Name: Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego rejestrowania obrazów w dwóch kanałach emisyjnych przy użyciu systemu podziału emisji z dwiema kamerami. Technika ta umożliwia prowadzenie zaawansowanych badań adhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dr. Douglasowi Goetzowi (Wydział Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej, Uniwersytet Ohio) oraz Dr. Fabianowi Benencii (Wydział Nauk Biomedycznych, Uniwersytet Ohio) za wnikliwe dyskusje i recenzję manuskryptu. Dziękujemy również dr. Christopherowi Huppenbauerowi za pomocne dyskusje techniczne (W. Nuhsbaum Inc.). Prace te były wspierane przez granty z National Science Foundation (CBET-1106118) i National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

1. Instalacja oprogramowania
<ol>
	<li>Kup oprogramowanie StreamPix 5 Multi-Camera z modułem SimulPix lub innym oprogramowaniem do obrazowania, które umożliwia zbieranie i łączenie obrazów zarejestrowanych przez monochromatyczne kamery CCD.</li>
	<li>Minimalne wymagania dla StreamPix 5 obejmują: Komputer wyposażony w Core 2 Duo o częstotliwości 2,4 GHz lub lepszej i 2 GB pamięci RAM lub wyższej. Obsługiwana kamera cyfrowa lub analogowa IEEE i kompatybilny frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 lub 64 bit. Monitor obsługujący rozdzielczość 1 024 x 768 lub wyższą. Karta graficzna o dobrej wydajności 2D (zalecany jest OCU express 16x lub lepszy) i dysk twardy o prędkości 7 200 obr./min do nagrywania w konfiguracji RAID-O.</li>
</ol>
2. Instalacja systemu dwóch kamer zdolnego do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach
<ol>
	<li>Podłącz rozdzielacz emisji DC2 Photometrics lub podobne urządzenie do rozdzielania emisji z dwiema kamerami do mikroskopu, wsuwając adapter DC2 C-mount do portu wideo mikroskopu tak, aby dostępna była obudowa dichroiku na urządzeniu.</li>
	<li>Włóż dwie monochromatyczne kamery CCD do żeńskiego mocowania C-mount 1 i żeńskiego C-mount 2. Preferowane są identyczne kamery. Można używać podobnych kamer, ale kompatybilność zależy od wewnętrznego sprzętu, przede wszystkim przetwornika obrazu CCD.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby wyświetlić obrazy z obu kamer. Poniższe kroki (2.3.1 - 2.3.4) dotyczą StreamPix 5 z modułem SimulPix i muszą być dostosowane do innych programów do obrazowania z wielu kamer.
	<ol>
		<li>Otwórz StreamPix 5 i wybierz "obszar roboczy" na wstążce zadań.</li>
		<li>Otwórz "menedżer przestrzeni roboczej" znajdujący się po prawej stronie ekranu i wybierz "nowy obszar roboczy".</li>
		<li>Po nazwaniu kamery postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby wybrać chwytak z wstępnie wypełnionej listy. Wybierz chwytak pasujący do modelu kamery i powtórz te czynności dla drugiego obszaru roboczego kamery. W przypadku scalonego obszaru roboczego powtórz tę czynność jeszcze raz, ale pojawi się komunikat o błędzie "wszystkie kamery są w użyciu". Ten komunikat jest normalny.</li>
		<li>Po wczytaniu scalonej przestrzeni roboczej przypisz kamery z przestrzeni roboczej 1 i przestrzeni roboczej 2 do scalonej przestrzeni roboczej w panelu dokowania znajdującym się po prawej stronie ekranu wyświetlania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównaj kamery w systemie podziału emisji z dwóch kamer.
	<ol>
		<li>Ustaw kamery w jasnym polu lub kontraście fazowym zgodnie z siatką kalibracyjną dostarczoną przez producenta za pomocą obiektywu PlanApo 40X (lub większego).</li>
		<li>Wyślij światło do okularów mikroskopu, umieść siatkę kalibracyjną z powłoką metaliczną, która została dostarczona przez producenta, na stoliku mikroskopu i ustaw siatkę pod kątem prostym na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Ustaw ostrość na siatce.</li>
		<li>Przesuń, ale nie zdejmuj, obudowę dichroiczną, aby wyrównać kamerę 1 (kamera obejściowa). Wyświetlanie siatki bez kategoryzacji i bez skalowania automatycznego. Ustaw ostrość obrazu za pomocą pokrętła regulacji ostrości na porcie 1 C-mount.</li>
		<li>Wciśnij całkowicie obudowę dichroiczną do dwukanałowego urządzenia akwizycyjnego, tak aby obraz został podzielony przez dichroik do obu kamer.</li>
		<li>Poluzuj trzy dociskowe 5/64" i obróć drugą kamerę na żeńskim C-mount 2, aż orientacja siatki będzie identyczna na obu obrazach. Za pomocą pokrętła regulacji ostrości na porcie 2 C-mount ustaw ostrość na obrazie z aparatu 2</li>.
		<li>Sfinalizuj wyrównanie, korzystając z połączonego obrazu w scalonym obszarze roboczym oprogramowania do obrazowania. Pozwala to zobaczyć w czasie rzeczywistym pseudokolorową nakładkę dwóch obrazów siatki kalibracyjnej. Dostosuj połączone pozycje obrazu, używając tylko pokrętła R/L po prawej stronie DC2. Reguluj to pokrętło, aż prawa/lewa pionowa granica obrazów zostanie dokładnie wyrównana.</li>
		<li>Użyj pokrętła U/D, aby wyregulować wyrównanie drugiego obrazu w górę/w dół, aż poziome paski siatki zostaną prawidłowo wyrównane.</li>
		<li>Jeśli podczas wyrównywania góra/dół nastąpi lekki obrót kamery, rozwiąż ten problem, poluzowując trzy 5/64" cala kamery 2 i obracaj, aż wyświetlany obraz zostanie prawidłowo wyrównany.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek rakowych do testu adhezyjnego w komorze z przepływem równoległym
<ol>
	<li>Hodowla komórek raka piersi BT-20 w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełniona do kompletnej pożywki 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5,0% CO2, jak opisano wcześniej 2.</li>
	<li>Zbierz komórki rakowe za pomocą rozcieńczonej trypsyny i policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Przemyć i zawiesić komórki w stężeniu10-7 komórek/ml w 0,1% albuminie z surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS z wapniem i magnezem (DPBS+).</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe, oczyszczony mysi anty-ludzki CD24 i oczyszczony szczurzy HECA-452 (antygeny anty-sjalofukozylowane), do z góry określonego optymalnego stężenia w 0,1% BSA DPBS+. Inkubuj komórki przez 30 minut 9, 10.</li>
	<li>Odwirować komórki z prędkością 1 200 obr./min, aby uzyskać osad komórkowy. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i dwukrotnie przemyć komórki 0,1% BSA DBPS+.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe, kozie przeciwciała anty-mysie IgG AlexaFluor 568 (maksimum emisji, 603 nm) i kozie przeciwciała antyszczurze IgM AlexaFluor 488 (maksimum emisji, 519 nm), do z góry określonego optymalnego stężenia w 0,1% BSA DPBS+. Inkubować komórki przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie i zawieś w 0,1% BSA DPBS+ w 106 komórek/ml w 0,1% BSA DPBS+.</li>
</ol>
4. Przygotowanie reaktywnego podłoża do testu adhezji w komorze z przepływem równoległym
<ol>
	<li>Podłącz dwie oddzielne długości rurki do portów wlotowych i wylotowych równoległej komory przepływowej płyty, która mieści się w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm. Jedna rurka połączy się ze zbiornikiem oznakowanych komórek zawieszonych w 0,1% BSA DPBS+, a druga z pompą strzykawkową, która będzie pobierać płyn o określonym natężeniu przepływu.</li>
	<li>Podłącz przewód podciśnieniowy do komory przepływowej 1.</li>
	<li>Umieścić komorę przepływową nad naczyniem do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającym monowarstwę komórek jajnika chomika chińskiego wykazujących ekspresję selektyny E (CHO-E). Komórki CHO-E hodowano w kompletnym pożywce MEM w temperaturze 37 °C i 5,0% CO2 2.</li>
	<li>Wyreguluj komorę przepływu i/lub uszczelkę komory przepływu, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie próżniowe 1.</li>
	<li>Pobrać płyn ze zbiornika, monitorując zespół komory przepływowej pod kątem prawidłowego uszczelnienia i braku wizualnych dowodów na tworzenie się pęcherzyków powietrza 1.</li>
	<li>Umieść zespół komory przepływowej w mikroskopie (Leica DMI 6000B)1.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazu dwukolorowego
<ol>
	<li>Zasil kompaktowe źródło światła Leica EL-6000 lub podobne urządzenie, aby generować światło o dużej intensywności i połącz je w światłowód. Użyj odwróconego mikroskopu, aby przepuścić to światło przez kombinowaną kostkę filtracyjną, tj. kostkę filtra G / R (zielony / czerwony), aby wzbudzić fluorofory o pożądanym kolorze/intensywności.</li>
	<li>Upewnij się, że obudowa dichroiczna znajduje się we właściwej pozycji roboczej (wciśnięta) i nie jest w trybie obejścia.</li>
	<li>Uruchom mikroskop w trybie fluorescencji i wybierz odpowiednią kostkę filtra fluorescencyjnego (zielony/czerwony).</li>
	<li>Określ czas ekspozycji i wzmocnienie w aparacie 1 (czerwony; 620±60 nm) i aparacie 2 (zielony; 535±40 nm).
	<ol>
		<li>Wciśnij dichroik, aby uzyskać obrazy zarówno w czerwonym, jak i zielonym kanale emisji. Użyj testu w komorze przepływowej z komórkami znakowanymi tylko czerwonym fluoroforem i uzyskaj obraz w kanale czerwonym, dostosowując czas ekspozycji kamery 1 w "ustawieniach na żywo" oprogramowania do obrazowania.</li>
		<li>Dopasuj czas naświetlania kamery 2 do czasu naświetlania aparatu 1. Jeśli obraz jest obserwowany w kanale zielonym, obecne są artefakty przebijające, a czas ekspozycji w obu kamerach musi zostać skrócony.</li>
		<li>Zachowując równoważny czas ekspozycji w kamerze 1 i kamerze 2, skróć czas ekspozycji, aż artefakt przebijający przestanie być widoczny w kanale zielonym. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienie kamery 1, aby poprawić widoczność obrazu w kanale czerwonym.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.4.1 - 5.4.3 z komórkami oznaczonymi tylko zielonym fluoroforem, ale zdefiniuj czas ekspozycji za pomocą kamery 2, aby zobrazować komórki w kanale zielonym bez artefaktów przebijania w kanale czerwonym zebranym przez kamerę 1.</li>
		<li>Miareczkowanie przeciwciał należy retitować, jeśli nie można wyeliminować artefaktów przebijania 11 lub jeśli czasy ekspozycji kamery 1 i kamery 2 znacznie się różnią, tak że połączone obrazy mogą być czasowo niewyrównane.</li>
	</ol>
	</li>
 <li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby wyświetlić obrazy jednocześnie zarejestrowane z dwóch monochromatycznych kamer CCD w eksperymencie w komorze przepływowej.</li>
 <li>Łącz obrazy zebrane z obu kamer za pomocą modułu SimulPix w Streampix 5 lub alternatywnego pakietu oprogramowania.</li>
 <li>W razie potrzeby użyj cyfrowych korekt korekcji w SimulPix lub alternatywnym oprogramowaniu, aby wyrównać przestrzennie scalone obrazy. Obrazy można korygować za pomocą modułu SimulPix w celu regulacji w poziomie, pionie i obracaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529(2012).</li>
<li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((carcinoma+cell+glycolipids%2C+integrins%2C+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li>
<li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li>
<li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion%3A+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li>
<li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow%3A+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li>
<li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells%3A+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?</a> Front. Oncol. 2, 103(2012).</li>
<li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffman%2C+GE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li>
<li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li>
<li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li>
<li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%3A+a+custom+technology+platform+for+high-speed%2C+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li>
<li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li>
<li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+%28CXCL4%29+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

System podziału emisji z dwiema kamerami ma rozdzielczość przestrzenną, czasową i optyczną potrzebną do rejestrowania wysokiej jakości obrazów w zastosowaniach, w których ruch komórek lub molekularnych jest szybki. Generując reprezentatywne wyniki, parametry w systemie podziału emisji z dwiema kamerami, w tym ustawienia oprogramowania i ustawienia kamery, zostały zoptymalizowane w celu uzyskania połączonej sekwencji obrazu, w której toczące się i przylegające komórki były wyrównane przestrzennie i czasowo. Ten etap optym...

Metody analizy cząsteczek na powierzchni komórki, takie jak barwienie immunologiczne, wykorzystują sondy, które są chemicznie sprzężone z fluoroforami, co pozwala na wykrycie docelowych cząsteczek. Obrazowanie żywych komórek i hydrodynamiczne testy adhezji komórek oparte na przepływie są zwykle rejestrowane za pomocą monochromatycznych kamer CCD zaprojektowanych do rejestrowania procesów fizjologicznych na poziomie komórkowym i/lub molekularnym 1, 2. Kamery te są bardzo czułe, zapewniają dużą liczbę klatek na sekundę (ponad 30 klatek na sekundę) i zapewniają wyjątkową rozdzielczość czasową (ze względu na dużą liczbę klatek na sekundę i krótkie czasy naświetlania). Jednak kamery monochromatyczne mogą rejestrować tylko jeden kanał emisyjny (wykrywający pojedynczy fluorofor) w celu zbierania obrazów. Systemy podziału emisji z jednej kamery mogą być włączone w celu przechwytywania wielu kanałów emisji, ale często zmniejszają pole widzenia i wymagają tego samego czasu ekspozycji do obrazowania wszystkich kanałów. Aby uchwycić pełne spektrum kolorów z komórek oznaczonych wieloma fluoroforami, alternatywą może być użycie kolorowej kamery. Jednak kolorowe kamery na ogół nie są w stanie zapewnić rozdzielczości czasowej wymaganej do obrazowania żywych komórek w niektórych zastosowaniach. Inne urządzenie do obrazowania jest potrzebne do zastosowań, w których korzystne jest obrazowanie żywych komórek na wielu długościach fal przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości czasowej. Podstawowym zastosowaniem eksperymentalnym jest test adhezji w komorze z przepływem równoległym, w którym komórki są perfundowane w fizjologicznie odpowiednich warunkach na potencjalnie reaktywnym substracie 1, 3. Komórki w przepływie, które wyrażają określone cząsteczki powierzchniowe komórki, mogą przylegać i toczyć się po podłożu, takim jak monowarstwa komórkowa wyrażająca cząsteczki adhezyjne lub zaadsorbowane powierzchniowo białka macierzy zewnątrzkomórkowej 4, 5. Toczące się komórki mogą ulegać ruchom rotacyjnym i translacyjnym w ułamkach sekundy. Cechy molekularne na toczących się i przylegających komórkach, takie jak skupiska cząsteczek na powierzchni komórki, również mogą ulegać aktywnej reorganizacji na powierzchni komórki. W związku z tym systemy obrazowania muszą zapewniać wyjątkową rozdzielczość czasową (30 klatek na sekundę lub więcej i "prawie zerowe" czasy ekspozycji), aby wygenerować sekwencję obrazu, która ilustruje krok po kroku postęp toczenia się komórek 6, 7. Systemy podziału emisji z dwiema kamerami są w stanie spełnić te wymagania w przypadku komórek obrazowania znakowanych wieloma fluoroforami.
Systemy podziału emisji z dwóch kamer dzielą i filtrują kanały fluorescencji na dwie podobne kamery, aby jednocześnie rejestrować dwa identyczne przestrzennie, ale specyficzne dla fluoroforu obrazy, zachowując pełne pole widzenia. Technologia ta umożliwia bezpośrednie porównywanie obrazu uchwyconego w czasie rzeczywistym w każdym kanale i pozwala użytkownikowi szybko przełączać się między modelami kamer o różnych możliwościach obrazowania. Ta funkcja jest przydatna do wprowadzania zmian w ustawieniach przechwytywania obrazu w jednym aparacie, które lepiej pozwalają systemowi na wychwytywanie fluoroforów o różnej intensywności, czasie życia i współczynnikach ekstynkcji 8. W połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania, systemy podziału emisji z dwiema kamerami umożliwiają rejestrowanie w czasie rzeczywistym testów obrazowania żywych komórek na wielu długościach fal i mogą usprawnić testy in vitro, które wykorzystują fluorescencję do badania zachowania komórek.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik/Materiał</silny></td></tr><tr><td>BT-20 komórki</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E</td><td>Cells Prezent od Dr. R. Sacksteina (Brigham and Women' s Szpital, Harvard Medical School)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna / 0,1% EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 przeciwciało monoklonalne</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne antyludzkie CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw szczurom IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw myszym AlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EXi Niebieska mikroskopia fluorescencyjna Cyfrowa kamera CCD</td> Q <td>Obrazowanie</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retiga EXi FAST 1394 Cyfrowa kamera CCD</td><td>Q Obrazowanie</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 Rozdzielacz emisji</td><td>Fotometria</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Streampix 5</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: zastosowania adhezji komórek

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Wielokolorowa mikroskopia immunofluorescencyjna do wykrywania określonych cząsteczek w błonie komórkowej może być połączona z równoległymi testami w komorze przepływu płytek w celu zbadania mechanizmów regulujących adhezję komórek w warunkach dynamicznego przepływu. Na przykład komórki rakowe znakowane wieloma fluoroforami mogą być perfundowane na potencjalnie reaktywnym substracie w celu modelowania mechanizmów przerzutów raka. Jednak wielokanałowe systemy jednokamerowe i kamery kolorowe wykazują braki w pozyskiwaniu obrazu do analizy komórek w czasie rzeczywistym. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy system podziału emisji z dwiema kamerami, aby jednocześnie rejestrować w czasie rzeczywistym sekwencje obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek w komorze przepływowej. Dwukamerowe systemy podziału emisji filtrują zdefiniowane zakresy długości fal do dwóch monochromatycznych kamer CCD, rejestrując w ten sposób jednocześnie dwa identyczne przestrzennie, ale specyficzne dla fluoroforu obrazy. Następnie, jednokanałowe obrazy o pseudokolorowych kolorach są łączone w jedną sekwencję scaloną w czasie rzeczywistym, która może ujawnić wiele docelowych cząsteczek na komórkach poruszających się szybko w obszarze zainteresowania.

Do wykazania działania systemu rozdzielania emisji z dwiema kamerami, który jednocześnie rejestrował sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisji, zastosowano test adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami (Rysunek 1). System rozdzielania emisji z dwiema kamerami wykrywał komórki BT-20 znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkiemu CD24 oraz HECA-452 (wykrywając antygeny sialofukozylowane) oraz odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi (Rys...

Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie testu adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami z wykorzystaniem systemu rozdzielania emisji z dwiema kamerami w celu jednoczesnej rejestracji sekwencji obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach. W tym celu w pierwszej kolejności należy wyrównać obie kamery w układzie obrazującym. Następnie przygotowuje się komórki i reaktywne podłoże oraz montuje komorę przepływową z równoległymi płytkami.Następnie kalibruje się ustawienia kamery do akwizycji dwukolorowych obrazów i wprowadza wszelkie niezbędne korekty cyfrowe w celu wyrównania kamer. Następnie rejestruje się sekwencje obrazów, które demonstrują akwizycję obrazów dwukolorowych z wysoką rozdzielczością czasową. Przewagą systemów rozdzielania emisji z dwiema kamerami nad systemami z jedną kamerą jest możliwość przypisania różnych czasów ekspozycji dla każdej kamery przy zachowaniu pełnego pola widzenia.Technika ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny adhezji komórkowej, takie jak wpływ lokalizacji cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek na dynamiczne procesy biologiczne, m.in. migrację komórek, stan zapalny oraz przerzuty nowotworowe. Poniższa procedura wymaga użycia odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Powinien być on wyposażony w wysokointensywne źródło światła połączone z prowadnicą światłowodową, kostkę filtrującą oraz system podziału emisji dla dwóch kamer.Układ mikroskopu powinien być podłączony do komputera z oprogramowaniem do obrazowania, które umożliwia zbieranie i łączenie obrazów rejestrowanych przez monochromatyczne kamery CCD. W tym przypadku zastosowano oprogramowanie stream picks five multi-camera z modułem simul picks. W celu rozpoczęcia otwórz program stream picks five, a następnie w pasku zadań wybierz workspace.Następnie po prawej stronie ekranu otwórz menedżera obszaru roboczego (workspace manager) i wybierz nowy obszar roboczy (new workspace). Po nazwaniu kamery postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby z dostępnej listy wybrać grabber odpowiadający modelowi kamery; w obszarze roboczym pojawi się mała ikona kamery, wskazująca na odbiór sygnału wideo. Obiekty obrazowane za pomocą mikroskopu mogą być teraz wyświetlane na ekranie.Powtórz ten proces dla drugiego obszaru roboczego kamery, a następnie dla połączonego obszaru roboczego powtórz tę czynność jeszcze raz, aż wszystkie kamery będą w użyciu. Pojawi się komunikat o błędzie. Jest to normalny komunikat; przypisz kamery z obszaru roboczego jeden i dwa do połączonego obszaru roboczego w panelu dokującym znajdującym się po prawej stronie ekranu podglądu.Obrazy z obszaru roboczego jeden i dwa zostaną nałożone na siebie w połączonym obszarze roboczym jako dwa obrazy w pseudokolorach. Najtrudniejszym etapem tej procedury jest wyrównanie kamer. Aby zapewnić powodzenie operacji, używamy preparatu producenta, ściśle przestrzegając instrukcji producenta.Aby zsynchronizować kamery w systemie rozdzielania emisji z podwójną kamerą, skieruj światło w polu jasnym lub w kontraście fazowym do okularu mikroskopu. Umieść dostarczoną przez producenta kalibracyjną siatkę z powłoką metaliczną na stoliku mikroskopu i ustaw ją prostopadle względem osi stolika. Wyświetl obraz siatki bez binningu oraz bez automatycznego skalowania, ustaw ostrość, a następnie przesuń, lecz nie usuwaj obudowy dichroicznej, aby wyregulować pierwszą kamerę.Następnie, używając pokrętła regulacji ostrości w porcie seamount one, ponownie ustaw ostrość obrazu. Dalej, wsuń obudowę dichroiczną całkowicie do urządzenia do akwizycji dwukanałowej, tak aby obraz został rozdzielony przez lustro dichroiczne na obie kamery. Poluzuj trzy śruby mocujące 5/60 cala i obracaj drugą kamerą w gnieździe female CM mount port two, aż orientacja siatki będzie identyczna na obu obrazach; używając pokrętła regulacji ostrości w porcie C mount port two, ustaw ostrość obrazu z drugiej kamery.Aby sfinalizować wyrównanie, należy użyć pokrętła RL po prawej stronie DC two, aby dostosować pozycje połączonych obrazów, aż prawą pionową granicę obrazów zostanie precyzyjnie wyrównana w obszarze roboczym. Następnie należy użyć pokrętła UD, aby dostosować wyrównanie góra-dół drugiego obrazu, aż poziome paski siatki zostaną odpowiednio wyrównane.Jeśli podczas wyrównywania góra-dół wystąpi niewielka rotacja kamery, należy skorygować ten problem, luzując śruby 3 5 60 o rozmiarze jednej czwartej cala dla kamery dwa i obracając ją do momentu, aż wyświetlany obraz zostanie prawidłowo wyrównany. Przygotować komórki raka piersi BET 20 do testu adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami, barwiąc je przeciwciałami anty-CD24 oraz TECA 4 5 2 przy użyciu wtórnych przeciwciał LOR 5 68 i 4 88, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie; należy pamiętać o przygotowaniu odpowiednich kontroli jednobarwnych. Po barwieniu nanieść komórki do zbiornika komory przepływowej z równoległymi płytkami. Podłączyć dwa oddzielne odcinki rurek do portów wlotowego i wylotowego komory przepływowej.Jedna rurka zostanie podłączona do zbiornika zawierającego znakowane komórki zawieszone w DPBS z dodatkiem 0,1% PSA. Drugą rurkę należy podłączyć do pompy strzykawkowej, która będzie pobierać płyn z określoną szybkością przepływu. Podłącz linię próżniową do komory przepływowej i umieść komorę nad 35 milimetrową płytką do hodowli tkanek zawierającą monowarstwę komórek jajnika chomika chińskiego wykazujących ekspresję lektyny lub komórek CHO.Wyreguluj komorę przepływową oraz uszczelkę komory przepływowej, aby zapewnić odpowiednią szczelność próżniową. Odciągnij płyn z rezerwuaru, monitorując zespół komory przepływowej pod kątem prawidłowej szczelności. Na koniec umieść zespół komory przepływowej na mikroskopie, włącz źródło światła i sprawdź ustawienia mikroskopu poprzez inspekcję manualną.Należy upewnić się, że obudowa dichroiczna znajduje się w prawidłowej, obniżonej pozycji roboczej i nie jest w trybie pominięcia (bypass). Ręcznie należy przełączyć urządzenie w tryb fluorescencji i wybrać kostkę z filtrem fluorescencji zielono-czerwonej, aby oddzielnie określić czas ekspozycji i wzmocnienie. Wykonać obrazowanie komórek z wykorzystaniem fluorescencji czerwonej w kamerze pierwszej oraz fluorescencji zielonej w kamerze drugiej.W razie potrzeby ręcznie przesunięto lustro dichroiczne, aby uzyskać obrazy. Następnie nanieśli zawiesinę komórek BT 20 zabarwionych wyłącznie czerwonym fluoresceiną. Cztery sprzężone przeciwciała umieszczono w zbiorniku połączonym z portem wlotowym komory przepływowej z równoległymi płytkami.Użyj pompy strzykawkowej, aby przeprowadzić perfuzję komórek BT 20 nad monowarstwą komórek choi w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. W ustawieniach obrazowania na żywo dostosuj czas naświetlania kamery pierwszej, aby uzyskać obraz w kanale czerwonym. Dopasuj czas naświetlania kamery drugiej do czasu naświetlania kamery pierwszej.Jeśli w kanale zielonym widoczny jest obraz, oznacza to występowanie artefaktów przenikania sygnału (bleed-through). W takim przypadku należy zachować równy czas ekspozycji w kamerze pierwszej i drugiej, a następnie skracać go do momentu, aż artefakt przenikania przestanie być widoczny w kanale zielonym. W razie potrzeby należy dostosować wzmocnienie (gain) kamery pierwszej, aby poprawić widoczność obrazu w kanale czerwonym.Następnie usuń z rezerwuaru pozostałą zawiesinę komórek BT 20 i zastąp ją DPBS. Używając pompy strzykawkowej, przepłucz monowarstwę chordoidzną roztworem, aż komórki BT 20 nie będą już widoczne na monowarstwie. Ponownie napełnij rezerwuar zawiesiną komórek BT 20 zabarwionych wyłącznie przeciwciałem koniugowanym z zielonym fluorochromem czterech.Powtórz proces kalibracji kamery, korzystając z zielonych jednobarwnych wzorców kontrolnych. Tym razem określ czas ekspozycji dla drugiej kamery tak, aby obrazować komórki w kanale zielonym, unikając artefaktów przenikania sygnału (bleed-through) do kanału czerwonego rejestrowanego przez pierwszą kamerę. Wykorzystaj oprogramowanie do obrazowania, aby jednocześnie przeglądać obrazy przechwycone przez dwie monochromatyczne kamery CCD w komorze przepływowej.Experiment.Połącz obrazy zebrane z obu kamer, korzystając z modułu simul pics oprogramowania stream picks. Użyj cyfrowych korekt w simul pic lub alternatywnym oprogramowaniu, aby wyrównać przestrzennie połączone obrazy. W razie potrzeby obrazy można skorygować za pomocą modułu simul PIC w zakresie ustawień poziomych, pionowych i obrotowych.System jest teraz gotowy do jednoczesnego rejestrowania dwóch obrazów kolorowych. Do zademonstrowania opisanego w tym filmie systemu rozdzielania emisji dla dwóch kamer wykorzystano test adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. Jak pokazano tutaj, system wykrył komórki BT 20 znakowane fluorescencyjnie przeciwciałem anty-human CD 24 (kolor czerwony) oraz HECA 4 52, które wiąże cząsteczki spokrewnione z SCO (kolor zielony).Niektóre toczące się komórki wykazywały sygnały czerwone, ale nie zielone. Inne wykazywały sygnały zielone, ale nie czerwone, a jeszcze inne wykazywały sygnały zarówno czerwone, jak i zielone. Kamery zachowały rozdzielczość optyczną i czasową pozwalającą na śledzenie cech komórki podczas jej koziołkowania i obracania się wzdłuż osi podczas toczenia po reaktywnym podłożu w kierunku przepływu. Połączone kanały emisji ujawniły rozkład i kolokalizację cząsteczek CD 24 i sated na powierzchni komórek BT 20 toczących się i przylegających do monowarstw CHO e.Obrazy te przedstawiają powiększenie pojedynczej komórki BT 20, w której cząsteczki CD 24 i sated kolokalizują, przejawiając się jako żółte lub pomarańczowe plamki po nałożeniu na siebie kanałów emisji w czerwonym i zielonym pseudokolorze. Wzięte razem, informacje te dowodzą, że system podziału emisji z podwójną kamerą posiada rozdzielczość przestrzenną, czasową i optyczną niezbędną do ujawnienia cech komórkowych i molekularnych w zastosowaniach takich jak testy adhezji w komorach przepływowych, w których komórki szybko przemieszczają się przez pole widzenia.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat konfiguracji i kalibracji dwukamerowego systemu rozdzielania emisji lub obrazowania w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach testu adhezji w komorze przepływowej z płytami równoległymi. Metodę tę można zastosować w innych badaniach in vitro wykorzystujących fluorescencję do analizy zachowania komórek.

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Jednoczesne rejestrowanie obrazów rzeczywistych w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą układu podzielonej emisji z dwoma kamerami: zastosowania do adhezji komórkowej

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Źródło: Bello-Gamboa, A. et al., Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej.J. Vis. Exp.(2019 rok) Ten film demonstruje badanie in vitro tworzenia synaps immunologicznych między komórką prezentującą antygen a limfocytami T pomocniczymi za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Receptory limfocytów T pomocniczych oddziałują z kompleksem antygenu-MHC-II w komórkach prezentujących antygen i tworzą synapsy immunologiczne, po których następują ruchy pęcherzyków wydzielniczych w kierunku synapsy, co...

Tworzenie synaps immunologicznych między limfocytami T pomocniczymi a komórkami prezentującymi antygen

Źródło: Kulkarni, M. et al. Obrazowanie ca2+ Dynamika w stożku fotoreceptorów zakończeń aksonów siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków transgenicznej siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania wycinków siatkówki, obrazowania biosensorów wapnia opartych na FRET oraz analizy zmian fluorescencji w celu ilościowego określenia poziomu wapnia przy oświetleniu tła i...

Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Poznaj metodę jednoczesnego rejestrowania obrazów w dwóch kanałach emisyjnych przy użyciu systemu podziału emisji z dwiema kamerami. Technika ta umożliwia prowadzenie zaawansowanych badań adhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową.

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Przeglądaj więcej filmów