedziałach strzępkowych (Film 1). Niemniej jednak, zwiększona wrażliwość na stężenia barwnika, które są "niezbędne" u typu dzikiego, może być wykorzystana do identyfikacji defektów w biosyntezie ściany komórkowej mutantów z utratą funkcji genów9. Dla CFW i czerwieni Kongo (CR), innego barwnika tekstylnego, znanego również jako czerwień bezpośrednia 28 i stosowanego jako barwnik ściany komórkowej specyficzny dla α i β-chityny dla grzybów i owadów27,28, stężenia progowe, które silnie indukują syntazy chityny, określono odpowiednio za pomocą > 60 μM CFW i > 70 μM CR, podczas gdy stężenia <15 μM żadnego barwnika nie zmieniały ani nie hamowały wzrostu grzybów29,30,31. Hickey i wsp. umieścili to stężenie progowe dla CFW na poziomie 25 μM2. Dlatego zaleca się stosowanie stężeń barwników ≤ 5 μM, aby wykluczyć artefakty związane ze stresem i zapewnić użycie tych cząsteczek jako naprawdę "niezbędnych barwników fluorescencyjnych"2,32. Dotyczy to w równym stopniu Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) i Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), synonimów odpowiednio Direct Yellow 86 i Direct Red 23, dwóch innych użytecznych barwników ściany komórkowej, których zastosowanie w przypadku grzybów zostało zgłoszone po raz pierwszy ponad dekadę temu33. Jednak pomimo ich niezwykłych właściwości spektralnych34,35, od tego czasu użycie obu barwników jest bardzo ograniczone36,37. Jak pokazano wcześniej dla 1,5 μM CFW2, 2 μM SPF są wystarczające do rozróżnienia dynamiki ściany komórkowej w warunkach natywnych z bardzo wysoką rozdzielczością czasową (Film 2). Te same wyniki można uzyskać przy użyciu 2 μM CR lub PFS.
Razem, te cztery barwniki, CFW, SPF, PFS i CR, tworzą zestaw selektywnych dla ściany komórkowej markerów fluorescencyjnych, które pokrywają prawie pełne spektrum światła widzialnego (400-700 nm) używane w nowoczesnych mikroskopach fluorescencyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Znaczny wzrost intensywności fluorescencji po związaniu się z polimerami ściany komórkowej jest nieodłączny dla wszystkich czterech i generuje doskonałe proporcje S/N. To z kolei pozwala na utrzymanie bardzo niskich stężeń barwnika i intensywności światła wzbudzającego oraz pozwala na barwienie ścian komórkowych jako technikę obrazowania żywych komórek w "niskiej dawce"2. Ponieważ te barwniki ściany komórkowej są nieprzepuszczalne dla błony plazmatycznej, jednocześnie działają jako żywe/martwe plamy. Warto zauważyć, że ze względu na ich niezwykle szerokie widma emisyjne światła, należy dokładnie rozważyć pewne ograniczenia dotyczące właściwości współobrazowania CFW i SPF z innymi fluoroforami.

