Name: Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową do tworzenia wielogatunkowych biofilmów jamy ustnej in vitro. System umożliwia analizę architektury i żywotności płytki nazębnej z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Williamowi Nance'owi (University of Michigan) za pomoc w sformułowaniu protokołów wzrostu biofilmu oraz Johnowi Battiscie (Fluxion, San Francisco, CA) za porady dotyczące kwestii technologicznych związanych z systemem Bioflux. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 do A. H. R.) i fundusze startowe Uniwersytetu Michigan dla A. H. R.

Opisany tutaj protokół pobierania śliny został sprawdzony przez University of Michigan Institutional Review Board for Human Subject Research. 
UWAGA: W odniesieniu do instytucjonalnych recenzji tego typu prac z udziałem ludzi, należy uzyskać uprzednie uzgodnienia i pozwolenia od instytucji przyjmującej. W szczególności, w zależności od instytucji, przed przystąpieniem do pobierania śliny od ochotników może być konieczne uzyskanie i zatwierdzenie przez IRB lub zasady etyki. Jako pomoc w przygotowaniu aplikacji, przydatny algorytm/wykres NIH można znaleźć tutaj: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a>
1. Przygotowanie śliny do użycia jako pożywka dla środowiska
<ol>
	<li>Zwerbuj >5 osób do oddania śliny. Nie pobieraj żadnych informacji identyfikacyjnych, upewnij się, że żadna osoba nie odda śliny, jeśli jest chora lub przyjmowała doustne antybiotyki w ciągu ostatnich 3 miesięcy lub spożywała żywność lub płyny, z wyjątkiem wody, w ciągu ostatnich 2 godzin przed oddaniem śliny.</li>
	<li>Zbierz ślinę do plastikowych tubek o pojemności 50 ml. Zebraną ślinę należy zebrać w plastikowej zlewce, trzymając ją na lodzie. Nie używaj szkła, ponieważ polimery w ślinie będą przylegać do wewnętrznych powierzchni szkła.</li>
	<li>Dodaj ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 2,5 mM ze 100-krotnego wyrostu. (Stado zamraża się w podwielokrotnościach jednorazowego użytku w temperaturze –20 °C). Mieszaj przez 10 minut w plastikowej zlewce na lodzie.</li>
	<li>W celu usunięcia cząstek stałych należy odwirować zebraną ślinę przez 30 minut przy 17 500 x g.</li>
	<li>Rozcieńczyć ślinę 3 objętościami dH2O, aby uzyskać jedną czwartą stężonej śliny.</li>
	<li>Filtruj i sterylizuj ślinę za pomocą 0,22 μm polieterosulfonu (PES), filtra o niskiej zawartości białka. Użyj filtra o dużej powierzchni lub użyj kilku filtrów o małym obszarze. Trzymaj ślinę w plastikowym pojemniku na lodzie podczas filtrowania.</li>
	<li>Zamrozić zebraną ślinę w temperaturze –80 °C w plastikowych probówkach o pojemności 50 ml, aż będzie potrzebna do rozwoju bakterii. Każda plastikowa probówka jest przeznaczona tylko do jednorazowego użytku i nie powinna zawierać więcej niż 35 ml, ponieważ każda studzienka mikroprzepływowa mieści maksymalnie 1,2 ml (1,2 ml x 24 studzienki = 28,8 ml), a w każdej probówce potrzebna jest przestrzeń, ponieważ ślina rozszerza się podczas zamrażania.</li>
	<li>Przed użyciem rozmrozić zebraną ślinę w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu ponownie wysterylizować filtr (0,22 μm polieterosulfonu, filtr o niskiej zawartości białka w celu usunięcia wszelkich osadów).</li>
</ol>
2. Przygotowanie zebranej śliny do użycia jako inokulum
<ol>
	<li>Zwerbuj >5 osób do oddania śliny. Nie pobieraj żadnych informacji identyfikujących, upewnij się, że żadna osoba nie odda śliny, jeśli jest chora, przyjmowała doustne antybiotyki w ciągu ostatnich 3 miesięcy lub spożywała żywność lub płyny, z wyjątkiem wody, w ciągu ostatnich 2 godzin przed oddaniem śliny. Próbki należy pobierać w ciągu 30 minut.</li>
	<li>Zebrać ślinę do plastikowych probówek o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej i zebrać zebraną ślinę w plastikowej zlewce o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć zebraną ślinę autoklawowanym odczynnikiem ogólnym glicerolem, aby uzyskać zapas o końcowym stosunku 25% glicerolu, 75% śliny zawierającej komórki [CCS].</li>
	<li>Zamrozić ślinę w temperaturze –80 °C w 3 ml jednorazowych porcji do czasu, aż będzie potrzebna.</li>
	<li>Gdy jest to wymagane do zaszczepienia układu mikroprzepływowego, podwielokrotności są rozmrażane w temperaturze pokojowej i delikatnie mieszane w wirówce przez 5 sekund, zanim zostaną odpipetowane do układu mikroprzepływowego, jak opisano w kroku 3 poniższego protokołu.</li>
</ol>
3. Wzrost biofilmów wielogatunkowych w jamie ustnej
<ol>
	<li>Obróbka wstępna CFS
	<ol>
