Name: Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego rejestrowania obrazów w dwóch kanałach emisyjnych przy użyciu systemu podziału emisji z dwiema kamerami. Technika ta umożliwia prowadzenie zaawansowanych badań adhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dr. Douglasowi Goetzowi (Wydział Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej, Uniwersytet Ohio) oraz Dr. Fabianowi Benencii (Wydział Nauk Biomedycznych, Uniwersytet Ohio) za wnikliwe dyskusje i recenzję manuskryptu. Dziękujemy również dr. Christopherowi Huppenbauerowi za pomocne dyskusje techniczne (W. Nuhsbaum Inc.). Prace te były wspierane przez granty z National Science Foundation (CBET-1106118) i National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

1. Instalacja oprogramowania
<ol>
	<li>Kup oprogramowanie StreamPix 5 Multi-Camera z modułem SimulPix lub innym oprogramowaniem do obrazowania, które umożliwia zbieranie i łączenie obrazów zarejestrowanych przez monochromatyczne kamery CCD.</li>
	<li>Minimalne wymagania dla StreamPix 5 obejmują: Komputer wyposażony w Core 2 Duo o częstotliwości 2,4 GHz lub lepszej i 2 GB pamięci RAM lub wyższej. Obsługiwana kamera cyfrowa lub analogowa IEEE i kompatybilny frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 lub 64 bit. Monitor obsługujący rozdzielczość 1 024 x 768 lub wyższą. Karta graficzna o dobrej wydajności 2D (zalecany jest OCU express 16x lub lepszy) i dysk twardy o prędkości 7 200 obr./min do nagrywania w konfiguracji RAID-O.</li>
</ol>
2. Instalacja systemu dwóch kamer zdolnego do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach
<ol>
	<li>Podłącz rozdzielacz emisji DC2 Photometrics lub podobne urządzenie do rozdzielania emisji z dwiema kamerami do mikroskopu, wsuwając adapter DC2 C-mount do portu wideo mikroskopu tak, aby dostępna była obudowa dichroiku na urządzeniu.</li>
	<li>Włóż dwie monochromatyczne kamery CCD do żeńskiego mocowania C-mount 1 i żeńskiego C-mount 2. Preferowane są identyczne kamery. Można używać podobnych kamer, ale kompatybilność zależy od wewnętrznego sprzętu, przede wszystkim przetwornika obrazu CCD.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby wyświetlić obrazy z obu kamer. Poniższe kroki (2.3.1 - 2.3.4) dotyczą StreamPix 5 z modułem SimulPix i muszą być dostosowane do innych programów do obrazowania z wielu kamer.
	<ol>
		<li>Otwórz StreamPix 5 i wybierz "obszar roboczy" na wstążce zadań.</li>
		<li>Otwórz "menedżer przestrzeni roboczej" znajdujący się po prawej stronie ekranu i wybierz "nowy obszar roboczy".</li>
		<li>Po nazwaniu kamery postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby wybrać chwytak z wstępnie wypełnionej listy. Wybierz chwytak pasujący do modelu kamery i powtórz te czynności dla drugiego obszaru roboczego kamery. W przypadku scalonego obszaru roboczego powtórz tę czynność jeszcze raz, ale pojawi się komunikat o błędzie "wszystkie kamery są w użyciu". Ten komunikat jest normalny.</li>
		<li>Po wczytaniu scalonej przestrzeni roboczej przypisz kamery z przestrzeni roboczej 1 i przestrzeni roboczej 2 do scalonej przestrzeni roboczej w panelu dokowania znajdującym się po prawej stronie ekranu wyświetlania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównaj kamery w systemie podziału emisji z dwóch kamer.
	<ol>
		<li>Ustaw kamery w jasnym polu lub kontraście fazowym zgodnie z siatką kalibracyjną dostarczoną przez producenta za pomocą obiektywu PlanApo 40X (lub większego).</li>
		<li>Wyślij światło do okularów mikroskopu, umieść siatkę kalibracyjną z powłoką metaliczną, która została dostarczona przez producenta, na stoliku mikroskopu i ustaw siatkę pod kątem prostym na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Ustaw ostrość na siatce.</li>
		<li>Przesuń, ale nie zdejmuj, obudowę dichroiczną, aby wyrównać kamerę 1 (kamera obejściowa). Wyświetlanie siatki bez kategoryzacji i bez skalowania automatycznego. Ustaw ostrość obrazu za pomocą pokrętła regulacji ostrości na porcie 1 C-mount.</li>
		<li>Wciśnij całkowicie obudowę dichroiczną do dwukanałowego urządzenia akwizycyjnego, tak aby obraz został podzielony przez dichroik do obu kamer.</li>
		<li>Poluzuj trzy dociskowe 5/64" i obróć drugą kamerę na żeńskim C-mount 2, aż orientacja siatki będzie identyczna na obu obrazach. Za pomocą pokrętła regulacji ostrości na porcie 2 C-mount ustaw ostrość na obrazie z aparatu 2</li>.
		<li>Sfinalizuj wyrównanie, korzystając z połączonego obrazu w scalonym obszarze roboczym oprogramowania do obrazowania. Pozwala to zobaczyć w czasie rzeczywistym pseudokolorową nakładkę dwóch obrazów siatki kalibracyjnej. Dostosuj połączone pozycje obrazu, używając tylko pokrętła R/L po prawej stronie DC2. Reguluj to pokrętło, aż prawa/lewa pionowa granica obrazów zostanie dokładnie wyrównana.</li>
		<li>Użyj pokrętła U/D, aby wyregulować wyrównanie drugiego obrazu w górę/w dół, aż poziome paski siatki zostaną prawidłowo wyrównane.</li>
		<li>Jeśli podczas wyrównywania góra/dół nastąpi lekki obrót kamery, rozwiąż ten problem, poluzowując trzy 5/64" cala kamery 2 i obracaj, aż wyświetlany obraz zostanie prawidłowo wyrównany.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek rakowych do testu adhezyjnego w komorze z przepływem równoległym
<ol>
	<li>Hodowla komórek raka piersi BT-20 w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełniona do kompletnej pożywki 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5,0% CO2, jak opisano wcześniej 2.</li>
	<li>Zbierz komórki rakowe za pomocą rozcieńczonej trypsyny i policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Przemyć i zawiesić komórki w stężeniu10-7 komórek/ml w 0,1% albuminie z surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS z wapniem i magnezem (DPBS+).</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe, oczyszczony mysi anty-ludzki CD24 i oczyszczony szczurzy HECA-452 (antygeny anty-sjalofukozylowane), do z góry określonego optymalnego stężenia w 0,1% BSA DPBS+. Inkubuj komórki przez 30 minut 9, 10.</li>
	<li>Odwirować komórki z prędkością 1 200 obr./min, aby uzyskać osad komórkowy. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i dwukrotnie przemyć komórki 0,1% BSA DBPS+.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe, kozie przeciwciała anty-mysie IgG AlexaFluor 568 (maksimum emisji, 603 nm) i kozie przeciwciała antyszczurze IgM AlexaFluor 488 (maksimum emisji, 519 nm), do z góry określonego optymalnego stężenia w 0,1% BSA DPBS+. Inkubować komórki przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie i zawieś w 0,1% BSA DPBS+ w 106 komórek/ml w 0,1% BSA DPBS+.</li>
</ol>
4. Przygotowanie reaktywnego podłoża do testu adhezji w komorze z przepływem równoległym
<ol>
	<li>Podłącz dwie oddzielne długości rurki do portów wlotowych i wylotowych równoległej komory przepływowej płyty, która mieści się w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm. Jedna rurka połączy się ze zbiornikiem oznakowanych komórek zawieszonych w 0,1% BSA DPBS+, a druga z pompą strzykawkową, która będzie pobierać płyn o określonym natężeniu przepływu.</li>
	<li>Podłącz przewód podciśnieniowy do komory przepływowej 1.</li>
	<li>Umieścić komorę przepływową nad naczyniem do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającym monowarstwę komórek jajnika chomika chińskiego wykazujących ekspresję selektyny E (CHO-E). Komórki CHO-E hodowano w kompletnym pożywce MEM w temperaturze 37 °C i 5,0% CO2 2.</li>
	<li>Wyreguluj komorę przepływu i/lub uszczelkę komory przepływu, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie próżniowe 1.</li>
	<li>Pobrać płyn ze zbiornika, monitorując zespół komory przepływowej pod kątem prawidłowego uszczelnienia i braku wizualnych dowodów na tworzenie się pęcherzyków powietrza 1.</li>
	<li>Umieść zespół komory przepływowej w mikroskopie (Leica DMI 6000B)1.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazu dwukolorowego
<ol>
	<li>Zasil kompaktowe źródło światła Leica EL-6000 lub podobne urządzenie, aby generować światło o dużej intensywności i połącz je w światłowód. Użyj odwróconego mikroskopu, aby przepuścić to światło przez kombinowaną kostkę filtracyjną, tj. kostkę filtra G / R (zielony / czerwony), aby wzbudzić fluorofory o pożądanym kolorze/intensywności.</li>
	<li>Upewnij się, że obudowa dichroiczna znajduje się we właściwej pozycji roboczej (wciśnięta) i nie jest w trybie obejścia.</li>
	<li>Uruchom mikroskop w trybie fluorescencji i wybierz odpowiednią kostkę filtra fluorescencyjnego (zielony/czerwony).</li>
	<li>Określ czas ekspozycji i wzmocnienie w aparacie 1 (czerwony; 620±60 nm) i aparacie 2 (zielony; 535±40 nm).
	<ol>
		<li>Wciśnij dichroik, aby uzyskać obrazy zarówno w czerwonym, jak i zielonym kanale emisji. Użyj testu w komorze przepływowej z komórkami znakowanymi tylko czerwonym fluoroforem i uzyskaj obraz w kanale czerwonym, dostosowując czas ekspozycji kamery 1 w "ustawieniach na żywo" oprogramowania do obrazowania.</li>
		<li>Dopasuj czas naświetlania kamery 2 do czasu naświetlania aparatu 1. Jeśli obraz jest obserwowany w kanale zielonym, obecne są artefakty przebijające, a czas ekspozycji w obu kamerach musi zostać skrócony.</li>
		<li>Zachowując równoważny czas ekspozycji w kamerze 1 i kamerze 2, skróć czas ekspozycji, aż artefakt przebijający przestanie być widoczny w kanale zielonym. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienie kamery 1, aby poprawić widoczność obrazu w kanale czerwonym.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.4.1 - 5.4.3 z komórkami oznaczonymi tylko zielonym fluoroforem, ale zdefiniuj czas ekspozycji za pomocą kamery 2, aby zobrazować komórki w kanale zielonym bez artefaktów przebijania w kanale czerwonym zebranym przez kamerę 1.</li>
		<li>Miareczkowanie przeciwciał należy retitować, jeśli nie można wyeliminować artefaktów przebijania 11 lub jeśli czasy ekspozycji kamery 1 i kamery 2 znacznie się różnią, tak że połączone obrazy mogą być czasowo niewyrównane.</li>
	</ol>
	</li>
 <li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby wyświetlić obrazy jednocześnie zarejestrowane z dwóch monochromatycznych kamer CCD w eksperymencie w komorze przepływowej.</li>
 <li>Łącz obrazy zebrane z obu kamer za pomocą modułu SimulPix w Streampix 5 lub alternatywnego pakietu oprogramowania.</li>
 <li>W razie potrzeby użyj cyfrowych korekt korekcji w SimulPix lub alternatywnym oprogramowaniu, aby wyrównać przestrzennie scalone obrazy. Obrazy można korygować za pomocą modułu SimulPix w celu regulacji w poziomie, pionie i obracaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529(2012).</li>
<li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((carcinoma+cell+glycolipids%2C+integrins%2C+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li>
<li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li>
<li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion%3A+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li>
<li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow%3A+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li>
<li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells%3A+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?</a> Front. Oncol. 2, 103(2012).</li>
<li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffman%2C+GE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li>
<li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li>
<li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li>
<li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%3A+a+custom+technology+platform+for+high-speed%2C+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li>
<li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li>
<li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+%28CXCL4%29+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

System podziału emisji z dwiema kamerami ma rozdzielczość przestrzenną, czasową i optyczną potrzebną do rejestrowania wysokiej jakości obrazów w zastosowaniach, w których ruch komórek lub molekularnych jest szybki. Generując reprezentatywne wyniki, parametry w systemie podziału emisji z dwiema kamerami, w tym ustawienia oprogramowania i ustawienia kamery, zostały zoptymalizowane w celu uzyskania połączonej sekwencji obrazu, w której toczące się i przylegające komórki były wyrównane przestrzennie i czasowo. Ten etap optym...

Metody analizy cząsteczek na powierzchni komórki, takie jak barwienie immunologiczne, wykorzystują sondy, które są chemicznie sprzężone z fluoroforami, co pozwala na wykrycie docelowych cząsteczek. Obrazowanie żywych komórek i hydrodynamiczne testy adhezji komórek oparte na przepływie są zwykle rejestrowane za pomocą monochromatycznych kamer CCD zaprojektowanych do rejestrowania procesów fizjologicznych na poziomie komórkowym i/lub molekularnym 1, 2. Kamery te są bardzo czułe, zapewniają dużą liczbę klatek na sekundę (ponad 30 klatek na sekundę) i zapewniają wyjątkową rozdzielczość czasową (ze względu na dużą liczbę klatek na sekundę i krótkie czasy naświetlania). Jednak kamery monochromatyczne mogą rejestrować tylko jeden kanał emisyjny (wykrywający pojedynczy fluorofor) w celu zbierania obrazów. Systemy podziału emisji z jednej kamery mogą być włączone w celu przechwytywania wielu kanałów emisji, ale często zmniejszają pole widzenia i wymagają tego samego czasu ekspozycji do obrazowania wszystkich kanałów. Aby uchwycić pełne spektrum kolorów z komórek oznaczonych wieloma fluoroforami, alternatywą może być użycie kolorowej kamery. Jednak kolorowe kamery na ogół nie są w stanie zapewnić rozdzielczości czasowej wymaganej do obrazowania żywych komórek w niektórych zastosowaniach. Inne urządzenie do obrazowania jest potrzebne do zastosowań, w których korzystne jest obrazowanie żywych komórek na wielu długościach fal przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości czasowej. Podstawowym zastosowaniem eksperymentalnym jest test adhezji w komorze z przepływem równoległym, w którym komórki są perfundowane w fizjologicznie odpowiednich warunkach na potencjalnie reaktywnym substracie 1, 3. Komórki w przepływie, które wyrażają określone cząsteczki powierzchniowe komórki, mogą przylegać i toczyć się po podłożu, takim jak monowarstwa komórkowa wyrażająca cząsteczki adhezyjne lub zaadsorbowane powierzchniowo białka macierzy zewnątrzkomórkowej 4, 5. Toczące się komórki mogą ulegać ruchom rotacyjnym i translacyjnym w ułamkach sekundy. Cechy molekularne na toczących się i przylegających komórkach, takie jak skupiska cząsteczek na powierzchni komórki, również mogą ulegać aktywnej reorganizacji na powierzchni komórki. W związku z tym systemy obrazowania muszą zapewniać wyjątkową rozdzielczość czasową (30 klatek na sekundę lub więcej i "prawie zerowe" czasy ekspozycji), aby wygenerować sekwencję obrazu, która ilustruje krok po kroku postęp toczenia się komórek 6, 7. Systemy podziału emisji z dwiema kamerami są w stanie spełnić te wymagania w przypadku komórek obrazowania znakowanych wieloma fluoroforami.
Systemy podziału emisji z dwóch kamer dzielą i filtrują kanały fluorescencji na dwie podobne kamery, aby jednocześnie rejestrować dwa identyczne przestrzennie, ale specyficzne dla fluoroforu obrazy, zachowując pełne pole widzenia. Technologia ta umożliwia bezpośrednie porównywanie obrazu uchwyconego w czasie rzeczywistym w każdym kanale i pozwala użytkownikowi szybko przełączać się między modelami kamer o różnych możliwościach obrazowania. Ta funkcja jest przydatna do wprowadzania zmian w ustawieniach przechwytywania obrazu w jednym aparacie, które lepiej pozwalają systemowi na wychwytywanie fluoroforów o różnej intensywności, czasie życia i współczynnikach ekstynkcji 8. W połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania, systemy podziału emisji z dwiema kamerami umożliwiają rejestrowanie w czasie rzeczywistym testów obrazowania żywych komórek na wielu długościach fal i mogą usprawnić testy in vitro, które wykorzystują fluorescencję do badania zachowania komórek.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik/Materiał</silny></td></tr><tr><td>BT-20 komórki</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E</td><td>Cells Prezent od Dr. R. Sacksteina (Brigham and Women' s Szpital, Harvard Medical School)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna / 0,1% EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 przeciwciało monoklonalne</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne antyludzkie CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw szczurom IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw myszym AlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EXi Niebieska mikroskopia fluorescencyjna Cyfrowa kamera CCD</td> Q <td>Obrazowanie</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retiga EXi FAST 1394 Cyfrowa kamera CCD</td><td>Q Obrazowanie</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 Rozdzielacz emisji</td><td>Fotometria</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Streampix 5</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: zastosowania adhezji komórek

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Wielokolorowa mikroskopia immunofluorescencyjna do wykrywania określonych cząsteczek w błonie komórkowej może być połączona z równoległymi testami w komorze przepływu płytek w celu zbadania mechanizmów regulujących adhezję komórek w warunkach dynamicznego przepływu. Na przykład komórki rakowe znakowane wieloma fluoroforami mogą być perfundowane na potencjalnie reaktywnym substracie w celu modelowania mechanizmów przerzutów raka. Jednak wielokanałowe systemy jednokamerowe i kamery kolorowe wykazują braki w pozyskiwaniu obrazu do analizy komórek w czasie rzeczywistym. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy system podziału emisji z dwiema kamerami, aby jednocześnie rejestrować w czasie rzeczywistym sekwencje obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek w komorze przepływowej. Dwukamerowe systemy podziału emisji filtrują zdefiniowane zakresy długości fal do dwóch monochromatycznych kamer CCD, rejestrując w ten sposób jednocześnie dwa identyczne przestrzennie, ale specyficzne dla fluoroforu obrazy. Następnie, jednokanałowe obrazy o pseudokolorowych kolorach są łączone w jedną sekwencję scaloną w czasie rzeczywistym, która może ujawnić wiele docelowych cząsteczek na komórkach poruszających się szybko w obszarze zainteresowania.

Do wykazania działania systemu rozdzielania emisji z dwiema kamerami, który jednocześnie rejestrował sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisji, zastosowano test adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami (Rysunek 1). System rozdzielania emisji z dwiema kamerami wykrywał komórki BT-20 znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkiemu CD24 oraz HECA-452 (wykrywając antygeny sialofukozylowane) oraz odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi (Rys...

Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie testu adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami z wykorzystaniem systemu rozdzielania emisji z dwiema kamerami w celu jednoczesnej rejestracji sekwencji obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach. W tym celu w pierwszej kolejności należy wyrównać obie kamery w układzie obrazującym. Następnie przygotowuje się komórki i reaktywne podłoże oraz montuje komorę przepływową z równoległymi płytkami.Następnie kalibruje się ustawienia kamery do akwizycji dwukolorowych obrazów i wprowadza wszelkie niezbędne korekty cyfrowe w celu wyrównania kamer. Następnie rejestruje się sekwencje obrazów, które demonstrują akwizycję obrazów dwukolorowych z wysoką rozdzielczością czasową. Przewagą systemów rozdzielania emisji z dwiema kamerami nad systemami z jedną kamerą jest możliwość przypisania różnych czasów ekspozycji dla każdej kamery przy zachowaniu pełnego pola widzenia.Technika ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny adhezji komórkowej, takie jak wpływ lokalizacji cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek na dynamiczne procesy biologiczne, m.in. migrację komórek, stan zapalny oraz przerzuty nowotworowe.

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Jednoczesne rejestrowanie obrazów rzeczywistych w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą układu podzielonej emisji z dwoma kamerami: zastosowania do adhezji komórkowej

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Źródło: Bello-Gamboa, A. et al., Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej.J. Vis. Exp.(2019 rok) Ten film demonstruje badanie in vitro tworzenia synaps immunologicznych między komórką prezentującą antygen a limfocytami T pomocniczymi za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Receptory limfocytów T pomocniczych oddziałują z kompleksem antygenu-MHC-II w komórkach prezentujących antygen i tworzą synapsy immunologiczne, po których następują ruchy pęcherzyków wydzielniczych w kierunku synapsy, co...

Tworzenie synaps immunologicznych między limfocytami T pomocniczymi a komórkami prezentującymi antygen

Źródło: Kulkarni, M. et al. Obrazowanie ca2+ Dynamika w stożku fotoreceptorów zakończeń aksonów siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków transgenicznej siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania wycinków siatkówki, obrazowania biosensorów wapnia opartych na FRET oraz analizy zmian fluorescencji w celu ilościowego określenia poziomu wapnia przy oświetleniu tła i...

Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Poznaj metodę jednoczesnego rejestrowania obrazów w dwóch kanałach emisyjnych przy użyciu systemu podziału emisji z dwiema kamerami. Technika ta umożliwia prowadzenie zaawansowanych badań adhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową.

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Przeglądaj więcej filmów