Name: Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Poznaj trójwymiarową analizę konfokalną markerów polaryzacji mikrogleju i makrofagów w modelu niedokrwiennego uszkodzenia mózgu myszy. Ta metoda umożliwia precyzyjną lokalizację ekspresji markerów w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Stefano Fumagalli jest członkiem Fundacji Monzino.

1. Immunofluorescencja
Następujący protokół jest wykonywany na koronalnych kriosekcjach mózgu uzyskanych od myszy z transcardially perfunded (20 ml PBS, 0,1 mol/litr, pH 7,4, a następnie 50 ml schłodzonego paraformaldehydu 4% w PBS). Po perfuzji mózgi są ostrożnie usuwane i przenoszone do 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C przez noc w celu krioprotekcji. Mózgi są następnie szybko zamrażane przez zanurzenie w izopentanie w temperaturze -45 °C przez 3 minuty, a następnie zamykane w fiolkach i przechowywane w temperaturze -70 °C do momentu użycia. Kriosekcje koronalne mózgu (20 μm) są cięte seryjnie i poddawane protokołowi immunofluorescencji 11, 6.
Przed użyciem doprowadź wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej. Należy pamiętać, że przedstawione robocze rozcieńczenia przeciwciał i surowicy wynikały z prób przeprowadzonych w celu uzyskania najlepszych wyników. W przypadku stosowania różnych przeciwciał i surowicy protokół musi zostać zwalidowany.
Zauważ, że ponieważ zarówno przeciwciała pierwotne anty-CD11b, jak i anty-CD68 są wytwarzane u szczurów, aby uniknąć sygnału krzyżowego przez antyszczurzą Alexę 546, użyliśmy wysokiego rozcieńczenia anty-CD11b, a następnie wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego za pomocą zestawu TSA (tyramid Cy5). Ustaliliśmy optymalne rozcieńczenie robocze dla anty-CD11b, wykonując opisany protokół z wyjątkiem kroku 1.17 i używając co najmniej 7 różnych rozcieńczeń anty-CD11b, jak podano w tabeli 1. W rezultacie wybrano rozcieńczenie 1:30 000 jako jedyne rozcieńczenie, w którym osiągnięto: 1) sygnał widzialny z Cy5 o długości fali wzbudzenia 646 nm; 2) brak sygnału z Alexa 546 przy długości fali wzbudzenia 532 nm. W ten sposób sygnał fluorescencyjny Alexa 546 jest selektywnie kojarzony z ekspresją CD68.
Optymalna zawartość rozcieńczeń dla przeciwciał anty-CD11b i anty-CD68 może się różnić w zależności od rodzaju tkanki i musi być określona przed rozpoczęciem protokołu wspólnego znakowania.
<ol>
	<li>Dwukrotnie przemyć kriosekcje mózgu PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 5 minut w PBS zawierającym 1%H2O2(etap wymagany, ponieważ amplifikacja fluorescencyjna wymaga inkubacji z peroksydazą chrzanową, streptawidyną-HRP, patrz krok 1.12).</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 2x PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,3% Triton.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD11b Ab Rat [1:30 000], 10% NGS i 0,3% Triton.</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 2x (5 min) PBS.</li>
	<li>Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym biotynylowany wtórny anty-Rat Ab [1:200] i 1% NGS.</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 2x PBS.</li>
	<li>Przemyć kriosekcje TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 1,5 godziny w TNB (bufor blokujący Tris-HCl-NaCl: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% odczynnik blokujący z odpowiedniego zestawu (patrz tabela odczynników)).</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 3 razy trotylem.</li>
	<li>Inkubuj kriosekcje w TNB zawierające streptawidynę-HRP [1:100].</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 3x trotylem.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 8 minut w rozcieńczalniku amplifikacyjnym zawierającym cyjaninę 5 Tyramid [1:300].</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,1% Triton.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD68 Ab Rat [1:200], 3% NGS i 0,3% Triton.</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym fluorsprzężony wtórny anty-Rat Ab Alexa 546 [1:500] i 1% NGS.</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 10 minut w PBS zawierającym Hoechst 1 μg/ml.</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Zamontuj kriosekcje w Prolong Gold.</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazów trójwymiarowych za pomocą mikroskopii konfokalnej
Użyty tutaj mikroskop to mikroskop IX81 wyposażony w konfokalny moduł skanujący FV500 z 3 liniami laserowymi: Ar-Kr (488nm), He-Ne czerwony (646nm) i He-Ne zielony (532nm) oraz diodą UV.
<ol>
	<li>Wybierz lasery wzbudzające w zależności od długości fal barwników fluorescencyjnych, które mają być wzbudzone (czerwony He-Ne dla Cy5, CD11b; He-Ne zielony dla Alexa546, CD68 i dioda UV dla Hoechst, jądra).</li>
	<li>Wybierz najlepszą kombinację zwierciadła dichroicznego do zbierania sygnałów świetlnych.</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość obrazu na co najmniej 800 x 600 pikseli.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar zainteresowania za pomocą epi-fluorescencji i stopniowo zwiększaj powiększenie do obiektywu 40X.</li>
	<li>Przełącz się na tryb laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).</li>
	<li>Uruchamiaj powtarzalne skanowanie, aby dostosować fotopowielacz (PMT) i wzmocnienie dla każdego kanału. Lasery mogą być włączane indywidualnie, aby ułatwić konfigurację. Utrzymuj wzmocnienie tak niskie, jak to możliwe, aby uniknąć niepożądanych sygnałów niespecyficznych.</li>
	<li>W przypadku wykonywania skanowania powtarzalnego przesuń element sterujący ostrością, aby zdefiniować dolne i górne krańce osi z (całkowita długość osi z = 10 μm).</li>
	<li>Zatrzymaj powtarzające się skanowanie.</li>
	<li>Określ rozmiar kroku. Powinien być jak najbardziej zbliżony do rozmiaru piksela (0,225 μm), aby uzyskać standardowy stosunek rozmiaru 1:1 na osi z.</li>
	<li>Aktywuj filtr Kalmana co najmniej 2 razy.</li>
	<li>Aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć efektów przebijania.</li>
	Przesuń się w <li>połowie osi z i uruchom skanowanie sekwencyjne xy. Sprawdź konfigurację PMT i wzmocnienie (dobry stosunek sygnału do szumu). Jeśli wynik nie jest zadowalający, powtórz krok 2.6.</li>
	<li>Uruchom pobieranie xyz.</li>
	<li>Eksportuj dane jako plik multitiff. Każdy plik multitiff zawiera zazwyczaj 3 kanały kolorów (niebieski, zielony i czerwony) oraz 44 płaszczyzny ogniskowych.</li>
</ol>
3. Trójwymiarowy widok akwizycji konfokalnych i trójwymiarowego renderingu
Prześlij pliki multitiff do oprogramowania Imaris i przetwarzaj je w następujący sposób:
<ol>
	<li>Otwarte oprogramowanie.</li>
	<li>Wybierz widok przewyższający.</li>
	<li>Przekaż plik multitiff.</li>
	<li>Wybierz żądany kolor dla każdego kanału.</li>
	<li>Usuń szum z tła, zwiększając minimalną wartość na panelu regulacji wyświetlacza. Dostosuj każdy kanał indywidualnie.</li>
	<li>Przejdź do widoku przekroju. Poruszaj się wzdłuż osi z, szukając kolokalizacji (żółte piksele).</li>
	<li>Kliknij na żółty obszar, aby sprawdzić, czy kolokalizacja występuje wzdłuż osi z (tj. należy do obiektu bryłowego). Rzuty osi Z są widoczne w prawej i dolnej części rysunku.</li>
	<li>Zrób migawkę.</li>
	<li>Wróć, aby przewyższyć widok.</li>
	<li>Kadrowanie 3D w celu odizolowania komórki lub grupy komórek.</li>
	<li>Wybierz jeden kanał na panelu regulacji wyświetlacza.</li>
	<li>Wybierz konstruktora algorytmu przewyższania/powierzchni. Kroki algorytmu:
	<ol>
		<li>Wybierz kanał.</li>
		<li>Zdefiniuj próg (użyj tej samej wartości minimalnej w panelu regulacji wyświetlania).</li>
		<li>Zdefiniuj zmianę rozmiaru.</li>
		<li>Zdefiniuj wygładzanie (najlepiej = 0,200).</li>
		<li>Określ wygląd koloru.</li>
		<li>Algorytm końcowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 3.12 dla każdego kanału.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie opcji Kanały fluorescencji na panelu regulacji wyświetlacza i zaznacz wszystkie trzy powierzchnie.</li>
	<li>Przesuń głośność, aby znaleźć najlepszy widok.</li>
	<li>Zrób migawkę.</li>
</ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li>
<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
<li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li>
<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj protokoły oparte na immunofluorescencji, a następnie trójwymiarową analizę konfokalną jako potężne podejście do badania lokalizacji i koekspresji markerów fenotypu M / M w obszarze niedokrwiennym (bardziej szczegółowa analiza znajduje się w odnośniku 6). Metoda ta łączy specyficzne barwienie odpowiedniego markera aktywacji M/M z trójwymiarowym obrazowaniem konfokalnym. Precyzyjne dostrojenie przeciwciał, surowicy i rozcieńczeń roboczych sprzężonych z fluorem pozwala na optymalny stosunek sy...

