Name: Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Poznaj trójwymiarową analizę konfokalną markerów polaryzacji mikrogleju i makrofagów w modelu niedokrwiennego uszkodzenia mózgu myszy. Ta metoda umożliwia precyzyjną lokalizację ekspresji markerów w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stefano Fumagalli jest członkiem Fundacji Monzino.

1. Immunofluorescencja
Następujący protokół jest wykonywany na koronalnych kriosekcjach mózgu uzyskanych od myszy z transcardially perfunded (20 ml PBS, 0,1 mol/litr, pH 7,4, a następnie 50 ml schłodzonego paraformaldehydu 4% w PBS). Po perfuzji mózgi są ostrożnie usuwane i przenoszone do 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C przez noc w celu krioprotekcji. Mózgi są następnie szybko zamrażane przez zanurzenie w izopentanie w temperaturze -45 °C przez 3 minuty, a następnie zamykane w fiolkach i przechowywane w temperaturze -70 °C do momentu użycia. Kriosekcje koronalne mózgu (20 μm) są cięte seryjnie i poddawane protokołowi immunofluorescencji 11, 6.
Przed użyciem doprowadź wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej. Należy pamiętać, że przedstawione robocze rozcieńczenia przeciwciał i surowicy wynikały z prób przeprowadzonych w celu uzyskania najlepszych wyników. W przypadku stosowania różnych przeciwciał i surowicy protokół musi zostać zwalidowany.
Zauważ, że ponieważ zarówno przeciwciała pierwotne anty-CD11b, jak i anty-CD68 są wytwarzane u szczurów, aby uniknąć sygnału krzyżowego przez antyszczurzą Alexę 546, użyliśmy wysokiego rozcieńczenia anty-CD11b, a następnie wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego za pomocą zestawu TSA (tyramid Cy5). Ustaliliśmy optymalne rozcieńczenie robocze dla anty-CD11b, wykonując opisany protokół z wyjątkiem kroku 1.17 i używając co najmniej 7 różnych rozcieńczeń anty-CD11b, jak podano w tabeli 1. W rezultacie wybrano rozcieńczenie 1:30 000 jako jedyne rozcieńczenie, w którym osiągnięto: 1) sygnał widzialny z Cy5 o długości fali wzbudzenia 646 nm; 2) brak sygnału z Alexa 546 przy długości fali wzbudzenia 532 nm. W ten sposób sygnał fluorescencyjny Alexa 546 jest selektywnie kojarzony z ekspresją CD68.
Optymalna zawartość rozcieńczeń dla przeciwciał anty-CD11b i anty-CD68 może się różnić w zależności od rodzaju tkanki i musi być określona przed rozpoczęciem protokołu wspólnego znakowania.
<ol>
	<li>Dwukrotnie przemyć kriosekcje mózgu PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 5 minut w PBS zawierającym 1%H2O2(etap wymagany, ponieważ amplifikacja fluorescencyjna wymaga inkubacji z peroksydazą chrzanową, streptawidyną-HRP, patrz krok 1.12).</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 2x PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,3% Triton.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD11b Ab Rat [1:30 000], 10% NGS i 0,3% Triton.</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 2x (5 min) PBS.</li>
	<li>Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym biotynylowany wtórny anty-Rat Ab [1:200] i 1% NGS.</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 2x PBS.</li>
	<li>Przemyć kriosekcje TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 1,5 godziny w TNB (bufor blokujący Tris-HCl-NaCl: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% odczynnik blokujący z odpowiedniego zestawu (patrz tabela odczynników)).</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 3 razy trotylem.</li>
	<li>Inkubuj kriosekcje w TNB zawierające streptawidynę-HRP [1:100].</li>
	<li>Przemyć kriosekcje 3x trotylem.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 8 minut w rozcieńczalniku amplifikacyjnym zawierającym cyjaninę 5 Tyramid [1:300].</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,1% Triton.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD68 Ab Rat [1:200], 3% NGS i 0,3% Triton.</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym fluorsprzężony wtórny anty-Rat Ab Alexa 546 [1:500] i 1% NGS.</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Inkubować kriosekcje przez 10 minut w PBS zawierającym Hoechst 1 μg/ml.</li>
	<li>Przemyj kriosekcje 3x PBS.</li>
	<li>Zamontuj kriosekcje w Prolong Gold.</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazów trójwymiarowych za pomocą mikroskopii konfokalnej
