Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie wielu gatunków białek jednocześnie z nanometrową precyzją w nieruchomych lub żywych komórkach. Osiąga się to poprzez najpierw dostosowanie położenia kamery i optyki, aż do momentu, gdy ostry obraz z mikroskopu zostanie wyświetlony na chipie kamery. Drugim krokiem jest ułożenie wiązek laserowych tak, aby były bezpośrednio ustawione na próbce na stoliku mikroskopu.

Następnie przygotowana próbka komórkowa jest naświetlana i wybierana jest komórka wykazująca ekspresję pożądanych białek. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie komórki za pomocą mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji poprzez oświetlenie próbki laserami, a następnie skierowanie fluorescencji komórki do chipa kamery w celu uzyskania zestawu danych. Ostatecznie, mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji służy do pokazania lokalizacji wielu gatunków białek w nanometrowej skali przestrzennej w nieruchomych lub żywych komórkach oraz w szerokim polu lub przy użyciu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia w celu wyizolowania cienkiego obszaru próbki.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna lub elektronowa, jest to, że można obrazować wiele białek jednocześnie z rozdzielczością nanometrową w komórkach stałych lub żywych. Poniższe kroki odnoszą się do systemu numeracji, jak pokazano tutaj, który jest schematem wielokolorowej konfiguracji F Om dostarczonej jako rysunek pierwszy w dołączonym protokole tekstowym w celu wyrównania mikroskopu, zacznij od umieszczenia skali kalibracyjnej lub rodnika na stoliku mikroskopu z założonym obiektywem 10 x i lampą ustawioną na światło przechodzące. Wyśrodkuj pion w środku pola widzenia.

Następnie dostosuj mikroskop do oświetlenia koer, zamykając aperturę pola i patrząc przez okulary w pionie. Jeśli krawędzie przysłony pola ostrości są nieostre, wyreguluj wysokość kondensora, aż zarówno przysłona pola, jak i redle będą ostre. Następnie wyreguluj boczne położenie otworu pola, aż zostanie wyśrodkowany w stosunku do pola view i zamknij przysłonę pola, aż zaświeci się tylko środkowa siatka na redle.

Przy pierwszym montażu tych komponentów dostosuj długości ścieżek każdego kanału tak, aby były równe. Aby zrealizować ten projekt, należy ponownie ustawić na chipie kamery lustra siódme i dziewiąte i zamknąć aperturę detekcji, aby zapobiec przestrzennemu nakładaniu się dwóch kanałów. Następnie skoncentruj obraz rodnika w odbitym kanale światła i sprawdź, czy jest on również ostry w kanale światła przechodzącego.

Jeśli obraz w kanale światła przechodzącego nie jest ostry, przesuwaj lustro dziewiąte, aż obraz radykalny będzie ostry jednocześnie w obu kanałach. Wyrównanie laserów należy rozpocząć od usunięcia soczewki pierwszej ze ścieżki lasera i zablokowania wiązki aktywacji i odczytu. Następnie umieść białą kartę równo z lustrem czwartym, otwórz migawkę mikroskopu i ustaw ostrość, aż radykalny obraz zostanie wyświetlony na karcie przed lustrem czwartym.

Następnie odblokuj wiązkę odczytu i wyreguluj lustro pierwsze, aby wyśrodkować laser odczytu na krzyżyku radykalnego obrazu na lustrze czwartym. Po wyśrodkowaniu rzutuj obraz radykalny na lustro piąte i dostosuj lustro czwarte, aż wiązka zostanie wyśrodkowana na krzyżyku obrazu lustra piątego. Belka odczytu powinna być teraz wyśrodkowana zarówno na M czterech, jak i M pięć.

Następnie zablokuj wiązkę odczytową, zamykając żaluzję. Następnie rzutuj radykalny obraz na lustro trzecie. Usuń ekspander wiązki ze ścieżki lasera i odblokuj laser aktywacyjny.

Teraz dostosuj lustro drugie, aby wyśrodkować wiązkę aktywacji na krzyżu nitkowym radykalnego obrazu na lustrze trzecim. Po wyśrodkowaniu wymień ekspander wiązki między lustrem drugim i trzecim i dostosuj położenie ekspandera wiązki, aż wiązka zostanie wyśrodkowana na krzyżu nitkowym radykalnego obrazu. Na lustrze trzecim rzutuj radykalny obraz na lustro piąte i skup się.

