Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych
28 listopada 2019
Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.
Barwniki fluorescencyjne selektywne dla błon i ścian komórkowych są ważnymi narzędziami do analizy dynamiki organelli i żywych komórek grzybów. Nasze protokoły zawierają niezbędne podstawy teoretyczne i praktyczne wskazówki dotyczące stosowania wybranych barwników jako naprawdę niezbędnych barwników. Kluczową kwestią w tym celu jest stosowanie bardzo niskich stężeń barwników, które nie powodują artefaktów komórkowych związanych z nasyceniem lub toksycznością barwnika, a jednocześnie zapewniają dobry stosunek sygnału do szumu dla wysokiej jakości, długoterminowego obrazowania żywych komórek.
Wraz z kolegami z Zakładu Medycyny Nuklearnej Uniwersytetu Medycznego wykorzystaliśmy ostatnio te techniki barwienia do opracowania nowatorskiego podejścia do diagnostyki aapergilozy pod kontrolą obrazu. Możliwość monitorowania struktur błony i ściany komórkowej w czasie rzeczywistym miała kluczowe znaczenie dla określenia dynamiki wchłaniania eksperymentalnego związku leczniczego. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw uzyskaj przygotowaną kulturę wstępną.
Użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć mały blok agaru, który przenosi grzybnię niezarodnikującą z krawędzi kolonii prekultury. Umieść blok agaru na środku świeżej, stałej płytki pożywki, aby zaszczepić eksperymentalną kulturę. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie ze stadium rozwojowym, które ma być inkubowane.
Przygotowanie próbki jest dość delikatne, a optymalizacja ustawień akwizycji obrazu jest dość złożona. Wizualna demonstracja obu procedur wraz z ustnym wyjaśnieniem znacznie ułatwia ich powtórzenie. Aby zamontować próbki, przygotuj czyste szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 60 milimetrów i dodaj 18 mikrolitrów płynnego roztworu soli o minimalnej ilości lub fizjologicznej soli na środek.
Dodać dwa mikrolitry przygotowanego 20 mikromolowego roztworu roboczego barwnika do cieczy w środku szkiełka nakrywkowego i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół, unikając wytwarzania pęcherzyków powietrza. Za pomocą czystego skalpela wytnij próbkę o wymiarach 15 na 15 milimetrów z obrzeży kolonii i umieść ją pionowo obok kropli pożywki na szkiełku nakrywkowym. Użyj skalpela, aby podeprzeć górną krawędź bloku i palca, aby przytrzymać tylną stronę bloku na miejscu.
Następnie powoli opuść stronę, w której znajduje się grzybnia, na płyn. Zamontuj przygotowaną próbkę na stoliku mikroskopu. Najpierw dostosuj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu, aby uchwycić dynamikę stania w poszczególnych strzępkach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W przypadku testów wychwytu endocytozy należy zapoznać się z rysunkiem pierwszym i tabelą pierwszą protokołu tekstowego, aby określić najlepsze ustawienia wzbudzenia i emisji dla FM 143 lub FM 464, które są dostępne w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować te ustawienia w systemie. Rozpocznij nagrywanie obrazu przy użyciu wcześniej dostosowanych ustawień i oceń wyniki. Następnie zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu dynamiki błony plazmatycznej lub endocytozy, na którym koncentruje się eksperyment.
W przypadku dynamiki ściany komórkowej należy zapoznać się z rysunkiem czwartym i tabelą pierwszą protokołu tekstowego, aby określić najlepsze ustawienia wzbudzenia i emisji dla zastosowanego barwnika ściany komórkowej i odpowiednio dostosować ustawienia w systemie mikroskopowym. Rozpocznij nagrywanie obrazu przy użyciu wcześniej dostosowanych ustawień i oceń wyniki. Następnie zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu morfogenezy ściany komórkowej, na którym koncentruje się eksperyment.
Oprócz samej wizualizacji procesów komórkowych, obrazowanie żywych komórek umożliwia ekstrakcję informacji ilościowych z zarejestrowanych danych. W przykładzie testów absorpcji FM 464 próbki grzybów są hodowane jako kolonie i montowane metodą odwróconego bloku agarowego. Testy zidentyfikowały defekty w czasoprzestrzennej organizacji endocytozy w delecji genu i mutantach nadekspresji genów specyficznego dla grzybów białka SFP 2 trichoderma atroviride.
