Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie reprezentatywnych pod względem składu, wielogatunkowych biofilmu płytki nazębnej. W celu przeprowadzenia analiz równoległych osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie reprezentatywnej pożywki oraz inokulum. Następnie inokulum wprowadza się do chipa mikroprzepływowego; po inkubacji przez noc wewnątrz mikrokanału formuje się biofilm.

Na koniec biofilm jest płukany i barwiony w celu przeprowadzenia obrazowania in situ za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego lub mikroskopii epifluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komory przepływowe, jest to, że jest to system wysokoprzepustowy, który pozwala na równoległe przeprowadzenie wielu eksperymentów przy użyciu mniejszej ilości materiałów i bez konieczności stosowania sztucznych pożywek laboratoryjnych. Aby rozpocząć, należy pobrać próbki śliny od grupy pięciu lub więcej ochotników do oddzielnych plastikowych probówek o pojemności 50 ml.

Przenieś próbki śliny do jednego plastikowego zlewki umieszczonej w lodzie. W tej konfiguracji unikaj stosowania zlewki szklanych, ponieważ biopolimery śliny mają tendencję do przylegania do szklanych powierzchni. Następnie dodaj ditiotreitol do próbki, aż jego stężenie końcowe wyniesie 2,5 mM.

Mieszaninę mieszać przez 10 minut w lodzie. Przenieść całą zawartość do kilku plastikowych probówek. Wirować z wysoką prędkością przez 30 minut w wirówce schłodzonej do 4 °C, aby oddzielić cząstki stałe od próbki.

Przenieś nadsącz śliny do nowego, sterylnego pojemnika i odrzuć frakcję osadu, aby przygotować wolne od bakterii podłoże hodowlane z próbki. Najpierw rozcieńcz próbkę wolną od zanieczyszczeń komórkowych trzykrotną objętością wody dejonizowanej. Następnie użyj membrany filtracyjnej o rozmiarze porów 0,22 µm o niskim wiązaniu białek.

Sterylizować ślinę, utrzymując frakcję po filtracji w niskiej temperaturze na lodzie. Przenieść wysterylizowany roztwór i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Pobrać próbki śliny od grupy pięciu lub więcej ochotników do sterylnych plastikowych probówek o pojemności 50 ml.

Przenieś próbki śliny do plastikowego zlewka lub probówki o pojemności 50 mililitrów, uprzednio wysterylizowanych i utrzymywanych w temperaturze pokojowej. Dodaj sterylną glicerynę, aż do uzyskania mieszaniny składającej się w 25% z gliceryny i w 75% ze śliny.

W przeciwieństwie do protokołu przygotowania pożywki wzrostowej, w którym zanieczyszczenia usuwano za pomocą etapu filtracji, tutaj kluczowe jest zachowanie technik sterylnych, aby zapobiec kontaminacji bakteriami lub grzybami niespecyficznymi dla jamy ustnej. Wymieszaj roztwór śliny z glicerolem. Dokładnie podziel mieszaninę śliny i glicerolu na aalikwoty, a następnie przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia badań.

Przed zaszczepieniem próbek do mikroczipu – zarówno medium o ujemnym wzroście bakterii, jak i inokulum z dodatnimi bakteriami – należy zakupić lub wykonać czip mikroprzepływowy z mikrokanałem podobnym do tych przedstawionych tutaj, pracując na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej. Przed przystąpieniem do głównego eksperymentu należy wymieszać zawartość każdej probówki w wirówce Vortex przez pięć sekund. Rozpocznij od dodania 100 µL medium wzrostowego do zbiornika wylotowego mikroczipu. Używając pompy sterowanej komputerowo, rozpocznij przepływ ścinający medium przez mikrokanał przez dwie minuty.

W temperaturze pokojowej należy przeprowadzić inspekcję wizualną każdego kanału, aby upewnić się, że zostały one prawidłowo wypełnione cieczą. Inkubować mikroczip w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Pozwoli to na pokrycie ścian bocznych mikrokanałów rusztowaniem z biopolimeru, do którego biofilm będzie się przytwierdzal podczas wzrostu.

Następnie ręcznie odessaj pozostałą pożywkę z rezerwuaru wylotowego i przenieś tę frakcję, która będzie teraz pełnić funkcję hydrodynamicznego obciążenia równoważącego, do rezerwuaru wlotowego. Po osadzeniu rusztowania biopolimerowego dodaj 100 µL dodatniego inokulum bakteryjnego do rezerwuaru wylotowego. Umieść mikrochip na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C i rozpocznij odwrotny przepływ z umiarkowanym ścinaniem.

Przepływ z wylotu do zbiornika wlotowego powinien trwać dokładnie sześć sekund. Następnie należy wyłączyć pompę i inkubować chip w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C przez 40 minut, aby umożliwić przywieranie bakterii lub grzybów do ścian bocznych mikrokanału. Następnie za pomocą pipety należy usunąć i zutylizować cały inokulum ze zbiornika wylotowego, a następnie ponownie napełnić ten sam zbiornik, dodając 1 mL wolnego od bakterii pożywki wzrostowej.

Inkubować mikrochip w temperaturze 37 °C przez około 20 godzin w warunkach niskiego przepływu ścinającego, aby umożliwić nocny wzrost biofilmu wewnątrz kanału. Odpipetować wszystkie roztwory z obu zbiorników wlotowego i wylotowego. Nanieść 100 µL PBS do zbiornika wlotowego i płukać mikrokanał przez 20 minut.

Przy niskim ścinaniu w przepływie przednim od wlotu do wylotu biofilm jest gotowy do barwienia żywe/martwe. Bezpośrednio przed barwieniem biofilmu przygotuj 100 µL mieszaniny do barwienia żywotności, zgodnie z protokołem tekstowym, dla każdego kanału przeznaczonego do barwienia. Chronij ten roztwór przed ekspozycją na światło aż do momentu barwienia biofilmu. Odessaj całą pozostałą ciecz z wlotu i ponownie napełnij ten sam zbiornik 100 µL mieszaniny do barwienia żywotności.

Następnie przepuść roztwór barwiący przez mikrokanał przez 45 minut. W warunkach niskiego przepływu ścinającego w temperaturze pokojowej należy pamiętać o ochronie chipa przed ekspozycją na światło. Odessij cały pozostały płyn z rezerwuaru wlotowego i napełnij go ponownie 100 µL PBS.

Płucz mikrokanał przez 20 minut przy niskim przepływie ścinającym w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar niezwiązanych barwników. Obarwiony biofilm jest teraz gotowy do badania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu analizy trójwymiarowej architektury biofilmu. Do wizualizacji ogólnej struktury filmu pod dowolnym kątem ukośnym można wykorzystać rekonstrukcje cyfrowe wykonane za pomocą skanowania poziomego w mikroskopie konfokalnym.

Ponadto, analiza barwienia żywe/martwe może zostać zastosowana do tego samego zestawu danych w celu zbadania zależności przestrzennej żywotności komórek wewnątrz biofilmu w funkcji różnych zabiegów chemicznych. Po wykonaniu obrazowania biofilmu można wyekstrahować komórki z kanałów niebarwionych. Wykorzystując wodę destylowaną w warunkach wysokiego przepływu ścinającego, florę biofilmu można następnie zidentyfikować na podstawie genomicznego DNA za pomocą sekwencjonowania pirosequencing 4 5 4.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak dodanie różnych gatunków lub związków, aby odpowiedzieć na inne pytania, na przykład dotyczące tego, co dzieje się z biofilmami wielogatunkowymi w różnych warunkach.