Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Protokół jest pomocny w uzyskaniu ilościowego wglądu w czasową regulację produktów genów wirusa w kontekście komórek gospodarza, zwłaszcza w odniesieniu do wirusów opryszczki. Technika ta może pomóc w odpowiedzi na pytania badawcze związane zarówno z RNA i białkami gospodarza, jak i wirusa. Co więcej, technika ta jest kompatybilna z jednoczesnymi testami biochemicznymi.

Aby przykleić komórki do ośmiu szkiełek komorowych, nałóż 200 mikrolitrów naturalnej zawiesiny komórek do każdej komory sterylnego, ośmiokomorowego szkiełka i pozwól nasionom rosnąć przez 12-24 godziny, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji odessać komórki supernatantowe i nieprzyłączone i natychmiast utrwalić komórki wstępnie schłodzonym 4% formaldehydem w PBS na lodzie przez 30 minut. Pod koniec utrwalania umyj komórki trzema, pięciominutowymi płukaniami w 200 mikrolitrach PBS o temperaturze 4 stopni Celsjusza na pranie.

Po ostatnim płukaniu przepuszczaj stałe komórki za pomocą 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonego 0,5% Triton-X w PBS na studzienkę, przez 10 minut na lodzie. Pod koniec przepuszczalności ostrożnie wyjmij komory, nie pękając szkiełka, i przepłucz komórki wstępnie schłodzonym PBS. Zablokuj wypłukane komórki wstępnie schłodzonym 4% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie inkubację z odpowiednim poliklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym w 0,1% BSA w PBS przez jedną godzinę, w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzykrotnie świeżym PBS i inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem zgodnym z przeciwciałem wykrywającym FISH przez jedną godzinę, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzech płukaniach PBS, jak pokazano, ponownie utrwalić próbki w 4% formaldehydzie w PBS przez 10-15 minut przed drugą permeablacją, jak pokazano. Następnie przykryj szkiełko folią aluminiową, aby zachować sygnał fluorescencyjny i zapobiec fotowybielaniu.

I umyj komórki 2x soli fizjologicznej cytrynianu sodu, przed zastosowaniem 45 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego. Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze dodaj destylowaną wodę do interesujących oligonukleotydów antysensownych, aby zwiększyć objętość denaturacji do 10 mikrolitrów. Denaturować oligonukleotydy w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, przed dodaniem 35 mikrolitrów świeżego roztworu hybrydyzacyjnego na szkiełko.

Następnie inkubować próbki przez 10-24 godziny w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zabezpieczonej folią. Następnego dnia umyj komórki dwoma, 10 minutami. 2X solony cytrynian sodu myje się w temperaturze pokojowej, a następnie jedno płukanie w 1X słony cytrynian sodu przez 10 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Po ostatnim praniu utrwal komórki wstępnie schłodzonym 4% formaldehydem w PBS przez 10-15 minut na lodzie, a następnie trzy razy przepłucz świeżym PBS. Następnie należy przepuścić próbki, jak pokazano, a następnie inkubować z anty-dioksygeniną FTC i wstępnie schłodzonym 0,1% BSA w PBS, przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka trzy razy w świeżej centrali PBX i utrwal próbki wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydem w PBS przez 10-15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po trzech płukaniach w PBS, oznaczyć jądra 0,4 mikrograma na mililitr DAPI i wstępnie schłodzić 0,5% Triton-X w PBS przez 15 minut na lodzie, a następnie trzy końcowe płukania w PBS. Zamontuj szkiełka z koralikami fluorescencyjnymi, jeśli jest to istotne doświadczalnie i w odpowiednim medium montażowym. Po usunięciu nadmiaru podłoża mocującego za pomocą sterylnych chusteczek, zaklej jedno szkiełko nakrywkowe do każdego szkiełka wieloma warstwami przezroczystego lakieru do paznokci i użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić pomyślne przeprowadzenie eksperymentu.

Obrazy mogą być następnie wykonywane pod mikroskopem konfokalnym w celu zebrania obrazów próbek w ciągu godziny do tygodnia od zamontowania, przy powiększeniu 630 razy. Te reprezentatywne wyniki FISH i immunofluorescencji są półilościowe i oferują wgląd w lokalizację oligonukleotydów, a nie w porównania między intensywnościami różnych barwników fluorescencyjnych, ponieważ eksperymenty te nie obejmowały kulki fluorescencyjnej w preparacie szkiełka. W tych eksperymentach obszary cytoplazmatyczne i jądrowe oraz ich proporcje były różne dla utajonych i litycznych komórek zakażonych KSHV.

Jak pokazano na tym rysunku, obszar jest kontrolowany w stosunku nukleocytoplazmatycznym. Gdy replikacja DNA KSHV jest hamowana w fazie litycznej, wczesne białko lityczne transkryptu oligonukleotydowego KSHV przesuwa się do lokalizacji głównie cytoplazmatycznej. Poliadenylowane RNA KSHV lokalizuje się jednak w określonych miejscach jądrowych pomimo hamowania replikacji wirusowego DNA.

Podczas wyjmowania komór z prowadnic należy uważać, aby na narzędziu było bardzo mało resztek kleju i użyć etanolu do przepuszczalności komórek i osłabienia kleju. Testy biochemiczne, takie jak QPCR, Western blot i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe, mogą być wykonywane w tandemie w celu rozszerzenia danych ilościowych zebranych z mikrofotografii.