Za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu wyreguluj kąt lustra dichroicznego numer jeden, aż wiązka aktywacyjna zostanie wyśrodkowana na obrazie redle. Następnie zablokuj aktywację lasera, zamykając drugą migawkę bez założonego obiektywu i otwierając migawkę mikroskopu. Otwórz migawkę migawki odczytu i skieruj laser przez tylną aperturę mikroskopu.

Wyreguluj zwierciadło piąte, aż wiązka wyłoni się z mikroskopu, tak aby wiązka wychodziła z mikroskopu pionowo z pierwszą soczewką i obiektywem z powrotem na miejscu. Umieścić próbkę zawierającą 100 mikromolowych bromów B na stoliku z zablokowanym laserem aktywacyjnym. Wyświetl laser odczytowy przez obiektyw o powiększeniu 60 x i do barwnika.

Z wyłączonym wzmocnieniem zwielokrotniania elektronów. Wyślij ten obraz do aparatu. Następnie skoncentruj obiektyw na próbce.

Otwórz przysłonę na tyle szeroko, aby umożliwić obrazowanie pełnego profilu wiązki. Następnie przesuń otwór na boki tak, aby środek profilu belki i otwór były koncentryczne. Korzystając z oprogramowania kamery, wybierz obszar zainteresowania, aby umożliwić najmniejszy obszar odczytu kamery obejmujący oba kanały i zapisz te współrzędne.

W tym momencie nagraj pojedynczą migawkę, aby przedstawić profil wiązki odczytu. Następnie zablokuj laser odczytu, zamykając migawkę pierwszą i otwierając migawkę drugą. Aby rozpocząć pomiar profilu wiązki aktywacyjnej, przenieś laser aktywacyjny na próbkę, jeśli to konieczne, użyj wzmocnienia zwielokrotniającego elektrony mniejszego niż 100 i wyreguluj pierwsze zwierciadło dichroiczne, aż wiązka zostanie wyśrodkowana w każdym polu widzenia.

Następnie nagraj migawkę profilu wiązki aktywacyjnej, aby rozpocząć pozyskiwanie wielokolorowych obrazów dłoni F. Wyeliminuj całe oświetlenie w pomieszczeniu. Następnie wyświetl lampę rtęciową za pomocą uchwytu flip na transfekowane komórki i zmień kostkę filtra na taką, która zawiera odpowiednią długość fali wzbudzenia przełącznika przed zdjęciem. Stan.

Po wybraniu komórki przesuń uchwyt klapki w dół, aby umożliwić laserom przejście do mikroskopu, zmień wieżyczkę filtra na taką, w której znajduje się odpowiednie zwierciadło dichroiczne do obrazowania, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wyświetl ten obraz do kamery, aby odróżnić transfekowane komórki od fluorescencji tła i potwierdzić, że cząsteczki są fotoplastyczne. Krótko oświetlić próbkę niską mocą mniejszą niż 10 mikrowatów z lasera aktywacyjnego.

Następnie przygotuj oprogramowanie kamery do akwizycji serii kinetycznych, ustawiając grę mnożenia elektronów na 200, a żądaną liczbę klatek na od pięciu do 10 000. Ustaw również ekspozycję na od 10 do 30 milisekund. Następnie zablokuj wiązkę aktywacyjną, odblokuj wiązkę odczytu i wyświetl obraz oświetlonej komórki do kamery.

Wybierz płaszczyznę ogniskową w pobliżu dolnej błony komórkowej, przesuwając ostrość w dół, aż poszczególne cząsteczki przestaną być widoczne. Następnie stopniowo przesuwaj ostrość w górę, aż cząsteczki staną się po raz pierwszy widoczne. Teraz odblokuj wiązkę aktywacyjną i oświetl próbkę intensywnością mniejszą niż jeden wat na centymetr kwadratowy.