Użyty tutaj mikroskop to mikroskop IX81 wyposażony w konfokalny moduł skanujący FV500 z 3 liniami laserowymi: Ar-Kr (488nm), He-Ne czerwony (646nm) i He-Ne zielony (532nm) oraz diodą UV.
<ol>
	<li>Wybierz lasery wzbudzające w zależności od długości fal barwników fluorescencyjnych, które mają być wzbudzone (czerwony He-Ne dla Cy5, CD11b; He-Ne zielony dla Alexa546, CD68 i dioda UV dla Hoechst, jądra).</li>
	<li>Wybierz najlepszą kombinację zwierciadła dichroicznego do zbierania sygnałów świetlnych.</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość obrazu na co najmniej 800 x 600 pikseli.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar zainteresowania za pomocą epi-fluorescencji i stopniowo zwiększaj powiększenie do obiektywu 40X.</li>
	<li>Przełącz się na tryb laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).</li>
	<li>Uruchamiaj powtarzalne skanowanie, aby dostosować fotopowielacz (PMT) i wzmocnienie dla każdego kanału. Lasery mogą być włączane indywidualnie, aby ułatwić konfigurację. Utrzymuj wzmocnienie tak niskie, jak to możliwe, aby uniknąć niepożądanych sygnałów niespecyficznych.</li>
	<li>W przypadku wykonywania skanowania powtarzalnego przesuń element sterujący ostrością, aby zdefiniować dolne i górne krańce osi z (całkowita długość osi z = 10 μm).</li>
	<li>Zatrzymaj powtarzające się skanowanie.</li>
	<li>Określ rozmiar kroku. Powinien być jak najbardziej zbliżony do rozmiaru piksela (0,225 μm), aby uzyskać standardowy stosunek rozmiaru 1:1 na osi z.</li>
	<li>Aktywuj filtr Kalmana co najmniej 2 razy.</li>
	<li>Aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć efektów przebijania.</li>
	Przesuń się w <li>połowie osi z i uruchom skanowanie sekwencyjne xy. Sprawdź konfigurację PMT i wzmocnienie (dobry stosunek sygnału do szumu). Jeśli wynik nie jest zadowalający, powtórz krok 2.6.</li>
	<li>Uruchom pobieranie xyz.</li>
	<li>Eksportuj dane jako plik multitiff. Każdy plik multitiff zawiera zazwyczaj 3 kanały kolorów (niebieski, zielony i czerwony) oraz 44 płaszczyzny ogniskowych.</li>
</ol>
3. Trójwymiarowy widok akwizycji konfokalnych i trójwymiarowego renderingu
Prześlij pliki multitiff do oprogramowania Imaris i przetwarzaj je w następujący sposób:
<ol>
	<li>Otwarte oprogramowanie.</li>
	<li>Wybierz widok przewyższający.</li>
	<li>Przekaż plik multitiff.</li>
	<li>Wybierz żądany kolor dla każdego kanału.</li>
	<li>Usuń szum z tła, zwiększając minimalną wartość na panelu regulacji wyświetlacza. Dostosuj każdy kanał indywidualnie.</li>
	<li>Przejdź do widoku przekroju. Poruszaj się wzdłuż osi z, szukając kolokalizacji (żółte piksele).</li>
	<li>Kliknij na żółty obszar, aby sprawdzić, czy kolokalizacja występuje wzdłuż osi z (tj. należy do obiektu bryłowego). Rzuty osi Z są widoczne w prawej i dolnej części rysunku.</li>
	<li>Zrób migawkę.</li>
	<li>Wróć, aby przewyższyć widok.</li>
	<li>Kadrowanie 3D w celu odizolowania komórki lub grupy komórek.</li>
	<li>Wybierz jeden kanał na panelu regulacji wyświetlacza.</li>
	<li>Wybierz konstruktora algorytmu przewyższania/powierzchni. Kroki algorytmu:
	<ol>
		<li>Wybierz kanał.</li>
		<li>Zdefiniuj próg (użyj tej samej wartości minimalnej w panelu regulacji wyświetlania).</li>
		<li>Zdefiniuj zmianę rozmiaru.</li>
		<li>Zdefiniuj wygładzanie (najlepiej = 0,200).</li>
		<li>Określ wygląd koloru.</li>
		<li>Algorytm końcowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 3.12 dla każdego kanału.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie opcji Kanały fluorescencji na panelu regulacji wyświetlacza i zaznacz wszystkie trzy powierzchnie.</li>
	<li>Przesuń głośność, aby znaleźć najlepszy widok.</li>
	<li>Zrób migawkę.</li>
</ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li>
<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
<li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li>
<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj protokoły oparte na immunofluorescencji, a następnie trójwymiarową analizę konfokalną jako potężne podejście do badania lokalizacji i koekspresji markerów fenotypu M / M w obszarze niedokrwiennym (bardziej szczegółowa analiza znajduje się w odnośniku 6). Metoda ta łączy specyficzne barwienie odpowiedniego markera aktywacji M/M z trójwymiarowym obrazowaniem konfokalnym. Precyzyjne dostrojenie przeciwciał, surowicy i rozcieńczeń roboczych sprzężonych z fluorem pozwala na optymalny stosunek sy...

Po ostrym uszkodzeniu mózgu, mikroglej jest szybko aktywowany i ulega dramatycznym zmianom morfologicznym i fenotypowym1-3. Ta wewnętrzna odpowiedź jest związana z rekrutacją makrofagów krwionośnych, które migrują do uszkodzonego miąższu mózgu4,5. Rola mikrogleju i makrofagów, które są antygenowo nierozróżnialne (odtąd określane jako M/M) w uszkodzeniu mózgu jest nadal dyskutowana. Coraz więcej badań wskazuje, że podobnie jak w przypadku makrofagów obwodowych, mikroglej i makrofagi rekrutowane do mózgu mogą przyjmować różne fenotypy, których skrajności odpowiadają klasycznemu prozapalnemu fenotypowi toksycznemu (M1) lub przeciwzapalnemu ochronnemu (M2). Różne stany aktywacji, w tym wydzielanie czynników pro- lub przeciwzapalnych, uwalnianie cząsteczek neurotroficznych i aktywność lizosomalna, charakteryzują się specyficznym wzorcem markerów fenotypowych, których ekspresja zależy od czasowej ewolucji otaczającego środowiska. Charakterystyka tych fenotypów M/M w uszkodzonym mózgu jest nadal skąpa. Użyliśmy dobrze ugruntowanego mysiego modelu pMCAo do analizy ekspresji i ewolucji M / M po udarze. Przedstawione tutaj protokoły oparte na immunofluorescencji mają na celu uzyskanie wglądu w wygląd specyficznych markerów fenotypu M/M, ich lokalizację i koekspresję komórkową w obszarze niedokrwiennym. Zbadaliśmy kilka cząsteczek związanych z różnymi stanami aktywacji lub fenotypami, a mianowicie CD11b, marker powierzchniowy wyrażany przez leukocyty i szeroko stosowany marker aktywacji / rekrutacji M / M6-8, CD68 marker lizosomów6,7 i Ym1, białko wydzielnicze wyrażane przez alternatywnie aktywowane (M2) makrofagi i związane z odzyskiwaniem i przywracaniem funkcji9-10.	
	Gdy dwa markery są wyrażane przez tę samą komórkę, ale w różnych subkomórkowych kompartmentach, sama kolokalizacja może nie być zbyt pouczająca. W takim przypadku analizę koekspresji można przeprowadzić przy użyciu widoku pojedynczej płaszczyzny i renderingów trójwymiarowych. Opisujemy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie dokładnej trójwymiarowej analizy koekspresji markerów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD11b</td><td>Uprzejmie dostarczone przez Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Mediolan, Włochy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-mouse </td><td>Ym1 Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; CHST 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Mysie jądra antynerwowe (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane kozie przeciwciało anty-szczurze</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyjanina 5 System </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anty-szczur alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anty mysz Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królik Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr>Normalne wektory<td>surowicy koziej</td><td>Laboratoria</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Mikroskop</td> konfokalny Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 </td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS</td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pakiety oprogramowania GraphPad Prism wersja 4.0</td><td>Oprogramowanie GraphPad Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Po udarze mózgu mikroglej/makrofagi (M/M) przechodzą szybką aktywację z dramatycznymi zmianami morfologicznymi i fenotypowymi, które obejmują ekspresję nowych antygenów powierzchniowych i produkcję mediatorów, które budują i utrzymują odpowiedź zapalną. Pojawiające się dowody wskazują, że M/M są wysoce plastycznymi komórkami, które mogą przyjąć klasyczną aktywację prozapalną (M1) lub alternatywną przeciwzapalną (M2) po ostrym uszkodzeniu mózgu. Nadal jednak brakuje pełnej charakterystyki ekspresji markerów fenotypu M/M, ich kolokalizacji i ewolucji czasowej w uszkodzonym mózgu.	
	Protokoły immunofluorescencji specyficznie barwiące odpowiednie markery aktywacji M/M mogą być wykonywane w niedokrwiennym mózgu. Tutaj przedstawiamy protokoły oparte na immunofluorescencji, a następnie trójwymiarową analizę konfokalną jako potężne podejście do badania wzorca lokalizacji i koekspresji markerów fenotypu M / M, takich jak CD11b, CD68, Ym1, w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia wywołanego przez trwałą niedrożność tętnicy środkowej mózgu (pMCAO). Dwuwymiarowa analiza zabarwionego obszaru ujawnia, że każdy marker jest powiązany z określoną morfologią M/M i ma określoną lokalizację w zmianie niedokrwiennej. Wzorce koekspresji markera fenotypu M/M można ocenić za pomocą trójwymiarowego obrazowania konfokalnego w obszarze niedokrwiennym. Obrazy mogą być rejestrowane w określonej objętości (oś Z 10 μm i krok co 0,23 μm, co odpowiada objętości 180 x 135 x 10 μm) w trybie skanowania sekwencyjnego w celu zminimalizowania efektów przebijania i uniknięcia nakładania się długości fal. Obrazy są następnie przetwarzane w celu uzyskania trójwymiarowych renderingów za pomocą oprogramowania Imaris. Solidny widok trójwymiarowych renderingów pozwala na zdefiniowanie wyrażenia znacznika w klastrach komórek. Wykazaliśmy, że M/M mają zdolność różnicowania się w kierunku wielu fenotypów, w zależności od lokalizacji w miejscu zmiany i czasu po urazie.

Przykład wyników uzyskanych po przeprowadzeniu protokołów znakowania i obrazowania konfokalnego w obszarze niedokrwiennym przedstawiono na rysunku 1A oraz 1B. Dwuwymiarowy widok pozyskanych obrazów pokazuje, że dwadzieścia cztery godziny po niedokrwieniu (A) marker lizosomalny CD68 (zielony) jest ekspresjonowany w hipertroficznych ameboidalnych komórkach CD11b (czerwone) obecnych w jądrze obszaru niedokrwiennego. W strefie granicznej (B) komórki CD11b-do...

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja ekspresji i lokalizacji komórkowej markerów fenotypu makrofagicznego mikrogleju po niedokrwieniu mózgu. W pierwszej kolejności preparaty z mrożonych przekrojów mózgów myszy z niedokrwieniem są barwione w celu identyfikacji markerów aktywacji makrofagicznej mikrogleju. Zabarwione przekroje poddawane są trójwymiarowemu obrazowaniu konfokalnemu.Otrzymane obrazy są następnie przetwarzane w celu wygenerowania renderingów trójwymiarowych, a analiza obrazu służy do lokalizacji ekspresji markerów w skupiskach komórek. Wynikowe dane wykazują skuteczność trójwymiarowej analizy konfokalnej w prawidłowym przypisywaniu ekspresji markerów do konkretnego ciała komórkowego. Gdy dwa markery są wyrażane przez tę samą komórkę, ale w różnych przedziałach subkomórkowych, sama kolokalizacja może nie być zbyt informacyjna. Zastosowanie analizy trójwymiarowej, co zostanie tutaj zademonstrowane, pozwala na uzyskanie lepszej rozdzielczości i dokładności.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat złożoności reakcji mózgu na uszkodzenie niedokrwienne, można ją również zastosować w innych stanach ostrych lub przewlekłych, w których postuluje się dwoistą rolę mikrogleju i makrofagów w procesach uszkadzania i naprawy. W przypadkach, gdy sygnały muszą zostać selektywnie zlokalizowane w różnych płaszczyznach przestrzennych, Carlo Perigo i Stefan of Magali przeprowadzą Państwa przez poszczególne etapy procedury. Poniższy protokół wykorzystuje tkankę mózgu myszy, w której niedokrwienie wywołano poprzez trwałe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu.Użyj kriotomatu do pobrania seryjnych przekrojów koronowych mózgu o grubości 20 micron na żelatynę. Przed użyciem doprowadź wszystkie odczynniki i próbki na szkiełkach krytych do temperatury pokojowej. Należy pamiętać, że rozcieńczenia robocze przeciwciał i surowicy wymienione w towarzyszącym dokumencie są wynikiem prób przeprowadzonych w celu uzyskania najlepszych rezultatów przy zastosowaniu różnych przeciwciał i surowic.Protokół wymaga walidacji. Należy rozpocząć od obrysowania sekcji na preparacie za pomocą pisaka z blokerem w cieczy, aby zminimalizować ilość potrzebnych odczynników. Następnie, za pomocą pipety 1 mL, należy umieścić sekcje mózgu w wilgotnej komorze.Do przekrojów dodać PBS w temperaturze pokojowej i inkubować przez pięć minut w celu ich przemycia. Następnie, używając jednorazowej strzykawki z igłą o pojemności 1 ml, usunąć roztwór i powtórzyć płukanie jeszcze raz. Po usunięciu drugiego płukania przystąpić do barwienia próbek, używając pipety 1 ml oraz jednorazowej strzykawki do wszystkich wymian roztworów. Procedurę barwienia należy przeprowadzić zgodnie z podsumowaniem dostępnym tutaj.Szczegóły, w tym etapy płukania, znajdują się w tekście towarzyszącym. Najpierw komórki inkubuje się z 1% nadtlenkiem wodoru po blokowaniu normalną surowicą kozią. Następnie inkubuje się je z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko CD 11 B. W kolejnym kroku preparaty inkubuje się z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym, a następnie płucze buforem TNT (Tris-NaCl-Tween) lub TNB (Tris-HCl-NaCl, bufor blokujący) po inkubacji z TNB.Preparaty inkubuje się ze streptawidyną HRP, a następnie z rozcieńczalnikiem amplifikacyjnym zawierającym cyjaninę 5, która wzmocni sygnał immunofluorescencyjny. Następnie preparaty inkubuje się z NGS w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania. Potem inkubuje się je z przeciwciałem pierwotnym przeciwko CD 68.Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym komórki inkubuje się z odpowiednim przeciwciałem wtórnym koniugowanym z fluorochromem, a następnie z 1 µg/mL hooks w celu znakowania DNA. Po zakończeniu barwienia preparuj krioprzecięcia, używając Prolong Gold; podczas montowania sekcji należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Przecięcia należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy.Akwizycję sygnału fluorescencyjnego należy przeprowadzić w ciągu jednego tygodnia. W tym protokole wykorzystano mikroskop IX 81 wyposażony w jednostkę skanowania konfokalnego FV 500 z trzema liniami laserowymi: argonowo-kryptonową o długości 488 nanometrów, helowo-neonową czerwoną o długości 646 nanometrów oraz helowo-neonową zieloną o długości 532 nanometrów, a także diodą UV w oprogramowaniu flu of U 500. Wybierz odpowiednie lasery wzbudzenia i lustra dichroiczne.Ustaw również rozdzielczość obrazu na minimum 800 na 600 pikseli. Następnie umieść preparat na stoliku mikroskopu i korzystając z fluorescencji epi, zidentyfikuj obszar zainteresowania, stopniowo zwiększając powiększenie do obiektywu 40 x. Następnie przełącz się na tryb mikroskopii skaningowej laserowej i wykonuj powtarzalne skanowanie, regulując poziom mocy fotopowielacza oraz wzmocnienie dla każdego kanału.Zredukuje to nakładanie się sygnałów spowodowane jednoczesną ekscytacją przy różnych długościach fal. Należy utrzymać wzmocnienie na jak najniższym poziomie, aby uniknąć niepożądanych sygnałów nieswoistych. Kontynuując skanowanie repetytywne, należy dostosować ostrość oraz zdefiniować dolną i górną granicę osi Z, przyjmując całkowitą długość osi Z wynoszącą 10 mikronów.Następnie przerwij skanowanie powtarzalne. W kolejnym kroku wprowadź wielkość kroku. Powinna być ona jak najbliższa rozmiarowi piksela, który wynosi 0.225 microns.Zapewni to standardowy stosunek wielkości 1:1 wzdłuż osi Z w oprogramowaniu. Aktywuj filtr Kalmana co najmniej dwukrotnie. Algorytm Kalmana to funkcja iteracyjna, która eliminuje losowy sygnał, taki jak pojedyncze dodatnie woksele należące do szumu tła, poprawiając tym samym stosunek sygnału do szumu. Teraz aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć efektów przenikania sygnału (bleed through).Przesuń się do punktu środkowego osi Z i wykonaj sekwencyjne skanowanie w płaszczyźnie XY. Sprawdź konfigurację PMT oraz wzmocnienie, aby zapewnić satysfakcjonujący stosunek sygnału do szumu. Następnie przeprowadź akwizycję w płaszczyznach XY i Z.Wyeksportuj dane jako plik multi TIF. Każdy plik multi TIF zazwyczaj zawiera trzy kanały kolorów i 44 płaszczyzny ogniskowe do przetwarzania. Rozpocznij od uruchomienia oprogramowania imas.Najpierw wybierz widok surpass, a następnie prześlij plik multi TIF. Następnie w panelu regulacji obrazu wybierz tutaj pożądany kolor dla każdego kanału. Kolor czerwony reprezentuje CD 11 B, zielony reprezentuje CD 68, a niebieski reprezentuje barwienie DNA Hoechst. Aby usunąć szum z tła, zwiększ wartość minimalną w panelu regulacji obrazu dla każdego kanału.Następnie przejdź do widoku przekroju, aby zwizualizować pojedynczą płaszczyznę ogniskową XY wraz z rzutami ortogonalnymi osi XZ i YZ. Poruszaj się wzdłuż osi Z, szukając kolokalizacji, która objawia się jako żółte piksele. Kliknij