		<li>Najpierw pokryj kanały mikroprzepływowe Bioflux CFS. Dodaj 100 μl CFS do każdego dołka wylotowego. Za pomocą oprogramowania sterującego Bioflux wybrać "ręczny" i ustawić przepływ z kanałów "B1-B24", które mają być używane.</li>
		<li>Następnie ustaw ścinanie na 1,0 dyn/cm² i rozpocznij przepływ przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zapewnić jednorodny rozkład CFS w całym kanale. Upewnij się, że w każdym kanale wlotowym znajduje się płyn, aby sprawdzić, czy CFS przepływał przez wszystkie kanały równomiernie.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Usuń roztwór CFS/obróbki wstępnej, który pozostał w studzienkach wylotowych i przenieś do studzienek wlotowych. Ta całkowita objętość 100 μl posłuży do zrównoważenia ciśnienia wywieranego na inokulum ze studni wylotowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>szczepienie
	<ol>
		<li>Do każdej studzienki wylotowej dodać 100 μl inokulum CCS. Umieść płytkę mikroprzepływową na płycie grzewczej (temperatura ustawiona na 37 °C), wybierz instrukcję w oprogramowaniu sterującym i ustaw przepływ ze studzienek wylotowych do studzienek wlotowych (tj. odwrotnie) na 1,0 dyn/cm² dokładnie na 6 sekund.</li>
		<li>Inkubować płytkę mikroprzepływową w temperaturze 37 °C przez 40 minut, aby umożliwić początkowe przyleganie i wzrost bakterii w inokulum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzrost z dnia na dzień
	<ol>
		<li>W przypadku zaszczepionych kanałów, które są używane, należy odessać inokulum odpadowe z każdej ze studzienek wylotowych. Dodać do 1 ml całkowitej objętości CFS do każdej ze studzienek wlotowych (można to zrobić na istniejącym CFS).</li>
		<li>Inkubować płytkę mikroprzepływową w temperaturze 37 °C, wybrać tryb ręczny i ustawić program tak, aby działał przy 0,2 dyn/cm² przez 20 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pranie wstępne bejcy
	<ol>
		<li>Odessać cały płyn ze studzienek wlotowych i wylotowych i dodać 100 μl PBS (pH 7,4) do każdej ze studzienek wlotowych. Przepływ przez 20 minut przy 0,2 dyn/cm².</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie mieszanki bejc
	<ol>
		<li>W celu barwienia żywotności komórek należy przygotować 100 μl mieszaniny barwiącej na każdy kanał, który ma być barwiony. W szczególności dodaj 3 μl SYTO 9 i 3 μl jodku propidyny na ml PBS za pomocą komercyjnego zestawu do barwienia żywotności komórek, takiego jak LIVE/DEAD. W ten sposób powstaje mieszanina barwiąca zawierająca 10 μM SYTO 9 i 60 μM jodku propidyny.</li>
		<li>Odessać pozostały PBS ze studzienek wlotowych, a następnie dodać 100 μl mieszaniny barwienia żywotności komórek do każdej studzienki wlotowej. Ustaw przepływ na poziomie 0,2 dyn/cm2 i uruchom roztwór od wlotu do wylotu przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie po barwieniu
	<ol>
		<li>Odessać pozostałą plamę w każdej ze studzienek wlotowych i dodać 100 μl PBS do każdej studzienki wlotowej. Ustaw przepływ na poziomie 0,2 dyn/cm² i uruchom roztwór PBS od wlotu do wylotu na 20 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar plam</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Gromadzenie obrazów, renderowanie 3D i analiza obrazów
<ol>
	<li>Użyj odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM), aby zebrać dane obrazu biofilmu z systemu mikroprzepływowego. Upewnij się, że CLSM jest w stanie wytrzymać ciężar płytki Bioflux, która może osiągnąć 150 g. 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę wymiary kanałów mikroprzepływowych, potrzebę czułości w celu rozpoznania struktury biofilmu oraz wymagania dotyczące wykrywania sygnału fluorescencji o różnym natężeniu, dopasuj CLSM do soczewki obiektywowej 40X 1,25 NA lub o podobnej jakości optycznej, powiększeniu i aperturze numerycznej.</li>
	<li>Standaryzacja bramek wychwytywania emisji z pomiarami wzmocnienia i przesunięcia przy zachowaniu stałego poziomu. Upewnij się, że moc lasera nie przekracza 25%, ponieważ może to spowodować fotowybielanie.</li>
	<li>Konwertuj pliki CLSM z typu LIF (L eica Image File type) na typ pliku OME (Open Microscopy Environment). Pozwala to na łatwiejszy dostęp i kompatybilność między programami. Użyj dostępnego na rynku oprogramowania, takiego jak IMARIS, aby przekonwertować pliki do tego typu.</li>
</ol>
Renderowanie 3D obrazów/figur
<ol start="4">
	<li>Po przekonwertowaniu do formatu OME użyj dostępnego na rynku oprogramowania, takiego jak IMARIS, aby renderować obrazy w 3D. Wykonaj to za pomocą kombinacji opcji "Easy3D" i "Surpass". 
