Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek
4 września 2013
Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie testu adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami z wykorzystaniem systemu rozdzielania emisji z dwiema kamerami w celu jednoczesnej rejestracji sekwencji obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach. W tym celu w pierwszej kolejności należy wyrównać obie kamery w układzie obrazującym. Następnie przygotowuje się komórki i reaktywne podłoże oraz montuje komorę przepływową z równoległymi płytkami.
Następnie kalibruje się ustawienia kamery do akwizycji dwukolorowych obrazów i wprowadza wszelkie niezbędne korekty cyfrowe w celu wyrównania kamer. Następnie rejestruje się sekwencje obrazów, które demonstrują akwizycję obrazów dwukolorowych z wysoką rozdzielczością czasową. Przewagą systemów rozdzielania emisji z dwiema kamerami nad systemami z jedną kamerą jest możliwość przypisania różnych czasów ekspozycji dla każdej kamery przy zachowaniu pełnego pola widzenia.
Technika ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny adhezji komórkowej, takie jak wpływ lokalizacji cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek na dynamiczne procesy biologiczne, m.in. migrację komórek, stan zapalny oraz przerzuty nowotworowe. Poniższa procedura wymaga użycia odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Powinien być on wyposażony w wysokointensywne źródło światła połączone z prowadnicą światłowodową, kostkę filtrującą oraz system podziału emisji dla dwóch kamer.
Układ mikroskopu powinien być podłączony do komputera z oprogramowaniem do obrazowania, które umożliwia zbieranie i łączenie obrazów rejestrowanych przez monochromatyczne kamery CCD. W tym przypadku zastosowano oprogramowanie stream picks five multi-camera z modułem simul picks. W celu rozpoczęcia otwórz program stream picks five, a następnie w pasku zadań wybierz workspace.
Następnie po prawej stronie ekranu otwórz menedżera obszaru roboczego (workspace manager) i wybierz nowy obszar roboczy (new workspace). Po nazwaniu kamery postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby z dostępnej listy wybrać grabber odpowiadający modelowi kamery; w obszarze roboczym pojawi się mała ikona kamery, wskazująca na odbiór sygnału wideo. Obiekty obrazowane za pomocą mikroskopu mogą być teraz wyświetlane na ekranie.
Powtórz ten proces dla drugiego obszaru roboczego kamery, a następnie dla połączonego obszaru roboczego powtórz tę czynność jeszcze raz, aż wszystkie kamery będą w użyciu. Pojawi się komunikat o błędzie. Jest to normalny komunikat; przypisz kamery z obszaru roboczego jeden i dwa do połączonego obszaru roboczego w panelu dokującym znajdującym się po prawej stronie ekranu podglądu.
Obrazy z obszaru roboczego jeden i dwa zostaną nałożone na siebie w połączonym obszarze roboczym jako dwa obrazy w pseudokolorach. Najtrudniejszym etapem tej procedury jest wyrównanie kamer. Aby zapewnić powodzenie operacji, używamy preparatu producenta, ściśle przestrzegając instrukcji producenta.
Aby zsynchronizować kamery w systemie rozdzielania emisji z podwójną kamerą, skieruj światło w polu jasnym lub w kontraście fazowym do okularu mikroskopu. Umieść dostarczoną przez producenta kalibracyjną siatkę z powłoką metaliczną na stoliku mikroskopu i ustaw ją prostopadle względem osi stolika. Wyświetl obraz siatki bez binningu oraz bez automatycznego skalowania, ustaw ostrość, a następnie przesuń, lecz nie usuwaj obudowy dichroicznej, aby wyregulować pierwszą kamerę.
Następnie, używając pokrętła regulacji ostrości w porcie seamount one, ponownie ustaw ostrość obrazu. Dalej, wsuń obudowę dichroiczną całkowicie do urządzenia do akwizycji dwukanałowej, tak aby obraz został rozdzielony przez lustro dichroiczne na obie kamery. Poluzuj trzy śruby mocujące 5/60 cala i obracaj drugą kamerą w gnieździe female CM mount port two, aż orientacja siatki będzie identyczna na obu obrazach; używając pokrętła regulacji ostrości w porcie C mount port two, ustaw ostrość obrazu z drugiej kamery.
Aby sfinalizować wyrównanie, należy użyć pokrętła RL po prawej stronie DC two, aby dostosować pozycje połączonych obrazów, aż prawą pionową granicę obrazów zostanie precyzyjnie wyrównana w obszarze roboczym. Następnie należy użyć pokrętła UD, aby dostosować wyrównanie góra-dół drugiego obrazu, aż poziome paski siatki zostaną odpowiednio wyrównane.
Jeśli podczas wyrównywania góra-dół wystąpi niewielka rotacja kamery, należy skorygować ten problem, luzując śruby 3 5 60 o rozmiarze jednej czwartej cala dla kamery dwa i obracając ją do momentu, aż wyświetlany obraz zostanie prawidłowo wyrównany. Przygotować komórki raka piersi BET 20 do testu adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami, barwiąc je przeciwciałami anty-CD24 oraz TECA 4 5 2 przy użyciu wtórnych przeciwciał LOR 5 68 i 4 88, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie; należy pamiętać o przygotowaniu odpowiednich kontroli jednobarwnych. Po barwieniu nanieść komórki do zbiornika komory przepływowej z równoległymi płytkami. Podłączyć dwa oddzielne odcinki rurek do portów wlotowego i wylotowego komory przepływowej.
Jedna rurka zostanie podłączona do zbiornika zawierającego znakowane komórki zawieszone w DPBS z dodatkiem 0,1% PSA. Drugą rurkę należy podłączyć do pompy strzykawkowej, która będzie pobierać płyn z określoną szybkością przepływu. Podłącz linię próżniową do komory przepływowej i umieść komorę nad 35 milimetrową płytką do hodowli tkanek zawierającą monowarstwę komórek jajnika chomika chińskiego wykazujących ekspresję lektyny lub komórek CHO.
Wyreguluj komorę przepływową oraz uszczelkę komory przepływowej, aby zapewnić odpowiednią szczelność próżniową. Odciągnij płyn z rezerwuaru, monitorując zespół komory przepływowej pod kątem prawidłowej szczelności. Na koniec umieść zespół komory przepływowej na mikroskopie, włącz źródło światła i sprawdź ustawienia mikroskopu poprzez inspekcję manualną.
Należy upewnić się, że obudowa dichroiczna znajduje się w prawidłowej, obniżonej pozycji roboczej i nie jest w trybie pominięcia (bypass). Ręcznie należy przełączyć urządzenie w tryb fluorescencji i wybrać kostkę z filtrem fluorescencji zielono-czerwonej, aby oddzielnie określić czas ekspozycji i wzmocnienie. Wykonać obrazowanie komórek z wykorzystaniem fluorescencji czerwonej w kamerze pierwszej oraz fluorescencji zielonej w kamerze drugiej.
W razie potrzeby ręcznie przesunięto lustro dichroiczne, aby uzyskać obrazy. Następnie nanieśli zawiesinę komórek BT 20 zabarwionych wyłącznie czerwonym fluoresceiną. Cztery sprzężone przeciwciała umieszczono w zbiorniku połączonym z portem wlotowym komory przepływowej z równoległymi płytkami.
Użyj pompy strzykawkowej, aby przeprowadzić perfuzję komórek BT 20 nad monowarstwą komórek choi w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. W ustawieniach obrazowania na żywo dostosuj czas naświetlania kamery pierwszej, aby uzyskać obraz w kanale czerwonym. Dopasuj czas naświetlania kamery drugiej do czasu naświetlania kamery pierwszej.
Jeśli w kanale zielonym widoczny jest obraz, oznacza to występowanie artefaktów przenikania sygnału (bleed-through). W takim przypadku należy zachować równy czas ekspozycji w kamerze pierwszej i drugiej, a następnie skracać go do momentu, aż artefakt przenikania przestanie być widoczny w kanale zielonym. W razie potrzeby należy dostosować wzmocnienie (gain) kamery pierwszej, aby poprawić widoczność obrazu w kanale czerwonym.
Następnie usuń z rezerwuaru pozostałą zawiesinę komórek BT 20 i zastąp ją DPBS. Używając pompy strzykawkowej, przepłucz monowarstwę chordoidzną roztworem, aż komórki BT 20 nie będą już widoczne na monowarstwie. Ponownie napełnij rezerwuar zawiesiną komórek BT 20 zabarwionych wyłącznie przeciwciałem koniugowanym z zielonym fluorochromem czterech.