w żółty obszar, aby sprawdzić, czy kolokalizacja występuje wzdłuż osi Z, co wskazuje, że należy ona do obiektu bryłowego wzdłuż osi Z.Rzuty są widoczne w prawej i dolnej części rysunku. Wykonaj migawkę, a następnie powróć do widoku ogólnego. Następnie w rozwijanym menu edycji wybierz opcję crop 3D i obrysuj obszar zainteresowania, aby wyizolować komórkę lub skupisko komórek.Następnie w panelu regulacji wyświetlania należy wybrać jeden kanał. Wybierz konstruktor algorytmów surpass surfaces. Aby skonfigurować algorytm, najpierw wybierz kanał.Następnie zdefiniuj próg jako tę samą wartość minimalną, która została ustawiona w panelu regulacji wyświetlania, i określ skalowanie, jeśli jest ono wymagane. Następnie ustaw wygładzanie na 0,200. Wybierz panel kolorów i zmień wygląd w razie potrzeby.Powtórz konfigurację kreatora algorytmu powierzchni przekraczających (surpass surfaces) dla każdego kanału. Następnie w panelu regulacji wyświetlania odznacz kanały fluorescencji i zaznacz wszystkie trzy powierzchnie. Na koniec przesuń wolumen, aby znaleźć optymalny widok, i wykonaj zrzut ekranu w celu określenia wzorca koekspresji markerów MM.Protokoły immunofluorescencji i obrazowania konfokalnego opisane w tym filmie zostały przeprowadzone na mysim modelu ogniskowego niedokrwienia wywołanego trwałą okluzją tętnicy środkowej mózgu. Dwuwymiarowy widok uzyskanych obrazów pokazuje, że 24 godziny po niedokrwieniu marker lizosomalny CD 68, przedstawiony na zielono, wykazuje ekspresję w hipertroficznych komórkach CD 11 B dodatnich, widocznych na czerwono w rdzeniu niedokrwiennym. Projekcja osi Z pokazana w prawym dolnym rogu demonstruje, że rozkład markerów udokumentowany w widoku pojedynczej płaszczyzny występuje również wzdłuż osi Z w strefie granicznej.Komórki wykazujące pozytywną ekspresję CD 11 B posiadają hipertroficzne ciała komórkowe z wypustkami silnie pozytywnymi w kierunku CD 68, co sugeruje, że fagosomy są związane z błoną komórkową. Wskazuje to na aktywny kwasowy charakter PHA komórek mikrogleju w celu oceny koekspresji CD 68 oraz YM 1, markera polaryzacji M2. Obrazy fluorescencyjne poddano renderowaniu trójwymiarowemu.Trójwymiarowy widok uzyskanych obrazów przedstawiony tutaj wskazuje na obecność komórek CD 68-dodatnich zaznaczonych na zielono oraz komórek YM1-dodatnich zaznaczonych czerwonymi wokselami fluorescencyjnymi. Przy równoległym ustawieniu widok obserwatora może ukazywać sygnał współlokalizacyjny widoczny jako kolor żółty, co może nie być związane z rzeczywistą odległością między markerami. Aby zdefiniować współlokalizację.Należy wygenerować widok w jednej płaszczyźnie z projekcjami osi Z, przemieszczając się wzdłuż osi Z. Celem jest poszukiwanie kolokalizacji. Projekcja osi Z jest uzyskiwana w sposób przedstawiony w prawej i dolnej części tego obrazu.Fluorescencyjne woksle można przekształcić w obiekty stałe poprzez renderowanie trójwymiarowe z przypisaniem ekspresji markera do konkretnego ciała komórkowego. Po zastosowaniu dużego powiększenia i renderowaniu 3D okazuje się, że oba markery należą do różnych komórek znajdujących się w bliskim sąsiedztwie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat przeprowadzania testów immunofluorescencyjnych z użyciem wielu markerów i barwników, a także prawidłowego pozyskiwania i wizualizacji obrazów trójwymiarowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.Ponadto opisana analiza postprocesowa może zostać z powodzeniem wykorzystana do badania koekspresji lub kolokalizacji na poziomie komórkowym, a także w przypadkach, gdy sygnały muszą zostać selektywnie zlokalizowane w różnych płaszczyznach przestrzennych.

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym urazie mózgu

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Krwotok śródmiąższowy i zapalenie nerwów, któremu towarzyszy stłuczenie mózgu, mogą spowodować poważne wtórne uszkodzenie mózgu. Protokół ten szczegółowo opisuje model kontrolowanego wpływu kory mózgowej (CCI) na myszy, umożliwiając naukowcom badanie kontuzji krwotoku i pourazowych odpowiedzi immunologicznych oraz badanie potencjalnych terapii.

Przedkliniczny, kontrolowany model oddziaływania kory mózgowej w przypadku krwotoku pourazowego, stłuczenia i zapalenia nerwów

Ten protokół przedstawia metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi na łagodne urazowe uszkodzenie mózgu oraz integracji tych danych jako części wielowymiarowej analizy systemów przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów.

Analiza systemowa odpowiedzi neurozapalnej i hemodynamicznej na urazowe uszkodzenie mózgu

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Protokół opisuje łagodne urazowe uszkodzenie mózgu w modelu mysim. W szczególności w pełni wyjaśniony jest protokół krok po kroku mający na celu wywołanie łagodnego urazu głowy w linii środkowej oraz charakterystyka modelu zwierzęcego.

Elektromagnetycznie sterowany model zamkniętej głowy łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u myszy

Identyfikacja mikrogleju (MG) i obwodowych naciekających makrofagów (Mø) w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest trudna. W tym protokole zastosowano cytometrię przepływową (FCM) do identyfikacji odpowiednio MG podobnego do M1, MG podobnego do M2, M1-podobnego Mø i M2-podobnego Mø. Technologia ta może być również stosowana w innych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, aby zrozumieć rolę MG i Mø.

Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Poznaj trójwymiarową analizę konfokalną markerów polaryzacji mikrogleju i makrofagów w modelu niedokrwiennego uszkodzenia mózgu myszy. Ta metoda umożliwia precyzyjną lokalizację ekspresji markerów w komórkach.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Przeglądaj więcej filmów