Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie wpływu modulatorów fenotypu, takich jak wyciszanie genów gospodarza lub wpływ małych cząsteczek na prątki gruźlicy, replikację wewnątrzkomórkową. Osiąga się to poprzez najpierw dozowanie małych cząsteczek i płytek 384-dołkowych lub transektowanie komórek irna i transfekcję do kompleksu. Następnym krokiem jest zakażenie komórek zielonym białkiem fluorescencyjnym wykazującym ekspresję prątków gruźlicy lub G-F-P-M-T-B, dodanie komórek do małej cząsteczki zawierającej studzienki i inkubacja mikropłytki przez pięć dni.

W przypadku podejścia RNAi dodaj komórki do kompleksu transfekcyjnego RNAi zawierającego studzienki. Inkubuj mikropłytkę przez trzy dni, a następnie zainfekuj komórki G-F-P-M-T-B wykazującym ekspresję prątków gruźlicy. Po wybarwieniu komórek ostatnim krokiem jest odczytanie płytek za pomocą automatycznego mikroskopu konfokalnego.

Ostatecznie zautomatyzowana mikroskopia fluorescencyjna, po której następuje analiza oparta na obrazie, służy do pomiaru zmian we wzroście wewnątrzkomórkowym G-F-P-M-T-V. Główną zaletą tej techniki istniejącej metody, takiej jak tworzenie kolonii, jest to, że oszczędza ona długi okres inkubacji i pozwala na większą przepustowość. Tę procedurę zademonstruje Christophe Keval lub SONG oraz trzech doktorantów z mojego zespołu badawczego.

Protokoły badań przesiewowych biblioteki SI RNA i badań przesiewowych biblioteki związków wykorzystują dwutygodniowe hodowle GFP z ekspresją MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV. Aby przygotować zawiesinę bakteryjną G-F-P-M-T-B, najpierw odwiruj kulturę w temperaturze 4 000 G przez pięć minut, wyrzuć supernatanty Resus, zawiesić kulturę w DPBS i ponownie odwiruj w ten sposób. Umyj kulturę trzy razy za pomocą DPBS.

Po trzecim praniu wyrzuć supernat i ponownie zawieś osad bakteryjny w 10 mililitrach 10% FBS zawierającego pożywkę RPMI 1640. Pozostawić zawiesinę na godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić osadzanie się agregatów bakteryjnych. Zbierz supernat bakteryjny i zmierz OD przy 600 nanometrach i fluorescencji GFP.

Używając czytnika mikropłytek do określenia stężenia bakterii, OD przy 600 nanometrach powinien wynosić od 0,6 do 0,8. Obliczyć miano zawiesiny za pomocą referencyjnej linii regresji, wyświetlając wartość RFU jako funkcję wartości CFU wygenerowanej przed eksperymentami na innej hodowli, która została przygotowana w tych samych warunkach. Typowe stężenie wynosi od 10 do ośmiu bakterii na mililitr.

Rozpocznij tę procedurę od zawieszenia przez Resus wysuszonej biblioteki SI RNA, która jest przechowywana w 96. Dobrze płytki macierzyste z jednym buforem X-S-I-R-N-A do stężenia dwóch mikromolowych. Przenieść 10 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki 384-dołkowej płytki potomnej, przenieść 2,5 mikrolitra SI RNA z każdej studzienki płytki potomnej do 384-dołkowej płytki testowej na tę samą płytkę testową.

Dodaj po 2,5 mikrolitra IRNA kontroli ujemnej i dodatniej do odpowiednich studzienek. Jeśli płytka potoczna nie będzie używana, natychmiast uszczelnij ją zdzieralną aluminiową uszczelką. Zapieczętowana płytka może być przechowywana w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza przez co najmniej sześć miesięcy, a nawet do dwóch do trzech lat, w zależności od IRNA.

Zalecenia producenta biblioteki. Przygotuj odczynniki do transfekcji, rozcieńczając je w jednym X-D-P-B-S, aby uzyskać wystarczającą ilość roztworu, aby zapewnić 0,1 mikrolitra dla każdego. Dobrze wstępnie inkubować rozcieńczony roztwór transfekcji w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Dodać 7,5 mikrolitra rozcieńczonego roztworu transfekcji do każdej studzienki na 384-dołkowej płytce testowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej do każdej studzienki płytki testowej w 40 mikrolitrach ludzkich dwóch pneumocytów, komórek A 5,4,9 zawieszonych w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. Utrzymuj komórki przez trzydniowy okres inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Komórki te dzielą się co 24 godziny, więc około 12 000 komórek znajduje się w każdej studzience trzy dni po transfekcji.

Trzy dni po si. Transfekcja RNA 5 49 komórek pozwala przygotować zawiesinę bakteryjną MTBH 37 RV GFP. Jak wykazano wcześniej.

Zawiesina powinna zawierać 2,4 razy 10 do sześciu bakterii na mililitr, co odpowiada wielokrotności infekcji wynoszącej pięć. Usunąć pożywkę z płytki testowej 384 dołków i dodać 25 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do dołka. Inkubować płytkę testową 384 dołków w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla.

Po pięciu godzinach. Usuń pożywkę i delikatnie umyj komórki trzykrotnie pożywką RPMI uzupełnioną 10% FBS, aby zabić pozostałe bakterie zewnątrzkomórkowe. Potraktuj komórki w każdym dołku 50 mikrolitrami.

Świeża pożywka R-P-M-I-F-B-S zawierająca 50 mikrogramów na mililitr amikacyny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Na koniec usuń pożywkę zawierającą amikacynę i dodaj 50 mikrolitrów świeżej pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS na. Studnia.

Inkubować płytkę testową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przed badaniem przesiewowym za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy rozmrozić 384-dołkową płytkę macierzystą zawierającą bibliotekę związków rozpuszczonych w 100% DMSO w temperaturze pokojowej, przenieść 0,5 mikrolitra związków z płytki macierzystej na 384-dołkową płytkę potomną zawierającą 10 mikrolitrów na studzienkę RPMI 1640. Pożywka uzupełniona 10% FPS następnie zbiera sześciodniowe pierwotne makrofagi ludzkie w ilości czterokrotnie 10 do pięciu komórek na mililitr w RPMI 1640.

Pożywka uzupełniona o 10% FPS i 50 nanogramów na mililitr. Rekombinowany ludzki MCSF inkubuje rozcieńczone komórki pierwotne z basiają przy różnych MOI, od jednego do pięciu w zawiesinie, z łagodnym wytrząsaniem przy 90 obr./min przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przemyć zakażone komórki przez odwirowanie w temperaturze 350 GS przez pięć minut, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe.

Resus zawiesić pelety w RPMI 1640. Pożywka uzupełniona 10% FPS i wirówką. Ponownie powtórz to, umyj dwa razy po ostatnim praniu.

Resus zawiesić zainfekowane komórki w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i 50 mikrogramów na mililitr. Amikacyna inkubuje zawiesinę z łagodnym wstrząsaniem przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wiruje w temperaturze 350 GS przez pięć minut. Usunąć pożywkę zawierającą amikacynę i umyć zainfekowane komórki kompletnym RPMI 1640.

Pożywka uzupełniona 10% FBS i 50 nanogramów na mililitr. Rekombinowany ludzki MCSF. Powtórz to pranie raz.

Dodać 40 mikrolitrów na studzienkę zakażonej zawiesiny makrofagów do tej samej przygotowanej wcześniej płytki testowej 384 dołków, która zawiera już 10 mikrolitrów rozcieńczeń związku. Końcowe stężenie DMSO w każdym dołku wynosi teraz 1%Inkubuj płytki testowe przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przed przesiewem za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania biblioteki SI RNA. Badania przesiewowe przed akwizycją obrazu, dodać do każdej studzienki płytki testowej 10 mikrolitrów świeżo przygotowanych 30 mikrogramów na mililitr DPI w PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Do badań przesiewowych związków Przed akwizycją obrazu należy wybarwić żywe komórki barwnikiem fluorescencyjnym przepuszczonym przez komórkę daleko czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Załaduj płytki testowe do automatycznego mikroskopu konfokalnego. Ustaw parametry ekspozycji, rejestruj fluorescencję DPI za pomocą lasera wzbudzającego o długości 405 nanometrów z filtrem emisyjnym o długości 450 nanometrów.

Rejestruj fluorescencję GFP za pomocą lasera wzbudzającego o długości 488 nanometrów z filtrem emisyjnym o długości 520 nanometrów. Wybierz dołki i pola w każdym dołku, które mają zostać pobrane, które są następnie nazywane układami i układami podrzędnymi. Parametry generują plik eksperymentów przy użyciu ustawionych parametrów i uruchamiają automatyczną akwizycję.

W tym przypadku rejestrowane są cztery różne obrazy tej samej studni i pola, które przesyłają obrazy na zdalny serwer. Następnie obrazy są oceniane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu acapella 2.6 w celu przeprowadzenia badań przesiewowych SI RNA. Każde pole zawiera dwa kanały lub kolory.

Zielony dla bakterii i niebieski dla komórki. Jądra wykrywają jądra komórkowe z kanału DAPI za pomocą algorytmu detekcji jąder, a obszar bakteryjny z kanału GFP za pomocą algorytmu właściwości intensywności pikseli. Łącząc kanały i zliczając liczbę pikseli współdzielonych zarówno przez bakterie, jak i komórki, bakterie wewnątrzkomórkowe są określane ilościowo.

Końcowe wyniki wyrażone jako średnia z czterech pól to całkowita powierzchnia bakterii, całkowita liczba komórek, procent zakażonych komórek i obszar bakteryjny na komórkę. W przypadku badań przesiewowych złożonych każde pole zawiera dwa kanały lub kolory, zielony dla bakterii i daleki czerwony dla komórki. Jądra i cytoplazma wykrywają obszar komórki z dalekiego kanału czerwonego i obszar bakteryjny z kanału GFP za pomocą algorytmu właściwości intensywności pikseli.

Łącząc kanały i zliczając liczbę pikseli wspólnych zarówno dla bakterii, jak i jąder, bakterie wewnątrzkomórkowe są określane ilościowo. Końcowe wyniki wyrażone jako średnia z czterech pól to całkowita powierzchnia bakterii, całkowita powierzchnia komórkowa, całkowita powierzchnia bakterii wewnątrzkomórkowych oraz stosunek wewnątrzkomórkowej powierzchni bakteryjnej do całkowitej powierzchni komórek. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki wysokoprzepustowych badań przesiewowych SI RNA obejmujących cały genom, wyciszenie ekspresji din one za pomocą SI RNA doprowadziło do zmniejszenia ilości prątków wewnątrzkomórkowych w 5 49 komórkach.

Jak pokazano na tych reprezentatywnych obrazach konfokalnych 5 49 komórek transfekowanych niedocelowym IRNA lub SI RNA specyficznym dla din jeden i zakażonych GFP eksprymującym MTB przez pięć dni. GFP MT BH 37 RV został uwidoczniony na zielono, a komórki na czerwono. Liczbę komórek i wewnątrzkomórkowe obciążenie G-F-P-M-T-B-H 37 RV określono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Ten wykres pokazuje procent zainfekowanych 5 49 komórek w pięciu powtórzeniach szyfrującego IRNA reprezentowanego przez niebieskie kółka i din jeden irna reprezentowany przez czerwone kółka. Po trzech dniach wyciszania i pięciu dniach infekcji odsetek zakażonych komórek zmniejsza się o połowę w przypadku wyciszenia 5 49 komórek w porównaniu z komórkami transfekowanymi niedocelowym mieszaczem IRNA. Do zdefiniowania wskaźnika Z zastosowano opartą na próbie normalizację SI RNA ukierunkowaną na DIN jeden w porównaniu z mieszaniem.

Średni wynik Z wynoszący około minus 15 uzyskano dla SI, docelowego wskaźnika DIN. Trzy gwiazdki reprezentują wartość P mniejszą niż 0,0001. Wyniki te wskazują, że DIN one może być stosowany jako kontrola pozytywna dla si, badania przesiewowego do odkrywania innych nowych czynników gospodarza zaangażowanych w kolonizację MTB i pneumocytów, które mogą mieć ten sam fenotyp, co w przypadku dins IRNA w badaniach przesiewowych związków o wysokiej zawartości.

Skuteczność związku w wewnątrzkomórkowym wzroście bakterii oceniano, ustalając krzywą dawka-odpowiedź lub DRC i normalizując do referencyjnych związków dodatnich i ujemnych. W tym przykładzie ludzkie pierwotne makrofagi zakażone szczepem A GFP eksprymującym MTBH 37 RV inkubowano z 1% DMSO jako kontrolę ujemną lub ze zwiększającymi się stężeniami dwóch związków odniesienia, isid, INH i ryfampicyny. RIF. Makrofagi są znakowane czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, a zielony kolor wskazuje, że analiza MTB konfokalnych obrazów fluorescencyjnych zakażonych ludzkich makrofagów wykazała, że związki czynne wpływają na wewnątrzkomórkową replikację MTB w komórkach gospodarza, prowadząc do zmniejszenia obciążenia prątkami, co odpowiada obszarowi sygnału GFP w komórkach.

Stosunek między wewnątrzkomórkową powierzchnią bakteryjną a całkowitą powierzchnią komórki został obliczony, a następnie wykreślony jako funkcja stężenia związków w celu wygenerowania DRC pokazanego tutaj są DRC isidu i ryfampicyny na każdym wykresie. DRC związku znormalizowano do 1% DMSO, kontroli negatywnej i 0,1 mikrograma na mililitr kontroli pozytywnej. Krzywe te pozwalają na określenie zarówno stężenia wymaganego do zahamowania 50% kolonizacji bakteryjnej, jak i minimalnego stężenia wymaganego do zahamowania 99% replikacji bakterii w ciągu jednego semestru.

Technikę tę można wykonać w ciągu 10 godzin podzielonych w następujący sposób: dwie godziny na transfekcję komórek lub przygotowanie związku, sześć godzin na infekcję komórek i dozowanie do mikropłytki oraz dwie godziny na podtrzymanie akwizycji obrazu. Nie zapominaj, że praca z prątkami gruźlicy może być niezwykle trudna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować przedwczesne kroki, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, w tym maski.