Name: Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Poznaj ilościową hybrydyzację fluorescencyjną in situ (FISH) i immunofluorescencję do wizualizacji RNA herpeswirusów w ludzkich komórkach. Ta metoda umożliwia badanie interakcji między wirusem a gospodarzem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jonathanowi Rodenfelsowi, Kazimierzowi Tycowskiemu i Johannie B. Withers za porady dotyczące analizy danych. Dziękujemy również G. Haywardowi za przeciwciało anty-SSB. Prace te były wspierane przez granty T32GM007223 i T32AI055403 z National Institutes of Health (dla TKV) oraz grant NIH (CA16038) (dla JAS). JAS jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. Rysunki 1-3 i Tabela 1 zostały powielone za zgodą Amerykańskiego Towarzystwa Mikrobiologii na licencji Creative Commons Attribution z następującej publikacji: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Accumulation in Nuclear Foci Is Influence by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenyled Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

<ol><li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions%3A+Comparisons+to+Coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81(2011).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li>
<li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microRNA+transcript+retention+at+sites+of+transcription+leads+to+enhanced+microRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production.</a> Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).</li>
<li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly%28A%29+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300(2011).</li>
<li>Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li>
<li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin%3A+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li>
<li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li>
<li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin%2C+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li>
<li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li>
<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
<li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+in+Kaposi%27s+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li>
<li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+structure+and+expression+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56%2C+ORF57%2C+ORF58%2C+and+ORF59%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li>
<li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li>
<li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li>
<li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li>
<li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li>
<li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół opisany w tym raporcie może być dostosowany do różnych typów komórek i obejmuje etapy dla podwójnego RNA FISH i RNA FISH z IF przy użyciu zarówno monoklonalnych, jak i poliklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych. Chociaż przygotowane preparaty są zwykle obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego, obrazowanie można wykonać za pomocą mikroskopu STED (stimulated emission depletion) po modyfikacji zwiększonego stężenia przeciwciał i innego podłoża montażowego. W celu lepszej analizy pojedynczych komórek, próbki p...

