Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikroskopii optycznej, takie jak sposób wykonywania obrazów o wysokiej rozdzielczości, a także obrazów FRET przy użyciu tego samego mikroskopu. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy połączyć trzy różne moduły obrazowania w jeden mikroskop, co znacznie obniża całkowity koszt. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ montaż ścieżki wzbudzenia jest trudny do nauczenia.

Wymagają one odpowiedniego doboru części i czułego wyrównania optycznego. Aby rozpocząć, zainstaluj kartę do akwizycji danych za pośrednictwem interfejsu PCI i użyj jej do podłączenia laserów do komputera. Kontroluj zachowanie włączania i wyłączania laserów za pomocą wyjścia logicznego tranzystor-tranzystor i regulację ich mocy za pomocą wyjścia analogowego tej karty.

Następnie przygotuj izolowany od drgań stół optyczny z lustrami i rozdzielaczami wiązki, jak pokazano tutaj i opisano w dołączonym protokole tekstowym. Połącz wiązki laserowe w światłowód jednomodowy, najpierw montując płytkę adaptera światłowodu w uchwycie translacyjnym osi z. Następnie zamontuj achromatyczną soczewkę dubletową w płycie klatkowej.

Użyj przedłużacza, aby połączyć adapter i soczewkę, aby utworzyć klatkę. Następnie użyj słupków optycznych o grubości jednego cala, aby zamontować klatkę na stole optycznym. Wyrównaj laser 647-nanometrowy, dostosowując komponenty, aby uzyskać maksymalną moc wyjściową lasera przez światłowód.

Po ustawieniu pierwszego lasera tymczasowo zainstaluj parę przysłon i wyrównaj pozostałe lasery jeden po drugim. Sprawdź skuteczność osiowania każdego lasera za pomocą miernika mocy. Pamiętaj, aby pozostawić jedną przysłonę przed płytą adaptera, aby zmniejszyć odbicia laserów.

Następnie zaprojektuj i zainstaluj soczewkę powiększającą zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Aby uzyskać efekt astygmatyzmu niezbędny do wyodrębnienia współrzędnych Z każdej pojedynczej cząsteczki, umieść soczewkę 3D o ogniskowej 10 metrów w kasecie i włóż ją do ścieżki wiązki emisyjnej. W celu zminimalizowania drgań podczas sekwencyjnego wielokolorowego obrazowania epifluorescencyjnego należy stosować filtry emisyjne umieszczone w barierowym kole filtrowym podłączonym obok mikroskopu.

W celu jednoczesnego wykrywania wielu kolorów podczas eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET, należy umieścić inny zestaw filtrów w rozdzielaczu emisji. Aby skonfigurować obrazowanie z ograniczeniem dyfrakcji za pomocą epi-wzbudzenia, najpierw dostosuj przypadkowy kąt lasera wzbudzenia do trybu epi w ramieniu oświetleniowym. Następnie odłącz soczewkę 3D i włóż kostkę obejściową do rozdzielacza emisji.

Następnie włóż soczewkę magazynka, aby uzyskać szersze oświetlenie. Po skonfigurowaniu wykonaj wielokanałowe, z-stack i/lub poklatkowe obrazy próbki w oparciu o pożądane wyniki. Aby skonfigurować wielokolorowe wykrywanie pojedynczych cząsteczek cząsteczek unieruchomionych powierzchniowo, najpierw przesuń koło filtra do pustej pozycji.

Umożliwi to przejście laserów. Następnie dostosuj przypadkowy kąt laserów wzbudzenia do kąta murawy i odłącz zarówno soczewki magnetyczne, jak i 3D. Następnie włącz tryb trzykanałowy w rozdzielaczu emisji, najpierw zastępując kostkę obejściową kostką kalibracyjną, która przepuszcza całe światło przez wszystkie kanały.

Następnie włącz kamerę w obszarze DIC i dostosuj przysłonę rozdzielacza emisji, aż na ekranie pojawią się trzy, całkowicie rozdzielone kanały. Obróć pokrętła regulacji pionowo-poziomej na rozdzielaczu emisji i z grubsza wyrównaj trzy kanały. Następnie wyłącz kamerę i zastąp kostkę kalibracyjną kostką potrójną.

Umieść próbkę wielokanałowych koralików o długości 100 nanometrów. Po wzbudzeniu na 488 nanometrach, wielokanałowe kulki o długości 100 nanometrów emitują światło o różnych długościach fal, umożliwiając wyrównanie trójkanałowe. Następnie włącz aparat i laser 488-nanometrowy, powiększ jeden z jasnych koralików, a na koniec wyrównaj trzy kanały, ponownie obracając pokrętła regulacji.

Po umieszczeniu próbki na miejscu, za pomocą słabego lasera, przejdź do obszaru o rozsądnej gęstości plamki i dostosuj moc lasera oraz czas ekspozycji, aby osiągnąć akceptowalne poziomy sygnału do szumu i fotowybielania. Następnie użyj oprogramowania do obrazowania, aby zrobić zdjęcia poklatkowe. Aby uzyskać obrazowanie w super rozdzielczości, zacznij od włożenia obiektywu 3D i wyjmij obiektyw magnetyczny.

Następnie określ optymalny kąt przypadkowy lasera wzbudzenia, który ma być kątem murawy. Aby znaleźć odpowiednią wysokość obiektywu do obrazowania SR, użyj obrazowania DIC, aby znaleźć środkową płaszczyznę komórek. Zidentyfikuj płaszczyznę na podstawie wysokości, na której komórki stają się przezroczyste.

Po określeniu żądanej płaszczyzny ogniskowej rozpocznij obrazowanie w super rozdzielczości. Podczas obrazowania zmieniaj moc lasera 405 nm, aby utrzymać rozsądną gęstość miejsc. Rozpocznij obrazowanie bez zasilania lasera fioletowego.

Policz liczbę punktów w określonym czasie i zwiększ moc fioletowego lasera, tak aby liczba punktów była utrzymywana powyżej zdefiniowanego przez użytkownika progu zliczania w polu widzenia. Analizuj dane, wykrywając centroidy każdego punktu w ramkach obrazowania i wyodrębnij wartości z dla każdego punktu z szerokości X i Y. Zbuduj zrekonstruowany obraz i wizualizuj obiekty w 3D.

Ta konfiguracja mikroskopu pozwala na elastyczne i powtarzalne przełączanie między różnymi metodami obrazowania, w tym konwencjonalnym obrazowaniem epifluorescencyjnym, obrazowaniem superrozdzielczym opartym na detekcji pojedynczej cząsteczki i wielokolorowym wykrywaniem pojedynczych cząsteczek. Aby ujawnić drobniejsze szczegóły w zespole molekularnym, mikroskopia superrozdzielcza łączy tysiące obrazów, takich jak ten. Obrazy te są następnie rekonstruowane w celu wygenerowania końcowego obrazu w super rozdzielczości.

Techniki superrozdzielczości pozwalają na uzyskanie wysokiej rozdzielczości przestrzennej, zapewniając szczegóły, których nie można zobaczyć za pomocą innych technik. Jest to zaznaczone na dwóch pokazanych tutaj obrazach. Obraz o wysokiej rozdzielczości pokazuje tę samą bakteryjną regulatorową RNazę, co obraz epifluorescencji, ale pozwala na wykrycie pojedynczej cząsteczki.

SmFRET to kolejna metoda zdolna do uzyskania rozdzielczości od angstremów do nanometrów. W tym przypadku pofałdowane cząsteczki RNA zostały oznaczone zielonym barwnikiem donorowym i czerwonym barwnikiem akceptorowym. Trajektorie intensywności fluorescencji można wyodrębnić z pojedynczych cząsteczek, generując wydajność FRET w funkcji czasu.

Nie zapominaj, że praca z laserami może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych lub zmniejszanie mocy lasera.