Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Ta analiza transkryptomiczna tkanek ludzkiego raka prostaty identyfikuje indywidualne endogenne loci ekspresji retrowirusa człowieka w celu oceny niestandardowej mikromacierzy o dużej gęstości jako narzędzia przesiewowego do odkrywania biomarkerów. Po usunięciu przez chirurga narządu prostaty od pacjenta, patolog przygotowuje oddzielnie tkanki nowotworowe i sąsiednie normalne tkanki w laboratorium, ekstrahuje, oczyszcza i kwalifikuje MR. NA z tkanek prawidłowych i nowotworowych amplifikuje mRNA za pomocą całego zestawu owacji transkryptomu, a następnie rozszczepia i znakuje powstałe amplifikowane produkty. Następnie sekwencyjnie przetwarzaj dwumacierz H-E-R-V-V poprzez napełnianie, hybrydyzację, mycie i skanowanie.

Ostatecznie, korzystając z metod biokomputerowych, można śledzić zestawy sond wykazujące znaczny sygnał i ekspresję różnicową, co prowadzi do identyfikacji aktywnych transkrypcyjnie poszczególnych loci. Wiele lat temu badaliśmy zachowanie rodziny IRV W w różnych kontekstach, w tym w próbkach stwardnienia rozsianego. Łożysko jądra.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy zaczęliśmy rozumieć, że wyrażają się nakładające się lub nienakładające się na siebie podgrupy elementów IRV w rodzinie. W zależności od kontekstu. Wykorzystanie technologii okrętowej pozwala na skoordynowaną eksplorację kilku jej rodzin i jednoczesną analizę różnych regionów dla każdego miejsca.

Na przykład domena US three i UF dla LTR, która może wspierać bezpośrednią rolę w patologii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak diagnostyka raka prostaty, w którym istniejące biomarkery białkowe, takie jak PSA, nie są swoiste i czułe. Tymczasem niekodujące RNA, takie jak PCA 3, wydają się bardziej obiecujące, Demonstracja procedury postępowania z prostatą sprzeda Michelowi technika z wydziału patologii.

Philippe Per zademonstruje ekstrakcję RNA, przygotowanie i analizę, a technik z laboratorium John Unit zademonstruje procedurę statku. Zamontuj zamrożoną tkankę pionowo na małym kopcu OCT przy kriostacie. Weź pojedynczy wycinek o grubości pięciu mikronów, wybarwić go Blu udine, a następnie wykonaj szybkie badanie histologiczne, aby zbadać charakter tkanki nowotworowej.

Oszacuj ilość komórek turalnych i wybierz tylko rdzenie z więcej niż 80% komórek nowotworowych. Wytnij kolejny odcinek o grubości pięciu mikronów i zabejcuj hematyną, eoiną i szafranem. Teraz wytnij 15 odcinków o grubości 30 mikronów i przenieś je do probówki z orphem bez RNA.

Następnie weź ostatni pięciomikronowy odcinek do barwienia hematyną, eoiną i szafranem, aby kontrolować ilość komórek nowotworowych. Pod koniec procedury próbki na suchym lodzie należy przenieść do laboratorium biologii molekularnej. Homogenizować tkankę w roztworze Triol na lodzie, używając ręcznego młynka, aż do całkowitego rozpuszczenia tkanki.

Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 300 mikrolitrów chloroformu i wiruj przez 15 sekund. Po dwóch minutach w temperaturze pokojowej wirować w temperaturze 12 000 G przez 15 minut w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.

W przypadku RNA ostrożnie przenieś górną fazę wodną do nowej probówki. Dodaj 750 mikrolitrów izopropanolu, wymieszaj przez odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwirować próbki, aby osadzać wytrącone RNA, przemyć granulkę RNA jednym mililitrem 80% etanolu.

Następnie odwirować próbki o sile 7,500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant za pomocą końcówek P 1000 i P 10. Pozostaw pozostały etanol do wyschnięcia na powietrzu.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od RNA. Przenieś próbki do bloku grzewczego o temperaturze 70 stopni Celsjusza. Aby rozpuścić osad, sprawdź jakość RNA i integralność RNA za pomocą bioanalizatora i NanoDrop zgodnie z instrukcjami producenta.

W idealnej ekstrakcji RNA liczba integralności RNA wynosi zwykle siedem lub więcej. Kontynuuj z całą owacją transkryptomu, zestawem do amplifikacji RNA zgodnie z instrukcjami dostawcy. Następnie oczyść powstały jednoniciowy produkt CD NA.