Po ostrym uszkodzeniu mózgu, mikroglej jest szybko aktywowany i ulega dramatycznym zmianom morfologicznym i fenotypowym1-3. Ta wewnętrzna odpowiedź jest związana z rekrutacją makrofagów krwionośnych, które migrują do uszkodzonego miąższu mózgu4,5. Rola mikrogleju i makrofagów, które są antygenowo nierozróżnialne (odtąd określane jako M/M) w uszkodzeniu mózgu jest nadal dyskutowana. Coraz więcej badań wskazuje, że podobnie jak w przypadku makrofagów obwodowych, mikroglej i makrofagi rekrutowane do mózgu mogą przyjmować różne fenotypy, których skrajności odpowiadają klasycznemu prozapalnemu fenotypowi toksycznemu (M1) lub przeciwzapalnemu ochronnemu (M2). Różne stany aktywacji, w tym wydzielanie czynników pro- lub przeciwzapalnych, uwalnianie cząsteczek neurotroficznych i aktywność lizosomalna, charakteryzują się specyficznym wzorcem markerów fenotypowych, których ekspresja zależy od czasowej ewolucji otaczającego środowiska. Charakterystyka tych fenotypów M/M w uszkodzonym mózgu jest nadal skąpa. Użyliśmy dobrze ugruntowanego mysiego modelu pMCAo do analizy ekspresji i ewolucji M / M po udarze. Przedstawione tutaj protokoły oparte na immunofluorescencji mają na celu uzyskanie wglądu w wygląd specyficznych markerów fenotypu M/M, ich lokalizację i koekspresję komórkową w obszarze niedokrwiennym. Zbadaliśmy kilka cząsteczek związanych z różnymi stanami aktywacji lub fenotypami, a mianowicie CD11b, marker powierzchniowy wyrażany przez leukocyty i szeroko stosowany marker aktywacji / rekrutacji M / M6-8, CD68 marker lizosomów6,7 i Ym1, białko wydzielnicze wyrażane przez alternatywnie aktywowane (M2) makrofagi i związane z odzyskiwaniem i przywracaniem funkcji9-10.	
	Gdy dwa markery są wyrażane przez tę samą komórkę, ale w różnych subkomórkowych kompartmentach, sama kolokalizacja może nie być zbyt pouczająca. W takim przypadku analizę koekspresji można przeprowadzić przy użyciu widoku pojedynczej płaszczyzny i renderingów trójwymiarowych. Opisujemy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie dokładnej trójwymiarowej analizy koekspresji markerów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD11b</td><td>Uprzejmie dostarczone przez Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Mediolan, Włochy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-mouse </td><td>Ym1 Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; CHST 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Mysie jądra antynerwowe (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane kozie przeciwciało anty-szczurze</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyjanina 5 System </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anty-szczur alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anty mysz Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królik Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr>Normalne wektory<td>surowicy koziej</td><td>Laboratoria</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Mikroskop</td> konfokalny Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 </td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS</td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pakiety oprogramowania GraphPad Prism wersja 4.0</td><td>Oprogramowanie GraphPad Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Po udarze mózgu mikroglej/makrofagi (M/M) przechodzą szybką aktywację z dramatycznymi zmianami morfologicznymi i fenotypowymi, które obejmują ekspresję nowych antygenów powierzchniowych i produkcję mediatorów, które budują i utrzymują odpowiedź zapalną. Pojawiające się dowody wskazują, że M/M są wysoce plastycznymi komórkami, które mogą przyjąć klasyczną aktywację prozapalną (M1) lub alternatywną przeciwzapalną (M2) po ostrym uszkodzeniu mózgu. Nadal jednak brakuje pełnej charakterystyki ekspresji markerów fenotypu M/M, ich kolokalizacji i ewolucji czasowej w uszkodzonym mózgu.	
	Protokoły immunofluorescencji specyficznie barwiące odpowiednie markery aktywacji M/M mogą być wykonywane w niedokrwiennym mózgu. Tutaj przedstawiamy protokoły oparte na immunofluorescencji, a następnie trójwymiarową analizę konfokalną jako potężne podejście do badania wzorca lokalizacji i koekspresji markerów fenotypu M / M, takich jak CD11b, CD68, Ym1, w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia wywołanego przez trwałą niedrożność tętnicy środkowej mózgu (pMCAO). Dwuwymiarowa analiza zabarwionego obszaru ujawnia, że każdy marker jest powiązany z określoną morfologią M/M i ma określoną lokalizację w zmianie niedokrwiennej. Wzorce koekspresji markera fenotypu M/M można ocenić za pomocą trójwymiarowego obrazowania konfokalnego w obszarze niedokrwiennym. Obrazy mogą być rejestrowane w określonej objętości (oś Z 10 μm i krok co 0,23 μm, co odpowiada objętości 180 x 135 x 10 μm) w trybie skanowania sekwencyjnego w celu zminimalizowania efektów przebijania i uniknięcia nakładania się długości fal. Obrazy są następnie przetwarzane w celu uzyskania trójwymiarowych renderingów za pomocą oprogramowania Imaris. Solidny widok trójwymiarowych renderingów pozwala na zdefiniowanie wyrażenia znacznika w klastrach komórek. Wykazaliśmy, że M/M mają zdolność różnicowania się w kierunku wielu fenotypów, w zależności od lokalizacji w miejscu zmiany i czasu po urazie.

Przykład wyników uzyskanych po przeprowadzeniu protokołów znakowania i obrazowania konfokalnego w obszarze niedokrwiennym przedstawiono na rysunku 1A oraz 1B. Dwuwymiarowy widok pozyskanych obrazów pokazuje, że dwadzieścia cztery godziny po niedokrwieniu (A) marker lizosomalny CD68 (zielony) jest ekspresjonowany w hipertroficznych ameboidalnych komórkach CD11b (czerwone) obecnych w jądrze obszaru niedokrwiennego. W strefie granicznej (B) komórki CD11b-do...

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja ekspresji i lokalizacji komórkowej markerów fenotypu makrofagicznego mikrogleju po niedokrwieniu mózgu. W pierwszej kolejności preparaty z mrożonych przekrojów mózgów myszy z niedokrwieniem są barwione w celu identyfikacji markerów aktywacji makrofagicznej mikrogleju. Zabarwione przekroje poddawane są trójwymiarowemu obrazowaniu konfokalnemu.Otrzymane obrazy są następnie przetwarzane w celu wygenerowania renderingów trójwymiarowych, a analiza obrazu służy do lokalizacji ekspresji markerów w skupiskach komórek. Wynikowe dane wykazują skuteczność trójwymiarowej analizy konfokalnej w prawidłowym przypisywaniu ekspresji markerów do konkretnego ciała komórkowego. Gdy dwa markery są wyrażane przez tę samą komórkę, ale w różnych przedziałach subkomórkowych, sama kolokalizacja może nie być zbyt informacyjna. Zastosowanie analizy trójwymiarowej, co zostanie tutaj zademonstrowane, pozwala na uzyskanie lepszej rozdzielczości i dokładności.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat złożoności reakcji mózgu na uszkodzenie niedokrwienne, można ją również zastosować w innych stanach ostrych lub przewlekłych, w których postuluje się dwois

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym urazie mózgu

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Krwotok śródmiąższowy i zapalenie nerwów, któremu towarzyszy stłuczenie mózgu, mogą spowodować poważne wtórne uszkodzenie mózgu. Protokół ten szczegółowo opisuje model kontrolowanego wpływu kory mózgowej (CCI) na myszy, umożliwiając naukowcom badanie kontuzji krwotoku i pourazowych odpowiedzi immunologicznych oraz badanie potencjalnych terapii.

Przedkliniczny, kontrolowany model oddziaływania kory mózgowej w przypadku krwotoku pourazowego, stłuczenia i zapalenia nerwów

Udar mózgu jest globalnym problemem, z minimalnymi możliwościami leczenia i brakiem obecnie klinicznej terapii regenerującej utraconą tkankę mózgową. W tym miejscu opisujemy metody tworzenia precyzyjnego udaru fotozakrzepowego w korze ruchowej gryzoni, a następnie wstrzykiwania biomateriałów hydrożelowych w celu zbadania ich wpływu na regenerację tkanek po udarze.

Wstrzyknięcie hydrożelowych rusztowań biomateriałowych do mózgu po udarze mózgu

Ten protokół przedstawia metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi na łagodne urazowe uszkodzenie mózgu oraz integracji tych danych jako części wielowymiarowej analizy systemów przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów.

Analiza systemowa odpowiedzi neurozapalnej i hemodynamicznej na urazowe uszkodzenie mózgu

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Identyfikacja mikrogleju (MG) i obwodowych naciekających makrofagów (Mø) w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest trudna. W tym protokole zastosowano cytometrię przepływową (FCM) do identyfikacji odpowiednio MG podobnego do M1, MG podobnego do M2, M1-podobnego Mø i M2-podobnego Mø. Technologia ta może być również stosowana w innych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, aby zrozumieć rolę MG i Mø.

Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Poznaj trójwymiarową analizę konfokalną markerów polaryzacji mikrogleju i makrofagów w modelu niedokrwiennego uszkodzenia mózgu myszy. Ta metoda umożliwia precyzyjną lokalizację ekspresji markerów w komórkach.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Przeglądaj więcej filmów