Name: Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę barwienia immunofluorescencyjnego IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości, morfologii mikrogleju oraz infiltracji makrofagów w mózgu myszy. Protokół umożliwia ilościową ocenę zmian w dystrybucji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Nathalie Vernoux za jej wskazówki i pomoc w eksperymentach. Chcielibyśmy również podziękować doktorom Emmanuelowi Planelowi i Serge'owi Rivestowi za użycie ich mikroskopów fluorescencyjnych i konfokalnych. Praca ta została częściowo sfinansowana ze stypendiów Meksykańskiej Rady Nauki i Technologii (CONACYT; dla F.G.I.), Fondation Famille-Choquette i Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; dla K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (dla M.B.) i Shastri Indo-Canadian Institute (dla K.B.), a także z grantu Discovery od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) dla M.E.T. M.E.T. posiada kanadyjską Kierownik Katedry Badawczej (Poziom II) Plastyczności Neuroimmunologicznej w Zdrowiu i Terapii.

<ol><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359(2018).</li>
<li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+across+the+lifespan%3A+from+origin+to+function+in+brain+development%2C+plasticity+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li>
<li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+NTPDase1%2FCD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li>
<li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li>
<li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li>
<li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915(2011).</li>
<li>Rodríguez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li>
<li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease%3A+a+review+of+the+models%2C+the+signals+and+the+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li>
<li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages%2Fmicroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li>
<li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li>
<li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation%2C+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages%2C+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li>
<li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome%2C+chromatin+landscape+and+response+to+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+monocytes%2C+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li>
<li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+infiltrating+monocytes%2Fmacrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation%3A+Effects+on+cognition%2C+learning+and+affective+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuro-Psychopharmacology+and+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten można podzielić na dwie krytyczne części: jakość barwienia i analizę. Jeśli barwienie nie jest optymalne, nie będzie w stanie odpowiednio reprezentować komórek mikrogleju, wpływając w ten sposób na pomiary gęstości, rozmieszczenia i morfologii. Ponadto odsetek naciekających obwodowych komórek szpikowych może być niedoszacowany. Jest to zoptymalizowana wersja protokołu barwienia, ale istnieje kilka czynników, które mogą skutkować nieoptymalnymi obrazami. Nawet jeśli perfuzja zwierzęcia nie jest uwzględniona w...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Czy to ostre, czy przewlekłe, zapalenie nerwów jest ściśle uzależnione od mikrogleju, makrofagów rezydujących w mózgu. Wizualizacja mikrogleju za pomocą barwienia immunologicznego jest cenna dla badania zapalenia nerwów przy użyciu mikroskopii świetlnej, która jest bardzo dostępną techniką. W warunkach homeostatycznych mikroglej jest zwykle rozmieszczony w nienakładającym się na siebie, przypominającym mozaikę wzorze. Wykazują małe somy, które rozszerzają rozgałęzione procesy1, które czasami kontaktują się ze sobą2. Rozgałęzione procesy mikrogleju dynamicznie badają miąższ mózgu, wchodząc w interakcje z neuronami, innymi komórkami glejowymi i naczyniami krwionośnymi w normalnych warunkach fizjologicznych3. Mikroglej jest wyposażony w arsenał receptorów, które pozwalają im wykonywać zadania immunologiczne i reagować na zmiany w środowisku mózgowym, śmierć komórki lub uszkodzenie tkanek. Ponadto pełnią kluczowe funkcje fizjologiczne, w szczególności w tworzeniu, utrzymywaniu i eliminacji synapty4,5.
Wśród dostępnych markerów używanych do badania mikrogleju, zjonizowana cząsteczka adaptora wiążącego wapń 1 (IBA1) jest jedną z najczęściej używanych. IBA1 jest białkiem wiążącym wapń, które zapewnia wyjątkową wizualizację morfologii mikrogleju, w tym drobnych procesów dystalnych, co potwierdza mikroskopia elektronowa6. Narzędzie to odegrało zasadniczą rolę w scharakteryzowaniu transformacji mikrogleju, wcześniej nazywanej "aktywacją", w szerokim zakresie modeli chorób zwierzęcych7,8,9. W obecności zapalenia układu nerwowego odpowiedź mikrogleju obejmuje: mikroglejozę, którą definiuje się jako wzrost gęstości komórek, zmiany w dystrybucji, które czasami prowadzą do grupowania, powiększenie ciała komórki, a także pogrubienie i skrócenie procesów związanych z bardziej ameboidalnymi kształtami10,11,12,13.
