Dlaczego pomiar wydajności smFRET jest istotny dla walidacji celu?

pomiary wydajności smFRET dostarczają informacji o zmianach konformacyjnych i dynamice wiązania cząsteczek docelowych z rozdzielczością od angstromów do nanometrów, co umożliwia bezpośrednią obserwację zachowania celu terapeutycznego w czasie rzeczywistym. Wspiera to redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie stanów strukturalnych z efektami funkcjonalnymi, co jest kluczowe dla oceny zasadności wyboru celu na wczesnym etapie procesu odkrywania leków.

W jaki sposób izolacja kąta lasera wzbudzenia umożliwia powtarzalną zmianę trybu obrazowania?

Precyzyjna regulacja kąta padania lasera do kątów epi lub turf pozwala na przełączanie się między epifluorescencją ograniczoną przez dyfrakcję a obrazowaniem o superrozdzielczości bez konieczności wymiany sprzętu. Taka izolacja zmiennej niezależnej zapewnia spójne warunki oświetlenia we wszystkich trybach obrazowania, co umożliwia niezawodne generowanie danych porównawczych w procesach badawczych.

Jakie pomiary ilościowe umożliwia lokalizacja pojedynczych cząsteczek w obrazowaniu super-rozdzielczym?

Lokalizacja pojedynczych cząsteczek umożliwia wyodrębnienie pozycji centroidów oraz szerokości X/Y z klatek obrazowania, które są wykorzystywane do obliczania współrzędnych z i rekonstrukcji trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości z około dziesięcio- lub dwudziestokrotnie poprawioną rozdzielczością przestrzenną. Te ilościowe wyniki dostarczają szczegółowych informacji strukturalnych o kompleksach molekularnych, wspierając walidację celów oraz badania mechanizmu działania.Dlaczego wymagania dotyczące replikacji są kluczowe dla współpracy międzyfunkcyjnej w centralnych ośrodkach obrazowania?

Dlaczego wymagania dotyczące replikacji są kluczowe dla współpracy międzyfunkcyjnej w centralnych ośrodkach obrazowania?

Wymagania dotyczące replikacji zapewniają, że wyniki obrazowania są powtarzalne pomiędzy różnymi użytkownikami, sesjami i konfiguracjami optycznymi, co jest niezbędne dla wymiany danych między zespołami zajmującymi się biologią docelową, opracowywaniem testów oraz zespołami przedklinicznymi. Standaryzowane procedury wyrównania oraz kule kalibracyjne umożliwiają spójną rejestrację kanałów i kwantyfikację sygnału, co pozwala na wiarygodne porównywanie danych z wielu ośrodków.

Jakie analizy statystyczne są wymagane przed zastosowaniem danych z wielokolorowego smFRET w identyfikacji związków wiodących?

Implementacja danych wielokolorowego smFRET wymaga detekcji trajektorii intensywności z pojedynczych cząsteczek, obliczania wydajności FRET w czasie oraz zastosowania filtrowania opartego na progach w celu odróżnienia specyficznego wiązania od szumu tła. Takie podejście statystyczne gwarantuje, że obserwowane zmiany FRET odzwierciedlają rzeczywiste oddziaływania molekularne, co pozwala na pewny wybór związków wiodących w oparciu o zwalidowane mechanizmy zaangażowania celu.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

9.5K wyświetleń

Cytowany 8 razy

08:32 min

28 października 2018

10.3791/58320-v

28 października 2018

9.5K wyświetleń

Seongjin Park¹ , Jiacheng Zhang² , Matthew A. Reyer² , Joanna Zareba¹^,³ , Andrew A. Troy⁴ , Jingyi Fei¹^,²

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, ²The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, ³Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, ⁴Nikon Instruments Inc.

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.