W swojej litycznej (aktywnej) fazie, herpeswirusy przejmują kontrolę nad komórką gospodarza, powodując zmiany w morfologii komórki i lokalizacji cząsteczek biologicznych, aby wytworzyć wiriony. Podstawą operacji jest jądro, w którym dwuniciowy genom wirusa DNA jest replikowany i pakowany w otoczkę białkową, zwaną capsid1. Po pierwsze, wirus wykazuje ekspresję własnych białek, przejmując kontrolę nad maszynerią gospodarza i zapobiegając ekspresji nieistotnych genów gospodarza, proces ten określa się mianem efektu wyłączenia gospodarza. Większość tej aktywności jest zlokalizowana w specyficznych regionach jądrowych wolnych od 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) zwanych przedziałami replikacji wirusa, składającymi się zarówno z białek gospodarza, jak i wirusa, RNA i wirusowego DNA2. Komórka jest remontowana w celu zapewnienia miejsca i zasobów dla przedziałów replikacyjnych, a tym samym montażu kapsydów wirusowych. Gdy kapsyd opuści jądro, nie jest jasne, w jaki sposób kapsyd jest otoczony cytoplazmą w celu wytworzenia cząsteczki wirusa związanej z błoną, znanej również jako wirion. Zrozumienie lokalizacji i przesunięć przestrzennych biomolekuł zarówno gospodarza, jak i wirusa podczas fazy litycznej zapewnia głębszy mechanistyczny wgląd w układ przedziału replikacyjnego, efekt wyłączenia gospodarza, szlak wyjścia wirionu i inne procesy związane z infekcją i replikacją wirusa opryszczki.
Obecnie najlepszą metodą wykrywania i badania tych zmian jest wizualizacja białek i RNA w zainfekowanych komórkach odpowiednio za pomocą immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Zastosowanie przebiegu czasowego z tymi technikami ujawnia lokalizację biomolekuł w kluczowych punktach fazy litycznej lub po prostu danych czasoprzestrzennych. FISH i IF uzupełniają inne techniki biochemiczne, takie jak hamowanie procesu komórkowego (np. hamowanie replikacji wirusowego DNA), RT-qPCR (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym), sekwencjonowanie RNA, plamy północne, spektrometria mas, Western blotting i analiza produkcji DNA wirusa, które mogą zapewnić bardziej globalny obraz aktywności komórkowej.
Opracowaliśmy strategie RNA FISH do badania produktów RNA z określonych genów oraz analizę obliczeniową, która ilościowo oblicza stosunek nukleocytoplazmatyczny określonego produktu genu. Przygotowanie próbki, zmodyfikowane na podstawie wcześniejszych publikacji Steitza i współpracowników3,4, jest stosunkowo łatwe i może być stosowane zarówno do komórek przylegających, jak i zawieszonych. Protokół można również dostosować do jednoczesnego stosowania wielu strategii RNA FISH (double RNA FISH) lub RNA FISH ze strategiami IF. Opracowanie konkretnej strategii FISH jest wyzwaniem, ale przedstawiono sugestie dotyczące poprawy sukcesu. Opisana tutaj analiza danych jest ilościowa, jeśli stosuje się koraliki fluorescencyjne i silne markery granic przedziałów, i oferuje dodatkowy wgląd w mikrofotografie, wgląd, który usuwa błąd obserwacji. Szczegółowy protokół jest przeznaczony zarówno dla komórek utajonych, jak i litycznych zakażonych herpeswirusem związanym z mięsakiem Kaposiego (KSHV) i może być stosowany z komórkami niezakażonymi lub komórkami zakażonymi innymi herpeswirusami5. Metody oznaczania ilościowego mają zastosowanie do badań nad przesunięciami nukleocytoplazmatycznym lub relokalizacją między przedziałami subkomórkowymi w większości komórek.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor594-5-dUTP</td><td>Life Technologies</td><td>C1100</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG FITC&nbsp;</td><td>Jackson Lab Immunologicals</td><td>200-092-156</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królicze wtórne AlexaFluor594 Przeciwciało monoklonalne</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Kozie</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-SSB</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Ref. Chiou et al. 2002</td></tr><tr><td>BLASTn</td><td>NIH NCBI</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do wyrównywania swobodnej sekwencji</td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Zestaw do ogonowania oligonukleotydów DIG</td><td>Sigma Roche</td> <td># 03353583910</td><td></td></tr><tr><td>Ośmiokomorowe prowadnice</td> 2. generacji <td>Nunc Lab Tek II</td><td>#154453</td><td>Niebieska uszczelka sprzyja napięciu powierzchniowemu, ale dostępna jest również separacja za pomocą przezroczystego żelu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9037</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>GAPDH Sondy</td><td>Stellaris</td><td>SMF-2019-1</td><td>Kompatybilny z protokołem, Quasar 670</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>NIH, Bethesda, MD</td><td>N/A</td><td>Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td></tr><tr><td>OligoAnalyzer</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Free Oligonukleotyd Analyzer&nbsp;</td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>A-150228</td><td></td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>Amaxa</td><td>VDF-1012</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Transferaza końcowa</td><td>Sigma Roche</td><td>#003333574001</td><td></td></tr><tr><td>Kompleksy rybonukleozydowe wanadylu&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>H-1000</td><td>DAPI w mediach montażowych rozprasza światło i zmniejsza kontrast.</td></tr></tbody></table>

ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (fish) i immunofluorescencja (if) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych kshv

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistyczny wgląd wynika z dokładnych badań i kwantyfikacji konkretnych RNA i białek. Względne lokalizacje tych biomolekuł w komórce w określonych momentach można uchwycić za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunofluorescencji (IF). Podczas zakażenia herpeswirusem litycznym wirus przejmuje kontrolę nad komórką gospodarza, aby preferencyjnie wyrażać geny wirusa, powodując zmiany w morfologii komórek i zachowaniu biomolekuł. Aktywność lityczna jest skoncentrowana w fabrykach jądrowych, zwanych przedziałami replikacji wirusa, które są dostrzegalne tylko w przypadku FISH i IF. Tutaj opisujemy adaptowalny protokół technik RNA FISH i IF dla komórek zakażonych wirusem opryszczki związanej z mięsakiem Kaposiego (KSHV), zarówno przylegających, jak i w zawiesinie. Metoda obejmuje etapy opracowywania specyficznych oligonukleotydów antysensownych, ryb z podwójnym RNA, RYBY RNA z IF oraz ilościowe obliczenia intensywności fluorescencji. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wielu typów komórek, komórek niezakażonych, komórek utajonych, komórek litycznych, przebiegów czasowych i komórek traktowanych inhibitorami w celu analizy czasoprzestrzennej aktywności określonych RNA i białek zarówno od ludzkiego gospodarza, jak i KSHV.

Metody FISH i IF szczegółowo opisane w niniejszej pracy przedstawiono na Rysunku 1 wraz z ilościową analizą wyników za pomocą linii profilu intensywności fluorescencji. Przedstawione tutaj wyniki mają charakter półilościowy i pozwalają na wgląd w lokalizację, a nie na porównanie intensywności różnych barwień fluorescencyjnych, ponieważ w preparatach na szkiełkach nie zastosowano kulek fluorescencyjnych. Rysunek 1 wykazuje również...

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Protokół jest pomocny w uzyskaniu ilościowego wglądu w czasową regulację produktów genów wirusa w kontekście komórek gospodarza, zwłaszcza w odniesieniu do wirusów opryszczki. Technika ta może pomóc w odpowiedzi na pytania badawcze związane zarówno z RNA i białkami gospodarza, jak i wirusa. Co więcej, technika ta jest kompatybilna z jednoczesnymi testami biochemicznymi.Aby przykleić komórki do ośmiu szkiełek komorowych, nałóż 200 mikrolitrów naturalnej zawiesiny komórek do każdej komory sterylnego, ośmiokomorowego szkiełka i pozwól nasionom rosnąć przez 12-24 godziny, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji odessać komórki supernatantowe i nieprzyłączone i natychmiast utrwalić komórki wstępnie schłodzonym 4% formaldehydem w PBS na lodzie przez 30 minut. Pod koniec utrwalania umyj komórki trzema, pięciominutowymi płukaniami w 200 mikrolitrach PBS o temperaturze 4 stopni Celsjusza na pranie.Po ostatnim płukaniu przepuszczaj stałe komórki za pomocą 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonego 0,5% Triton-X w PBS na studzienkę, przez 10 minut na lodzie. Pod koniec przepuszczalności ostrożnie wyjmij komory, nie pękając szkiełka, i przepłucz komórki wstępnie schłodzonym PBS. Zablokuj wypłukane komórki wstępnie schłodzonym 4% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie inkubację z odpowiednim poliklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym w 0,1% BSA w PBS przez jedną godzinę, w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzykrotnie świeżym PBS i inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem zgodnym z przeciwciałem wykrywającym FISH przez jedną godzinę, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzech płukaniach PBS, jak pokazano, ponownie utrwalić próbki w 4% formaldehydzie w PBS przez 10-15 minut przed drugą permeablacją, jak pokazano. Następnie przykryj szkiełko folią aluminiową, aby zachować sygnał fluorescencyjny i zapobiec fotowybielaniu.I umyj komórki 2x soli fizjologicznej cytrynianu sodu, przed zastosowaniem 45 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego. Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze dodaj destylowaną wodę do interesujących oligonukleotydów antysensownych, aby zwiększyć objętość denaturacji do 10 mikrolitrów. Denaturować oligonukleotydy w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, przed dodaniem 35 mikrolitrów świeżego roztworu hybrydyzacyjnego na szkiełko.Następnie inkubować próbki przez 10-24 godziny w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zabezpieczonej folią. Następnego dnia umyj komórki dwoma, 10 minutami. 2X solony cytrynian sodu myje się w temperaturze pokojowej, a następnie jedno płukanie w 1X słony cytrynian sodu przez 10 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Po ostatnim praniu utrwal komórki wstępnie schłodzonym 4% formaldehydem w PBS przez 10-15 minut na lodzie, a następnie trzy razy przepłucz świeżym PBS. Następnie należy przepuścić próbki, jak pokazano, a następnie inkubować z anty-dioksygeniną FTC i wstępnie schłodzonym 0,1% BSA w PBS, przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka trzy razy w świeżej centrali PBX i utrwal próbki wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydem w PBS przez 10-15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po trzech płukaniach w PBS, oznaczyć jądra 0,4 mikrograma na mililitr DAPI i wstępnie schłodzić 0,5% Triton-X w PBS przez 15 minut na lodzie, a następnie trzy końcowe płukania w PBS. Zamontuj szkiełka z koralikami fluorescencyjnymi, jeśli jest to istotne doświadczalnie i w odpowiednim medium montażowym. Po usunięciu nadmiaru podłoża mocującego za pomocą sterylnych chusteczek, zaklej jedno szkiełko nakrywkowe do każdego szkiełka wieloma warstwami przezroczystego lakieru do paznokci i użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić pomyślne przeprowadzenie eksperymentu.Obrazy mogą być następnie wykonywane pod mikroskopem konfokalnym w celu zebrania obrazów próbek w ciągu godziny do tygodnia od zamontowania, przy powiększeniu 630 razy. Te reprezentatywne wyniki FISH i immunofluorescencji są półilościowe i oferują wgląd w lokalizację oligonukleotydów, a nie w porównania między intensywnościami różnych barwników fluorescencyjnych, ponieważ eksperymenty te nie obejmowały kulki fluorescencyjnej w preparacie szkiełka. W tych eksperymentach obszary cytoplazmatyczne i jądrowe oraz ich proporcje były różne dla utajonych i litycznych komórek zakażonych KSHV.Jak pokazano na tym rysunku, obszar jest kontrolowany w stosunku nukleocytoplazmatycznym. Gdy replikacja DNA KSHV jest hamowana w fazie litycznej, wczesne białko lityczne transkryptu oligonukleotydowego KSHV przesuwa się do lokalizacji głównie cytoplazmatycznej. Poliadenylowane RNA KSHV lokalizuje się jednak w określonych miejscach jądrowych pomimo hamowania replikacji wirusowego DNA.Podczas wyjmowania komór z prowadnic należy uważać, aby na narzędziu było bardzo mało resztek kleju i użyć etanolu do przepuszczalności komórek i osłabienia kleju. Testy biochemiczne, takie jak QPCR, Western blot i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe, mogą być wykonywane w tandemie w celu rozszerzenia danych ilościowych zebranych z mikrofotografii.

quantitative-fluorescence-situ-hybridization-fish-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Czynniki komórek gospodarza odgrywają krytyczną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się mięsaka Kaposiego (KS). Opisujemy metody identyfikacji czynników komórek gospodarza, które uległy zmianie w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w tkance nowotworowej KS. Geny komórkowe zmodyfikowane przez wirusa będą służyć jako potencjalne cele dla nowych terapii.

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji reakcji łańcuchowej (HCR)-fluorescencji in situ (FISH) do wizualizacji przestrzennego rozkładu subgenomowego RNA SARS-CoV-2. Połączenie HCR z technikami immunofluorescencji może dostarczyć informacji na temat interakcji gospodarz-wirus na poziomie pojedynczej komórki.

Wykorzystanie fluorescencji immuno-RNA Hybrydyzacja in Situ do wizualizacji SARS-CoV-2

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Poznaj ilościową hybrydyzację fluorescencyjną in situ (FISH) i immunofluorescencję do wizualizacji RNA herpeswirusów w ludzkich komórkach. Ta metoda umożliwia badanie interakcji między wirusem a gospodarzem.

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Przeglądaj więcej filmów