Name: Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę integracji wielu technik obrazowania w jednym mikroskopie fluorescencyjnym, obejmującą obrazowanie superrozdzielcze i detekcję pojedynczych cząsteczek. To podejście znacząco obniża koszty badań mikroskopowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.F. dziękuje za wsparcie ze strony Programu Stypendialnego Searle oraz Nagrody Dyrektora NIH dla Nowych Innowatorów. Autorzy przyjmują do wiadomości przydatne sugestie z laboratorium Paula Selvina (University of Illinois, Urbana-Champaign) dotyczące pozycjonowania soczewki 3D.

<ol><li>Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLipson%2C+SG+%22Optical+physics%22">Optical physics</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).</li>
<li>Török, P., Wilson, T. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0030401896007717">Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes.</a> Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Balzarotti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606-612 (2017).</li>
<li>Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+photoactivatable+fluorophores+created+by+reductive+caging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging.</a> Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).</li>
<li>Ha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+two+single+molecules%3A+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+a+single+donor+and+a+single+acceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Hua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+surface+passivation+method+for+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved surface passivation method for single-molecule studies.</a> Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).</li>
<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+biochemistry.+Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Stracy, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+super-resolution+imaging+of+transcription+in+living+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria.</a> Methods. 120, 103-114 (2017).</li>
<li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li>
<li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+disruption+of+ciliary+transition-zone+architecture+causes+Joubert+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).</li>
<li>Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+nanoimprint+lithography+for+drift+correction+in+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy.</a> Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten hybrydowy system mikroskopowy eliminuje konieczność zakupu wielu mikroskopów. Całkowity koszt wszystkich części, w tym stołu optycznego, robocizny instalacyjnej stołu, oprogramowania i stacji roboczej, wynosi około 230 000 USD. Części obrabiane na zamówienie, w tym soczewka magnetyczna i soczewka 3D, kosztują około 700 USD (koszt zależy od rzeczywistych opłat w różnych instytutach). Typowe dostępne na rynku zintegrowane systemy do mikroskopii SR opartej na detekcji pojedynczych cząsteczek kosztują ponad 300 000 ~ 400...

Mikroskopy fluorescencyjne są ważnymi narzędziami dla nowoczesnych badań biologicznych, a obrazowanie fluorescencyjne jest rutynowo wykonywane w wielu laboratoriach biologicznych. Oznaczając interesujące nas biomolekuły fluoroforami, możemy bezpośrednio wizualizować je pod mikroskopem i rejestrować zależne od czasu zmiany w lokalizacji, konformacji, interakcji i stanie składania in vivo lub in vitro. Konwencjonalne mikroskopy fluorescencyjne mają ograniczoną dyfrakcją rozdzielczość przestrzenną, która wynosi ~200 - 300 nm w kierunku bocznym i ~500 - 700 nm w kierunku osiowym1,2, a zatem są ograniczone do obrazowania w skali 100 nanometrów na mikrony. Aby ujawnić drobniejsze szczegóły w zespole lub organizacji molekularnej, opracowano różne mikroskopie SR, które mogą przekroczyć granicę dyfrakcji. Strategie stosowane do osiągnięcia SR obejmują nieliniowe efekty optyczne, takie jak mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji (STED)3,4 i mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM)5,6,7, stochastyczne wykrywanie pojedynczych cząsteczek, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)8 oraz mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM)9 oraz kombinacja obu, np. MINFLUX10. Wśród tych mikroskopów SR, mikroskopy SR oparte na detekcji pojedynczych cząsteczek mogą być stosunkowo łatwo modyfikowane z zestawu mikroskopu jednocząsteczkowego. Dzięki powtarzalnej aktywacji i obrazowaniu fotoaktywowalnych białek fluorescencyjnych (FP) lub fotoprzełączalnych barwników oznaczonych na interesujących biomolekułach, rozdzielczość przestrzenna może osiągnąć 10 - 20 nm11. Aby uzyskać informacje na temat oddziaływań molekularnych i dynamiki konformacyjnej w czasie rzeczywistym, wymagana jest rozdzielczość od angstrema do nanometrów. smFRET12,13 jest jednym ze sposobów osiągnięcia tego rozwiązania. Ogólnie rzecz biorąc, w zależności od interesujących nas kwestii biologicznych, potrzebne są metody obrazowania o różnych rozdzielczościach przestrzennych.