Przykłady współbarwienia FM 464 fluorescencyjnych białek fuzyjnych ukierunkowanych na przedziały endocytarne przedstawiono tutaj. To współbarwienie stosuje się do powiązania subkomórkowej dystrybucji dwóch wzmocnionych białek transbłonowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym, SFP 2 i GPR 1, ze szlakiem endocytarnym w atrowirydzie trichodermy. Przykład współbarwienia FM 464 w celu identyfikacji różnic morfogenetycznych pokazuje, że to współbarwienie pozwala na dalsze powiązanie dynamiki lokalizacji subkomórkowej znakowanego fluorescencyjnie białka kompleksu polaryzmu BUD-6 z końcem niektórych procesów zależnych od transportu, takich jak tworzenie przegród i wzrost spolaryzowanych końcówek strzępek.
Charakteryzuje również różnice w organizacji subkomórkowej i architekturze strzępek między dzikimi i zmutowanymi szczepami Neurospora crassa. Reprezentatywne barwienie ścian komórkowych pokazuje, że różne właściwości interakcji bieli kalkofluorowej, soofenylu flavine i czerwieni kongo z polimerami ściany komórkowej podkreślają różnice morfogenetyczne między mutantem delta SFP 2 a szczepem trichoderma atroviride typu dzikiego. Zwiększenie stresu ściany komórkowej wywołanego podwyższonym stężeniem barwnika zachodzi szybciej i jest bardziej wyraźne u mutanta w porównaniu z typem dzikim.
Ponadto te same obrazy pozwalają na ilościowe określenie różnic morfogenetycznych dotyczących średnicy strzępek i odległości przegrody między oboma szczepami. Reprezentatywne monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym wskazuje, że bardzo niskie stężenie bieli kalkofluoru zapobiega nasyceniu ściany komórkowej cząsteczkami barwnika i umożliwia ilościowe monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. Ujawnia to, że osadzanie się nowego materiału ściany komórkowej nie jest jednorodne, ale bardzo szybko reaguje na zlokalizowane naprężenia fizyczne wynikające ze względnego przemieszczenia jednej komórki po przyczepieniu się komórki do komórki przed dermalinfuzją w Neurospora crassa.
Mniej znaczy więcej. Użyj jak najmniejszej ilości barwnika, aby wykluczyć interferencję markera fluorescencyjnego z procesami komórkowymi. Po tej procedurze można przeprowadzić odzyskiwanie fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem w celu ilościowego określenia kinetyki transportu i biogenezy.
Pionierskie wprowadzenie barwienia błon i ścian komórkowych u grzybów strzępkowych na początku tysiąclecia dosłownie zrewolucjonizowało sposób, w jaki patrzymy na grzyby. Calcofluor white może powodować podrażnienia oczu i jest klasyfikowany jako rakotwórczy. Czerwień kongijska jest rakotwórcza i teratogenna, dlatego podczas pracy z tymi barwnikami należy nosić ochronę oczu i skóry.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wykorzystanie barwników fluorescencyjnych w obrazowaniu żywych komórek w celu śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endocytozy/egzocytozy oraz morfogenezy ściany komórkowej w grzybach nitkowatych. Przedstawia ono praktyczne wytyczne dotyczące stosowania różnych barwników bez wywoływania artefaktów komórkowych, co umożliwia dokładną obserwację procesów komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Obrazowanie żywych komórek
- Biologia komórki grzybów
- Dynamika błony i ściany komórkowej
Wstęp
- Znaczenie żywych barwników fluorescencyjnych w badaniu procesów komórkowych
- Konieczność stosowania niskich stężeń barwników w celu uniknięcia artefaktów komórkowych
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamicznych zachowań komórek
Zastosowane metody
- Techniki barwienia fluorescencyjnego
- Grzyby nitkowate, takie jak Trichoderma atroviride i Neurospora crassa
- Protokoły pozyskiwania i analizy obrazów
Główne wyniki
- Skuteczne śledzenie dynamiki błon i endocytozy
- Identyfikacja różnic morfogenetycznych za pomocą współbarwienia fluorescencyjnego
- Ilościowe monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w odpowiedzi na stres
Wnioski
- Badanie demonstruje skuteczne techniki obrazowania żywych komórek grzybów.
- Wyniki dostarczają cennych informacji na temat organizacji i dynamiki komórkowej w biologii grzybów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie żywych komórek grzybów nitkowatych z użyciem selektywnych barwników fluorescencyjnych umożliwia mechanistyczną weryfikację walidacji celu poprzez rozstrzygnięcie dynamiki czasoprzestrzennej endocytozy i biogenezy ściany komórkowej. Obrazowanie ilościowe zwiększa pewność predykcyjną w screeningu fenotypowym i opracowywaniu testów służących do identyfikacji celów przeciwgrzybiczych. Podejście to zapewnia system istotny z punktu widzenia choroby do oceny wpływu związków na morfologię grzybów i szlaki transportu wewnątrzkomórkowego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie mutantów genetycznych z defektami czasowo-przestrzennej organizacji endocytozy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez kolokalizację białek znakowanych GFP z przedziałami endocytycznymi.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację morfogenetycznych defektów ściany komórkowej u mutantów za pomocą różnicowej interakcji barwników z polimerami ściany komórkowej.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy grzybowe do dalszych badań przesiewowych poprzez opracowanie protokołów barwienia wolnych od artefaktów przy niskich stężeniach barwników.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki zoptymalizowanym ustawieniom wzbudzenia/emisji dla barwników FM oraz barwników ścian komórkowych.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w odniesieniu do różnych gatunków grzybów nitkowatych dzięki adaptacyjnym warunkom hodowli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na lokalne stresy fizyczne, co dostarcza danych do badań nad mechanizmem działania.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obrazowanie odkrywcze z walidacją przedkliniczną poprzez kwantyfikację średnicy strzępek i odległości między przegrodami jako biomarkerów morfodynamicznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go poprzez ujawnienie różnic w dynamice odkładania składników ściany komórkowej między szczepami typu dzikiego a mutantami w warunkach stresu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po przedkliniczne profilowanie morfodynamiczne w modelach grzybów nitkowatych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez identyfikację defektów endocytozy u mutantów genetycznych za pomocą testów pobierania barwnika FM.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzacji przygotowania próbek z wykorzystaniem montażu w odwróconym bloku agarowym oraz niskostężonych roztworów roboczych barwnika.
- Analityka: Umożliwia ilościowe wyznaczanie kinetyki transportu i biogenezy za pomocą protokołów kompatybilnych z metodą FRAP (fluorescence recovery after photo-bleaching).
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym biogenezy ściany komórkowej oraz jej reakcji na stresy związane z przyleganiem komórka-komórka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania obrazowania w badaniach podłużnych nad organizacją komórkową grzybów w wielu szczepach i gatunkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu poprzez rozstrzygnięcie dynamiki subkomórkowej procesów błonowych i ścian komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność dzięki protokołom z niskim stężeniem barwnika, które zapobiegają nasyceniu i toksyczności, zachowując jednocześnie stosunek sygnału do szumu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez dostarczenie ilościowych odczytów morfodynamicznych, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach programów przeciwgrzybiczych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki porównawczej charakterystyce wspólnej i odrębnej lokalizacji białek w szlakach endocytycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w utrzymywaniu kultur grzybów, technikach sterylnych oraz mikroskopii żywych komórek.
- Niezbędny jest mikroskop fluorescencyjny z konfigurowalnymi ustawieniami wzbudzenia/emisji oraz kontrolą środowiskową do obrazowania długoterminowego.
- Wymagana jest standaryzacja roboczych stężeń barwników i procedur montażu próbek między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Konieczna jest adaptacja warunków inkubacji i przygotowania próbek dla specyficznych gatunkowych modeli grzybów nitkowatych.
- Ograniczeniem jest fotobleaching przy wysokich częstotliwościach akwizycji oraz potencjalny stres wywołany barwnikiem przy stężeniach suprawitalnych.
