Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji
9 grudnia 2013
Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesne obrazowanie wielu gatunków białek z nanometrową precyzją w komórkach utrwalonych lub żywych. Osiąga się to najpierw poprzez regulację pozycji kamery i optyki, aż do momentu, gdy ostry obraz z mikroskopu zostanie wyświetlony na matrycy kamery. Drugim krokiem jest ustawienie wiązek laserowych w taki sposób, aby były one skierowane bezpośrednio na próbkę znajdującą się na stoliku mikroskopu.
Następnie przygotowaną próbkę komórkową oświetlono i wybrano komórkę wykazującą ekspresję pożądanych białek. Ostatnim krokiem jest obrazowanie komórki przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacyjnej z fotoaktywacją poprzez oświetlenie próbki laserami, a następnie skierowanie fluorescencji komórkowej na matrycę kamery w celu pozyskania zbioru danych. W rezultacie fluorescencyjna mikroskopia lokalizacyjna z fotoaktywacją służy do wykazania lokalizacji wielu gatunków białek w nanometrowej skali przestrzennej w komórkach utrwalonych lub żywych, zarówno w szerokim polu, jak i przy zastosowaniu całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji w celu wyizolowania cienkiego obszaru próbki.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna czy elektronowa, jest możliwość jednoczesnego obrazowania wielu białek z rozdzielczością nanometrową w komórkach utrwalonych lub żywych. Poniższe kroki odnoszą się do systemu numeracji przedstawionego tutaj, który stanowi schemat konfiguracji wielokolorowej F Om dostarczony jako rycina 1 w towarzyszącym protokole tekstowym; aby skalibrować mikroskop, należy rozpocząć od umieszczenia wzorca kalibracyjnego lub siatki na stole mikroskopu przy zastosowanym obiektywie 10 x i lampie ustawionej na światło przechodzące. Należy wycentrować oś pionową w centrum pola widzenia.
Następnie należy dostosować mikroskop do oświetlenia Koer⌘, zamykając aperturę polową i patrząc przez okulary na siatkę. Jeśli krawędzie apertury polowej są nieostre, należy regulować wysokość kondensora, aż zarówno apertura polowa, jak i siatka staną się ostre. Następnie należy dostosować boczne położenie apertury polowej, aż znajdzie się ona w centrum pola widzenia, a następnie przymknąć aperturę polową tak, aby oświetlona była tylko środkowa część siatki.
Podczas pierwszego montażu tych komponentów należy dostosować długości ścieżek każdego kanału tak, aby były równe. Aby zrealizować ten projekt, należy skierować wiązkę na chip kamery, wyregulować lustra siedem i dziewięć oraz zamknąć aperturę detekcyjną, aby zapobiec nakładaniu się przestrzennemu obu kanałów. Następnie należy ustawić ostrość obrazu rodnika w kanale światła odbitego i sprawdzić, czy jest on również ostry w kanale światła przechodzącego.
Jeśli obraz w kanale światła przechodzącego jest nieostry, przesuwaj lustro dziewięć, aż obraz rodnika stanie się jednocześnie ostry w obu kanałach. Rozpocznij ustawianie laserów, usuwając soczewkę pierwszą z drogi wiązki lasera i blokując wiązki aktywacji oraz odczytu. Następnie przyłóż białą kartkę ściśle do lustra cztery, otwórz migawkę mikroskopu i ustaw ostrość tak, aby obraz rodnika został rzutowany na kartkę przed lustrem cztery.
Następnie odblokuj wiązkę odczytu i wyreguluj lustro pierwsze, aby wycentrować laser odczytujący na krzyżu obrazu radialnego na lustrze czwartym. Po wycentrowaniu skieruj obraz radialny na lustro piąte i reguluj lustro czwarte, aż wiązka zostanie wycentrowana na krzyżu obrazu lustra piątego. Wiązka odczytu powinna być teraz wycentrowana zarówno na M czwartym, jak i M piątym.
Następnie zablokuj wiązkę odczytu, zamykając migawkę pierwszą. Dalej, wyświetl obraz rodnika na lustrze trzecim. Usuń rozszerzacz wiązki z drogi lasera i odblokuj laser aktywacyjny.
Teraz należy ustawić lustro drugie tak, aby wycentrować wiązkę aktywacyjną na przecięciu linii obrazu rodnika na lustrze trzecim. Po wycentrowaniu należy zamontować rozszerzacz wiązki pomiędzy lustrami drugim i trzecim, a następnie korygować jego pozycję, aż wiązka zostanie wycentrowana na przecięciu linii obrazu rodnika. Następnie należy rzutować obraz rodnika z lustra trzeciego na lustro piąte i ustawić ostrość.