Barwienie immunologiczne jest ograniczone przez dostępność przeciwciał skierowanych przeciwko określonym markerom. Co ważne, IBA1 jest wyrażany przez mikroglej, ale także przez makrofagi obwodowe, które infiltrują mózg14. Podczas gdy obserwacja komórek IBA1-dodatnich w mózgu stała się markerem mikrogleju w tej dziedzinie badań, infiltracja makrofagów obwodowych została zgłoszona w różnych warunkach, nawet marginalnie w zdrowym mózgu15,16,17,18. W związku z tym samo zastosowanie IBA1 nie pozwala na selektywną wizualizację mikrogleju. Ponadto makrofagi przyjmują molekularne i morfologiczne cechy rezydującego mikrogleju po infiltracji mózgu, utrudniając w ten sposób różnicowanie19. Stanowi to wyzwanie podczas badania funkcji zarówno mikrogleju, jak i naciekających makrofagów.
Chociaż mikroglej i makrofagi obwodowe mają różne pochodzenie (np. odpowiednio z embrionalnego woreczka żółtkowego i szpiku kostnego20,21), istnieje coraz więcej wyników wskazujących, że te dwie populacje komórek pełnią różne role w mózgu19. Dlatego tak ważne jest stosowanie metod, które rozróżniają te dwie populacje bez inwazyjnych manipulacji (tj. chimer szpiku kostnego lub parabiozy), które mogą modulować ich gęstość, rozmieszczenie, morfologię i funkcję. TMEM119 pojawił się jako marker specyficzny dla mikrogleju w różnych stanach zdrowotnych i chorobowych22. W połączeniu z IBA1 marker ten staje się przydatny do różnicowania tych komórek od naciekających makrofagów, które są TMEM119-ujemne i IBA1-dodatnie. Chociaż jest regulowany rozwojowo, TMEM119 wyraża się już w 3 (P3) i 6 dniu po urodzeniu (P6), stale rosnąc, aż do osiągnięcia dorosłego poziomu między P10 a P1422. IBA1 ulega ekspresji już w 10,5 dniu embrionalnym (E10,5)23. Proponowany protokół podwójnego znakowania jest zatem przydatny do badania tych dwóch populacji przez całe życie pourodzeniowe.
Ten protokół zapewnia krok po kroku procedurę barwienia immunologicznego, która pozwala na rozróżnienie między mikroglejem a makrofagami obwodowymi. Wyjaśnia również, jak przeprowadzić analizę ilościową gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także analizę infiltracji makrofagów obwodowych. Podczas gdy badanie mikrogleju i makrofagów obwodowych jest przydatne samo w sobie, protokół ten dodatkowo umożliwia lokalizację neurozapalnych foyer; W związku z tym służy również jako platforma do identyfikacji konkretnych regionów do zbadania, przy użyciu uzupełniających (ale bardziej czasochłonnych) technik.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-myszy</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 koza anty-królik</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Biolite 24 Well wielodaniowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Bejca kwasem nuceleinowym</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>MP 01306</td><td></td></tr><tr><td>Fine Brush</td><td>Art store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>1254418</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszkiełka dodatnio naładowane</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna Anti-IBA1</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2PO4&middot; H2O</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>SPM306, SPM400</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>SPD307, SPD600</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480886</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642500</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm-M</td><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>Królik monoklonalny anty-TMEM119</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>Wanna z wzajemnym wytrząsaniem model 25</td><td>Precyzyjna</td> pipeta <td></td> do transferu naukowego <td></td></tr><tr><td></td> Chlorowodorek buforu Tris BioShop Canada Inc.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>TRS002/TRS004</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu iba1 i tmem119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

To jest protokół do podwójnej wizualizacji mikrogleju i infiltracji makrofagów w tkance mózgowej myszy. TMEM119 (która selektywnie znakuje mikroglej), w połączeniu z IBA1 (który zapewnia wyjątkową wizualizację ich morfologii), umożliwia badanie zmian w gęstości, rozmieszczeniu i morfologii. Kwantyfikacja tych parametrów jest ważna dla uzyskania wglądu w role odgrywane przez mikroglej, makrofagi rezydujące w mózgu. W normalnych warunkach fizjologicznych mikroglej jest regularnie rozmieszczony w wzór przypominający mozaikę i przedstawia małą somę z rozgałęzionymi procesami. Niemniej jednak, w odpowiedzi na czynniki środowiskowe (tj. uraz, infekcję, chorobę lub uraz), gęstość, rozmieszczenie i morfologia mikrogleju są zmieniane na różne sposoby, w zależności od zniewagi. Dodatkowo opisana metoda podwójnego barwienia pozwala na wizualizację naciekających makrofagów w mózgu na podstawie ich ekspresji IBA1 i bez kolokalizacji z TMEM119. Podejście to pozwala zatem na rozróżnienie między mikroglejem a infiltrującymi makrofagami, co jest niezbędne do uzyskania funkcjonalnego wglądu w ich wyraźny udział w homeostazie mózgu w różnych kontekstach zdrowia i choroby. Protokół ten integruje najnowsze odkrycia w dziedzinie neuroimmunologii, które odnoszą się do identyfikacji markerów selektywnych. Służy również jako użyteczne narzędzie zarówno dla doświadczonych neuroimmunologów, jak i badaczy dążących do zintegrowania neuroimmunologii z projektami.

Rysunek 1 przedstawia podwójne znakowanie mikrogleju przy użyciu IBA1 i TMEM119 w przekroju czołowym grzbietowej części hipokampa, obrazowanym przy 20-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Prawidłowe barwienie ujawnia ciała komórek mikrogleju oraz ich cienkie wypustki (Rysunek 1A−C). Barwienie to pozwala na określenie gęstości i rozmieszczenia mikrogleju oraz identyfikację skupisk mikroglej...

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Ten protokół pokaże Ci, jak barwieć mikroglej, przeprowadzać ilościową analizę gęstości i morfologii, a także określać ilościowo infiltrację makrofagów do mózgu. Technika ta pozwala badaczowi zmierzyć zmiany w rozmieszczeniu i morfologii mikrogleju w sposób ilościowy oraz odróżnić mikroglej od naciekających makrofagów Ten protokół analizy można łatwo zastosować do innych modeli zwierzęcych w celu pomiaru zmian w rozmieszczeniu i morfologii mikrogleju, w których dostępne są przeciwciała anty-IBA1 i anty-TMEM119. Zdecydowanie zaleca się, aby zliczanie komórek i ślady były przeprowadzane w sposób zaślepiony na warunki eksperymentalne i aby być konsekwentnym w sposobie wykonywania tej procedury.Aby rozpocząć tę procedurę, otwórz program do przetwarzania obrazu, taki jak Fiji lub ImageJ, który ma zainstalowaną wtyczkę odległości najbliższego sąsiada. Otwórz obraz 20X, jeśli skala jest zawarta w metadanych pliku i nie jest automatycznie ustawiana na podstawie metadanych. Na pasku menu wybierz pozycję Analizuj, Ustaw skalę, a następnie wprowadź poprawne informacje.Aby ręcznie ustawić skalę na podstawie skali odciśniętej na obrazie, wybierz narzędzie Linia prosta. Umieść kursor na krawędzi skali i naciskając Shift narysuj linię jak najbliżej skali na obrazie. Wybierz pozycję Analizuj, ustaw skalę.Pojawi się okno z prawidłową znaną odległością i jednostką długości, aby określić jednostkę długości pikseli i kliknij OK. Następnie wybierz Obraz, Kolor, Utwórz kompozyt, aby utworzyć obraz kompozytowy wszystkich kanałów. Na pasku menu wybierz pozycję Analizuj, ustaw miary. Sprawdź obszar, środek ciężkości i obwód.Z menu rozwijanego Przekieruj do wybierz Otwórz plik, a następnie kliknij OK. Przejdź do narzędzia Obraz, Kolor, Kanał, aby otworzyć narzędzie Kanał. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby narysować przybliżony obrys wokół obszaru zainteresowania. Kliknij dwukrotnie narzędzie Owal na pasku narzędzi, aby włączyć narzędzie Pędzel zaznaczania.Upewnij się, że pole Włącz pędzel zaznaczania jest zaznaczone i kliknij przycisk OK. Za pomocą pędzla zaznaczania dopasuj obwód, aby jak najlepiej pasował do obszaru zainteresowania, a następnie naciśnij T na klawiaturze w całym tym obszarze, aby ustawić strzałkę Y menedżera. Wybierz Analizuj, Zmierz lub Naciśnij M, a pojawi się okno Wyniki. Skopiuj i wklej wyniki do arkusza danych i zapisz informacje dotyczące obszaru.Po skopiowaniu obszaru obszaru zainteresowania, bazujesz na informacjach z okna Wyniki, klikając na niego i naciskając Backspace. Wybierz okno Menedżer ROI, wybierz Ślad ROI i zmień nazwę tak, aby była zgodna z nazwą obrazu, naciskając Zmień nazwę. Kliknij OK, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy nową nazwę śledzenia ROI i zapisz.Kliknij dwukrotnie narzędzie Pędzel na pasku narzędzi. Wybierz kolor i rozmiar pędzla 10. Upewnij się, że opcja Maluj na nakładce nie jest zaznaczona.W kanale TMEM119 ostrożnie umieść czarną kropkę na środku somy dla każdego TMEM119 dodatniego mikrogleju. Umieść białą kropkę na środku komórek, które nie są dodatnie dla TMEM119. Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich komórek zawartych w obszarze zainteresowania.Następnie wybierz Obraz, Kolor, Podziel kanał, pojawi się okno dla każdego kanału. Zidentyfikuj kanał, który ma adnotacje kropkowe i zamknij pozostałe dwa okna. Aby przekierować nowy obraz podzielonego kanału, przejdź do opcji Analizuj, Ustaw pomiary.Z menu rozwijanego Przekieruj do wybierz obraz podzielonego kanału i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz Obraz, Typ, ośmiobitowy. Przejdź do opcji Image Adjustment (Regulacja obrazu) i wybierz opcję Threshold (Próg). Przesuń suwaki maksymalnie w lewo na obu paskach.Spowoduje to pozostawienie tylko czarnych kropek, które będą teraz białe. Wybierz interesujący Cię region w oknie Menedżer ROI. Na pasku menu wybierz Analizuj, Analizuj cząstkę.W polu tekstowym Rozmiar wprowadź wartości od jednego do 20. Pole Jednostki pikseli powinno pozostać niezaznaczone, natomiast pole Wyświetl wyniki, Podsumuj i Dodaj do Menedżera powinno być zaznaczone. Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić okno Podsumowanie, w którym zostanie podana liczba punktów.Skopiuj te informacje i wklej je do arkusza danych. Następnie wybierz wtyczki NND, aby wyświetlić okno NND. Każda liczba reprezentuje odległość, jaką każdy mikroglej ma do najbliższego sąsiedniego mikrogleju.Skopiuj wszystkie te informacje i wklej je do arkusza danych. Wróć do okna Próg i przesuń górny suwak maksymalnie w prawo, co sprawi, że wszystkie białe kropki będą widoczne, teraz będą białe. Wybierz opcję Analizuj, Analizuj cząstkę, aby wyświetlić wyskakujące okno Analizuj cząstki.Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić okno Podsumowanie, w którym podana jest liczba punktów. Skopiuj te informacje i wklej je do arkusza danych. Przejdź do Menedżera ROI i wybierz wszystkie punkty.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i zapisz z nazwą obrazu. Umożliwi to zapisanie wszystkich punktów w pliku ZIP. Najpierw otwórz pliki obrazów 4DX.Pojawi się wyskakujące okienko z pytaniem, czy obrazy powinny być otwierane w stosie. Kliknij przycisk OK. Następnie wybierz Obraz, Stosy, ZProject, aby otworzyć okno Projekcja Z. Uwzględnij wszystkie plasterki od pierwszego do ostatniego plasterka.Upewnij się, że w obszarze Typ projekcji wybrano opcję Maksymalna intensywność, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij nowe okno, które zawiera ZProject. Wybierz Obraz, Kolory, Podziel kanały i przeprowadź ślady na obrazach kanału IBA1. Na pasku menu wybierz Analizuj, Ustaw miary.Sprawdź obszar, środek ciężkości i obwód. Z menu rozwijanego Przekieruj do wybierz otwarty plik i kliknij OK.To ustawić skalę ręcznie na podstawie skali nadrukowanej na obrazie, wybierz narzędzie Linia prosta. Umieść kursor na krawędzi skali i naciskając Shift narysuj linię jak najbliżej skali na obrazie.Wybierz pozycję Analizuj, ustaw skalę. Pojawi się okno. Wprowadź poprawną znaną odległość i jednostkę długości, aby określić jednostkę pikseli na długość, a następnie kliknij OK.To zmierzyć rozmiar somy w kanale IBA1, narysuj przybliżony obwód somy za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne.Kliknij dwukrotnie narzędzie Owal na pasku narzędzi, aby włączyć narzędzie Pędzel zaznaczania. Upewnij się, że pole Włącz pędzel zaznaczania jest zaznaczone i kliknij przycisk OK. Za pomocą pędzla zaznaczania dostosuj ślad, aby jak najlepiej pasował do somy. Powiększenie umożliwi precyzję na tym etapie.Następnie naciśnij T, aby dodać ślad somy do Menedżera ROI. Wybierz opcję Analizuj, Zmierz lub naciśnij M, aby wyświetlić wyniki. Skopiuj te wyniki i wklej je do arkusza danych.Przejdź do okna Menedżer ROI, wybierz interesujący Cię region i zmień nazwę tak, aby była zgodna z nazwą obrazu, naciskając Zmień nazwę. Kliknij prawym przyciskiem myszy obszar zainteresowania o zmienionej nazwie i kliknij Zapisz. Upewnij się, że nazwa określa, że ślad jest dla soma i zapisz plik.Aby zmierzyć obszar arboryzacji w kanale IBA1, najpierw wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów. Kliknij koniec procesu mikrogleju za pomocą narzędzia, aby rozpocząć kształt wielokąta. Obejdź mikroglej, klikając na końcach każdego końca procesu, aby utworzyć wielokąt, który najlepiej reprezentuje obszar pokryty arboryzacją mikrogleju.Gdy wielokąt jest gotowy, kliknij punkt początkowy, aby go zamknąć. Następnie naciśnij T, aby dodać ślad do Menedżera ROI. Wybierz opcję Analizuj, Zmierz lub naciśnij M, aby dodać dane do okna Wyniki.Skopiuj te dane i wklej je do arkusza danych. Aby zapisać informacje dotyczące obszaru arboryzacji, przejdź do okna Menedżer ROI, wybierz interesujący Cię region i zmień nazwę tak, aby pasowała do nazwy obrazu, naciskając Zmień nazwę. Kliknij prawym przyciskiem myszy obszar zainteresowania o zmienionej nazwie i kliknij Zapisz.Upewnij się, że nazwa określa, że ślad jest przeznaczony do arboryzacji i zapisz plik. W badaniu tym opisano krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119 oraz analizę gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy. Mikroskopia fluorescencyjna służy do obrazowania wspólnego znakowania mikrogleju za pomocą IBA1 i TMEM119 w odcinku koronalnym grzbietowego hipokampa przy 20-krotnym powiększeniu.Udane barwienie ujawnia ciała komórek mikrogleju i ich drobne procesy. Barwienie pozwala na określenie gęstości i rozmieszczenia mikrogleju oraz identyfikację klastrów mikrogleju i infiltrujących makrofagów. Mikroskopia konfokalna służy do obrazowania krokowej procedury śledzenia arboryzacji mikrogleju przy 40-krotnym powiększeniu.Te reprezentatywne wyniki pokazują IBA1-dodatni i TMEM119-dodatni mikroglej, a także przykład śledzenia komórek ciała. Ważne jest, aby być konsekwentnym podczas liczenia komórek i zwracać uwagę zarówno na sygnały IBA1, jak i TMEM119. Technika ta pozwala badaczowi zidentyfikować obszary mózgu, na które wpływa określony bodziec, które można następnie bardziej dogłębnie zbadać za pomocą technik uzupełniających.

immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Ten artykuł opisuje protokół wizualizacji blaszek amyloidowych Aβ w mysich modelach choroby Alzheimera za pomocą metoksy-X04, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Umożliwia wstępne badanie przesiewowe skrawków tkanek zawierających płytkę przed barwieniem immunologicznym i przetwarzaniem do mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

Przedstawiamy protokół do identyfikacji grup białkowych zawierających antygeny dla ludzkich i mysich przeciwciał IgM ze specyficznymi łańcuchami lekkimi kappa (Vκ). Protokół ten nie ogranicza się do przeciwciał klasy IgM, ale ma zastosowanie do wszystkich izotypów immunoglobulin, które celują w swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem podczas immunoprecypitacji.

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Prezentowany tutaj jest protokół przejściowego otwierania bariery krew-mózg (BBB) albo ogniskowo, albo przez mózg myszy, w celu dostarczenia fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał i aktywacji mikrogleju. Przedstawiono również metodę wykrywania dostarczania przeciwciał i aktywacji mikrogleju za pomocą histologii.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Poznaj metodę barwienia immunofluorescencyjnego IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości, morfologii mikrogleju oraz infiltracji makrofagów w mózgu myszy. Protokół umożliwia ilościową ocenę zmian w dystrybucji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów