Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej
December 1st, 2014
Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.
Ogólnym celem tego zabiegu jest stworzenie reprezentatywnych kompozycyjnie, wielogatunkowych biofilmów płytki nazębnej. Równolegle do analizy osiąga się to poprzez stworzenie najpierw reprezentatywnej pożywki i inokulum. Po całonocnej inkubacji inokulum jest następnie wprowadzane do chipa mikroprzepływowego, wewnątrz mikrokanału tworzy się biofilm.
Na koniec biofilm jest myty i barwiony do dwóch konfokalnych laserowych mikroskopii skaningowych in situ lub mikroskopii fluorescencyjnej epi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komórki przepływowe, jest to, że jest to system o wysokiej przepustowości, który pozwala na równoległe przeprowadzanie wielu eksperymentów przy użyciu mniejszej ilości materiałów i nie wymaga sztucznych pożywek laboratoryjnych. Aby rozpocząć, zbierz próbki śliny od kohorty pięciu lub więcej ochotników w pojedynczych 50-mililitrowych plastikowych probówkach.
Pobrać próbki śliny do jednej plastikowej zlewki umieszczonej na lodzie. Unikaj używania szklanych zlewek w tej konfiguracji, ponieważ biopolimery śliny mają tendencję do przylegania do szklanych powierzchni. Następnie dodaj trzy otwory do próbki, aż jego końcowe stężenie wyniesie 2,5 milimola.
Mieszaj mieszaninę przez 10 minut na lodzie. Wciągnij całą zawartość do kilku plastikowych rurek. Wirować z dużą prędkością przez 30 minut w wirówce chłodzonej o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oddzielić cząstki stałe od próbki.
Przenieść ślinę do świeżego, sterylnego pojemnika i wyrzucić frakcję osadów, aby przygotować z próbki pożywkę wolną od bakterii. Najpierw rozcieńczyć jednodniową próbkę wolną od zanieczyszczeń trzema objętościami wody dejonizowanej. Następnie za pomocą 0,22 mikrofiltra membranowego o niskim poziomie wiązania białka.
Wysterylizuj ślinę, utrzymując frakcję po przefiltrowaniu schłodzoną na lodzie. Elokwentnie wysterylizowany roztwór i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny. Zbierz próbki śliny od kohorty pięciu lub więcej ochotników w sterylnych 50-mililitrowych plastikowych probówkach.
Przeciągnij próbki śliny do wstępnie wysterylizowanej plastikowej zlewki o temperaturze pokojowej lub 50-mililitrowej probówki. Dodaj wysterylizowany glicerol do uzyskania 25% glicerolu. Osiąga się 75% mieszaniny śliny.
W przeciwieństwie do protokołu pożywki wzrostowej, w którym zanieczyszczenia były usuwane na etapie filtracji, sterylna technika jest tutaj ważna, aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteriami lub grzybami, które nie są specyficzne dla jamy ustnej. Wymieszać roztwór glicerolu w ślinie. Dobrze podsycić mieszaninę śliny i glicerolu i przechowywać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do rozpoczęcia.
Kup lub wyprodukuj chip mikroprzepływowy z mikrokanalikiem podobnym do tych pokazanych tutaj przed zaszczepieniem próbek do mikroczipa zarówno dla pożywki o ujemnym wzroście bakterii, jak i inokulum bakterii dodatnich na stole w temperaturze pokojowej. Wiruj każdą probówkę przez pięć sekund, aby wymieszać przed przystąpieniem do głównego eksperymentu, zacznij od dodania 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej w zbiorniku wylotowym mikroczipów. Za pomocą komputerowej pompy sterującej rozpocznij przepływ medium przez mikrokanał przez dwie minuty.
W temperaturze pokojowej sprawdź wzrokowo każdy kanał, aby zapewnić prawidłowe napełnienie płynem. Inkubować mikroczip w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Spowoduje to pokrycie ścian bocznych mikrokanalików rusztowaniem biopolimerowym, do którego biofilm zakotwiczy się podczas wzrostu.
Następnie ręcznie zassać lub pozostałe media ze zbiornika wylotowego i przenieść tę frakcję, która będzie teraz działać jako hydrodynamiczne obciążenie równoważące do zbiornika wlotowego. Po osadzeniu rusztowania biopolimerowego dodać 100 mikrolitrów inokulum bakteriododatniego do zbiornika wylotowego. Umieść mikroczip na płycie grzejnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozpocznij przepływ wsteczny średniego ścinania.
Podróż od wylotu do zbiornika wlotowego przez dokładnie sześć sekund. Następnie wyłącz pompę i inkubuj chip w warunkach statycznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby ułatwić przyczepienie się bakterii lub grzybów do bocznych ścianek mikrokanałów. Następnie wyjmij i wyrzuć całe inokulum ze zbiornika wylotowego za pomocą pipety i ponownie napełnij ten sam zbiornik, dodając jeden mililitr pożywki wzrostowej wolnej od bakterii.
Inkubuj mikroczip w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 20 godzin przy niskim przepływie, aby pobudzić wzrost biofilmu wewnątrzkanałowego po nocnym wzroście. Odpipetować wszystkie roztwory zarówno ze zbiornika wlotowego, jak i wylotowego. Nałóż 100 mikrolitrów PBS na zbiornik wlotowy i myj mikrokanał przez 20 minut.
Przy niskim przepływie do przodu od wlotu do wylotu, biofilm jest teraz gotowy do barwienia żywymi martwymi. Tuż przed barwieniem biofilmu należy przygotować 100 mikrolitrów mieszanki barwiącej żywotność, zgodnie z protokołem tekstowym dla każdego kanału, który ma być zabarwiony. Chronić ten roztwór przed ekspozycją na światło, dopóki nie będzie to konieczne do zabarwienia biofilmu, odessania całej pozostałej cieczy z wlotu i ponownego napełnienia tego samego zbiornika 100 mikrolitrami mieszanki barwiącej żywotność.
Następnie przepychaj roztwór barwiący przez mikrokanalik przez 45 minut. Przy niskim przepływie lemiesza w temperaturze pokojowej należy chronić chip przed działaniem światła. Odessać całą pozostałą ciecz ze zbiornika wlotowego i ponownie napełnić 100 mikrolitrami PBS.
Myj mikrokanaliki przez 20 minut przy niskim przepływie lemiesza w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar niezwiązanych barwników. Barwiony biofilm jest teraz gotowy do mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania trójwymiarowej architektury biofilmów. Rekonstrukcje cyfrowe za pomocą skanów poziomych za pomocą mikroskopu konfokalnego mogą być wykorzystywane do oglądania całej struktury filmu pod dowolnym kątem.
Co więcej, analizę barwienia żywymi trupami można zastosować do tego samego zestawu danych w celu zbadania przestrzennej zależności żywotności komórek wewnątrz biofilmu w funkcji różnych zabiegów chemicznych. Po zobrazowaniu biofilmu można pobrać komórki z niewybarwionych kanałów. Używając wody destylowanej działającej przy wysokim przepływie ścinającym, flora biofilmu może być następnie zidentyfikowana na podstawie genomowego DNA za pomocą sekwencjonowania pirologicznego 4 5 4
.Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak dodawanie różnych gatunków lub związków, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na różne pytania, takie jak to, co dzieje się z wielogatunkowymi biofilmami w różnych warunkach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy dokument opisuje mikrofluidyczny system zaprojektowany do rozwoju wiegogatunkowych biofilmów, które naśladują ludzką płytkę nazębną ponaddziąsłową. Badanie koncentruje się na technikach analizy architektury biofilmu, jego żywotności oraz pozyskiwaniu próbek do dalszych analiz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Badania nad biofilmami
- Mikrobiologia stomatologiczna
Tło
- Biofilmy są złożonymi społecznościami mikroorganizmów.
- Ludzka płytka nazębna jest częstym przykładem biofilmu.
- Zrozumienie formowania się biofilmów jest kluczowe dla zdrowia jamy ustnej.
- Obecne metody badania biofilmów mają ograniczenia.
Cel badania
- Stworzyć reprezentatywne wiegogatunkowe biofilmy płytki nazębnej.
- Opracować wysokowydajny system do analizy biofilmów.
- Poprawić metody badania żywotności i architektury biofilmów.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek śliny od wolontariuszy.
- Przygotowanie reprezentatywnego pożywki i inokulum.
- Wprowadzenie inokulum do mikroczipa mikrofluidycznego.
- Barwienie i obrazowanie biofilmów przy użyciu technik mikroskopowych.
Główne wyniki
- Udana formacja biofilmów w mikrokanałach.
- Zdolność do przeprowadzania wielu eksperymentów dzięki wysokiej wydajności.
- Zmniejszone zużycie materiałów w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- In situ obrazowanie dostarcza informacji na temat struktury biofilmu.
Wnioski
- System mikrofluidyczny jest efektywnym narzędziem do badań nad biofilmami.
- Ta metoda poprawia zrozumienie biofilmów płytki nazębnej.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać to podejście w różnych zastosowaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic systems for multi-species oral biofilm development enable pharmaceutical R&D teams to model complex, disease-relevant microbial communities under physiologically relevant conditions. This approach supports predictive confidence in early-stage anti-biofilm compound screening and informs target validation for oral health therapeutics. The system's scalability and use of natural human saliva enhance translational continuity from discovery to preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community dynamics and therapeutic hypothesis testing in a controlled, human-relevant environment.
- Supports biological de-risking by modeling in vivo-like biofilm complexity for functional target validation.
- Facilitates predictive confidence in identifying anti-biofilm targets and mechanisms relevant to oral disease.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multi-species biofilm systems for robust compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs through confocal imaging and viability assays.
- Enables high-throughput, parallel experimentation with reduced material requirements and increased assay scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant oral microbiota for translational biomarker studies.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting genomic and architectural analyses.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical candidate selection for oral health interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic biofilm system integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification and mechanistic de-risking for oral therapeutics.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by modeling native oral biofilm communities.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible biofilm systems with quantitative imaging and viability readouts.
- Analytics: Provides 3D architectural and viability data to compare compound effects across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease relevance through use of pooled human saliva and multi-species communities.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse oral biofilm research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation for anti-biofilm strategies.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and enables high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in oral health portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oral biofilm-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, oral microbiology, and advanced imaging techniques.
- Needs access to confocal microscopy and genomic analysis infrastructure for comprehensive outputs.
- Demands rigorous cross-team standardization for saliva collection, biofilm growth, and data analysis.
- Adaptation across different microbial communities or disease models may require protocol optimization.
- Limitations include current throughput of imaging and the complexity of multi-species data interpretation.