Zazwyczaj, dla każdego rodzaju obrazowania, wymagana jest specyficzna konfiguracja optyczna wzbudzenia i/lub emisji. Na przykład jedną z najczęściej stosowanych metod oświetlenia do wykrywania pojedynczych cząsteczek jest całkowite odbicie wewnętrzne (TIR), w którym należy osiągnąć określony kąt wzbudzenia przez pryzmat lub soczewkę obiektywu. W celu detekcji smFRET emisje zarówno barwników donorowych, jak i akceptorowych muszą być przestrzennie oddzielone i skierowane do różnych części urządzenia zwielokrotniającego elektrony ze sprzężeniem ładunkowym (EMCCD), co można osiągnąć za pomocą zestawu luster i dichroicznych rozdzielaczy wiązki umieszczonych na ścieżce emisji. W przypadku trójwymiarowego (3-D) obrazowania SR komponent optyczny, taki jak soczewka cylindryczna14, jest potrzebny do wywołania efektu astygmatyzmu na ścieżce emisji. W związku z tym domowe lub dostępne na rynku mikroskopy zintegrowane są zazwyczaj funkcjonalnie wyspecjalizowane dla każdego typu metody obrazowania i nie są elastyczne w przełączaniu się między różnymi metodami obrazowania przy użyciu tej samej konfiguracji. Poniżej przedstawiamy ekonomiczny, hybrydowy system, który zapewnia regulowane i powtarzalne przełączanie między trzema różnymi metodami obrazowania: konwencjonalnym obrazowaniem epi-fluorescencyjnym z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcją, obrazowaniem SR opartym na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowym wykrywaniem pojedynczych cząsteczek, w tym obrazowaniem smFRET (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). W szczególności prezentowana tutaj konfiguracja zawiera sprzężone światłowody lasery wejściowe do wzbudzenia wielokolorowego oraz komercyjne ramię oświetleniowe na ścieżce wzbudzenia, które umożliwia zaprogramowaną kontrolę kąta wzbudzenia, przełączanie między trybem epi a trybem TIR. Na ścieżce emisji w korpusie mikroskopu umieszcza się wyjmowaną cylindryczną kasetę obiektywu do obrazowania 3D SR, a komercyjny rozdzielacz wiązki jest umieszczany przed kamerą EMCCD, którą można selektywnie włączyć do jednoczesnego wykrywania wielu kanałów emisji.

<table><tbody><tr><td>Statyw mikroskopu Nikon Ti-E</td><td>Obiektyw Nikon</td><td>Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td></td><td>100X NA 1.49 CFI HP TIRF</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Advanced Research/HC</td><td>HC zawiera moduł "JOBS", zaprogramowany moduł akwizycji używany do obrazowania SR.</td></tr><tr><td>Ramię oświetleniowe</td><td>Nikon</td><td>Ti-TIRF-EM Zmotoryzowany oświetlacz M</td><td>To ramię ma szczelinę na soczewkę powiększającą</td></tr><tr><td>Analizuj blok</td><td>Nikon</td><td>Ti-A</td><td>Jest zainstalowany w wieżyczce filtra.</td></tr><tr><td>System korekcji dryfu Z</td><td>Nikon</td><td>PFS</td><td>Ten system składa się z silnika krokowego na końcówce obiektywu, diody LED podczerwieni i detektora.