<table><tbody><tr><td>Komora zliczania komórek</td><td>marki Merck</td><td>BR718005</td><td>format</td></tr><tr><td>Thoma Calcofluor White M2R</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td>barwnik ściany komórkowej</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td>cel zanurzenia w wodzie</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td>cel do zanurzenia w wodzie</td></tr><tr><td>Kongo Czerwony</td><td>Merck/ Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>barwnik ściany komórkowej</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>VWR</td><td>8,36,73,230</td><td>rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-E z jednostką skanującą C1</td><td>Niestandardowa konfiguracja</td><td>Nikon odwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny używany do pozyskiwania przykładowych danych 2 i 4</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U z jednostką skanującą Bio-Rad Radiance 2100</td><td>Niestandardowa konfiguracja</td><td></td> <td>Nikonodwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny służący do pozyskiwania przykładowych danych 5</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Barwnik membranowy</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>S6814</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Barwnik membranowy</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>S6689</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Rettberg</td><td>1340691030</td> 3 <td>mm Koraliki</td></tr><tr><td>szklane Nakrywki szklane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BB02400600A113MNT0</td><td>24 x 60 #1 szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td><td>Leica</td><td>15506353</td><td>Glycerol Obiektyw immersyjny</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta</td><td>Zeiss</td><td>niestandardowa konfiguracja</td><td>odwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny używany do pozyskiwania przykładowych danych 3</td></tr><tr><td>M9 Minimalny średni</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>generyczne podłoże do wzrostu grzybów</td></tr><tr><td>Micro-slide 8-dołkowy</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td>polimer ibiTreat #1.5 szkiełko nakrywkowe</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck/Millipore</td><td>475855-1R</td><td>poliestrowy materiał filtracyjny</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>8,21,472</td><td>92 x 16 mm naczynie hodowlane bez krzywek</td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td>przezroczysty środek żelujący</td></tr><tr><td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td>obiektyw</td></tr> <tr><td>zanurzeniowy w olejuPontamine Fast Scarlet 4B</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>212490</td><td>barwnik do ścian komórkowych</td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)</td><td>BD Difco</td><td>213400</td><td>pożywka do wzrostu grzybów T. atroviride</td></tr><tr><td>Bulion z dekstrozy ziemniaczanej (PDB)</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td>pożywka do wzrostu grzybów T. atroviride</td></tr><tr><td>Probówka reakcyjna</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td>1,5 ml probówka SafeSeal</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>B.Braun</td><td>5518016</td><td>Cutfix sterylny skalpel #23</td></tr><tr><td>Rurka z nakrętką</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,54,502</td><td>15 ml probówka polipropylenowa</td></tr><tr><td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td><td>CIBA</td><td>1485385V6</td> barwnik <td>do ścian komórkowych</td></tr><tr><td>SynaptoGreen C4</td><td>Biotum</td><td>70020</td> barwnik <td>membranowy</td></tr><tr><td>SynaptoRed C2</td><td>Biotum</td><td>70021</td> barwnik <td>membranowy</td></tr><tr><td>Filtr membranowy strzykawkowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>723-9945</td><td>0,45 &mikro; m Filtr strzykawkowy SFCA</td></tr><tr><td>TCS SP5 II</td><td></td><td>Niestandardowa konfiguracja</td><td>odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica służącego do pozyskiwania przykładowych danych 1</td></tr><tr><td>Pożywka Vogel's Minimal Medium (VMM)</td><td>FGSC</td><td>Fungal Genetics Stock Centre</td><td>dla N. crassa</td></tr></tbody></table>

zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych do analiz obrazowania żywych komórek dynamiki organelli w komórkach grzybów rozpoczęło się dwie dekady temu i od tego czasu nadal przyczynia się w znacznym stopniu do naszego zrozumienia stylu życia grzybów nitkowatych. Niniejszy artykuł zawiera praktyczny przewodnik dotyczący stosowania dwóch barwników membranowych FM 1-43 i FM 4-64 oraz czterech barwników ściany komórkowej: Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 i Congo Red. Nacisk kładziony jest na ich zastosowanie w niskich dawkach w celu zapewnienia barwienia wolnego od artefaktów, ich właściwości współobrazowania i oceny ilościowej. Przedstawione metody mają zastosowanie do wszystkich próbek grzybów nitkowatych, które można przygotować w opisany sposób. Podstawowe podejścia do barwienia mogą służyć jako punkty wyjścia do adaptacji do gatunków, które mogą wymagać różnych warunków uprawy. Po pierwsze, dokonuje się przeglądu właściwości biofizycznych i biochemicznych, ponieważ ich zrozumienie jest niezbędne do stosowania tych barwników jako naprawdę ważnych barwników fluorescencyjnych. Po drugie, przedstawiono protokoły krok po kroku, które szczegółowo opisują przygotowanie różnych typów próbek grzybów do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. Wreszcie, przykładowe eksperymenty ilustrują różne podejścia do: (1) identyfikacji defektów w czasoprzestrzennej organizacji endocytozy w mutantach genetycznych, (2) porównawczego scharakteryzowania wspólnej i odrębnej kolokalizacji białek docelowych znakowanych GFP w szlaku endocytarnym, (3) identyfikacji morfogenetycznych defektów ściany komórkowej w mutancie genetycznej oraz (4) monitorowania biogenezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym.

