Name: Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Poznaj mikroskopowy test fenotypowy do ilościowego oznaczania Mycobacterium tuberculosis wewnątrzkomórkowego przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej. Ta metoda umożliwia badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla tej pracy zostało zapewnione przez Wspólnotę Europejską (Grant ERC-STG INTRACELLTB nr 260901, Grant MM4TB nr 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) oraz Region Nord Pas de Calais. Wyrażamy wdzięczność za pomoc techniczną ze strony Gasparda Deloisona, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanniego i Franka Lafonta z platformy BICeL.

<ol><li>Gandhi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+and+extensively+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+threat+to+global+control+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis.</a> Lancet. 375, 1830-1843 (2010).</li>
<li>Barry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+latent+tuberculosis%3A+rethinking+the+biology+and+intervention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).</li>
<li>Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis-infected+macrophages%3A+an+in+vitro+model+for+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery.</a> Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).</li>
<li>Brodin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+phenotypic+cell-based+visual+screen+identifies+Mycobacterium+tuberculosis+acyltrehalose-containing+glycolipids+involved+in+phagosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li>
<li>Bermudez, L. E., Goodman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+invades+and+replicates+within+type+II+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells.</a> Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).</li>
<li>Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrosis+of+lung+epithelial+cells+during+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis+is+preceded+by+cell+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation.</a> Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).</li>
<li>McDonough, K. A., Kress, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+for+lung+epithelial+cells+is+a+virulence-associated+phenotype+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis.</a> Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).</li>
<li>Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+is+inducible+and+plays+an+essential+role+for+mycobacteria-induced+innate+immune+responses+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells.</a> J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).</li>
<li>Song, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal-based+method+for+quantification+of+diffusion+kinetics+in+microwell+plates+and+its+application+for+identifying+a+rapid+mixing+method+for+high-content%2Fthroughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisujemy tutaj metody wymagane do testu fenotypowego z wykorzystaniem szczepu Mtb H37Rv z ekspresją GFP do infekowania znakowanych fluorescencyjnie komórek gospodarza, co czyni go odpowiednim do badań przesiewowych o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy związków, sond fluorescencyjnych i mutantów Mtb . Dla każdego opisanego powyżej protokołu można przeprowadzić etapy fiksacji i znakowania immunologicznego przed akwizycją obrazu. Do pozyskiwania ...

Wśród pojawiających się i ponownie pojawiających się patogenów zakaźnych zgłoszonych w ostatnich latach, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) zajmuje czołowe miejsce, odpowiadając za 1,4 miliona zgonów i 8,7 miliona nowych infekcji w 2011 roku (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Pomimo dostępności terapii wielolekowych, liczba zakażonych osób wciąż rośnie, a wielolekooporne (MDR) oraz wysoce lekooporne (XDR) Mtb szybko rozprzestrzeniają się na całym świecie1. Co więcej, biorąc pod uwagę obecność antygenów Mtb, oczywiste jest, że jedna trzecia światowej populacji jest uważana za utajoną zakażoną Mtb. Statystycznie w jednym przypadku na dziesięć następuje ewolucja w kierunku aktywnej postaci choroby z późniejszymi objawami klinicznymi2. Dlatego pilnie potrzebne są nowe środki do walki z Mtb. W tym kontekście opracowaliśmy wizualny test fenotypowy in vitro, opierający się na monitorowaniu inwazji i namnażania Mtb do komórek gospodarza za pomocą zautomatyzowanej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej3. Adaptacja testu na 384-dołkowych płytkach mikromiareczkowych w połączeniu z automatyczną akwizycją i analizą obrazu umożliwiła przeprowadzenie badań przesiewowych o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości (HC/HTS) bibliotek średniego skali związków, siRNA i mutantów bakteryjnych. Badania przesiewowe biblioteki RNAi obejmującej cały genom w tym teście fenotypowym umożliwiły zatem identyfikację kluczowych czynników gospodarza zaangażowanych w transport Mtb i replikację wewnątrzkomórkową, ale także wyjaśnienie szlaków gospodarza wykorzystywanych przez prątki gruźlicy. Kolejną adaptacją tego konkretnego testu fenotypowego była identyfikacja czynników bakteryjnych niezbędnych do utrzymania się Mtb w obrębie fagosomalów. Na przykład zatrzymanie dojrzewania fagosomów jest uważane za jeden z głównych mechanizmów ułatwiających przetrwanie i replikację Mtb w makrofagach. Monitorowanie subkomórkowej lokalizacji mutantów nokautujących Mtb w znakowanych fluorescencyjnie kompartmentach kwasowych pozwoliło na identyfikację genów bakteryjnych zaangażowanych w proces przeżycia4. Wreszcie, obrazowanie Mtb o wysokiej zawartości stanowi również doskonałą metodę ilościowego określania skuteczności leku w hamowaniu różnych zjawisk, takich jak wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii3. Ogólnie rzecz biorąc, ten rodzaj wysokoprzepustowego testu fenotypowego pozwala przyspieszyć odkrywanie leków przeciwko gruźlicy, a dane zebrane za pomocą tych różnych podejść przyczyniają się do lepszego zrozumienia manipulacji gospodarza wywieranej przez Mtb.

