Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja ekspresji i lokalizacji komórkowej markerów fenotypu makrofagów mikrogleju po niedokrwieniu mózgu. Najpierw wycinki kriogeniczne z niedokrwionych mózgów myszy są barwione w celu zidentyfikowania markerów aktywacji makrofagów mikrogleju. Wybarwione skrawki poddawane są trójwymiarowemu obrazowaniu konfokalnemu.

Powstałe obrazy są następnie przetwarzane w celu wygenerowania trójwymiarowych renderingów, a analiza obrazu jest wykonywana w celu zlokalizowania ekspresji markerów w skupiskach komórek. Uzyskane dane pokazują skuteczność trójwymiarowej analizy konfokalnej w prawidłowym przypisywaniu ekspresji markera do określonego ciała komórkowego Gdy dwa markery są wyrażane przez tę samą komórkę, ale w różnych przedziałach subkomórkowych, sama kolokalizacja może nie być zbyt pouczająca. Korzystanie z analizy trójwymiarowej, jak tutaj pokażemy, pozwala na lepszą rozdzielczość i dokładność.

Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w złożoność reakcji mózgu na uszkodzenie niedokrwienne, może być również stosowana w innych ostrych lub przewlekłych stanach, w których zaproponowano podwójną rolę makrofagów mikrogleju w uszkodzeniu i naprawie. Lub w tych przypadkach, w których sygnały muszą być selektywnie zlokalizowane w różnych płaszczyznach specjalnych, Carlo Perigo i Stefan z Magali przeprowadzą Cię przez różne etapy procedury. Poniższy protokół wykorzystuje tkankę mózgową myszy, w której niedokrwienie zostało wywołane przez trwałe zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej.

Użyj kriostatu, aby zebrać seryjnie 20-mikronowe odcinki koronalne mózgu na żelatynie. Zakryte szkiełka doprowadzają wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej przed użyciem. Należy zwrócić uwagę, że robocze rozcieńczenie przeciwciał i surowicy wymienionych w towarzyszącym im dokumencie wynikało z prób przeprowadzonych w celu uzyskania najlepszych wyników przy użyciu różnych przeciwciał i surowicy.

Protokół musi zostać zweryfikowany. Zacznij od okrążania sekcji na szkiełku za pomocą pisaka blokującego płyn, aby zminimalizować ilość potrzebnych odczynników. Następnie umieść skrawki mózgu w mokrej komorze za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.

Dodaj PBS o temperaturze pokojowej do sekcji i inkubuj przez pięć minut, aby je umyć. Następnie za pomocą jednomililitrowej jednorazowej strzykawki z igłą usuń roztwór i powtórz mycie jeszcze raz Po wyjęciu drugiego prania przystąp do barwienia próbek za pomocą jednomililitrowej pipety i jednorazowej strzykawki do wszystkich wymian roztworu. Procedurę barwienia należy wykonać zgodnie z podsumowaniem. Tu.

Zapoznaj się z dołączonym tekstem, aby uzyskać szczegółowe informacje, w tym instrukcje prania. Najpierw komórki inkubuje się z 1% nadtlenkiem wodoru po zablokowaniu normalną kozią surowicą. Są inkubowane z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko CD 11 B. Następnie szkiełka są inkubowane z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym, a następnie triss, buforem pośrednim NACL lub TNT, a następnie triss, H-C-L-N-A-C-L, buforem blokującym lub TNB po inkubacji z TNB.

Szkiełka inkubuje się ze streptawidyną HRP, a następnie rozcieńczalnikiem do amplifikacji zawierającym cyjanek pięć tyromów, który wzmacnia sygnał immunofluorescencyjny. Następnie szkiełka są inkubowane z NGS w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania. Następnie są inkubowane z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko CD 68.

Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, komórki są następnie inkubowane w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorem, a następnie jeden mikrogram na mililitr haczyków w celu znakowania DNA. Po zakończeniu barwienia zamontuj sekcje kriogeniczne za pomocą przedłużonego złota podczas montażu sekcji, unikając generowania pęcherzyków powietrza. Przechowuj sekcje w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, dopóki nie zostaną przeanalizowane.

Akwizycja sygnału fluorescencyjnego powinna być wykonana w ciągu jednego tygodnia. Protokół ten wykorzystuje mikroskop IX 81 wyposażony w konfokalny moduł skanujący FV 500 z trzema liniami laserowymi: argon, krypton o długości 488 nanometrów, hel neonowy o długości 646 nanometrów i hel neonowy o długości fali 532 nanometry oraz dioda UV w oprogramowaniu grypy U 500. Dobierz odpowiednie lasery wzbudzające i zwierciadła dichroiczne.

Ustaw także rozdzielczość obrazu na co najmniej 800 na 600 pikseli. Następnie umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i za pomocą epi fluorescencji zidentyfikuj obszar zainteresowania, stopniowo zwiększaj powiększenie do obiektywu 40x. Następnie przełącz się na tryb laserowej mikroskopii skaningowej i uruchamiaj powtarzalne skany, dostosowując poziom mocy fotopowielacza i wzmocnienie dla każdego kanału.

Zmniejszy to nakładanie się sygnałów spowodowane współczesnym wzbudzeniem na różnych długościach fal. Utrzymuj wzmocnienie na jak najniższym poziomie, aby uniknąć niepożądanych sygnałów niespecyficznych. Kontynuując powtarzalne skanowanie, dostosuj ostrość i zdefiniuj dolne i górne krańce osi Z o całkowitej długości osi Z wynoszącej 10 mikronów.

Następnie przerwij powtarzanie skanowania. Następnie wprowadź rozmiar kroku. Powinien być jak najbardziej zbliżony do rozmiaru piksela, który wynosi 0,225 mikrona.

Da to standardowy stosunek wielkości jeden do jednego na osi Z w oprogramowaniu Aktywuj filtr Kalmana co najmniej dwa razy. Algorytm Kalmana to funkcja iteracyjna, która eliminuje losowy sygnał, taki jak pojedyncze dodatnie woksele należące do szumu tła, poprawiając w ten sposób stosunek sygnału do szumu. Teraz aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć efektów przebijania.

Przejdź do punktu środkowego osi Z i uruchom skanowanie sekwencyjne XY. Sprawdź konfigurację PMT i wzmocnienia, aby zapewnić zadowalający stosunek sygnału do szumu. Uruchom akwizycję XY, Z po przejęciu.

Wyeksportuj dane jako plik z wieloma plikami TIF. Każdy plik multi TIF zawiera zazwyczaj trzy kanały kolorów i 44 płaszczyzny ogniskowe do przetwarzania. Zacznij od otwarcia oprogramowania imas.

Najpierw wybierz widok przewyższający, a następnie przekaż plik z wieloma plikami TIF. Następnie na panelu regulacji wyświetlacza wybierz żądany kolor dla każdego kanału tutaj. Czerwony reprezentuje CD 11 B. Zielony reprezentuje CD 68, a niebieski reprezentuje barwnik DNA haczyków w celu usunięcia szumu z tła, zwiększ minimalną wartość na panelu regulacji wyświetlacza dla każdego kanału.

Następnie przejdź do widoku przekroju, aby zwizualizować pojedynczą płaszczyznę ogniskową XY z ortogonalnymi rzutami osi x, Z i YZ. Poruszaj się wzdłuż osi Z, szukając kolokalizacji, która jest wyświetlana jako żółte piksele. Kliknij żółty obszar, aby sprawdzić, czy kolokalizacja występuje wzdłuż osi Z, co oznacza, że należy ona do osi Z obiektu bryłowego.

Projekcje widoczne są w prawej i dolnej części rysunku. Zrób migawkę, a następnie wróć do widoku przewyższającego. Następnie z menu rozwijanego edycji wybierz opcję Przytnij 3D i obrysuj obszar zainteresowania, aby wyizolować komórkę lub klaster komórek.

Następnie na panelu regulacji wyświetlacza wybierz jeden kanał. Wybierz konstruktora algorytmu przewyższania powierzchni. Następnie, aby skonfigurować algorytm, najpierw wybierz kanał.

Następnie zdefiniuj próg jako tę samą wartość minimalną, która została ustawiona w panelu dopasowania wyświetlania i w razie potrzeby zdefiniuj zmianę rozmiaru. Następnie zdefiniuj wygładzanie jako 0,200. Wybierz panel kolorów i w razie potrzeby zmień jego wygląd.

Powtórz konfigurację dla konstruktora algorytmu przewyższania powierzchni dla każdego kanału. Następnie na panelu regulacji wyświetlacza usuń zaznaczenie opcji Kanały fluorescencji i zaznacz wszystkie trzy powierzchnie. Na koniec przesuń wolumin, aby znaleźć najlepszy widok i zrób migawkę, aby określić wzór koekspresji markerów MM.

Opisane w tym filmie protokoły immunofluorescencji i akwizycji konfokalnej przeprowadzono w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia wywołanego trwałą niedrożnością tętnicy środkowej mózgu. Dwuwymiarowy widok uzyskanych obrazów pokazuje, że po 24 godzinach od niedokrwienia markery lizosomalne CD 68, które są pokazane na zielono, ulegają ekspresji w hipertroficznym wśród komórek dodatnich CD 11 B, które są widoczne na czerwono obecne w niedokrwiennym rdzeniu. Rzut osi Z pokazany w prawym dolnym rogu pokazuje, że rozkład znaczników udokumentowany w widoku jednopłaszczyznowym występuje również wzdłuż osi Z w strefie granicznej.

Komórki CD 11 B dodatnie wykazują przerostowe ciała komórkowe z procesami wysoce dodatnimi dla CD 68, co sugeruje, że fagosomy są związane z błoną komórkową. Wskazuje to na aktywne kwaśne zachowanie komórek mikrogleju PHA w celu oceny koekspresji CD 68 i YM one, markera M dwa spolaryzowanego. Obrazy fluorescencyjne zostały poddane trójwymiarowemu renderingowi.

Trójwymiarowy widok uzyskanych obrazów pokazanych tutaj wskazuje na obecność komórek CD 68 dodatnich pokazanych na zielono i komórek dodatnich YM one pokazanych na czerwonych wokselach fluorescencyjnych. Układając się równolegle, widok obserwatora może dać sygnał kolokalizowany widziany jako żółty, który może nie być związany z rzeczywistą odległością między znacznikami. Definiowanie kolokalizacji.

Powinien zostać wygenerowany pojedynczy widok płaszczyzny z rzutami osi Z poruszającymi się wzdłuż osi Z. Szukam kolokalizacji. Projekcja osi Z jest uzyskiwana tak, jak pokazano w prawej i dolnej części tego obrazu.

Woksele fluorescencyjne mogą być przekształcane w obiekty stałe przez trójwymiarowe renderowanie z przypisaniem ekspresji znacznika do określonego ciała komórkowego. Po dużym powiększeniu i renderowaniu 3D dwa markery wydają się należeć do różnych komórek, które znajdują się w bliskiej odległości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test immunofluorescencyjny z wieloma markerami i barwnikami oraz jak prawidłowo pozyskiwać i wizualizować trójwymiarowe obrazy za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ponadto opisana analiza post-processingu, która może być owocnie wykorzystana do analizy dowolnej koekspresji lub kolokalizacji na poziomie komórkowym lub w tych przypadkach, w których sygnały muszą być selektywnie zlokalizowane na różnych płaszczyznach przestrzennych.