Powtórz proces kalibracji kamery, korzystając z zielonych jednobarwnych wzorców kontrolnych. Tym razem określ czas ekspozycji dla drugiej kamery tak, aby obrazować komórki w kanale zielonym, unikając artefaktów przenikania sygnału (bleed-through) do kanału czerwonego rejestrowanego przez pierwszą kamerę. Wykorzystaj oprogramowanie do obrazowania, aby jednocześnie przeglądać obrazy przechwycone przez dwie monochromatyczne kamery CCD w komorze przepływowej.Experiment.
Połącz obrazy zebrane z obu kamer, korzystając z modułu simul pics oprogramowania stream picks. Użyj cyfrowych korekt w simul pic lub alternatywnym oprogramowaniu, aby wyrównać przestrzennie połączone obrazy. W razie potrzeby obrazy można skorygować za pomocą modułu simul PIC w zakresie ustawień poziomych, pionowych i obrotowych.
System jest teraz gotowy do jednoczesnego rejestrowania dwóch obrazów kolorowych. Do zademonstrowania opisanego w tym filmie systemu rozdzielania emisji dla dwóch kamer wykorzystano test adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. Jak pokazano tutaj, system wykrył komórki BT 20 znakowane fluorescencyjnie przeciwciałem anty-human CD 24 (kolor czerwony) oraz HECA 4 52, które wiąże cząsteczki spokrewnione z SCO (kolor zielony).
Niektóre toczące się komórki wykazywały sygnały czerwone, ale nie zielone. Inne wykazywały sygnały zielone, ale nie czerwone, a jeszcze inne wykazywały sygnały zarówno czerwone, jak i zielone. Kamery zachowały rozdzielczość optyczną i czasową pozwalającą na śledzenie cech komórki podczas jej koziołkowania i obracania się wzdłuż osi podczas toczenia po reaktywnym podłożu w kierunku przepływu. Połączone kanały emisji ujawniły rozkład i kolokalizację cząsteczek CD 24 i sated na powierzchni komórek BT 20 toczących się i przylegających do monowarstw CHO e.
Obrazy te przedstawiają powiększenie pojedynczej komórki BT 20, w której cząsteczki CD 24 i sated kolokalizują, przejawiając się jako żółte lub pomarańczowe plamki po nałożeniu na siebie kanałów emisji w czerwonym i zielonym pseudokolorze. Wzięte razem, informacje te dowodzą, że system podziału emisji z podwójną kamerą posiada rozdzielczość przestrzenną, czasową i optyczną niezbędną do ujawnienia cech komórkowych i molekularnych w zastosowaniach takich jak testy adhezji w komorach przepływowych, w których komórki szybko przemieszczają się przez pole widzenia.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat konfiguracji i kalibracji dwukamerowego systemu rozdzielania emisji lub obrazowania w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach testu adhezji w komorze przepływowej z płytami równoległymi. Metodę tę można zastosować w innych badaniach in vitro wykorzystujących fluorescencję do analizy zachowania komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano procedurę przeprowadzania testu adhezji w komorze przepływowej z równoległymi płytkami z wykorzystaniem systemu rozdzielania emisji z dwiema kamerami. System ten umożliwia jednoczesną rejestrację sekwencji obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach, co podnosi jakość obrazowania żywych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Obrazowanie żywych komórek
- Testy adhezji komórkowej
Wstęp
- Systemy z podwójną kamerą poprawiają możliwości obrazowania.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym jest kluczowe dla analiz żywych komórek.
- Wysoka rozdzielczość czasowa jest niezbędna do dokładnego zbierania danych.
- Rozdzielanie emisji umożliwia jednoczesne obrazowanie kolorystyczne.
Cel badania
- Przeprowadzenie testów adhezji z wykorzystaniem zaawansowanych technik obrazowania.
- Wykazanie zalet systemów z dwiema kamerami w porównaniu z układami z jedną kamerą.
- Rejestracja wysokiej jakości dwukolorowych obrazów w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Ustawienie obu kamer w celu optymalizacji obrazowania.
- Przygotowanie komórek i podłoży do analizy.
- Kalibracja ustawień kamer dla akwizycji dwukolorowej.
- Rejestracja sekwencji obrazów wykazujących wysoką rozdzielczość czasową.
Główne wyniki
- Pomyślne pozyskanie obrazów dwukolorowych.
- Osiągnięcie wysokiej rozdzielczości czasowej w sekwencjach obrazów.
- Możliwość przypisania różnych czasów ekspozycji dla każdej kamery.
- Zachowanie pełnego pola widzenia podczas obrazowania.
Wnioski
- Systemy z podwójną kamerą poprawiają jakość mikroskopii fluorescencyjnej.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym jest możliwe przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości.
- Metoda ta jest korzystna w badaniach adhezji żywych komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie dwukolorowe w czasie rzeczywistym umożliwia precyzyjne śledzenie dynamiki molekularnej w badaniach adhezji żywych komórek, co ma kluczowe znaczenie dla oceny ryzyka w przypadku celów terapeutycznych związanych z przerzutami i stanami zapalnymi. System rozdzielania emisji z dwiema kamerami zapewnia wysoką rozdzielczość czasową bez ograniczania pola widzenia, co wspiera analizę ilościową szybko poruszających się komórek. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków, ujawniając wzorce kolokalizacji cząsteczek adhezyjnych w warunkach fizjologicznego przepływu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celów
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie rozkładu przestrzennego i kolokalizacji cząsteczek adhezyjnych, takich jak CD24 i HECA452, na krążących komórkach nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Pozwala na weryfikację hipotez dotyczących wpływu lokalizacji molekularnej na toczenie się, adhezję i transmigrację komórek w warunkach przepływu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje przestrzennie identyczne, specyficzne dla fluoroforu pary obrazów w celu dokładnej detekcji multipleksowej w analizach opartych na przepływie.
- Wartość operacyjna: Pozwala na niezależną optymalizację czasu ekspozycji dla każdego kanału, aby zminimalizować przenikanie sygnału (bleed-through) i zmaksymalizować wierność sygnału.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje mechanizmy przerzutowania nowotworów poprzez perfuzję znakowanych komórek rakowych nad reaktywnymi podłożami wykazującymi ekspresję ligandów śródbłonka.
- Wartość operacyjna: Zachowuje pełne pole widzenia oraz wysoką rozdzielczość czasową, co pozwala na uchwycenie rzadkich zdarzeń adhezyjnych w systemach dynamicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesami badawczymi w biologii odkrywczej, zapewniając ilościowe odczyty interakcji molekularnych w czasie rzeczywistym podczas adhezji komórek, co bezpośrednio wpływa na decyzje dotyczące identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka celów terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki cząsteczek adhezyjnych w żywych komórkach poddanym naprężeniom ścinającym.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne wyniki dwukolorowe, odpowiednie do automatyzacji testów i kampanii przesiewowych związków.
- Analityka: Generuje zsynchronizowane sekwencje obrazów z precyzyjnym dopasowaniem czasowym do analizy kolokalizacji i motoryki.
- Badania translacyjne: Przenosi wyniki adhezji in vitro na istotność in vivo poprzez symulację fizjologicznych warunków przepływu w modelach przerzutów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do multiparametrycznej analizy żywych komórek w projektach onkologicznych, immunologicznych i sercowo-naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu poprzez bezpośrednią obserwację ko-dystrybucji molekularnej na migrujących komórkach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki precyzyjnym protokołom kalibracji kamery i narzędziom korekcji cyfrowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając dowodów wizualnych na zaangażowanie celu w dynamicznych, fizjologicznie istotnych kontekstach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację celów adhezyjnych w oparciu o walidację funkcjonalną w warunkach przepływu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz kalibracji kamer z wykorzystaniem siatek kalibracyjnych producenta.
- Wymagany jest odwrócony mikroskop epifluorescencyjny z intensywnym źródłem światła, kostkami filtracyjnymi oraz sprzętem do podziału emisji dla dwóch kamer.
- Metoda opiera się na oprogramowaniu do obrazowania umożliwiającym sterowanie kamerą monochromatyczną, łączenie obrazów oraz rejestrację przestrzenną (np. StreamPix z modułem SimulPix).
- Proces obejmuje standaryzację przygotowania komórek, protokołów barwienia oraz montażu komory przepływowej w celu uzyskania spójnych pomiarów adhezji.
- Ograniczeniem jest konieczność dokładnej korekcji przenikania sygnału (bleed-through) przy użyciu fluroforów o nakładających się widmach w detekcji dwukanałowej.