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Barwniki fluorescencyjne selektywne dla błon i ścian komórkowych są ważnymi narzędziami do analizy dynamiki organelli i żywych komórek grzybów. Nasze protokoły zawierają niezbędne podstawy teoretyczne i praktyczne wskazówki dotyczące stosowania wybranych barwników jako naprawdę niezbędnych barwników. Kluczową kwestią w tym celu jest stosowanie bardzo niskich stężeń barwników, które nie powodują artefaktów komórkowych związanych z nasyceniem lub toksycznością barwnika, a jednocześnie zapewniają dobry stosunek sygnału do szumu dla wysokiej jakości, długoterminowego obrazowania żywych komórek.Wraz z kolegami z Zakładu Medycyny Nuklearnej Uniwersytetu Medycznego wykorzystaliśmy ostatnio te techniki barwienia do opracowania nowatorskiego podejścia do diagnostyki aapergilozy pod kontrolą obrazu. Możliwość monitorowania struktur błony i ściany komórkowej w czasie rzeczywistym miała kluczowe znaczenie dla określenia dynamiki wchłaniania eksperymentalnego związku leczniczego. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw uzyskaj przygotowaną kulturę wstępną.Użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć mały blok agaru, który przenosi grzybnię niezarodnikującą z krawędzi kolonii prekultury. Umieść blok agaru na środku świeżej, stałej płytki pożywki, aby zaszczepić eksperymentalną kulturę. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie ze stadium rozwojowym, które ma być inkubowane.Przygotowanie próbki jest dość delikatne, a optymalizacja ustawień akwizycji obrazu jest dość złożona. Wizualna demonstracja obu procedur wraz z ustnym wyjaśnieniem znacznie ułatwia ich powtórzenie. Aby zamontować próbki, przygotuj czyste szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 60 milimetrów i dodaj 18 mikrolitrów płynnego roztworu soli o minimalnej ilości lub fizjologicznej soli na środek.Dodać dwa mikrolitry przygotowanego 20 mikromolowego roztworu roboczego barwnika do cieczy w środku szkiełka nakrywkowego i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół, unikając wytwarzania pęcherzyków powietrza. Za pomocą czystego skalpela wytnij próbkę o wymiarach 15 na 15 milimetrów z obrzeży kolonii i umieść ją pionowo obok kropli pożywki na szkiełku nakrywkowym. Użyj skalpela, aby podeprzeć górną krawędź bloku i palca, aby przytrzymać tylną stronę bloku na miejscu.Następnie powoli opuść stronę, w której znajduje się grzybnia, na płyn. Zamontuj przygotowaną próbkę na stoliku mikroskopu. Najpierw dostosuj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu, aby uchwycić dynamikę stania w poszczególnych strzępkach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W przypadku testów wychwytu endocytozy należy zapoznać się z rysunkiem pierwszym i tabelą pierwszą protokołu tekstowego, aby określić najlepsze ustawienia wzbudzenia i emisji dla FM 143 lub FM 464, które są dostępne w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować te ustawienia w systemie. Rozpocznij nagrywanie obrazu przy użyciu wcześniej dostosowanych ustawień i oceń wyniki. Następnie zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu dynamiki błony plazmatycznej lub endocytozy, na którym koncentruje się eksperyment.W przypadku dynamiki ściany komórkowej należy zapoznać się z rysunkiem czwartym i tabelą pierwszą protokołu tekstowego, aby określić najlepsze ustawienia wzbudzenia i emisji dla zastosowanego barwnika ściany komórkowej i odpowiednio dostosować ustawienia w systemie mikroskopowym. Rozpocznij nagrywanie obrazu przy użyciu wcześniej dostosowanych ustawień i oceń wyniki. Następnie zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu morfogenezy ściany komórkowej, na którym koncentruje się eksperyment.Oprócz samej wizualizacji procesów komórkowych, obrazowanie żywych komórek umożliwia ekstrakcję informacji ilościowych z