Name: Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Poznaj metodę FPALM do jednoczesnego obrazowania wielu białek z nanometrową precyzją w komórkach stałych i żywych. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji protein z rozdzielczością przekraczającą granicę dyfrakcji światła.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Philipowi Andresenowi, Matthew Parentowi i Seanowi Carterowi za programowanie komputerowe, pomoc techniczną i przydatne rozmowy oraz Patowi Byardowi za pomoc administracyjną. Praca ta została sfinansowana przez NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 i 2061 oraz Maine Economic Improvement Fund.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H. i M.J.M. posiadają patenty w dziedzinie mikroskopii superrozdzielczej. S.T.H. zasiada w naukowej radzie doradczej Vutara, Inc.

Obrazowanie w superrozdzielczości oparte na lokalizacji zapewnia wiele potężnych możliwości obrazowania biologicznego. Droga od pojedynczych elementów optycznych umieszczonych na stole do funkcjonalnego mikroskopu superrozdzielczego, zdolnego do jednoczesnego obrazowania wielu gatunków fluorescencyjnych w próbce biologicznej, wiąże się z wieloma wyzwaniami. Niektóre aspekty wyrównania są bardziej krytyczne niż inne; Poniżej staramy się udzielić wskazówek potencjalnym użytkownikom zajmującym się najtrudniejszymi aspektami...

Chociaż struktury komórkowe istnieją w szerokim zakresie skal przestrzennych, obrazowanie fluorescencyjne organizacji komórkowej na skalach długości mniejszych niż ~250 nm jest ograniczone w konwencjonalnej mikroskopii ze względu na fizyczne ograniczenie limitu dyfrakcji. Ograniczenie to zostało przezwyciężone wraz z pojawieniem się fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji (FPALM1) i podobnych technik2,3, które mogą lokalizować dużą liczbę pojedynczych cząsteczek z precyzją ~10 nm, w celu generowania obrazów o rozdzielczości kilkudziesięciu nanometrów. FPALM opiera się na wykorzystaniu kontroli optycznej do aktywacji i dezaktywacji podzbiorów cząsteczek (pełny opis FPALM i instrukcje dotyczące implementacji tego systemu obrazowania można znaleźć w Gould i wsp.4). Technika ta pozwala na mapowanie rozkładów przestrzennych całych populacji pojedynczych cząsteczek, wyjaśniając w ten sposób struktury biologiczne w skalach długości od kilkudziesięciu nanometrów do dziesiątek mikronów. Mikroskopia superrozdzielcza oparta na lokalizacji (zwana dalej mikroskopią lokalizacyjną) została obecnie zaadaptowana do rozwiązywania szeregu problemów biologicznych, a rozwój technologiczny pozwolił na przykład na obrazowanie poszczególnych orientacji molekularnych za pomocą polaryzacji FPALM lub P-FPALM5, obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych cząsteczek w trzech wymiarach za pomocą Biplane FPALM6 lub innych technik7-9oraz superrozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach10-12. Mikroskopia lokalizacyjna została również zastosowana do obrazowania wielu gatunków w stałych komórkach13-16. Ostatnio trzy gatunki białek zostały jednocześnie zobrazowane za pomocą FPALM zarówno w komórkach stałych, jak i żywych17. Mikroskopia lokalizacyjna może obrazować próbki znakowane na różne sposoby: Przykłady obejmują białka wyrażane za pomocą znaczników fuzyjnych PAFP lub PSFP, przeciwciała lub cząsteczki znakowane barwnikami organicznymi w klatkach lub konwencjonalnymi barwnikami organicznymi. Podczas gdy stosowanie konwencjonalnych barwników fluorescencyjnych pozwala na znakowanie białek przy braku znacznika białka fuzyjnego, warunki ogólnie wymagane do stosowania barwników organicznych bez klatkowania w obrazowaniu superrozdzielczym wymagają, aby próbki były zanurzone w redukcyjnych2. Dodatkowo, wewnątrzkomórkowe dostarczanie koniugatów przeciwciało-barwnik zazwyczaj wymaga utrwalenia komórek i przepuszczalności ich błon, lub wymaga, aby żywe komórki były przepuszczalne poprzez elektroporację lub w inny sposób. Wymagania dotyczące zmniejszenia warunków buforowych i przepuszczalności błony ograniczają przydatność barwników organicznych do obrazowania żywych komórek, chociaż ostatnie osiągnięcia pozwoliły na skuteczne wykorzystanie HaloTags i FPALM do obrazowania struktur błonowych18.
FPALM był pierwszą techniką mikroskopii lokalizacyjnej zastosowaną do żywych komórek10. W żywych komórkach, oprócz dostarczania zależnej od czasu mapy przestrzennej lokalizacji znakowanych cząsteczek, FPALM może śledzić pojedyncze cząsteczki w wielu klatkach i trajektorie molekularne wyznaczane w skalach czasowychmilisekund 19. Tak więc, FPALM zapewnia dostęp do dość krótkich skal czasowych i rozdzielczości w nanoskali.
Multicolor FPALM może być używany do wielu różnych sond, w tym białek fotoaktywowalnych i organicznych barwników w klatkach lub bez nich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe informacje na temat protokołu i konfiguracji do jednoczesnego obrazowania dwóch fluorescencyjnych gatunków białek, Dendra2 i PAmCherry. Przedstawiamy wyniki obrazowania PAmCherry sprzężonego z beta aktyną (PAmCherry-aktyna) i Dendra2 sprzężonego z hemaglutyniną grypy (Dendra2-HA) w fibroblastach NIH-3T3. Komponenty opisane w konfiguracji mogą być wymieniane na inny sprzęt, bardziej przystosowany do obrazowania innych sond. Tam, gdzie tak jest, staraliśmy się być jednoznaczni w tekście.
Multicolor FPALM jest idealny do raportowania przestrzennego rozkładu wielu gatunków białek w żywych lub stałych komórkach. Technika ta jest szczególnie przydatna do badania relacji przestrzennych i/lub dynamicznych w skalach przestrzennych o długości nanometrów, chociaż obrazy będą raportować lokalizację w różnych skalach długości, od dziesiątek nanometrów do dziesiątek mikronów. Jedną z głównych zalet wielokolorowego FPALM jest to, że konfiguracja jest stosunkowo niedroga w budowie i bardzo elastyczna w użyciu z różnymi kombinacjami sond. Proces budowy i kalibracji systemu na podstawie komponentów zapewnia również znaczne zrozumienie czynników, które mogą mieć negatywny wpływ na jakość i interpretowalność danych, a tym samym na wynik badań. Szczegółowo opisujemy tutaj metody konfiguracji optycznej, przygotowania próbek i pozyskiwania danych z wielu gatunków białek, z konstruktami fuzyjnymi PSFP i PAFP, przy użyciu FPALM. Chociaż protokół ten opisuje analizę komórek stałych, procedury te można łatwo zastosować do obrazowania żywych komórek.
Opisany tutaj układ optyczny jest idealny do jednoczesnego obrazowania PSFP Dendra2 i PAFP PAmCherry. Wiele innych sond może być używanych do obrazowania wielokolorowego; Jednak dokładne wymagane komponenty mogą się różnić w zależności od widm wzbudzenia i emisji wybranych sond. Wybór zwierciadeł dichroicznych, filtrów i długości fal laserowych powinien być dokonywany na podstawie tych rozważań.

<table><tbody><tr><td>Komory LabTek II</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Koraliki do kalibracji Koraliki</td></tr><tr><td>Tetraspeck</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Czterokolorowe koraliki do kalibracji</td></tr><tr><td>Obiektywowy olejek immersyjny</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Olejek immersyjny do obiektywu o wysokim NA (w zależności od wyboru obiektywu)</td></tr><tr><td>HPLC woda</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Lub Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>surowica</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>UWAGA: Toksyczny</td></tr></tbody></table>

jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Mikroskopia superrozdzielcza oparta na lokalizacji może być zastosowana do uzyskania przestrzennej mapy (obrazu) rozkładu pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych pojedynczych cząsteczek w próbce o rozdzielczości przestrzennej dziesiątek nanometrów. Wykorzystując fotoaktywowane (PAFP) lub fotoprzełączalne (PSFP) białka fluorescencyjne połączone z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania lub barwniki organiczne sprzężone z przeciwciałami lub innymi interesującymi cząsteczkami, mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) może jednocześnie obrazować wiele gatunków cząsteczek w pojedynczych komórkach. Stosując następujące podejście, populacje dużej liczby (od tysięcy do setek tysięcy) pojedynczych cząsteczek są obrazowane w pojedynczych komórkach i lokalizowane z precyzją ~10-30 nm. Uzyskane dane można zastosować do zrozumienia rozkładów przestrzennych w nanoskali wielu typów białek w komórce. Jedną z głównych zalet tej techniki jest dramatyczny wzrost rozdzielczości przestrzennej: podczas gdy dyfrakcja ogranicza rozdzielczość do ~200-250 nm w konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, FPALM może skalować długość obrazu o ponad rząd wielkości mniejszą. Ponieważ wiele hipotez biologicznych dotyczy relacji przestrzennych między różnymi biomolekułami, ulepszona rozdzielczość FPALM może dostarczyć informacji na temat organizacji komórek, które wcześniej były niedostępne dla konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Oprócz szczegółowego omówienia metod przygotowania próbek i pozyskiwania danych, opisujemy tutaj konfigurację optyczną dla FPALM. Dodatkową kwestią dla badaczy, którzy chcą przeprowadzić mikroskopię superrozdzielczą, jest koszt: własne konfiguracje są znacznie tańsze niż większość dostępnych na rynku urządzeń do obrazowania. Ograniczenia tej techniki obejmują konieczność optymalizacji znakowania cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania w próbkach komórkowych oraz potrzebę oprogramowania do przetwarzania końcowego w celu wizualizacji wyników. Opisujemy tutaj zastosowanie ekspresji PAFP i PSFP do obrazowania dwóch gatunków białek w utrwalonych komórkach. Opisano również rozszerzenie tej techniki na żywe komórki.

Hemaglutynina (HA) wirusa grypy tworzy klastry o rozmiarach od kilkudziesięciu nanometrów do mikrometrów, które w zmiennym stopniu kolokalizują z aktyną (Rycina 5). Rozkłady przestrzenne te potwierdzają obrazowanie obu tych białek w większej skali28 oraz zależność rozkładu przestrzennego HA od aktyny19. Wielokolorowe obrazy FPALM mogą być dodatkowo wykorzystane do opisania gęstości, pola powierzchni i obwodu tych klastrów, a także stopnia kolokalizacji obu gatunków białek zarówno w ...

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesne obrazowanie wielu gatunków białek z nanometrową precyzją w komórkach utrwalonych lub żywych. Osiąga się to najpierw poprzez regulację pozycji kamery i optyki, aż do momentu, gdy ostry obraz z mikroskopu zostanie wyświetlony na matrycy kamery. Drugim krokiem jest ustawienie wiązek laserowych w taki sposób, aby były one skierowane bezpośrednio na próbkę znajdującą się na stoliku mikroskopu.Następnie przygotowaną próbkę komórkową oświetlono i wybrano komórkę wykazującą ekspresję pożądanych białek. Ostatnim krokiem jest obrazowanie komórki przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacyjnej z fotoaktywacją poprzez oświetlenie próbki laserami, a następnie skierowanie fluorescencji komórkowej na matrycę kamery w celu pozyskania zbioru danych. W rezultacie fluorescencyjna mikroskopia lokalizacyjna z fotoaktywacją służy do wykazania lokalizacji wielu gatunków białek w nanometrowej skali przestrzennej w komórkach utrwalonych lub żywych, zarówno w szerokim polu, jak i przy zastosowaniu całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji w celu wyizolowania cienkiego obszaru próbki.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metoda

simultaneous-multicolor-imaging-biological-structures-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jednoczesne wielokolorowe przedstawianie struktur biologicznych za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacji z fotoaktywacją

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Demonstrujemy metodę obrazowania wielu cząsteczek w heterogenicznych nanostrukturach z dokładnością do pojedynczej cząsteczki, wykorzystując sekwencyjne wiązanie i elucję fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.

Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Poznaj metodę FPALM do jednoczesnego obrazowania wielu białek z nanometrową precyzją w komórkach stałych i żywych. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji protein z rozdzielczością przekraczającą granicę dyfrakcji światła.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Przeglądaj więcej filmów