	UWAGA: Należy zwrócić uwagę na sygnał tła i progowanie. Funkcja histogramu w IMARIS może być wykorzystana do uzyskania zakresu kolekcji i powinien być utrzymywany na stałym poziomie między analizowanymi obrazami.</li>
	<li>Zapisz obrazy za pomocą funkcji "migawki" i dokładnie rozważ rozdzielczość obrazu przed zapisaniem typów plików.</li>
	<li>Składaj obrazy w figury za pomocą oprogramowania do edycji obrazów, takiego jak CorelDraw lub Adobe Illustrator.</li>
</ol>
Analiza obrazów 3D dla wykresów i tabel
<ol start="7">
	<li>Do analizy obrazu można korzystać z ogólnodostępnych programów IMAGEJ 23 i COMSTAT/COMSTAT2 38. Pobierz pakiety odpowiednio z http://rsb.info.nih.gov/ij/ i http://comstat.dk/. Na komputerze jest zainstalowana najnowsza aktualizacja oprogramowania Java. 
	UWAGA: Przed użyciem oprogramowania do analizy obrazu należy zainstalować platformę programową JAVA.
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania IMAGEJ z wtyczką COMSTAT2, aby zaimportować pliki OME dla każdego obrazu biofilmu w trybie "hyperstack" i view z "podzielonymi kanałami".</li>
		<li>Indywidualnie przeanalizuj dwa kanały (czerwony/jodek propidy/martwy to kanał 0, zielony/SYTO-9/LIVE to kanał 1) za pomocą funkcji "histogramu" IMAGEJ. Ta funkcja wyświetla łączną liczbę pikseli 8-bitowych plików OME (wyświetlanych jako "liczba") przy każdej intensywności kolorów od 0 do 255 (wyświetlanych jako "wartość"), gdzie 0 to piksele bez sygnału (tło), a 255 to piksele z pełnym nasyceniem sygnału.</li>
		<li>Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i ustandaryzuj wszystkie wartości sygnału, ważąc każdy piksel odpowiednią intensywnością sygnału. Odbywa się to poprzez pomnożenie całkowitej liczby przy danym natężeniu sygnału przez liczbową 8-bitową wartość (0-255) tego natężenia sygnału.</li>
		<li>Zsumuj wszystkie wartości ważone (od 0 do 255) dla obu kanałów dla każdego zarejestrowanego obrazu biofilmu. Weź sumę wartości ważonych dla obu kanałów, aby określić procentowy całkowity sygnał z każdego kanału. Zrób to, aby określić względny stosunek lub procent czerwonego i procentowego zielonego sygnału (tj. procent "MARTWY" i procent "ŻYWY" dla każdego zabiegu).</li>
		<li>Wykonuj analizy statystyczne, na przykład przy użyciu dwustronnego testu Studenta T-shirt zmodyfikowanego pod kątem nierównej wariancji. Wartości p <0,05 są uważane za istotne, a wartości p <0,01 są uważane za wysoce istotne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pobieranie komórek biofilmu do analizy niezależnej od kultury
<ol start="1">
	<li>Usuń całą zużytą i niewykorzystaną ślinę ze studzienek wlotowych i wylotowych. Umyj studzienki trzykrotnie 1 ml sterylnej wody destylowanej.</li>
	<li>Dodać 100 μl sterylnej wody destylowanej do studzienek wlotowych i za pomocą interfejsu sterowania oprogramowania przepuścić sterylną wodę destylowaną do przodu przez kanały z prędkością >8,0 dyn/cm2 (natężenie przepływu >745 μl/h, ścinanie 800 sek-1) przez co najmniej 5 minut. Powtórz w odwrotnym kierunku przez co najmniej 5 minut, a następnie powtórz proces mycia do przodu i do tyłu.</li>
	<li>Sprawdź za pomocą światła lub mikroskopii epifluorescencyjnej (jeśli komórki były barwione/znakowane) w celu dokładnego usunięcia biofilmu (ryc. 2). Zebrać 100 μl zawiesiny komórek i przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy niezależnej od hodowli. Opłacalną analizę składu zbiorowiska można przeprowadzić za pomocą kodowania pirosekwencjonu FLX z kodowaniem znaczników bakteryjnych (bTEFAP) przy użyciu podejścia opisanego w Nance i wsp. 20</li>
</ol>

<ol><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+as+complex+differentiated+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li>
<li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metropolis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+physiology%22%5BJournal%5D)">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li>
<li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+ruin%3A+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms%3A+how+could+antibacterial+therapy+be+effective%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+dental+research%22%5BJournal%5D)">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li>
<li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+physiology%22%5BJournal%5D)">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li>
<li>Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag">http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag</a> (2011).</li>
<li>Smith, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+H+%22Microbial+behavior%2C+%27in+vivo%27+and+%27in+vitro%22">Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro</a>. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).</li>
<li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities%2C+development+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li>