Za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu należy dostosować kąt lustra dichroicznego numer jeden, aż wiązka aktywacyjna zostanie wycentrowana na obrazie redle. Następnie, przy otwartej migawce mikroskopu i bez zamontowanego obiektywu, należy zablokować laser aktywacyjny, zamykając migawkę dwa. Otwórz migawkę odczytu (migawka jeden) i skieruj laser przez tylną aperturę mikroskopu.
Dostrój lustro pięć, aż wiązka wyjdzie z mikroskopu, tak aby wiązka opuszczała mikroskop pionowo, przy ponownym umieszczeniu soczewki jeden i obiektywu. Umieść na stoliku próbkę zawierającą 100 µM bromu B, blokując laser aktywacyjny. Skieruj laser odczytowy przez obiektyw 60x w głąb barwnika.
Przy wyłączonym wzmocnieniu mnożnikowym elektronów. Prześlij ten obraz do kamery. Następnie ustaw ostrość obiektywu na próbce.
Otwórz przysłonę na tyle szeroko, aby umożliwić obrazowanie pełnego profilu wiązki. Następnie przesuń przysłonę bocznie tak, aby środek profilu wiązki i przysłona były współśrodkowe. Używając oprogramowania kamery, wybierz obszar zainteresowania (ROI), aby uzyskać jak najmniejszy obszar odczytu kamery obejmujący oba kanały, i zapisz te współrzędne.
W tym momencie należy zarejestrować pojedynczy obraz reprezentujący profil wiązki odczytującej. Następnie zablokuj laser odczytujący, zamykając migawkę pierwszą i otwierając migawkę drugą. Aby rozpocząć pomiar profilu wiązki aktywacyjnej, skieruj laser aktywacyjny na próbkę; w razie potrzeby ustaw wzmocnienie mnożnika elektronów na wartość mniejszą niż 100 i dostrój pierwsze lustro dichroiczne, aż wiązka znajdzie się w centrum każdego pola widzenia.
Następnie należy zarejestrować obraz profilu wiązki aktywującej, aby rozpocząć akwizycję wielokolorowych obrazów F palm. Należy wyłączyć całe oświetlenie pomieszczenia. Następnie należy skierować światło lampy rtęciowej za pomocą uchwytu obrotowego na przetransfekowane komórki i zmienić kostkę filtrującą na taką, która zawiera odpowiednią długość fali wzbudzenia dla stanu przed przełączeniem fotonicznym.
Po wybraniu komórki należy opuścić uchwyt obrotowy, aby umożliwić przejście wiązek laserowych do mikroskopu, a następnie zmienić ustawienie wieżyczki filtrów na taką, która zawiera odpowiednie lustro dichroiczne do obrazowania, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie należy wyświetlić ten obraz na kamerze, aby odróżnić komórki transfekowane od fluorescencji tła i potwierdzić, że cząsteczki nadają się do fotoaktywacji. Próbkę należy krótko naświetlić laserem aktywacyjnym o niskiej mocy, wynoszącej mniej niż 10 µW.
Następnie należy przygotować oprogramowanie kamery do akwizycji serii kinetycznych, ustawiając wzmocnienie elektronowe na 200 oraz pożądaną liczbę klatek w przedziale od 5 do 10 000. Należy również ustawić czas ekspozycji w przedziale od 10 do 30 ms. Następnie należy zablokować wiązkę aktywującą, odblokować wiązkę odczytującą i wyświetlić obraz oświetlonej komórki na kamerze.
Wybierz płaszczyznę ogniskową w pobliżu dolnej błony komórkowej, przesuwając ostrość w dół, aż poszczególne cząsteczki przestaną być widoczne. Następnie stopniowo przesuwaj ostrość w górę, aż cząsteczki ponownie pojawią się w polu widzenia. Teraz odblokuj wiązkę aktywacyjną i oświetl próbkę intensywnością mniejszą niż 1 W/cm².
Rozpocznij pozyskiwanie danych za pomocą oprogramowania kamery, utrzymując gęstość od 0,1 do 1 widocznych cząsteczek fotopodatnych na mikrometr kwadratowy poprzez dynamiczną regulację filtra neutralnego położonego przed laserem aktywacyjnym. W celu obrazowania fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem zamontuj lustro pięć i soczewkę jeden na pojedynczym stole translacyjnym, który należy przesuwać bocznie tuż za wlot do mikroskopu. W miarę przesuwania lustra pięć i soczewki jeden, wiązki laserowe wychodzące z obiektywu w górę przez próbkę będą stopniowo przechylać się na jedną stronę; kontynuuj przesuwanie stołu, aż kąt wiązek laserowych osiągnie 90 stopni względem pionu.
W tym momencie wiązka laserowa wyjściowa zniknie, a wiązka wpadająca zostanie odbita wstecznie przez aperturę, poruszając się antyrównolegle do wiązki wpadającej i będąc przesuniętą w bok. Po zakończeniu akwizycji obrazów, gdy próbka wejdzie w stan całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji, powinno nastąpić zmniejszenie tła. Należy niezwłocznie zamknąć migawkę mikroskopu i zablokować obie wiązki. Wyłącz wzmocnienie mnożnikowe elektronów.
Ustaw kamerę na rejestrację jednej klatki i ustaw obszar odczytu kamery na rozmiar maksymalny. Na koniec zablokuj jeden kanał, umieszczając kartkę nad F3 lub F4 z filtrem długoprzepustowym zamontowanym w lampie mikroskopu. Oświetl próbkę i wyświetl ten obraz na kamerze.
Wykonaj zdjęcie komórki, aby przedstawić całą komórkę w świetle przechodzącym. Przedstawiono tutaj przykład dwukolorowej akwizycji F palm komórki NIH 3T3 wykazującej ekspresję zarówno DENDRA 2 Hemaglutyniny, jak i PAM Cherry aktyny. Kanał przechodzący po lewej stronie zawiera dłuższe fale niż kanał odbity po prawej stronie.
Przedstawiono tutaj migawki z tej samej akwizycji dwukolorowego F OM po odjęciu tła i transformacji w celu nałożenia na siebie kanału lewego i prawego. Można zidentyfikować i zlokalizować poszczególne cząsteczki. Niektóre cząsteczki wydają się jaśniejsze w kanale transmitowanym, a inne wykazują bardziej równomierny rozkład emisji pomiędzy dwoma kanałami.
Wskazuje to na różnicę w widmach emisji odpowiednio między PAM cherry a DENDRA two i jest wykorzystywane w analizie do identyfikacji tych dwóch gatunków. Przedstawiony tutaj histogram wskazuje stosunek natężenia czerwonego kanału transmisyjnego do całkowitego natężenia dla wszystkich zlokalizowanych cząsteczek po zastosowaniu tolerancji. Piksele są białe na obrazie w lewym dolnym rogu i czerwone na końcowym obrazie scalonym w prawym dolnym rogu, podczas gdy te w obszarze zielonym są białe na obrazie w prawym górnym rogu i zielone na końcowym obrazie scalonym w prawym dolnym rogu.
Poziomy progowe wybrane podczas renderowania mają ogromny wpływ na stopień szumów oraz wygląd kolokalizacji. Przedstawiono tutaj trzy różne opcje renderowania, które skutkują różnym stopniem przenikania sygnału; najbardziej konserwatywne poziomy progowe pokazano na dwóch dolnych obrazach. Histogramy Color F palm alpha najlepiej interpretować w sytuacjach, gdy na obrazie widoczne są dwa wyraźne piki.
Podczas gdy histogram po lewej stronie jest dobrym kandydatem do dalszej analizy, obrazy wynikające z dwóch pozostałych histogramów będą znacznie trudniejsze do zinterpretowania po zastosowaniu tej procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób organizacji białek w nanoskali w błonach komórkowych żywych komórek, można przeprowadzić badania z wykorzystaniem metod takich jak mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia oraz obrazowanie żywych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak skonfigurować własny mikroskop FAR i wykorzystać go do pozyskiwania danych.
Należy pamiętać, że praca z laserami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego przed przystąpieniem do tej procedury należy przejść szkolenie z zakresu bezpieczeństwa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie demonstruje zastosowanie mikroskopii lokalizacyjnej z fotoaktywacją fluorescencji (FPALM) do obrazowania wielu rodzajów białek wewnątrz komórek z nanometrową precyzją. Technika ta umożliwia lokalizację tysięcy białek znakowanych fluorescencyjnie zarówno w komórkach utrwalonych, jak i żywych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Mikroskopia fluorescencyjna jest potężnym narzędziem do wizualizacji komponentów komórkowych.
- FPALM zwiększa rozdzielczość poza limit dyfrakcyjny mikroskopii świetlnej.
- Metoda ta pozwala na badanie oddziaływań i rozmieszczenia białek na poziomie molekularnym.
- Może być stosowana zarówno w obrazowaniu komórek utrwalonych, jak i żywych.
Cel badania
- Aby umożliwić jednoczesne obrazowanie wielu gatunków białek.
- Aby zapewnić wysoką rozdzielczość przestrzenną w obrazowaniu komórkowym.
- Aby ułatwić badanie dynamiki lokalizacji białek w żywych komórkach.
Zastosowane metody
- Regulacja kamery i optyki w celu uzyskania ostrego obrazowania.
- Ustawienie wiązek laserowych na próbce znajdującej się na stoliku mikroskopu.
- Oświetlenie próbki komórek wykazujących ekspresję pożądanych białek.
- Pozyskiwanie zbiorów danych metodą FPALM poprzez kierowanie fluorescencji na matrycę kamery.
Główne wyniki
- Skuteczna lokalizacja wielu gatunków białek w skali nanometrów.
- Wykazana skuteczność zarówno w komórkach utrwalonych, jak i żywych.
- Wykorzystanie technik fluorescencji w szerokim polu oraz całkowitego wewnętrznego odbicia.
- Osiągnięcie wysokiej precyzji w obrazowaniu tysięcy pojedynczych białek.
Wnioski
- FPALM jest skuteczną metodą badania lokalizacji białek.
- Technikę tę można dostosować do różnych kontekstów komórkowych.
- Otwiera ona nowe możliwości badań nad dynamiką i oddziaływaniami komórkowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Symultaniczny wielokolorowy FPALM umożliwia mapowanie w skali nanometrów wielu gatunków białek w pojedynczych komórkach, bezpośrednio rozwiązując problem rozdzielczości relacji przestrzennych między biomolekułami poza limitem dyfrakcyjnym. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych fazach odkrywania poprzez ujawnienie organizacji w nanoskali, która jest kluczowa dla walidacji celu i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Zgodność tej metody zarówno z komórkami utrwalonymi, jak i żywymi wspiera ciągłość translacyjną oraz selekcję portfolio w punktach zwrotnych odkrywania i badań przedklinicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację kolokalizacji białek oraz nanometrycznych relacji przestrzennych w celu weryfikacji hipotez.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie rozmieszczenia białek z precyzją ~10–30 nm.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnianie rzeczywistych oddziaływań molekularnych od artefaktów bliskości.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie kierowania celów przez etap odkrywania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy komórkowe do dalszych badań przesiewowych poprzez potwierdzenie lokalizacji molekularnej.
- Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych przestrzennych do standaryzacji i benchmarkingu testów.
- Umożliwia obrazowanie multipleksowe, wspierając skalowalną ocenę wpływu związków na wiele celów.
- Zapewnia wysokotreściowe odczyty (high-content readouts) dla niezawodnej selekcji i priorytetyzacji związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki obrazowania w nanoskali z modelami komórkowymi istotnymi dla danej choroby w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez umożliwienie analizy komórek żywych oraz utrwalonych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne w rozwoju przedklinicznym dzięki wyjaśnieniu organizacji molekularnej w odpowiednich systemach.
- Poprawia zrozumienie mechanizmów w celu podejmowania decyzji z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
FPALM integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne – zapewniając możliwość wielokrotnego wykorzystania obrazowania zarówno w modelach komórek utrwalonych, jak i żywych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie rozkładu białek z rozdzielczością nanometryczną.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki przestrzenne w celu przygotowania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary statystyczne lokalizacji i kolokalizacji molekularnej do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie wyników obrazowania do modeli istotnych dla chorób w celu walidacji biomarkerów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, kosztowo efektywną platformę obrazowania, którą można dostosować do wielu programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości, zapewniając powtarzalne, ilościowe wyniki.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie organizacji molekularnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w fazie odkrywania i badań przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej i bezpieczeństwa laserowego.
- Wymaga precyzyjnego dopasowania optycznego i kalibracji w celu obrazowania wielokolorowego.
- Wymaga wydajnego oprogramowania do postprocessingu w celu analizy lokalizacji i kolokalizacji.
- Wiąże się z optymalizacją strategii znakowania białek docelowych w odpowiednich modelach komórkowych.
- Konstrukcje własne, będące rozwiązaniem kosztowo efektywnym, są możliwe do zrealizowania, lecz wymagają infrastruktury technicznej i przeszkolenia.