Rozpocznij pozyskiwanie tych danych za pomocą oprogramowania kamery, utrzymując gęstość od 0,1 do jednej widzialnej cząsteczki fotomożliwej do sfotografowania na mikron kwadratowy poprzez dynamiczną regulację filtra o neutralnej gęstości przed laserem aktywacyjnym. Aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, zamontuj fluorescencyjne zwierciadło pięć i soczewkę jedną na jednym stoliku translacyjnym, który należy przesunąć na bok tuż za wejściem do mikroskopu. Gdy zwierciadło piąte i soczewka pierwsza są translowane, lasery wychodzące z obiektywu w górę przez próbkę będą stopniowo przechylać się na jedną stronę, kontynuując przesuwanie stolika, aż kąt laserów osiągnie 90 stopni od pionu.

W tym momencie pojawiający się laser sam zniknie, a nadchodzący laser zostanie z powrotem odbity w aperturze, poruszając się przeciwlegle do nadchodzącej wiązki i przemieszczony na bok. Powinieneś zauważyć zmniejszenie tła, gdy próbka wejdzie w całkowitą fluorescencję odbicia wewnętrznego po zakończeniu akwizycji obrazu, natychmiast zamknij migawkę mikroskopu i zablokuj obie wiązki. Wyłącz wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów.

Ustaw kamerę tak, aby nagrywała jedną klatkę i ustaw maksymalny rozmiar regionu odczytu kamery. Na koniec zablokuj jeden kanał, umieszczając kartę na F trzy lub F cztery z filtrem długoprzepustowym zamontowanym na lampie mikroskopu. Oświetl próbkę i wyświetl ten obraz w kamerze.

Nagraj migawkę komórki, aby przedstawić całą komórkę w świetle przechodzącym. Pokazano tutaj przykład dwukolorowego nabycia dłoni F przez komórkę NIH trzy T trzy wyrażające zarówno DENDRA dwie hemaglutyninę, jak i aktynę PAM Cherry. Kanał transmitowany po lewej stronie zawiera dłuższe fale niż kanał odbity po prawej stronie.

Pokazane tutaj są migawki z tych samych dwóch kolorów Akwizycji F OM po tle, odejmowaniu i transformacji w celu nałożenia lewego i prawego kanału. Poszczególne cząsteczki mogą być identyfikowane i lokalizowane. Niektóre cząsteczki wydają się jaśniejsze w transmitowanym kanale, a niektóre mają bardziej równomierny rozkład emisji między tymi dwoma kanałami.

Wskazuje to na różnicę w widmach emisyjnych między wiśnią PAM a DENDRA odpowiednio dwoma i jest wykorzystywane w analizie do identyfikacji tych dwóch gatunków. Pokazany tutaj histogram wskazuje stosunek intensywności kanału nadawanego w kolorze czerwonym podzielony przez całkowity natężenie dla wszystkich zlokalizowanych cząsteczek po zastosowaniu tolerancji. Piksele są białe na lewym dolnym obrazie i czerwone na końcowym scalonym obrazie pokazanym w prawym dolnym rogu, gdzie te w zielonym obszarze są wyświetlane jako białe na prawym górnym obrazie i wydają się zielone na ostatnim scalonym obrazie pokazanym w prawym dolnym

Poziomy progowe, które są wybierane podczas renderowania, mają duży wpływ na stopień szumu i wygląd kolokalizacji. Pokazano. Poniżej przedstawiono trzy różne opcje renderowania, które skutkują różnym stopniem krwawienia przez najbardziej konserwatywne poziomy progowe, które są pokazane na dwóch dolnych poziomach. Histogramy dłoni alfa w kolorze F najlepiej interpretować, gdy na obrazie występują dwa dostrzegalne szczyty.

Podczas gdy histogram po lewej stronie jest dobrym kandydatem do dalszej analizy, obrazy wynikające z pozostałych dwóch histogramów będą znacznie trudniejsze do zinterpretowania Po tej procedurze. Metody takie jak całkowite odbicie wewnętrzne, mikroskopia i obrazowanie żywych komórek mogą być wykonywane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób organizacji białek w nanoskali w żywych błonach komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować własny mikroskop FAR i używać go do pozyskiwania danych.

Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna, a przed przystąpieniem do tej procedury należy ukończyć szkolenie w zakresie bezpieczeństwa.