</td></tr><tr><td>Blat stołu optycznego</td><td>TMC</td><td>783-655-02R</td><td></td></tr><tr><td>Podstawy stołu optycznego</td><td>TMC</td><td>14-426-35</td><td></td></tr><tr><td>Laser 647 nm</td><td>Cobolt</td><td>90346 (0647-06-01-0120-100)</td><td>Modulowana dioda laserowa 647nm 120mW wraz z głowicą laserową, skrzynką sterowniczą CDRH, USB i zasilaczem (Power Supply Unit)</td></tr><tr><td>Laser 561 nm</td><td>Laser Koherentny</td><td>1280721</td><td>OBIS 561nm LS 150mW System laserowy</td></tr><tr><td>Laser</td> <td>488 nmCobolt</td><td>90308 (0488-06-01-0060-100)</td><td>Modulowana dioda laserowa 488nm 60mW wraz z głowicą laserową, skrzynką kontrolną CDRH, USB i zasilaczem (zasilaczem)</td></tr><tr><td>Kryształowiec</td> <td>laserowy 405 nm</td><td>DL405-025-O</td><td>405 (+/-5)nm, 25mW, Okrągły , M2 < 1.3, niski poziom szumów, CW, TTL do 20MHz. 2 złącza BNC dla TTL i Regulacja analogowa</td></tr><tr><td>Radiator</td><td>Cobolt</td><td>11658 (HS-03)</td><td>Dwie jednostki, Radiator bez wentylatora HS-03, Radiator do laserów 647 nm i 488 nm</td></tr><tr><td>Radiator</td><td>Radiator Coherent</td><td>1193289</td><td>Radiator Obis z wentylatorem, 165 x 50 x 50 mm do lasera 561 nm</td></tr><tr><td>CAB-USB-miniUSB</td><td>Cobolt</td><td>10908</td><td>Dwie jednostki, komunikacyjny do laserów 647 nm i 488 nm</td></tr><tr><td>aluminium do regulacji wysokości</td><td>McMaster-Carr</td><td>9146T35</td><td>Uniwersalny 6061 Aluminiowy, prostokątny pręt, 4MM X 40MM, 1' Długi do podnoszenia 561 nm laserowe</td></tr><tr><td>aluminium do regulacji wysokości</td><td>McMaster-Carr</td><td>8975K248</td><td>Uniwersalny 6061 Aluminium, 1-1/4" Grubość X 3" Szerokość X 1' Długość do podnoszenia 405 nm laserowy</td></tr><tr><td>BNC</td><td>L-com</td><td>CC58C-6</td><td>RG58C koncentryczny, BNC męski / męski, 6.0 ft</td></tr><tr><td>Adapter BNC</td><td>L-com</td><td>BA1087</td><td>Adapter koncentryczny, grodzia BNC, uziemiony</td></tr><tr><td>adapter SMA na BNC</td><td>HOD</td><td>SMA-870</td><td>Lasery Cobolt MLD mają interfejs SMA, więc ten adapter służy do połączenia BNC.</td></tr><tr><td>Przejściówka SMB na BNC</td><td>Fairview Kuchenka mikrofalowa</td><td>FMC1638316-12</td><td>Wtyczka SMB do żeńskiego grodziowego BNC RG316 12 cali do koherentnych laserów Obis</td></tr><tr><td>Karta akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6723</td><td>13-bitowy, 32-kanałowy, 800 kS / s Analogowe urządzenie wyjściowe do sterowania laserami, diodami DIC LED itp</td></tr><tr><td>Filtr barierowy Kontroler koła</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-B</td><td>Zmieniacz</td></tr> <tr><td>filtrów optycznychRozdzielacz emisji</td><td>Cairn</td> Dichroiczny rozdzielacz wiązki <td>OptoSplit III</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chroma</td><td>T640LPXR-UF2</td><td>Dichroiczny rozdzielacz wiązki oddzielający emisję czerwoną od zielonej w OptoSplit III</td></tr><tr><td>Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Chroma</td><td>T565LPXR-UF2</td><td>Dichroiczny rozdzielacz wiązki oddzielający emisję zieloną i czerwoną od niebieskiej w OptoSplit III</td></tr><tr><td>Filtr emisji</td><td>Chroma</td><td>ET700/75M</td><td>Dwie jednostki, Filtr emisyjny do emisji czerwonej (jak Alexa Fluor 647) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Chroma</td><td>ET595/50M</td><td>Dwie sztuki, Filtr emisyjny do emisji żółtego/zielonego (jak Cy3B) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych</td></tr><tr><td>Filtr</td><td>emisyjny Chroma</td><td>ET525/50M</td><td>Dwie jednostki, Filtr emisyjny do emisji niebieskiego (jak Alexa Fluor 488/GFP) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td>Filtr emisyjny do emisji fioletu (jak DAPI/Alexa Fluor 405), zainstalowany w kole