<table><tbody><tr><td>&mikro; przezroczysta płytka, 384-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781091</td><td>127,8/86/15 MM z pokrywką,</td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka CellCarrier</td> z powłoką TC <td>PerkinElmer</td><td>6007550</td><td>, przezroczysta z dnem, z pokrywką, z dnem w kształcie litery V poddanym obróbce TC</td></tr><tr><td>, biała, płytka 384-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781280</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>taśma uszczelniająca, oddychająca, sterylna</td><td>Corning</td><td>3345</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Dulbecco&#039; s Bufor do zasolenia fosforanów</td></tr><tr><td>D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-091</td><td>Dulbecco&#039; s Bufor fosforanowy Salin</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>2610040-79</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll Paque PLUS</td><td>Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>Ficoll do oczyszczania komórek monocytów krwi obwodowej</td></tr><tr><td>Mikrogranulki CD14, ludzkie</td><td>Miltenyi</td><td>130-050-201</td><td>Oczyszczanie monocytów CD14 +</td></tr><tr><td>Ludzki M-CSF, premium gr. (1000 &mu; g)</td> <td>Miltenyi</td><td>130-096-493</td><td>Kolumny LS czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Kolumny do izolacji monocytów CD14 +</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Euromedex</td><td>2002-A</td><td>Kultura prątków</td></tr><tr><td>Glicerol o wysokiej czystości&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>50405-EX</td><td>Hodowla prątków</td></tr><tr><td>&nbsp; Wzbogacenie Middlebrook OADC</td><td>Becton-Dickinson</td><td>211886</td><td>Hodowla prątków</td></tr><tr><td>7H9</td><td>Becton-Dickinson</td><td>W1701P</td><td>Kultura prątków</td></tr><tr><td>Versene 1x</td><td>Life Technologies</td><td>15040033</td><td>Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>Barwnik jąder</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Barwnik jąder</td></tr><tr><td>Syto60</td><td>Life Technologies</td><td>S11342</td><td>Barwnik jądrowy/cytoplazmatyczny</td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014</td><td>Roztwór do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>siRNA ukierunkowany na Dectin-1</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-63276</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*siGenome* Nieukierunkowana pula siRNA&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Izoniazyd (INH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3377-50G</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Amikacyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1774</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Automatyczny mikroskop konfokalny OPERA</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Columbus 2.3.1 Serwerowa baza danych</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Przesyłanie, przechowywanie i analiza danych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Acapella 2.6</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Analiza obrazowa</td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism5</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Analiza statystyczna</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Analiza statystyczna</td></tr></tbody></table>

mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Pomimo dostępności terapii i szczepionek, gruźlica (TB) pozostaje jedną z najbardziej śmiertelnych i rozpowszechnionych infekcji bakteryjnych na świecie. Od kilkudziesięciu lat nagły wybuch szczepów wielolekoopornych i intensywnie lekoopornych stanowi poważne zagrożenie dla zwalczania gruźlicy. W związku z tym konieczne jest zidentyfikowanie nowych celów i szlaków krytycznych dla czynnika wywołującego gruźlicę, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), oraz poszukiwanie nowych substancji chemicznych, które mogłyby stać się lekami na gruźlicę. Jednym z podejść jest stworzenie metod odpowiednich dla genetycznych i chemicznych badań przesiewowych w dużych bibliotekach umożliwiających poszukiwanie igły w stogu siana. W tym celu opracowaliśmy test fenotypowy polegający na wykrywaniu znakowanego fluorescencyjnie Mtb w znakowanych fluorescencyjnie komórkach gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej. Ten test in vitro pozwala na ilościową identyfikację procesu kolonizacji Mtb do gospodarza na podstawie obrazu i został zoptymalizowany pod kątem formatu mikropłytki 384-dołkowej, który jest odpowiedni dla badań przesiewowych bibliotek siRNA, związków chemicznych lub mutantów Mtb. Obrazy są następnie przetwarzane do analizy wieloparametrycznej, która umożliwia odczytanie wniosków na temat patogenezy Mtb w komórkach gospodarza.

