Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych
November 28th, 2019
Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.
Barwniki fluorescencyjne selektywne dla błon i ścian komórkowych są ważnymi narzędziami do analizy dynamiki organelli i żywych komórek grzybów. Nasze protokoły zawierają niezbędne podstawy teoretyczne i praktyczne wskazówki dotyczące stosowania wybranych barwników jako naprawdę niezbędnych barwników. Kluczową kwestią w tym celu jest stosowanie bardzo niskich stężeń barwników, które nie powodują artefaktów komórkowych związanych z nasyceniem lub toksycznością barwnika, a jednocześnie zapewniają dobry stosunek sygnału do szumu dla wysokiej jakości, długoterminowego obrazowania żywych komórek.
Wraz z kolegami z Zakładu Medycyny Nuklearnej Uniwersytetu Medycznego wykorzystaliśmy ostatnio te techniki barwienia do opracowania nowatorskiego podejścia do diagnostyki aapergilozy pod kontrolą obrazu. Możliwość monitorowania struktur błony i ściany komórkowej w czasie rzeczywistym miała kluczowe znaczenie dla określenia dynamiki wchłaniania eksperymentalnego związku leczniczego. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw uzyskaj przygotowaną kulturę wstępną.
Użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć mały blok agaru, który przenosi grzybnię niezarodnikującą z krawędzi kolonii prekultury. Umieść blok agaru na środku świeżej, stałej płytki pożywki, aby zaszczepić eksperymentalną kulturę. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie ze stadium rozwojowym, które ma być inkubowane.
Przygotowanie próbki jest dość delikatne, a optymalizacja ustawień akwizycji obrazu jest dość złożona. Wizualna demonstracja obu procedur wraz z ustnym wyjaśnieniem znacznie ułatwia ich powtórzenie. Aby zamontować próbki, przygotuj czyste szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 60 milimetrów i dodaj 18 mikrolitrów płynnego roztworu soli o minimalnej ilości lub fizjologicznej soli na środek.
Dodać dwa mikrolitry przygotowanego 20 mikromolowego roztworu roboczego barwnika do cieczy w środku szkiełka nakrywkowego i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół, unikając wytwarzania pęcherzyków powietrza. Za pomocą czystego skalpela wytnij próbkę o wymiarach 15 na 15 milimetrów z obrzeży kolonii i umieść ją pionowo obok kropli pożywki na szkiełku nakrywkowym. Użyj skalpela, aby podeprzeć górną krawędź bloku i palca, aby przytrzymać tylną stronę bloku na miejscu.
Następnie powoli opuść stronę, w której znajduje się grzybnia, na płyn. Zamontuj przygotowaną próbkę na stoliku mikroskopu. Najpierw dostosuj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu, aby uchwycić dynamikę stania w poszczególnych strzępkach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W przypadku testów wychwytu endocytozy należy zapoznać się z rysunkiem pierwszym i tabelą pierwszą protokołu tekstowego, aby określić najlepsze ustawienia wzbudzenia i emisji dla FM 143 lub FM 464, które są dostępne w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować te ustawienia w systemie. Rozpocznij nagrywanie obrazu przy użyciu wcześniej dostosowanych ustawień i oceń wyniki. Następnie zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu dynamiki błony plazmatycznej lub endocytozy, na którym koncentruje się eksperyment.
W przypadku dynamiki ściany komórkowej należy zapoznać się z rysunkiem czwartym i tabelą pierwszą protokołu tekstowego, aby określić najlepsze ustawienia wzbudzenia i emisji dla zastosowanego barwnika ściany komórkowej i odpowiednio dostosować ustawienia w systemie mikroskopowym. Rozpocznij nagrywanie obrazu przy użyciu wcześniej dostosowanych ustawień i oceń wyniki. Następnie zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu morfogenezy ściany komórkowej, na którym koncentruje się eksperyment.
Oprócz samej wizualizacji procesów komórkowych, obrazowanie żywych komórek umożliwia ekstrakcję informacji ilościowych z zarejestrowanych danych. W przykładzie testów absorpcji FM 464 próbki grzybów są hodowane jako kolonie i montowane metodą odwróconego bloku agarowego. Testy zidentyfikowały defekty w czasoprzestrzennej organizacji endocytozy w delecji genu i mutantach nadekspresji genów specyficznego dla grzybów białka SFP 2 trichoderma atroviride.
Przykłady współbarwienia FM 464 fluorescencyjnych białek fuzyjnych ukierunkowanych na przedziały endocytarne przedstawiono tutaj. To współbarwienie stosuje się do powiązania subkomórkowej dystrybucji dwóch wzmocnionych białek transbłonowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym, SFP 2 i GPR 1, ze szlakiem endocytarnym w atrowirydzie trichodermy. Przykład współbarwienia FM 464 w celu identyfikacji różnic morfogenetycznych pokazuje, że to współbarwienie pozwala na dalsze powiązanie dynamiki lokalizacji subkomórkowej znakowanego fluorescencyjnie białka kompleksu polaryzmu BUD-6 z końcem niektórych procesów zależnych od transportu, takich jak tworzenie przegród i wzrost spolaryzowanych końcówek strzępek.
Charakteryzuje również różnice w organizacji subkomórkowej i architekturze strzępek między dzikimi i zmutowanymi szczepami Neurospora crassa. Reprezentatywne barwienie ścian komórkowych pokazuje, że różne właściwości interakcji bieli kalkofluorowej, soofenylu flavine i czerwieni kongo z polimerami ściany komórkowej podkreślają różnice morfogenetyczne między mutantem delta SFP 2 a szczepem trichoderma atroviride typu dzikiego. Zwiększenie stresu ściany komórkowej wywołanego podwyższonym stężeniem barwnika zachodzi szybciej i jest bardziej wyraźne u mutanta w porównaniu z typem dzikim.
Ponadto te same obrazy pozwalają na ilościowe określenie różnic morfogenetycznych dotyczących średnicy strzępek i odległości przegrody między oboma szczepami. Reprezentatywne monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym wskazuje, że bardzo niskie stężenie bieli kalkofluoru zapobiega nasyceniu ściany komórkowej cząsteczkami barwnika i umożliwia ilościowe monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. Ujawnia to, że osadzanie się nowego materiału ściany komórkowej nie jest jednorodne, ale bardzo szybko reaguje na zlokalizowane naprężenia fizyczne wynikające ze względnego przemieszczenia jednej komórki po przyczepieniu się komórki do komórki przed dermalinfuzją w Neurospora crassa.
Mniej znaczy więcej. Użyj jak najmniejszej ilości barwnika, aby wykluczyć interferencję markera fluorescencyjnego z procesami komórkowymi. Po tej procedurze można przeprowadzić odzyskiwanie fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem w celu ilościowego określenia kinetyki transportu i biogenezy.
Pionierskie wprowadzenie barwienia błon i ścian komórkowych u grzybów strzępkowych na początku tysiąclecia dosłownie zrewolucjonizowało sposób, w jaki patrzymy na grzyby. Calcofluor white może powodować podrażnienia oczu i jest klasyfikowany jako rakotwórczy. Czerwień kongijska jest rakotwórcza i teratogenna, dlatego podczas pracy z tymi barwnikami należy nosić ochronę oczu i skóry.
Przegląd
To badanie bada zastosowanie barwników fluorescencyjnych do obrazowania żywych komórek w celu śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy oraz morfogenezy ściany komórkowej u grzybów nitkowatych. Przedstawia praktyczne wytyczne dotyczące stosowania różnych barwników bez indukowania artefaktów komórkowych, umożliwiając dokładne obserwowanie procesów komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Obrazowanie żywych komórek
- Biologia komórek grzybów
- Dynamika błony i ściany komórkowej
Tło
- Znaczenie witalnych barwników fluorescencyjnych w badaniu procesów komórkowych
- Potrzeba niskich stężeń barwników, aby zapobiec artefaktom komórkowym
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamicznych zachowań komórkowych
Stosowane metody
- Techniki barwienia fluorescencyjnego
- Grzyby nitkowate takie jak Trichoderma atroviride i Neurospora crassa
- Protokoły pozyskiwania i analizy obrazów
Główne wyniki
- Skuteczne śledzenie dynamiki błony i endocytozy
- Identyfikacja różnic morfogenetycznych poprzez współbarwienie fluorescencyjne
- Ilościowe monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w odpowiedzi na stres
Wnioski
- Badanie wykazuje skuteczne techniki obrazowania żywych komórek u grzybów.
- Wyniki wnoszą cenne informacje dotyczące organizacji i dynamiki komórek w biologii grzybów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging of filamentous fungi using selective fluorescent dyes enables mechanistic de-risking of target validation by resolving spatiotemporal dynamics of endocytosis and cell wall biogenesis. Quantitative imaging supports predictive confidence in phenotypic screening and assay development for antifungal target identification. The approach provides a disease-relevant system for evaluating compound effects on fungal morphology and trafficking pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genetic mutants to defects in endocytic spatio-temporal organization.
- Operational Value: Enables functional target validation through co-localization of GFP-labeled proteins with endocytic compartments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying morphogenetic cell wall defects in mutants via differential dye interaction with cell wall polymers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated fungal systems for downstream screening by establishing artifact-free staining protocols at low dye concentrations.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through optimized excitation/emission settings for FM dyes and cell wall stains.
- Scalability: Facilitates platform reuse across filamentous fungal species with adaptable cultivation conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time monitoring of cell wall biosynthesis in response to localized physical stresses, informing mechanism of action studies.
- Translational Continuity: Connects discovery imaging to preclinical validation by quantifying hyphal diameter and septal distance as morphodynamic biomarkers.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing differential cell wall deposition dynamics between wild-type and mutant strains under stress.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical morphodynamic profiling in filamentous fungal models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying endocytosis defects in genetic mutants via FM dye uptake assays.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized sample preparation using inverted agar block mounting and low-dose dye working solutions.
- Analytics: Enables quantitative extraction of transport and biogenesis kinetics via fluorescence recovery after photo-bleaching (FRAP) compatible protocols.
- Translational Research: Connects to preclinical work by monitoring real-time cell wall biogenesis and its response to cell-to-cell attachment stresses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for longitudinal studies of fungal cellular organization across multiple strains and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by resolving subcellular dynamics of membrane and cell wall processes.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through low-dye protocols that prevent saturation and toxicity while maintaining signal-to-noise ratio.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative morphodynamic readouts that reduce late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through comparative characterization of shared and distinct protein localization in endocytic pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fungal culture maintenance, sterile technique, and live-cell microscopy.
- Needs fluorescence microscopy with configurable excitation/emission settings and environmental control for long-term imaging.
- Demands cross-team standardization of dye working concentrations and mounting procedures to ensure reproducibility.
- Requires adaptation of incubation conditions and sample preparation for species-specific filamentous fungal models.
- Limited by photobleaching at high acquisition frequencies and potential dye-induced stress at supra-vital concentrations.