filtrów barierowych</td></tr><tr><td>Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/647/752rpc-UF3</td><td>Wielopasmowy rozdzielacz wiązki dichroicznej do wzbudzeń laserowych 647, 561, 488 i 405 nm wewnątrz korpusu mikroskopu</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów DAPI</td><td>Chroma</td><td>49000</td><td>zainstalowany w korpusie mikroskopu</td></tr><tr><td>Nikon laser/TIRF filtercube</td><td>Chroma</td><td>91032</td><td></td></tr><tr><td>590 filtr długoprzepustowy</td><td>Chroma</td><td>T590LPXR-UF1</td><td>do łączenia lasera 647 nm i lasera 561 nm</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy 525</td><td>Chroma</td><td>T525LPXR-UF1</td><td>do łączenia już połączonych laserów 647 nm i 561 nm z laserem 488 nm</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy 470</td><td>Chroma</td><td>T470LPXR-UF1</td><td>do łączenia już połączonych laserów 647 nm, 561 nm i 488 nm z laserem 405 nm</td></tr><tr><td>Filtr do czyszczenia laserowego (647)</td><td>Chroma</td><td>zet640/20x</td><td>do czyszczenia innych długości fal z lasera 647 nm</td></tr><tr><td>Filtr laserowy czyszczący (488)</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-25</td><td>do czyszczenia innych długości fal z laserowego źródła światła LED 488 nm</td></tr><tr><td></td><td>Excelitas</td><td>X-Cite120LED</td><td>używany tylko do obrazowania DAPI</td></tr><tr><td>Mocowanie lustrzane</td><td>Newport</td><td>SU100-F3K</td><td></td></tr><tr><td>Słupki optyczne</td><td>Newport</td><td>PS-2</td> Widelec mocujący Newport PS-F <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy</td><td>Newport</td><td>PMKIT</td><td>Newport Do pomiaru mocy lasera</td></tr><tr><td>Mocowanie łącznika wiązki dichroicznej</td><td>Edmund Optics</td><td>58-872</td><td>C-Mount Kinematic Mount, do mocowania łączników wiązki dichroicznej w zespole wzbudzenia laserowego</td></tr><tr><td>Pierścień ustalający</td><td>Thorlabs</td><td>CMRR</td><td>używany do mocowań łącznika wiązek dichroicznych</td></tr><tr><td>Płyta adaptera światłowodowego</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td>FC/PC Płyta adaptera światłowodowego z zewnętrznym SM1 (1.035"-40)</td></tr><tr><td>Gwintowany montaż translacyjny osi Z</td>Uchwyt translacyjny <td>osi Z Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>, 30 mm kompatybilny z klatką</td></tr><tr><td>Achromatyczny obiektyw dubletowy</td><td>Thorlabs</td><td>AC050-008-A-ML</td><td>&Oslash; 5 mm, zamontowane dublety achromatyczne, Powłoka AR: 400 - 700 nm</td></tr><tr><td>Płyta klatki</td><td>Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>30 mm Płyta klatkowa z gwintem wewnętrznym M9 x 0,5, pręt montażowy klatki kranu 8-32</td></tr><tr>Pręt<td>montażowy</td> klatki <td>Thorlabs</td><td>ER4</td><td>, długość 4" i Oslash; </td></tr><tr><td>Wspornik montażowy klatki</td> 6 mm <td>Thorlabs</td><td>CP02B</td><td>Wspornik montażowy klatki 30 mm</td></tr><tr><td>Światłowód jednomodowy</td> krosowy <td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td>, PM, FC/PC do FC/APC, 405 nm, Panda,</td></tr><tr><td>2 m światłowód wielomodowy</td><td>Thorlabs</td><td>M42L01</td><td>&Oslash; 50 &mikro; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC światłowodowy, 1 m</td></tr><tr><td>Achromatyczny obiektyw dubletowy (soczewka