zarejestrowanych danych. W przykładzie testów absorpcji FM 464 próbki grzybów są hodowane jako kolonie i montowane metodą odwróconego bloku agarowego. Testy zidentyfikowały defekty w czasoprzestrzennej organizacji endocytozy w delecji genu i mutantach nadekspresji genów specyficznego dla grzybów białka SFP 2 trichoderma atroviride.Przykłady współbarwienia FM 464 fluorescencyjnych białek fuzyjnych ukierunkowanych na przedziały endocytarne przedstawiono tutaj. To współbarwienie stosuje się do powiązania subkomórkowej dystrybucji dwóch wzmocnionych białek transbłonowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym, SFP 2 i GPR 1, ze szlakiem endocytarnym w atrowirydzie trichodermy. Przykład współbarwienia FM 464 w celu identyfikacji różnic morfogenetycznych pokazuje, że to współbarwienie pozwala na dalsze powiązanie dynamiki lokalizacji subkomórkowej znakowanego fluorescencyjnie białka kompleksu polaryzmu BUD-6 z końcem niektórych procesów zależnych od transportu, takich jak tworzenie przegród i wzrost spolaryzowanych końcówek strzępek.Charakteryzuje również różnice w organizacji subkomórkowej i architekturze strzępek między dzikimi i zmutowanymi szczepami Neurospora crassa. Reprezentatywne barwienie ścian komórkowych pokazuje, że różne właściwości interakcji bieli kalkofluorowej, soofenylu flavine i czerwieni kongo z polimerami ściany komórkowej podkreślają różnice morfogenetyczne między mutantem delta SFP 2 a szczepem trichoderma atroviride typu dzikiego. Zwiększenie stresu ściany komórkowej wywołanego podwyższonym stężeniem barwnika zachodzi szybciej i jest bardziej wyraźne u mutanta w porównaniu z typem dzikim.Ponadto te same obrazy pozwalają na ilościowe określenie różnic morfogenetycznych dotyczących średnicy strzępek i odległości przegrody między oboma szczepami. Reprezentatywne monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym wskazuje, że bardzo niskie stężenie bieli kalkofluoru zapobiega nasyceniu ściany komórkowej cząsteczkami barwnika i umożliwia ilościowe monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. Ujawnia to, że osadzanie się nowego materiału ściany komórkowej nie jest jednorodne, ale bardzo szybko reaguje na zlokalizowane naprężenia fizyczne wynikające ze względnego przemieszczenia jednej komórki po przyczepieniu się komórki do komórki przed dermalinfuzją w Neurospora crassa.Mniej znaczy więcej. Użyj jak najmniejszej ilości barwnika, aby wykluczyć interferencję markera fluorescencyjnego z procesami komórkowymi. Po tej procedurze można przeprowadzić odzyskiwanie fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem w celu ilościowego określenia kinetyki transportu i biogenezy.Pionierskie wprowadzenie barwienia błon i ścian komórkowych u grzybów strzępkowych na początku tysiąclecia dosłownie zrewolucjonizowało sposób, w jaki patrzymy na grzyby. Calcofluor white może powodować podrażnienia oczu i jest klasyfikowany jako rakotwórczy. Czerwień kongijska jest rakotwórcza i teratogenna, dlatego podczas pracy z tymi barwnikami należy nosić ochronę oczu i skóry.

application-membrane-cell-wall-selective-fluorescent-dyes-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Defensyny roślinne odgrywają ważną rolę w obronie roślin przed patogenami. Aby skutecznie wykorzystać te peptydy przeciwgrzybicze jako środki przeciwgrzybicze, zrozumienie ich sposobów działania (MOA) ma kluczowe znaczenie. W tym miejscu opisano metodę obrazowania żywych komórek w celu zbadania krytycznych aspektów MOA tych peptydów.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Poznaj techniki barwienia fluorescencyjnego do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych, w tym Trichoderma atroviride i Neurospora crassa. Metoda umożliwia śledzenie dynamiki błon i biosyntezy ścian komórkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Przeglądaj więcej filmów