<li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%3A+In+vitro+biofilm+models%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li>
<li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li>
<li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+microbiology%22%5BJournal%5D)">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101(2010).</li>
<li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li>
<li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+periodontology%22%5BJournal%5D)">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li>
<li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+journal%22%5BJournal%5D)">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li>
<li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+dental+research%22%5BJournal%5D)">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li>
<li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li>
<li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+dentistry%22%5BJournal%5D)">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li>
<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li>
<li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li>
<li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science+progress%22%5BJournal%5D)">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li>
<li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li>
<li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li>
<li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinducer+2%3A+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li>
<li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li>
<li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+sequence+typing+at+the+speed+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li>
<li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+diagnostics%3A+molecular+analysis+of+oral+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+hygiene+%3A+JDH+%2F+American+Dental+Hygienists%27+Association%22%5BJournal%5D)">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li>
<li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilms%3A+emerging+concepts+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li>
<li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics%3A+concepts%2C+tools%2C+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li>
<li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li>
<li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews%29%5BTitle%5D)+AND+%22MMBR%22%5BJournal%5D)">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li>
<li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li>
<li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+dentistry+Spec+No+12B-17B%22%5BJournal%5D)">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li>
<li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li>
</ol>

A. H. R. i N.S.J. otrzymały nagrody naukowe z różnych źródeł, takich jak National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) i Society for Applied Microbiology, aby sfinansować badania naukowe w ich laboratorium w ciągu ostatnich pięciu lat. Wszyscy pozostali autorzy: żaden do zadeklarowania.

W tym artykule przedstawiono podstawowe kroki wymagane do skonfigurowania i uruchomienia systemu mikroprzepływowego w sposób umożliwiający rozwój doustnych wielogatunkowych biofilmów pochodzących z zebranej ludzkiej śliny i hodowanych w sterylizowanej filtrem 25% puli ludzkiej śliny. Podano podejścia do charakterystyki biofilmu, ale należy pamiętać, że opisane podejścia są modyfikowalne i można wprowadzić dodatkowe technologie, takie jak np. plamy czy etykiety. Na przykład można sobie wyobrazić użycie znakowanych przeciw...

Biofilmy to architektonicznie skomplikowane społeczności bakterii, które są agregowane na powierzchniach 1. Zbiorowiska te zazwyczaj zawierają wiele gatunków, które oddziałują ze sobą w obrębie biofilmu 2. Biofilmy jamy ustnej, z których najbardziej rzucająca się w oczy jest płytka nazębna, stanowią uporczywy problem u ludzi, a ich niekontrolowany rozwój prowadzi do powstawania zróżnicowanych taksonomicznie zbiorowisk wielogatunkowych 3. Bakterie składowe tych zróżnicowanych społeczności mogą być do 1000 razy bardziej odporne na środki przeciwdrobnoustrojowe niż ich swobodnie pływające (planktonowe) odpowiedniki 4-6. Brak leczenia tych biofilmów jamy ustnej, które mogą powodować próchnicę i choroby przyzębia, spowodował znaczne obciążenie dla zdrowia publicznego: ponad 500 milionów wizyt w gabinecie dentystycznym rocznie w USA i około 108 miliardów dolarów na leczenie lub zapobieganie chorobom przyzębia i próchnicy zębów 7.
"Podczas gdy wielu mikrobiologów opowiada się za badaniem zachowania mikroorganizmów w warunkach naturalnych, niewielu z nich to robi. Dzieje się tak dlatego, że ich morale do pokonywania trudności jest stale osłabiane przez atrakcyjną łatwość pracy z kulturami laboratoryjnymi" (Smith, 8).
Obecnie badania biofilmu jamy ustnej są prowadzone przy użyciu różnych podejść in vivo i in vitro, z których każde ma swoje zalety i wady 9,10. Podejścia in vitro często wykorzystują modelowe systemy biofilmu, które są stosunkowo łatwe do skonfigurowania, ale mogą nie mieć zastosowania klinicznego/rzeczywistego 10,11. Podejścia in vivo zazwyczaj opierają się na systemach modeli zwierzęcych, które mogą odtwarzać pewne aspekty środowiska jamy ustnej człowieka, ale ponownie cierpią z powodu ograniczeń wynikających z różnic w anatomii, fizjologii, mikrobiologii i immunologii między zwierzętami a ludźmi 12,13. Należy zauważyć, że biofilmy w jamie ustnej mogą również powstawać na powierzchniach szkliwa utrzymywanych w stencie w ustach ochotników, ale takie podejście jest obecnie stosunkowo kosztowne i pracochłonne 14,15. Ostatecznie nowatorskie środki lub technologie mające na celu poprawę higieny jamy ustnej są testowane na ludziach w kontrolowanych warunkach badań klinicznych 11. Obecnie często stosowanym sposobem identyfikacji i oceny nowych środków do higieny jamy ustnej jest najpierw przeprowadzenie badań laboratoryjnych w celu rozpoznania potencjalnej skuteczności, a następnie przeprowadzenie badań na zwierzętach i "prób terenowych", które zatrudniają klinicystów w celu oceny sukcesu technologii 9,16,17. Niestety, badania laboratoryjne zwykle opierają się na systemach modelowych, które zajmują dużą powierzchnię, są technologicznie trudne w użyciu i często zawierają uproszczone społeczności jednego lub co najwyżej kilku gatunków, aby uzyskać potencjalne znaczenie w świecie rzeczywistym 10,18. Biorąc pod uwagę, że biofilmy płytki nazębnej zawierają wiele gatunków i tworzą się w złożonym, przepływającym środowisku ślinowym, jest mało prawdopodobne, aby tworzenie biofilmów zawierających jeden lub kilka gatunków w sztucznych pożywkach wygenerowało społeczności, które zachowują się w podobny sposób jak te w rzeczywistym scenariuszu 10,19. Aby sprostać wymaganiom czasowym, kosztowym, szkoleniowym i słabo reprezentatywnemu charakterowi systemów biofilmu w modelu laboratoryjnym w porównaniu z rzeczywistym środowiskiem, opracowaliśmy niedawno wysokowydajny i przyjazny dla środowiska system biofilmu 20 (Rysunek 1). System czerpie korzyści z zastosowania bezkomórkowej puli ludzkiej śliny (CFS) jako pożywki i niepoddanej działaniu substancji puli ludzkiej śliny bakteryjnej zawierającej komórki bakteryjne (CCS) jako inokulum. Wyjątkowość systemu polega na połączeniu technologii mikroprzepływowej, konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego oraz technologii analizy różnorodności bakterii niezależnej od hodowli. W związku z tym system modelowy jest przyjazny dla środowiska (wykorzystuje ślinę jako inokulum do wzrostu wielogatunkowych biofilmów w temperaturze 37 °C w wysterylizowanej przez filtr płynnej ślinie), a biofilmy jamy ustnej zawierają gatunki (w tym Streptococcus, Neisseria, Veillonella i Porphyromonas) w ilościach reprezentatywnych dla tych znalezionych we wczesnej blaszce naddziąsłowej 20.
Biorąc pod uwagę, że ta praca opisuje użycie nowo opracowanego systemu modelowego, należy zwrócić szczególną uwagę na połączenie mikrofluidyki konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) i technologii analizy różnorodności niezależnych od kultur. Połączenie tych technologii przez naszą grupę badawczą było zamierzone i nie tylko zwiększa przepustowość nowo opracowanego systemu modelowego, ale także pozwala na zadawanie pytań, które wcześniej nie były łatwe do rozwiązania za pomocą innych systemów. Po pierwsze, CLSM ma wyraźną przewagę nad tradycyjną mikroskopią, ponieważ pozwala na trójwymiarową analizę biofilmów. Często niedoceniane, jest to niezwykle ważne, ponieważ biofilmy są niejednorodne pod względem składu gatunkowego i pozycji przestrzennej, a także warunków fizjologicznych narzucanych w różnych miejscach przestrzennych w obrębie biofilmu 6,21. W połączeniu z oprogramowaniem do renderowania trójwymiarowego i oprogramowaniem do analizy obrazu, architektura biofilmu, relacje przestrzenne między gatunkami składowymi oraz zakres zabijania przeciwdrobnoustrojowego mogą być analizowane 22-24. Takie zdolności nie są możliwe przy użyciu standardowej mikroskopii światła przechodzącego lub mikroskopii epifluorescencyjnej. Mikrofluidyka zyskała szczególną uwagę w dziedzinie mikrobiologii, ponieważ umożliwia badanie biofilmów w ściśle kontrolowanych warunkach (przepływ, temperatura, pH itp.) i wymaga jedynie niewielkich objętości cieczy 25-27. Dla porównania, wyhodowanie biofilmu jamy ustnej w ludzkiej ślinie w systemie modelu komórek przepływowych (systemie, który jest prawdopodobnie uważany za podstawowy model dla wielu badań nad biofilmem jamy ustnej) przez 20 godzin przy podobnym natężeniu przepływu i ścinaniu, jak w systemie mikroprzepływowym, wymaga co najmniej 200 ml, w przeciwieństwie do 800 μl w urządzeniu mikroprzepływowym 28-31. W ten sposób system biofilmu w modelu mikroprzepływowym umożliwia badanie materiału o ograniczonej ilości w określonych warunkach. Wreszcie, technologia pirosekwencjonowania została zoptymalizowana w ciągu ostatniej dekady tak, aby wymagała jedynie niewielkich ilości materiału do przeprowadzenia analizy zbiorowiska i jest wystarczająco wszechstronna, aby kontrolować głębokość sekwencjonowania w celu uzyskania tożsamości nawet rzadkich gatunków biofilmu. Zastosowanie tej technologii, takiej jak kodowanie pirologiczne FLX z amplikonem bakteryjnym (bTEFAP), pozwoliło na znalezienie odpowiedzi na istotne pytania dotyczące ekologii biofilmów 32,33. Takie pytania powodowały trudności w przeszłości, gdy pirosekwencjonowanie nie było dostępne ze względu na czas i koszty wymagane do stworzenia bibliotek plazmidowych oraz złożone kroki technologiczne i analityczne wymagane do uzyskania danych 33,34. Oczywiście, wielką zaletą podejść niezależnych od hodowli, takich jak pirosekwencjonowanie, jest to, że gatunki bakterii, których nie można hodować oddzielnie w konwencjonalnych pożywkach laboratoryjnych (tj. gatunki żywotne, ale niehodowlane), mogą być hodowane i identyfikowane w systemie modelowym, a ich względna liczebność w społeczności może być określana ilościowo 35,36 . Dla porównania, już w 1963 roku nieżyjący już Sigmund Socransky oszacował, że około 50% bakterii w materiale wyizolowanym ze szczeliny dziąsła w jamie ustnej człowieka nie może być hodowane w warunkach laboratoryjnych 37.