mag)</td><td>Thorlabs</td><td>ACN127-025-A</td><td>ACN127-025-A - f=-25.0 mm, &Oslash; 1/2" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm , wklęsła soczewka w "soczewce magnetycznej"</td></tr><tr><td>Achromatyczna soczewka dubletowa (soczewka mag)</td><td>Thorlabs</td><td>AC127-050-A</td><td>f=50.0 mm, &Oslash; 1/2" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm, wypukła soczewka w "soczewce magnetycznej"</td></tr><tr><td>Pierścień ustalający</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PRR</td><td>SM05 Plastikowy pierścień ustalający do &Oslash; Tubusy i mocowania obiektywów 1/2", do "soczewek magnetycznych"</td></tr><tr><td>Śruba z nylonową końcówką</td><td>Thorlabs</td><td>SS3MN6</td><td>M3 x 0.5 Śruba dociskowa z nylonową końcówką, 6 mm długa, do mocowania "soczewki 3D"</td></tr><tr><td>Soczewka 3D</td><td>CVI Optyka laserowa</td><td>RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700</td><td>f=10 m, prostokątny obiektyw cylindryczny Kamera</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>100 nm wielokanałowe koraliki</td><td>Thermo</td><td>T7279, mikrosfery</td><td></td>TetraSpeck</tr><tr><td>czerwony barwnik</td><td>Thermo</td><td>Alexa Fluor 647</td><td></td></tr><tr><td>żółto-zielony barwnik</td><td>GE Healthcare</td><td>Cy3</td><td></td></tr><tr><td>zielony barwnik</td><td>GE Healthcare</td><td>Cy3B</td><td></td></tr><tr><td>niebieski barwnik</td><td>Thermo</td><td>Alexa Fluor 488</td><td></td></tr></tbody></table>

prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Mikroskopia fluorescencyjna to potężne narzędzie do wykrywania cząsteczek biologicznych in situ oraz monitorowania ich dynamiki i interakcji w czasie rzeczywistym. Oprócz konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej opracowano różne techniki obrazowania, aby osiągnąć określone cele eksperymentalne. Niektóre z szeroko stosowanych technik obejmują transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET), który może zgłaszać zmiany konformacyjne i interakcje molekularne z rozdzielczością angstremów, oraz obrazowanie superrozdzielcze (SR) oparte na detekcji pojedynczych cząsteczek, które może zwiększyć rozdzielczość przestrzenną około dziesięć do dwudziestu razy w porównaniu z mikroskopią o ograniczonej dyfrakcji. Prezentujemy tutaj zaprojektowany przez klienta zintegrowany system, który łączy wiele metod obrazowania w jednym mikroskopie, w tym konwencjonalne obrazowanie epifluorescencyjne, obrazowanie SR oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorową detekcję pojedynczych cząsteczek, w tym obrazowanie smFRET. Różne metody obrazowania można łatwo i powtarzalnie uzyskać poprzez wymianę elementów optycznych. Taka konfiguracja jest łatwa do przyjęcia przez każde laboratorium badawcze w naukach biologicznych, które wymaga rutynowych i zróżnicowanych eksperymentów obrazowych przy zmniejszonych kosztach i przestrzeni w porównaniu z budową oddzielnych mikroskopów do indywidualnych celów.

Ten mikroskop umożliwia elastyczne i powtarzalne przełączanie się między różnymi metodami obrazowania. Poniżej przedstawiamy przykładowe obrazy uzyskane za pomocą każdego modułu obrazowania.
Rysunek 5D przedstawia PSF cząsteczki w stanie „włączonym” (blinking-on) podczas akwizycji SR. Tysiące takich obrazów są rekonstruowane w celu wygenerowania końcowego obrazu SR (Rysunek 5E</...

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikroskopii optycznej, takie jak sposób wykonywania obrazów o wysokiej rozdzielczości, a także obrazów FRET przy użyciu tego samego mikroskopu. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy połączyć trzy różne moduły obrazowania w jeden mikroskop, co znacznie obniża całkowity koszt. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ montaż ścieżki wzbudzenia jest trudny do nauczenia.Wymagają one odpowiedniego doboru części i czułego wyrównania optycznego. Aby rozpocząć, zainstaluj kartę do akwizycji danych za pośrednictwem interfejsu PCI i użyj jej do podłączenia laserów do komputera. Kontroluj zachowanie włączania i wyłączania laserów za pomocą wyjścia logicznego tranzystor-tranzystor i regulację ich mocy za pomocą wyjścia analogowego tej karty.Następnie przygotuj izolowany od drgań stół optyczny z lustrami i rozdzielaczami wiązki, jak pokazano tutaj i opisano w dołączonym protokole tekstowym. Połącz wiązki laserowe w światłowód jednomodowy, najpierw montując płytkę adaptera światłowodu w uchwycie translacyjnym osi z. Następnie zamontuj achromatyczną soczewkę dubletową w płycie klatkowej.Użyj przedłużacza, aby połączyć adapter i soczewkę, aby utworzyć klatkę. Następnie użyj słupków optycznych o grubości jednego cala, aby zamontować klatkę na stole optycznym. Wyrównaj laser 647-nanometrowy, dostosowując komponenty, aby uzyskać maksymalną moc wyjściową lasera przez światłowód.Po ustawieniu pierwszego lasera tymczasowo zainstaluj parę przysłon i wyrównaj pozostałe lasery jeden po drugim. Sprawdź skuteczność osiowania każdego lasera za pomocą miernika mocy. Pamiętaj, aby pozostawić jedną przysłonę przed płytą adaptera, aby zmniejszyć odbicia laserów.Następnie zaprojektuj i zainstaluj soczewkę powiększającą zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Aby uzyskać efekt astygmatyzmu niezbędny do wyodrębnienia współrzędnych Z każdej pojedynczej cząsteczki, umieść soczewkę 3D o ogniskowej 10 metrów w kasecie i włóż ją do ścieżki wiązki emisyjnej. W celu zminimalizowania drgań podczas sekwencyjnego wielokolorowego obrazowania epifluorescencyjnego należy stosować filtry emisyjne umieszczone w barierowym kole filtrowym podłączonym obok mikroskopu.W celu jednoczesnego wykrywania wielu kolorów podczas eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET, należy umieścić inny zestaw filtrów w rozdzielaczu emisji. Aby skonfigurować obrazowanie z ograniczeniem dyfrakcji za pomocą epi-wzbudzenia, najpierw dostosuj przypadkowy kąt lasera wzbudzenia do trybu epi w ramieniu oświetleniowym. Następnie odłącz soczewkę 3D i włóż kostkę obejściową do rozdzielacza emisji.Następnie włóż soczewkę magazynka, aby uzyskać szersze oświetlenie. Po skonfigurowaniu wykonaj wielokanałowe, z-stack i/lub poklatkowe obrazy próbki w oparciu o pożądane wyniki. Aby skonfigurować wielokolorowe wykrywanie pojedynczych cząsteczek cząsteczek unieruchomionych powierzchniowo, najpierw przesuń koło filtra do pustej pozycji.Umożliwi to przejście laserów. Następnie dostosuj przypadkowy kąt laserów wzbudzenia do kąta murawy i odłącz zarówno soczewki magnetyczne, jak i 3D. Następnie włącz tryb trzykanałowy w rozdzielaczu emisji, najpierw zastępując kostkę obejściową kostką kalibracyjną, która przepuszcza całe światło przez wszystkie kanały.Następnie włącz kamerę w obszarze DIC i dostosuj przysłonę rozdzielacza emisji, aż na ekranie pojawią się trzy, całkowicie rozdzielone kanały. Obróć pokrętła regulacji pionowo-poziomej na rozdzielaczu emisji i z grubsza wyrównaj trzy kanały. Następnie wyłącz kamerę i zastąp kostkę kalibracyjną kostką potrójną.Umieść próbkę wielokanałowych koralików o długości 100 nanometrów. Po wzbudzeniu na 488 nanometrach, wielokanałowe kulki o długości 100 nanometrów emitują światło o różnych długościach fal, umożliwiając wyrównanie trójkanałowe. Następnie włącz aparat i laser 488-nanometrowy, powiększ jeden z jasnych koralików, a na koniec wyrównaj trzy kanały, ponownie obracając pokrętła regulacji.Po umieszczeniu próbki na miejscu, za pomocą słabego lasera, przejdź do obszaru o rozsądnej gęstości plamki i dostosuj moc lasera oraz czas ekspozycji, aby osiągnąć akceptowalne poziomy sygnału do szumu i fotowybielania. Następnie użyj oprogramowania do obrazowania, aby zrobić zdjęcia poklatkowe. Aby uzyskać obrazowanie w super rozdzielczości, zacznij od włożenia obiektywu 3D i wyjmij obiektyw magnetyczny.Następnie określ optymalny kąt przypadkowy lasera wzbudzenia, który ma być kątem murawy. Aby znaleźć odpowiednią wysokość obiektywu do obrazowania SR, użyj obrazowania DIC, aby znaleźć środkową płaszczyznę komórek. Zidentyfikuj płaszczyznę na podstawie wysokości, na której komórki stają się przezroczyste.Po określeniu żądanej płaszczyzny ogniskowej rozpocznij obrazowanie w super rozdzielczości. Podczas obrazowania zmieniaj moc lasera 405 nm, aby utrzymać rozsądną gęstość miejsc. Rozpocznij obrazowanie bez zasilania lasera fioletowego.Policz liczbę punktów w określonym czasie i zwiększ moc fioletowego lasera, tak aby liczba punktów była utrzymywana powyżej zdefiniowanego przez użytkownika progu zliczania w polu widzenia. Analizuj dane, wykrywając centroidy każdego punktu w ramkach obrazowania i wyodrębnij wartości z dla każdego punktu z szerokości X i Y. Zbuduj zrekonstruowany obraz i wizualizuj obiekty w 3D.Ta konfiguracja mikroskopu pozwala na elastyczne i powtarzalne przełączanie między różnymi metodami obrazowania, w tym konwencjonalnym obrazowaniem epifluorescencyjnym, obrazowaniem superrozdzielczym opartym na detekcji pojedynczej cząsteczki i wielokolorowym wykrywaniem pojedynczych cząsteczek. Aby ujawnić drobniejsze szczegóły w zespole molekularnym, mikroskopia superrozdzielcza łączy tysiące obrazów, takich jak ten. Obrazy te są następnie rekonstruowane w celu wygenerowania końcowego obrazu w super rozdzielczości.Techniki superrozdzielczości pozwalają na uzyskanie wysokiej rozdzielczości przestrzennej, zapewniając szczegóły, których nie można zobaczyć za pomocą innych technik. Jest to zaznaczone na dwóch pokazanych tutaj obrazach. Obraz o wysokiej rozdzielczości pokazuje tę samą bakteryjną regulatorową RNazę, co obraz epifluorescencji, ale pozwala na wykrycie pojedynczej cząsteczki.SmFRET to kolejna metoda zdolna do uzyskania rozdzielczości od angstremów do nanometrów. W tym przypadku pofałdowane cząsteczki RNA zostały oznaczone zielonym barwnikiem donorowym i czerwonym barwnikiem akceptorowym. Trajektorie intensywności fluorescencji można wyodrębnić z pojedynczych cząsteczek, generując wydajność FRET w funkcji czasu.Nie zapominaj, że praca z laserami może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych lub zmniejszanie mocy lasera.

conducting-multiple-imaging-modes-with-one-fluorescence-microscope

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.

Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.

Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj metodę integracji wielu technik obrazowania w jednym mikroskopie fluorescencyjnym, obejmującą obrazowanie superrozdzielcze i detekcję pojedynczych cząsteczek. To podejście znacząco obniża koszty badań mikroskopowych.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów