Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Ten protokół pokaże Ci, jak barwieć mikroglej, przeprowadzać ilościową analizę gęstości i morfologii, a także określać ilościowo infiltrację makrofagów do mózgu. Technika ta pozwala badaczowi zmierzyć zmiany w rozmieszczeniu i morfologii mikrogleju w sposób ilościowy oraz odróżnić mikroglej od naciekających makrofagów Ten protokół analizy można łatwo zastosować do innych modeli zwierzęcych w celu pomiaru zmian w rozmieszczeniu i morfologii mikrogleju, w których dostępne są przeciwciała anty-IBA1 i anty-TMEM119. Zdecydowanie zaleca się, aby zliczanie komórek i ślady były przeprowadzane w sposób zaślepiony na warunki eksperymentalne i aby być konsekwentnym w sposobie wykonywania tej procedury.

Aby rozpocząć tę procedurę, otwórz program do przetwarzania obrazu, taki jak Fiji lub ImageJ, który ma zainstalowaną wtyczkę odległości najbliższego sąsiada. Otwórz obraz 20X, jeśli skala jest zawarta w metadanych pliku i nie jest automatycznie ustawiana na podstawie metadanych. Na pasku menu wybierz pozycję Analizuj, Ustaw skalę, a następnie wprowadź poprawne informacje.

Aby ręcznie ustawić skalę na podstawie skali odciśniętej na obrazie, wybierz narzędzie Linia prosta. Umieść kursor na krawędzi skali i naciskając Shift narysuj linię jak najbliżej skali na obrazie. Wybierz pozycję Analizuj, ustaw skalę.

Pojawi się okno z prawidłową znaną odległością i jednostką długości, aby określić jednostkę długości pikseli i kliknij OK. Następnie wybierz Obraz, Kolor, Utwórz kompozyt, aby utworzyć obraz kompozytowy wszystkich kanałów. Na pasku menu wybierz pozycję Analizuj, ustaw miary. Sprawdź obszar, środek ciężkości i obwód.

Z menu rozwijanego Przekieruj do wybierz Otwórz plik, a następnie kliknij OK. Przejdź do narzędzia Obraz, Kolor, Kanał, aby otworzyć narzędzie Kanał. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby narysować przybliżony obrys wokół obszaru zainteresowania. Kliknij dwukrotnie narzędzie Owal na pasku narzędzi, aby włączyć narzędzie Pędzel zaznaczania.

Upewnij się, że pole Włącz pędzel zaznaczania jest zaznaczone i kliknij przycisk OK. Za pomocą pędzla zaznaczania dopasuj obwód, aby jak najlepiej pasował do obszaru zainteresowania, a następnie naciśnij T na klawiaturze w całym tym obszarze, aby ustawić strzałkę Y menedżera. Wybierz Analizuj, Zmierz lub Naciśnij M, a pojawi się okno Wyniki. Skopiuj i wklej wyniki do arkusza danych i zapisz informacje dotyczące obszaru.

Po skopiowaniu obszaru obszaru zainteresowania, bazujesz na informacjach z okna Wyniki, klikając na niego i naciskając Backspace. Wybierz okno Menedżer ROI, wybierz Ślad ROI i zmień nazwę tak, aby była zgodna z nazwą obrazu, naciskając Zmień nazwę. Kliknij OK, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy nową nazwę śledzenia ROI i zapisz.

Kliknij dwukrotnie narzędzie Pędzel na pasku narzędzi. Wybierz kolor i rozmiar pędzla 10. Upewnij się, że opcja Maluj na nakładce nie jest zaznaczona.

W kanale TMEM119 ostrożnie umieść czarną kropkę na środku somy dla każdego TMEM119 dodatniego mikrogleju. Umieść białą kropkę na środku komórek, które nie są dodatnie dla TMEM119. Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich komórek zawartych w obszarze zainteresowania.

Następnie wybierz Obraz, Kolor, Podziel kanał, pojawi się okno dla każdego kanału. Zidentyfikuj kanał, który ma adnotacje kropkowe i zamknij pozostałe dwa okna. Aby przekierować nowy obraz podzielonego kanału, przejdź do opcji Analizuj, Ustaw pomiary.

Z menu rozwijanego Przekieruj do wybierz obraz podzielonego kanału i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz Obraz, Typ, ośmiobitowy. Przejdź do opcji Image Adjustment (Regulacja obrazu) i wybierz opcję Threshold (Próg). Przesuń suwaki maksymalnie w lewo na obu paskach.

Spowoduje to pozostawienie tylko czarnych kropek, które będą teraz białe. Wybierz interesujący Cię region w oknie Menedżer ROI. Na pasku menu wybierz Analizuj, Analizuj cząstkę.

W polu tekstowym Rozmiar wprowadź wartości od jednego do 20. Pole Jednostki pikseli powinno pozostać niezaznaczone, natomiast pole Wyświetl wyniki, Podsumuj i Dodaj do Menedżera powinno być zaznaczone. Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić okno Podsumowanie, w którym zostanie podana liczba punktów.

Skopiuj te informacje i wklej je do arkusza danych. Następnie wybierz wtyczki NND, aby wyświetlić okno NND. Każda liczba reprezentuje odległość, jaką każdy mikroglej ma do najbliższego sąsiedniego mikrogleju.

Skopiuj wszystkie te informacje i wklej je do arkusza danych. Wróć do okna Próg i przesuń górny suwak maksymalnie w prawo, co sprawi, że wszystkie białe kropki będą widoczne, teraz będą białe. Wybierz opcję Analizuj, Analizuj cząstkę, aby wyświetlić wyskakujące okno Analizuj cząstki.

Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić okno Podsumowanie, w którym podana jest liczba punktów. Skopiuj te informacje i wklej je do arkusza danych. Przejdź do Menedżera ROI i wybierz wszystkie punkty.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i zapisz z nazwą obrazu. Umożliwi to zapisanie wszystkich punktów w pliku ZIP. Najpierw otwórz pliki obrazów 4DX.

Pojawi się wyskakujące okienko z pytaniem, czy obrazy powinny być otwierane w stosie. Kliknij przycisk OK. Następnie wybierz Obraz, Stosy, ZProject, aby otworzyć okno Projekcja Z. Uwzględnij wszystkie plasterki od pierwszego do ostatniego plasterka.

Upewnij się, że w obszarze Typ projekcji wybrano opcję Maksymalna intensywność, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij nowe okno, które zawiera ZProject. Wybierz Obraz, Kolory, Podziel kanały i przeprowadź ślady na obrazach kanału IBA1. Na pasku menu wybierz Analizuj, Ustaw miary.

Sprawdź obszar, środek ciężkości i obwód. Z menu rozwijanego Przekieruj do wybierz otwarty plik i kliknij OK.To ustawić skalę ręcznie na podstawie skali nadrukowanej na obrazie, wybierz narzędzie Linia prosta. Umieść kursor na krawędzi skali i naciskając Shift narysuj linię jak najbliżej skali na obrazie.

Wybierz pozycję Analizuj, ustaw skalę. Pojawi się okno. Wprowadź poprawną znaną odległość i jednostkę długości, aby określić jednostkę pikseli na długość, a następnie kliknij OK.To zmierzyć rozmiar somy w kanale IBA1, narysuj przybliżony obwód somy za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne.

Kliknij dwukrotnie narzędzie Owal na pasku narzędzi, aby włączyć narzędzie Pędzel zaznaczania. Upewnij się, że pole Włącz pędzel zaznaczania jest zaznaczone i kliknij przycisk OK. Za pomocą pędzla zaznaczania dostosuj ślad, aby jak najlepiej pasował do somy. Powiększenie umożliwi precyzję na tym etapie.

Następnie naciśnij T, aby dodać ślad somy do Menedżera ROI. Wybierz opcję Analizuj, Zmierz lub naciśnij M, aby wyświetlić wyniki. Skopiuj te wyniki i wklej je do arkusza danych.

Przejdź do okna Menedżer ROI, wybierz interesujący Cię region i zmień nazwę tak, aby była zgodna z nazwą obrazu, naciskając Zmień nazwę. Kliknij prawym przyciskiem myszy obszar zainteresowania o zmienionej nazwie i kliknij Zapisz. Upewnij się, że nazwa określa, że ślad jest dla soma i zapisz plik.

Aby zmierzyć obszar arboryzacji w kanale IBA1, najpierw wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów. Kliknij koniec procesu mikrogleju za pomocą narzędzia, aby rozpocząć kształt wielokąta. Obejdź mikroglej, klikając na końcach każdego końca procesu, aby utworzyć wielokąt, który najlepiej reprezentuje obszar pokryty arboryzacją mikrogleju.

Gdy wielokąt jest gotowy, kliknij punkt początkowy, aby go zamknąć. Następnie naciśnij T, aby dodać ślad do Menedżera ROI. Wybierz opcję Analizuj, Zmierz lub naciśnij M, aby dodać dane do okna Wyniki.

Skopiuj te dane i wklej je do arkusza danych. Aby zapisać informacje dotyczące obszaru arboryzacji, przejdź do okna Menedżer ROI, wybierz interesujący Cię region i zmień nazwę tak, aby pasowała do nazwy obrazu, naciskając Zmień nazwę. Kliknij prawym przyciskiem myszy obszar zainteresowania o zmienionej nazwie i kliknij Zapisz.

Upewnij się, że nazwa określa, że ślad jest przeznaczony do arboryzacji i zapisz plik. W badaniu tym opisano krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119 oraz analizę gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy. Mikroskopia fluorescencyjna służy do obrazowania wspólnego znakowania mikrogleju za pomocą IBA1 i TMEM119 w odcinku koronalnym grzbietowego hipokampa przy 20-krotnym powiększeniu.

Udane barwienie ujawnia ciała komórek mikrogleju i ich drobne procesy. Barwienie pozwala na określenie gęstości i rozmieszczenia mikrogleju oraz identyfikację klastrów mikrogleju i infiltrujących makrofagów. Mikroskopia konfokalna służy do obrazowania krokowej procedury śledzenia arboryzacji mikrogleju przy 40-krotnym powiększeniu.

Te reprezentatywne wyniki pokazują IBA1-dodatni i TMEM119-dodatni mikroglej, a także przykład śledzenia komórek ciała. Ważne jest, aby być konsekwentnym podczas liczenia komórek i zwracać uwagę zarówno na sygnały IBA1, jak i TMEM119. Technika ta pozwala badaczowi zidentyfikować obszary mózgu, na które wpływa określony bodziec, które można następnie bardziej dogłębnie zbadać za pomocą technik uzupełniających.