Wysokoprzepustowy screening siRNA w całym genomie
Mtb jest w stanie kolonizować komórki odpornościowe in vitro, jak również kilka innych komórek nabłonkowych płuc. Na przykład Mtb potrafi infekować i uszkadzać komórki nabłonkowe A549, które są powszechnie stosowane jako model ludzkich pneumocytów typu II5-7. Wykazano, że Dectin-1 jest receptorem komórkowym gospodarza zaangażowanym w pobieranie Mtb, odpowiedź prozapalną oraz efekt przeciwbakteryjny w ...

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar wpływu modulatorów fenotypu, takich jak wyciszanie genów gospodarza lub oddziaływanie małych cząsteczek, na replikację wewnątrzkomórkową mycobacterium tuberculosis. Jest to realizowane poprzez najpierw dozowanie małych cząsteczek do płytek 384-dołkowych lub transfekcję komórek kompleksami siRNA. Kolejnym krokiem jest zakażenie komórek szczepem mycobacterium tuberculosis wykazującym ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (G-F-P-M-T-B), przeniesienie komórek do dołków zawierających małe cząsteczki i inkubację mikropłytki przez pięć dni.W podejściu RNAi należy dodać komórki do dołków zawierających kompleksy transfekcyjne RNAi. Mikropłytkę inkubuje się przez trzy dni, a następnie zakaża komórki szczepem mycobacterium tuberculosis ekspresującym G-F-P-M-T-B. Po zabarwieniu komórek ostatnim etapem jest odczyt płytek przy użyciu zautomatyzowanego mikroskopu konfokalnego.W końcowym etapie zautomatyzowana mikroskopia fluorescencyjna, a następnie analiza obrazu, są wykorzystywane do pomiaru zmian w wewnątrzkomórkowym wzroście G-F-P-M-T-V. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak oznaczanie jednostek tworzących kolonie, jest wyeliminowanie długiego okresu inkubacji oraz możliwość zwiększenia przepustowości. Procedurę tę zaprezentują Christophe Keval lub SONG oraz trzech pracowników postdoktorskich z mojego zespołu badawczego.Protokoły przesiewania biblioteki siRNA oraz biblioteki związków wykorzystują dwutygodniowe hodowle Mycobacterium tuberculosis H37Rv wykazujące ekspresję GFP. Aby przygotować zawiesinę bakteryjną GFP-Mtb, w pierwszej kolejności należy odwirować hodowlę z prędkością 4000 g przez pięć minut, odrzucić nadsącz, resuspender hodowlę w DPBS i ponownie odwirować w ten sam sposób. Hodowlę należy przemyć trzykrotnie DPBS.Po trzecim przemyciu odrzuć nadsącz i resuspenduj osad bakteryjny w 10 mililitrach pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Pozostaw zawiesinę na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby agregaty bakteryjne mogły osiąść. Zbierz nadsącz bakteryjny, a następnie zmierz OD przy 600 nanometrach oraz fluorescencję GFP.Przy użyciu czytnika mikropłytek do określenia stężenia bakterii, wartość OD przy 600 nm powinna mieścić się w przedziale od 0,6 do 0,8. Oblicz miano zawiesiny, korzystając z referencyjnej linii regresji, przedstawiającej wartość RFU jako funkcję wartości CFU, wyznaczonej przed eksperymentami na innej kulturze przygotowanej w tych samych warunkach. Typowe stężenie wynosi 1 × 10⁸ bakterii/mL.Procedurę należy rozpocząć od resuspensji wysuszonej biblioteki siRNA, przechowywanej w 96-dołkowych płytkach macierzystych, w 1X-siRNA buffer do stężenia 2 µM. Następnie należy przenieść 10 µL mieszaniny do każdego dołka 384-dołkowej płytki potomnej, a następnie przenieść 2,5 µL siRNA z każdego dołka płytki potomnej do 384-dołkowej płytki testowej.Do odpowiednich dołków dodaj po 2,5 µL ujemnej i dodatniej kontroli iRNA. Jeśli płytka potomna nie zostanie użyta natychmiast, należy ją zamknąć odrywaną aluminiową folią uszczelniającą. Zamkniętą płytkę można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej sześć miesięcy, a potencjalnie do dwóch-trzech lat, w zależności od rodzaju iRNA.Zalecenia producenta biblioteki. Przygotować odczynniki do transfekcji, rozcieńczając je w 1X DPBS, aby uzyskać ilość roztworu wystarczającą do odmierzenia 0,1 µL na każdą studzienkę. Rozcieńczony roztwór do transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Do każdej studzienki płyty testowej 384-dołkowej dodaj 7,5 µL rozcieńczonego roztworu do transfekcji i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej; każda studzienka płyty powinna zawierać 40 µL ludzkich pneumocytów typu II, komórek A549 zawieszonych w medium RPMI 1640 uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej. Hoduj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Komórki te dzielą się co 24 godziny, w związku z czym trzy dni po transfekcji w każdej studzience znajduje się około 12 000 komórek.Trzy dni po transfekcji siRNA komórek 5 49 przygotować zawiesinę bakteryjną MTBH 37 RV GFP zgodnie z wcześniejszym opisem.Zawiesina powinna zawierać 2,4 × 10⁶ bakterii na mililitr, co odpowiada wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej pięć. Usunąć pożywkę z płytki assay 384-dołkowej i dodać 25 µL zawiesiny bakteryjnej do każdego dołka. Inkubować płytkę assay 384-dołkową w temperaturze 37 °C przez pięć godzin w atmosferze zawierającej 5% CO2.Po pięciu godzinach usunąć medium i delikatnie przemyć komórki trzykrotnie medium RPMI uzupełnionym o 10%FBS, aby usunąć pozostałe bakterie pozakomórkowe. Potraktować komórki w każdej studni 50 µl.Świeża pożywka R-P-M-I-F-B-S zawierająca 50 µg/mL amikacyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę w atmosferze zawierającej 5% CO2. Na koniec usunąć pożywkę z amikacyną i dodać 50 µL świeżej pożywki RPMI uzupełnionej o 10% FBS na dołek.Inkubować płytkę testową w temperaturze 37°C przez pięć dni w atmosferze zawierającej 5% CO2 przed przeprowadzeniem przesiewania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić w temperaturze pokojowej płytkę matkę 384-dołkową zawierającą bibliotekę związków rozpuszczonych w 100% DMSO, a następnie przenieść 0,5 µL związków z płytki matki do płytki córki 384-dołkowej zawierającej 10 µL na dołek pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS. Następnie zebrać sześciodniowe pierwotne ludzkie makrofagi w stężeniu 4 × 10⁵ komórek/mL w pożywce RPMI 1640.Pożywka uzupełniona o 10% FBS i 50 ng/mL rekombinowanego ludzkiego MCSF. Inkubować rozcieńczone komórki pierwotne z bakteriami przy różnych MOI w zakresie od 1 do 5 w zawiesinie, przy łagodnym wytrząsaniu z prędkością 90 RPM przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Przemyć zainfekowane komórki poprzez wirowanie przy 350 ×g przez pięć minut, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe.Resuspenduj osady w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FPS i odwiruj. Powtórz tę czynność, wykonując dwa płukania po ostatnim przemyciu.Zresuspenduj zakażone komórki w medium RPMI 1640 uzupełnionym o 10% FBS i 50 µg/mL amikacyny. Inkubuj zawiesinę przy łagodnym wstrząsaniu przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie odwiruj przy 350 ×g przez pięć minut. Usuń medium zawierające amikacynę i przemyj zakażone komórki pełnym medium RPMI 1640.Pożywka uzupełniona o 10% FBS oraz 50 ng/mL rekombinowanego ludzkiego MCSF. Powtórzyć to płukanie raz.Do wcześniej przygotowanej płytki assay 384-dołkowej, zawierającej już 10 µL rozcieńczeń związku, dodaj 40 µL zawiesiny zakażonych makrofagów do każdego dołka. Końcowe stężenie DMSO w każdym dołku wynosi teraz 1%. Inkubuj płytki assay przez pięć dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 przed przesiewaniem biblioteki siRNA za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przed akwizycją obrazów, do każdego dołka płytki assay dodaj 10 µL świeżo przygotowanego roztworu DPI o stężeniu 30 µg/mL w PBS i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C.W celu przesiewania związków, przed akwizycją obrazów, należy zbarwić żywe komórki przenikającym do wnętrza komórek dalekoczerwonym barwnikiem fluorescencyjnym przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Płytki do testów należy wprowadzić do zautomatyzowanego mikroskopu konfokalnego. Następnie należy ustawić parametry ekspozycji, aby zarejestrować fluorescencję DPI, wykorzystując laser wzbudzający o długości fali 405 nm oraz filtr emisyjny 450 nm.Rejestruj fluorescencję GFP, używając lasera wzbudzającego o długości fali 488 nanometrów z filtrem emisyjnym 520 nanometrów. Wybierz studzienki oraz pola w każdej studzience do akwizycji, które następnie określane są jako układy i podukłady. Parametry generują plik eksperymentu przy użyciu ustawionych wartości i uruchamiają automatyczną akwizycję.W tym przypadku rejestrowane są cztery różne obrazy tej samej studzienki i pola, a następnie obrazy te są przesyłane na zdalny serwer. Następnie obrazy są oceniane przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu acapella 2.6 w celu screeningu SI RNA. Każde pole zawiera dwa kanały lub kolory.Kolor zielony oznacza bakterie, a niebieski komórkę. Narzędzie Nuclei wykrywa jądra komórkowe z kanału DAPI przy użyciu algorytmu detekcji jąder oraz obszar bakterii z kanału GFP przy użyciu algorytmu właściwości intensywności pikseli. Poprzez scalenie kanałów i zliczenie liczby pikseli wspólnych dla bakterii i komórek, następuje ilościowe określenie liczby bakterii wewnątrzkomórkowych.Wyniki końcowe, wyrażone jako średnia z czterech pól, to całkowita powierzchnia bakterii, całkowita liczba komórek, procent zainfekowanych komórek oraz powierzchnia bakterii na komórkę. W przypadku przesiewania związków każde pole zawiera dwa kanały lub kolory: zielony dla bakterii i daleką czerwień dla komórki. Jądra i cytoplazma wykrywają powierzchnię komórki z kanału dalekiej czerwieni oraz powierzchnię bakterii z kanału GFP, wykorzystując algorytm właściwości intensywności pikseli.Poprzez scalenie kanałów i zliczenie liczby pikseli wspólnych dla bakterii i jąder komórkowych, określa się ilość bakterii wewnątrzkomórkowych. Wyniki końcowe, wyrażone jako średnia z czterech pól, obejmują całkowitą powierzchnię bakterii, całkowitą powierzchnię komórek, całkowitą powierzchnię bakterii wewnątrzkomórkowych oraz stosunek powierzchni bakterii wewnątrzkomórkowych do całkowitej powierzchni komórek. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki wysokoprzepustowego genomowego przesiewu SI RNA; wyciszenie ekspresji din one za pomocą SI RNA doprowadziło do zmniejszenia ilości wewnątrzkomórkowych prątków w komórkach 5 49.Jak pokazano na tych reprezentatywnych obrazach konfokalnych komórek 5 49 przetransfekowanych niecelowym siRNA lub siRNA specyficznym dla din one i zainfekowanych MTB wykazującym ekspresję GFP przez pięć dni. GFP MT BH 37 RV zwizualizowano na zielono, a komórki na czerwono. Liczbę komórek oraz wewnątrzkomórkowy ładunek G-F-P-M-T-B-H 37 RV określono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.Wykres ten przedstawia odsetek zainfekowanych komórek a 5 49 w pięciu powtórzeniach dla scramble IRNA (reprezentowanych przez niebieskie okręgi) oraz din one irna (reprezentowanych przez czerwone okręgi). Po trzech dniach wyciszania i pięciu dniach infekcji odsetek zainfekowanych komórek jest zmniejszony o połowę w komórkach a 5 49 z wyciszonym din one w porównaniu do komórek transfekowanych niecelowaną scramble IRNA. W celu zdefiniowania wyniku Z-score zastosowano normalizację opartą na próbkach dla SI RNA nakierowanego na DIN one w porównaniu do scramble.Dla SI ukierunkowanego na DIN1 uzyskano średni wynik Z-score w okolicach -15. Trzy gwiazdki oznaczają wartość P mniejszą niż 0,0001. Wyniki te wskazują, że DIN1 może być wykorzystany jako kontrola pozytywna dla si, przesiewu w celu odkrycia innych nowych czynników gospodarza zaangażowanych w kolonizację MTB i pneumocyty, które mogłyby wykazywać taki sam fenotyp jak w przypadku iRNA dla DIN1 w wysokoprzepustowym przesiewie związków.Wydajność związku w hamowaniu wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii oceniono poprzez wyznaczenie krzywej zależności efektu od dawki (DRC) i normalizację względem referencyjnych związków dodatnich i ujemnych. W tym przykładzie ludzkie makrofagi pierwotne zakażone szczepem MTB H37Rv wykazującym ekspresję GFP inkubowano z 1% DMSO jako kontrolą ujemną lub z rosnącymi stężeniami dwóch związków referencyjnych: izoniazydem (INH) oraz ryfampicyną (RIF). Makrofagi znakowano czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, a kolor zielony wskazuje na obecność MTB. Analiza obrazów z mikroskopu konfokalnego zakażonych ludzkich makrofagów wykazała, że związki aktywne wpływają na wewnątrzkomórkową replikację MTB w komórkach gospodarza, prowadząc do zmniejszenia ładunku prątków, co odpowiada powierzchni sygnału GFP w komórkach.Obliczono stosunek wewnątrzkomórkowej powierzchni bakteryjnej do całkowitej powierzchni komórki, a następnie przedstawiono go jako funkcję stężenia związków w celu wygenerowania krzywych zależności dawka-odpowiedź (DRC). Przedstawione tutaj DRC dotyczą isid oraz rifampicyny w każdym z wykresów. DRC badanego związku znormalizowano względem 1% DMSO (kontrola negatywna) oraz 0,1 µg/mL isid (kontrola pozytywna). Krzywe te pozwalają na wyznaczenie zarówno stężenia wymaganego do zahamowania 50% kolonizacji bakteryjnej, jak i minimalnego stężenia wymaganego do zahamowania 99% replikacji bakterii.Tę technikę można przeprowadzić w ciągu 10 godzin, podzielonych w następujący sposób: dwie godziny na transfekcję komórek lub przygotowanie związku, sześć godzin na infekcję komórek i ich rozdzielenie do mikropłytki oraz dwie godziny na przeprowadzenie akwizycji obrazów. Cały proces trwa osiem dni; należy pamiętać, że praca z mycobacterium tuberculosis może być niezwykle ryzykowna i zawsze należy przestrzegać środków ostrożności podczas wykonywania tej procedury, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej, w tym maski.

a-microscopic-phenotypic-assay-for-quantification-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroskopijne badanie fenotypow dla ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych prątków gruźlicy przystosowane do wysokosprawnego/wysokozawartościowego przesiewowego badania

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Próba CARA) to półilościowa, średnio przepustowa metoda oceny aktywności badanych agentów przeciwko prątkom, które się replikują, nie replikują, lub jedno i drugie.  CARA pozwala na szybką ocenę aktywności zależnej od czasu i stężenia oraz identyfikuje parametry, które należy realizować za pomocą testów jednostek tworzących kolonie (CFU).

Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Opisujemy alternatywne podejście do enumeracji prątków in vitro, w którym zamiast jednostek tworzących kolonie (CFU) wykorzystuje się prątki oznakowane genem reporterowym. „Przeżywalność” organizmów oraz markery odpowiedzi gospodarza są mierzone jednocześnie, co zapewnia niskokosztowy, wszechstronny i funkcjonalny system do badań interakcji gospodarz-patogen w kontekście gruźlicy.

Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Poznaj mikroskopowy test fenotypowy do ilościowego oznaczania Mycobacterium tuberculosis wewnątrzkomórkowego przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej. Ta metoda umożliwia badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Przeglądaj więcej filmów