Celem tego artykułu jest opisanie podejścia do tworzenia doustnych wielogatunkowych biofilmów w komercyjnie dostępnym systemie mikroprzepływowym (Bioflux) w: (i) warunkach reprezentatywnych dla ludzkiej jamy ustnej i (ii) o składzie gatunkowym i obfitości porównywalnej do blaszki naddziąsłowej. Ponadto, korzystając zarówno z oprogramowania freeware, jak i komercyjnego, podkreślamy, w jaki sposób podstawowe miary architektury biofilmu można uzyskać na podstawie danych CLSM, koncentrując się na podejściach do ilościowego określania biomasy, chropowatości i żywotności biofilmu (w oparciu o barwienie żywe/martwe). Na koniec opisano etapy wymagane do pobrania materiału biofilmu do analizy różnorodności za pomocą bTEFAP.

<table><tbody><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotriitol (białe kryształy lub proszek/elektroforeza), Fisher BioReagents</td><td>Ultrawirówka Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Sorval&nbsp; (Kompatybilny z SS-34)</td><td>Thermoscientific</td><td>Zależny</td><td></td>od jednostki</tr><tr><td>wirnik Thermo Scientific SS-34&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>28-020</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Typ 1 Odczynnik do wody dejonizowanej</td><td>Thermo&nbsp; Scientific Inc</td><td>23-290-065</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Filtry o szybkim przepływie i filtry butelkowe, membrana PES, sterylne.</td><td>VWR</td><td>73520-986&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>NC0542269</td><td></td></tr><tr><td>System mikroprzepływowy BioFlux</td><td>System Fluxion Bioflux 200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta 24-kanałowa Bioflux</td><td>Fluxion</td><td>910-0004</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ŻYWY/MARTWY (Invitrogen)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Lecia</td><td>SPE lub system</td><td></td>ekwiwalentny</tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Wiele wyborów</td><td>Wiele wyborów</td><td></td>Urządzenia</tr> do <tr><td>pirosekwencjonowania</td><td>Wiele wyborów</td><td>Wiele wyborów</td><td></td></tr><tr><td>Decon SaniHol 70 Roztwór etanolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka ultra niskotemperaturowa -80&nbsp; &deg; C</td><td>Wielokrotny</td><td>wybór Wielokrotny wybór</td><td></td></tr><tr><td>Wskazówki (20, 200 i 1,000&nbsp; &#956; l)</td> <td>Wiele wyborów</td><td>Jednokanałowe</td><td></td></tr><tr><td>pipety o zmiennej objętości (20, 200, 1,000 i #956; l)</td><td>Wiele wyborów</td><td>Wiele wyborów</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Bioflux dedykowane oprogramowanie</td><td>Bioflux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SPE</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSTAT/COMSTAT 2</td><td>Darmowe oprogramowanie (http://www.comstat.dk/)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Istnieje niewiele wysokoprzepustowych systemów in vitro, które ułatwiają rozwój wielogatunkowych biofilmów, które zawierają wiele gatunków powszechnie wykrywanych w biofilmach doustnych in vivo. Co więcej, system, który wykorzystuje naturalną ludzką ślinę jako źródło składników odżywczych, zamiast sztucznych pożywek, jest szczególnie pożądany w celu wspierania ekspresji właściwości specyficznych dla komórek i biofilmu, które naśladują społeczności in vivo. Opisano metodę wytwarzania wielogatunkowych biofilmów jamy ustnej, które są porównywalne pod względem składu gatunkowego do naddziąsłowej płytki nazębnej, w warunkach zbliżonych do jamy ustnej człowieka. W szczególności w tym artykule dotyczącym metod opisano, w jaki sposób można dostosować dostępny na rynku system mikroprzepływowy, aby ułatwić rozwój wielogatunkowych biofilmów jamy ustnej pochodzących i hodowanych w ślinie. Ponadto przedstawiony zostanie opis tego, w jaki sposób system może być wykorzystywany w połączeniu z konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym do generowania rekonstrukcji 3D biofilmu do analiz architektonicznych i żywotności. Biorąc pod uwagę dużą różnorodność mikroorganizmów, które rozwijają się w biofilmach w układzie mikroprzepływowym (w tym Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella i Porphyromonas), przedstawiony zostanie również protokół opisujący, w jaki sposób zbierać komórki biofilmu w celu dalszej subkultury lub ekstrakcji i analizy DNA. Omówione zostaną ograniczenia zarówno systemu biofilmu mikroprzepływowego, jak i obecnych analiz danych zgodnie z aktualnym stanem wiedzy. Ostatecznie przewiduje się, że artykuł ten dostarczy podstawowej techniki, która usprawni badanie biofilmów w jamie ustnej i pomoże w opracowaniu dodatkowych technologii, które można zintegrować z platformą mikroprzepływową.

Renderowanie 3D biofilmu
Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 3. Przydatnym narzędziem w oprogramowaniu IMARIS jest opcja badania każdego przekroju zgromadzonego stosu obrazów biofilmu i łączenia ich w celu stworzenia rekonstrukcji trójwymiarowych. Dodatkowo można dodać sztuczne efekty cieniowania, aby ułatwić wizualną interpretację struktur trójwymiarowych. Wyrenderowane biofilmy można orientować w dowolnym kierunku przy różnych powiększen...

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie reprezentatywnych pod względem składu, wielogatunkowych biofilmu płytki nazębnej. W celu przeprowadzenia analiz równoległych osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie reprezentatywnej pożywki oraz inokulum. Następnie inokulum wprowadza się do chipa mikroprzepływowego; po inkubacji przez noc wewnątrz mikrokanału formuje się biofilm.Na koniec biofilm jest płukany i barwiony w celu przeprowadzenia obrazowania in situ za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego lub mikroskopii epifluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komory przepływowe, jest to, że jest to system wysokoprzepustowy, który pozwala na równoległe przeprowadzenie wielu eksperymentów przy użyciu mniejszej ilości materiałów i bez konieczności stosowania sztucznych pożywek laboratoryjnych. Aby rozpocząć, należy pobrać próbki śliny od grupy pięciu lub więcej ochotników do oddzielnych plastikowych probówek o pojemności 50 ml.Przenieś próbki śliny do jednego plastikowego zlewki umieszczonej w lodzie. W tej konfiguracji unikaj stosowania zlewki szklanych, ponieważ biopolimery śliny mają tendencję do przylegania do szklanych powierzchni. Następnie dodaj ditiotreitol do próbki, aż jego stężenie końcowe wyniesie 2,5 mM.Mieszaninę mieszać przez 10 minut w lodzie. Przenieść całą zawartość do kilku plastikowych probówek. Wirować z wysoką prędkością przez 30 minut w wirówce schłodzonej do 4 °C, aby oddzielić cząstki stałe od próbki.Przenieś nadsącz śliny do nowego, sterylnego pojemnika i odrzuć frakcję osadu, aby przygotować wolne od bakterii podłoże hodowlane z próbki. Najpierw rozcieńcz próbkę wolną od zanieczyszczeń komórkowych trzykrotną objętością wody dejonizowanej. Następnie użyj membrany filtracyjnej o rozmiarze porów 0,22 µm o niskim wiązaniu białek.Sterylizować ślinę, utrzymując frakcję po filtracji w niskiej temperaturze na lodzie. Przenieść wysterylizowany roztwór i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Pobrać próbki śliny od grupy pięciu lub więcej ochotników do sterylnych plastikowych probówek o pojemności 50 ml.Przenieś próbki śliny do plastikowego zlewka lub probówki o pojemności 50 mililitrów, uprzednio wysterylizowanych i utrzymywanych w temperaturze pokojowej. Dodaj sterylną glicerynę, aż do uzyskania mieszaniny składającej się w 25% z gliceryny i w 75% ze śliny.W przeciwieństwie do protokołu przygotowania pożywki wzrostowej, w którym zanieczyszczenia usuwano za pomocą etapu filtracji, tutaj kluczowe jest zachowanie technik sterylnych, aby zapobiec kontaminacji bakteriami lub grzybami niespecyficznymi dla jamy ustnej. Wymieszaj roztwór śliny z glicerolem. Dokładnie podziel mieszaninę śliny i glicerolu na aalikwoty, a następnie przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia badań.Przed zaszczepieniem próbek do mikroczipu – zarówno medium o ujemnym wzroście bakterii, jak i inokulum z dodatnimi bakteriami – należy zakupić lub wykonać czip mikroprzepływowy z mikrokanałem podobnym do tych przedstawionych tutaj, pracując na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej. Przed przystąpieniem do głównego eksperymentu należy wymieszać zawartość każdej probówki w wirówce Vortex przez pięć sekund. Rozpocznij od dodania 100 µL medium wzrostowego do zbiornika wylotowego mikroczipu. Używając pompy sterowanej komputerowo, rozpocznij przepływ ścinający medium przez mikrokanał przez dwie minuty.W temperaturze pokojowej należy przeprowadzić inspekcję wizualną każdego kanału, aby upewnić się, że zostały one prawidłowo wypełnione cieczą. Inkubować mikroczip w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Pozwoli to na pokrycie ścian bocznych mikrokanałów rusztowaniem z biopolimeru, do którego biofilm będzie się przytwierdzal podczas wzrostu.Następnie ręcznie odessaj pozostałą pożywkę z rezerwuaru wylotowego i przenieś tę frakcję, która będzie teraz pełnić funkcję hydrodynamicznego obciążenia równoważącego, do rezerwuaru wlotowego. Po osadzeniu rusztowania biopolimerowego dodaj 100 µL dodatniego inokulum bakteryjnego do rezerwuaru wylotowego. Umieść mikrochip na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C i rozpocznij odwrotny przepływ z umiarkowanym ścinaniem.Przepływ z wylotu do zbiornika wlotowego powinien trwać dokładnie sześć sekund. Następnie należy wyłączyć pompę i inkubować chip w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C przez 40 minut, aby umożliwić przywieranie bakterii lub grzybów do ścian bocznych mikrokanału. Następnie za pomocą pipety należy usunąć i zutylizować cały inokulum ze zbiornika wylotowego, a następnie ponownie napełnić ten sam zbiornik, dodając 1 mL wolnego od bakterii pożywki wzrostowej.Inkubować mikrochip w temperaturze 37 °C przez około 20 godzin w warunkach niskiego przepływu ścinającego, aby umożliwić nocny wzrost biofilmu wewnątrz kanału. Odpipetować wszystkie roztwory z obu zbiorników wlotowego i wylotowego. Nanieść 100 µL PBS do zbiornika wlotowego i płukać mikrokanał przez 20 minut.Przy niskim ścinaniu w przepływie przednim od wlotu do wylotu biofilm jest gotowy do barwienia żywe/martwe. Bezpośrednio przed barwieniem biofilmu przygotuj 100 µL mieszaniny do barwienia żywotności, zgodnie z protokołem tekstowym, dla każdego kanału przeznaczonego do barwienia. Chronij ten roztwór przed ekspozycją na światło aż do momentu barwienia biofilmu. Odessaj całą pozostałą ciecz z wlotu i ponownie napełnij ten sam zbiornik 100 µL mieszaniny do barwienia żywotności.Następnie przepuść roztwór barwiący przez mikrokanał przez 45 minut. W warunkach niskiego przepływu ścinającego w temperaturze pokojowej należy pamiętać o ochronie chipa przed ekspozycją na światło. Odessij cały pozostały płyn z rezerwuaru wlotowego i napełnij go ponownie 100 µL PBS.Płucz mikrokanał przez 20 minut przy niskim przepływie ścinającym w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar niezwiązanych barwników. Obarwiony biofilm jest teraz gotowy do badania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu analizy trójwymiarowej architektury biofilmu. Do wizualizacji ogólnej struktury filmu pod dowolnym kątem ukośnym można wykorzystać rekonstrukcje cyfrowe wykonane za pomocą skanowania poziomego w mikroskopie konfokalnym.Ponadto, analiza barwienia żywe/martwe może zostać zastosowana do tego samego zestawu danych w celu zbadania zależności przestrzennej żywotności komórek wewnątrz biofilmu w funkcji różnych zabiegów chemicznych. Po wykonaniu obrazowania biofilmu można wyekstrahować komórki z kanałów niebarwionych. Wykorzystując wodę destylowaną w warunkach wysokiego przepływu ścinającego, florę biofilmu można następnie zidentyfikować na podstawie genomicznego DNA za pomocą sekwencjonowania pirosequencing 4 5 4.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak dodanie różnych gatunków lub związków, aby odpowiedzieć na inne pytania, na przykład dotyczące tego, co dzieje się z biofilmami wielogatunkowymi w różnych warunkach.

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zastosowanie in vitro mikrofluidycznego systemu przepływowego o dużej wydajności w celu opracowania biofilmów wielogatunkowych jamy ustnej

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

Omawiane są protokoły badania tworzenia się biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z szeregu mikrofilarów i badane jest tworzenie biofilmu przez Pseudomonas fluorescens w tym urządzeniu.

Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

Obecny protokół opisuje zastosowanie organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy nabłonek jamy ustnej narażony na działanie mikroorganizmów związanych z biofilmami (płytką nazębną) w kontekście zdrowia jamy ustnej w porównaniu z chorobą.

Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Poznaj metodę mikroprzepływową do tworzenia wielogatunkowych biofilmów jamy ustnej in vitro. System umożliwia analizę architektury i żywotności płytki nazębnej z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Przeglądaj więcej filmów