Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie testu adhezji w komorze z przepływem równoległym przy użyciu systemu podziału emisji z dwiema kamerami w celu jednoczesnego rejestrowania sekwencji obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach. Aby to zrobić, dwie kamery w konfiguracji obrazowania są najpierw wyrównane. Następnie przygotowuje się komórki i substrat reaktywny oraz ustawia się równoległą komorę przepływu płytek.

Ustawienia aparatu są następnie kalibrowane pod kątem akwizycji obrazu dwukolorowego, a wszelkie potrzebne korekty cyfrowe są wprowadzane w celu wyrównania kamery. Następnie rejestrowane są sekwencje obrazów, które pokazują pozyskiwanie dwukolorowych obrazów o wysokiej rozdzielczości czasowej. Przewagą systemów podziału emisji z dwoma kamerami w porównaniu z systemami pojedynczymi kamerami jest to, że do każdej kamery można przypisać różne czasy naświetlania i zachowane jest pełne pole widzenia.

Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie adhezji komórek, takie jak to, w jaki sposób lokalizacja cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek może wpływać na dynamiczne procesy biologiczne, takie jak migracja komórek, stan zapalny i przerzuty raka. Poniższa procedura wymaga mikroskopu odwróconej epifluorescencji. Powinien być wyposażony w źródło światła o dużej intensywności sprzężone z światłowodem, kombinowaną kostkę filtrującą i system kamer z podziałem emisji z dwóch kamer.

Zestaw mikroskopu powinien być podłączony do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do obrazowania, które może zbierać i łączyć obrazy zarejestrowane przez monochromatyczne kamery CCD. W tym przypadku oprogramowanie do obsługi wielu kamer Stream Picks Five jest używane z modułem simul picks. Zacznij od otwarcia strumienia wybiera pięć na wstążce zadań, wybierz obszar roboczy.

Następnie po prawej stronie ekranu otwórz Menedżera przestrzeni roboczej i wybierz nowy obszar roboczy. Po nazwaniu kamery postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby wybrać ze wstępnie wypełnionej listy, chwytak pasujący do modelu kamery, w przestrzeni roboczej pojawi się mała ikona kamery, aby wskazać, że obraz z kamery jest odbierany. Obiekty zobrazowane za pomocą mikroskopu można teraz oglądać na ekranie.

Powtórz ten proces dla drugiego obszaru roboczego kamery, a następnie dla scalonej przestrzeni roboczej powtórz go jeszcze raz, a wszystkie kamery będą używane. Pojawi się komunikat o błędzie. Ten komunikat jest normalnie przypisany do kamer z pierwszego i drugiego obszaru roboczego do połączonego obszaru roboczego w panelu dokowania znajdującym się po prawej stronie ekranu wyświetlania.

Obrazy w pierwszym i drugim obszarze roboczym zostaną nałożone na siebie w scalonym obszarze roboczym jako dwa pseudokolorowe obrazy. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest wyrównanie kamery. Aby zapewnić sukces, korzystamy ze zjeżdżalni producenta, skrupulatnie przestrzegając zaleceń producenta.

Aby ustawić kamery w systemie podziału emisji z dwiema kamerami, wyślij światło jasnego pola lub kontrastu fazowego do okularu mikroskopu. Umieść siatkę kalibracyjną z powłoką metaliczną, która została dostarczona przez producenta, na stoliku mikroskopu i ustaw siatkę pod kątem prostym na stoliku mikroskopu. Wyświetlaj siatkę bez kategoryzacji i bez automatycznego skalowania, ustaw na niej ostrość, a następnie przemieszcz, ale nie zdejmuj obudowy dichroicznej, aby wyrównać kamerę pierwszą.

Następnie, używając pokrętła regulacji ostrości na pierwszym porcie podmorskim, ponownie ustaw ostrość obrazu. Następnie należy całkowicie wsunąć obudowę dichroiczną do dwukanałowego urządzenia akwizycyjnego, tak aby obraz został podzielony przez dichroik do obu kamer. Poluzuj 3 5 60 czwartych dociskowych i obróć drugą kamerę na żeńskim porcie mocowania CM dwa, aż orientacja siatki będzie identyczna na obu obrazach za pomocą pokrętła regulacji ostrości na drugim porcie mocowania C, ustaw ostrość obrazu z kamery dwójnej.

Aby sfinalizować wyrównanie, użyj pokrętła RL po prawej stronie DC Two, aby wyregulować połączone pozycje obrazu do momentu prawego podniesienia. Pionowa granica obrazów jest precyzyjnie wyrównana w scalonej przestrzeni roboczej. Następnie użyj pokrętła UD, aby wyregulować wyrównanie drugiego obrazu w górę, w dół, aż poziome paski siatki zostaną prawidłowo wyrównane.

Jeśli podczas wyrównywania góra-dół nastąpi lekki obrót kamery, rozwiąż ten problem, poluzowując 3 5 60 czwartego cala kamery drugiej i obracając, aż wyświetlany obraz zostanie prawidłowo wyrównany. Przygotować komórki raka piersi BET 20 do testu adhezji w komorze z przepływem równoległym, barwiąc je anty CD 24 i TECA 4 5 2 przy użyciu wtórnych LOR 5 68 i 4 88, jak opisano w dokumencie towarzyszącym, należy upewnić się, że po barwieniu komórek dozujących odpowiednie kontrole pojedynczego koloru do zbiornika komory przepływu równoległych płytek. Podłącz dwie oddzielne długości rurki do otworów wlotowych i wylotowych komory przepływowej.

Jedna probówka połączy się ze zbiornikiem zawierającym oznakowane komórki zawieszone w DPBS plus zawierające 0,1% PSA. Podłącz drugą rurkę do pompy strzykawkowej, która będzie pobierać płyn z określonym natężeniem przepływu. Podłącz przewód próżniowy do komory przepływowej i umieść komorę przepływową nad 35-milimetrowym naczyniem do hodowli tkankowej zawierającym monowarstwę komórek jajnika chomika chińskiego wyrażających lektynę lub komórki cho e.

Wyreguluj komorę przepływu i uszczelkę komory przepływu, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie próżniowe. Pobrać płyn ze zbiornika, monitorując zespół komory przepływowej pod kątem prawidłowego uszczelnienia. Na koniec umieść zespół komory przepływowej na mocy mikroskopu na źródle światła i konfiguracji mikroskopu poprzez ręczną kontrolę.

Upewnij się, że obudowa dichroiczna znajduje się we właściwej wciśniętej pozycji roboczej i nie jest w trybie obejścia. Ręcznie przełącz się w tryb fluorescencji i wybierz zieloną, czerwoną kostkę filtra fluorescencyjnego, aby osobno określić czas ekspozycji i wzmocnienie. Zobrazuj komórki za pomocą czerwonej fluorescencji w kamerze pierwszej i zielonej fluorescencji w kamerze drugiej.

Ręcznie obniż dichroik zgodnie z potrzebami, aby uzyskać obrazy. Następnie zdeponuj zawiesinę komórek BT 20 zabarwionych tylko czerwoną florą. Cztery sprzężone przeciwciała w zbiorniku podłączone do portu wlotowego równoległej komory przepływu płytki.

Użyj pompy strzykawkowej, aby perfaktoryzować komórki BT 20 nad monowarstwą choi w komorze przepływu równoległej płytki. W ustawieniach na żywo w oprogramowaniu do obrazowania dostosuj czas naświetlania aparatu pierwszego, aby uzyskać obraz w kanale czerwonym. Dopasuj czas naświetlania aparatu nr dwa do czasu naświetlania aparatu pierwszego.

Jeśli obraz jest obserwowany w zielonym kanale, obecne są artefakty przebijające. Jeśli tak się stanie, zachowaj ekwiwalent czasu ekspozycji w aparacie pierwszym i drugim i zmniejsz czas naświetlania, aż artefakt przebijający się przez artefakt nie będzie już widoczny w kanale zielonym. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienie pierwszej kamery, aby poprawić widoczność obrazu w kanale czerwonym.

Następnie usuń pozostałą zawiesinę ogniw BT 20 ze zbiornika i zastąp zawiesinę DPBS. Za pomocą pompy strzykawkowej przetaczać roztwór przez monowarstwę choi, aż komórki BT 20 przestaną być widoczne na monowarstwie. Napełnij zbiornik zawiesiną komórek BT 20 barwionych tylko zielonym przeciwciałem sprzężonym z fluorem czterem.

Powtórz proces kalibracji aparatu, używając zielonych elementów sterujących pojedynczym kolorem. Tym razem zdefiniuj czas naświetlania za pomocą kamery drugiej, aby zobrazować komórki w kanale zielonym bez przebijania przez artefakty w kanale czerwonym zebrane przez kamerę pierwszą. Za pomocą oprogramowania do obrazowania można jednocześnie wyświetlać obrazy zarejestrowane z dwóch monochromatycznych kamer CCD w komorze przepływowej. Eksperyment.

Scal obrazy zebrane z obu kamer za pomocą modułu simul pics wybranych strumieni. Użyj cyfrowych korekt korekcji w symul picie lub alternatywnym oprogramowaniu, aby wyrównać przestrzennie scalone obrazy. W razie potrzeby obrazy można skorygować za pomocą modułu simul do regulacji w poziomie, pionie i obrocie.

System jest teraz gotowy do użycia w celu jednoczesnego rejestrowania dwóch kolorowych obrazów. Test adhezji w komorze z przepływem równoległym został wykorzystany do zademonstrowania opisanego w tym filmie systemu podziału emisji z dwiema kamerami. Jak pokazano tutaj, system wykrył komórki BT 20, które były znakowane fluorescencyjnie anty-ludzkim CD 24 pokazanym na czerwono i HECA 4 52, który wiąże się z cząsteczkami związanymi z SCOs pokazanymi na zielono.

Niektóre toczące się komórki wyświetlały czerwone, ale nie zielone sygnały. Inne wyświetlały zielone sygnały, ale nie czerwone, a jeszcze inne komórki wyświetlały zarówno czerwone, jak i zielone sygnały. Tu. Kamery utrzymały rozdzielczość optyczną i czasową, aby śledzić cechy komórki na komórce, która przewraca się i przewraca, gdy toczy się na reaktywnym podłożu w kierunku przepływu, połączone kanały emisyjne ujawniły rozmieszczenie i kolokalizację CD 24 i nasyconych cząsteczek na powierzchni komórek BT 20 toczących się i przylegających do monowarstw CHO e.

Obrazy te pokazują powiększenie pojedynczej komórki BT 20, w której CD 24 i nasycone cząsteczki lokalizują się i pojawiają się jako żółte do pomarańczowych plamy, gdy czerwone i zielone pseudokolorowe kanały emisyjne są połączone. Wzięte razem. Informacje te pokazują, że system podziału emisji z dwiema kamerami ma rozdzielczość przestrzenną, czasową i optyczną potrzebną do ujawnienia cech komórkowych i molekularnych w zastosowaniach, takich jak testy adhezji w komorze przepływowej, w których komórki szybko poruszają się w polu widzenia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować i skalibrować system podziału emisji z dwiema kamerami lub obrazować test adhezji w komorze z przepływem równoległym w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach. Metodę tę można zastosować do innych testów in vitro, które wykorzystują fluorescencję do badania zachowania komórek.