Sprawdź wydajność i rozkład wielkości jednoniciowego CDNA za pomocą bioanalizatora i NanoDrop zgodnie z instrukcjami producenta. Rozkład wielkości wzmocnionej CD NA powinien zazwyczaj wynosić od 101 do 500 zasad długości ze szczytem około 600 zasad i mieć ogólny rozkład w kształcie dzwonu. Następnie rozdrobnić CDNA, dodaj 6,6 mikrolitra mieszanki fragmentacyjnej do dwóch mikrogramów CD NA w 30 mikrolitrach wirowania i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie dezaktywuj DNA w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut i trzymaj na lodzie. Porcjować jeden mikrolitr rozdrobnionego CDNA do weryfikacji rozkładu wielkości na podstawie Agilent. Jeden zabieg DNA homogenizuje rozkład wielkości CD NA do około 100 nukleotydów przed hybrydyzacją.

Sprawdź rozkład wielkości jednoniciowej płyty CD NA za pomocą wstępnie zwilżonego bioanalizatora firmy Pfizer. Chip genu HERV z 200 mikrolitrami wstępnej hybrydyzacji. Mieszaj i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza, 60 obr./min przez 10 minut.

Dodaj 131 mikrolitrów mieszanki hybrydyzacyjnej do 69 mikrolitrów rozdrobnionej i oznakowanej płyty CD NA w temperaturze pokojowej i w naturze przez dwie minuty w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez pięć minut i wirować z maksymalną prędkością przez pięć minut. Teraz opróżnij wstępnie zwilżony chip genu HERV i załaduj preparat docelowy o pojemności 200 mikrolitrów.

Zastosuj twarde miejsca na dwóch hybrydyzacjach SEPTA w temperaturze 50 stopni Celsjusza, 60 obr./min przez 18 godzin. Opróżnij chip genu HERV i napełnij sondę. Umieść w tablicy 250 mikrolitrów buforu do mycia, umieść 600 mikrolitrów mieszaniny roztworu SAPE i 600 mikrolitrów mieszaniny roztworu przeciwciała w pozycjach numer jeden i numer dwa, umieść 800 mikrolitrów buforu do przechowywania macierzy w pozycji.

Po trzecie, wciśnij igły. Przypisz odpowiedni układ scalony do każdego modułu. Wybierz protokół FS 4 5 0 0 0 4 i uruchom każdy moduł zgodnie z instrukcjami oprogramowania.

Nałóż twarde miejsca na SEPTA, aby zapobiec przeciekaniu. Następnie załaduj chip do automatycznego podajnika lub alternatywnie bezpośrednio do skanera. Rozpocznij skanowanie.

Po zeskanowaniu chip dot pliki CEL są generowane, sprawdź obraz i wyrównaj siatkę do miejsca, aby zidentyfikować komórki sondy. Poddaj również chipy kilku pomiarom kontroli jakości. Teraz znormalizuj chipy i zastosuj hierarchiczne podejście do grupowania w celu zbadania zestawu danych po normalizacji, przeprowadzono istotną analizę w celu wyszukania genów o zróżnicowanej ekspresji z procedury mikromacierzy, a następnie nastąpiła korekta wskaźnika fałszywego wykrywania na pięciu próbkach RNA guza z pasującą parą i normalną prostatą.

Doprowadziło to do zidentyfikowania 207 zestawów sond HERV z różnicowymi wartościami wyrażenia. Dalsza analiza 35 dodatkowych próbek par dopasowań z innych tkanek nowotworowych zidentyfikowała 44 zestawy sond HERV specyficzne dla prostaty. Oto 10 najistotniejszych struktur HERV.

Wreszcie, analizę funkcjonalną można przeprowadzić w dedykowanym interfejsie składającym się z adnotowanych sekwencji będących przedmiotem zainteresowania, zilustrowanych jednym elementem H-E-R-V-W wybranym z 10 najlepszych zidentyfikowanych struktur prowirusowych oznaczonych na górze za pomocą dedykowanych specyficznych sond obecnych na dwóch matrycach H-E-R-V-V i oznaczonych funkcjonalnymi regionami retrowirusowymi LTR gag POLE N, a także z naciskiem na pięć głównych subdomen LTRU trzy i U pięć, oraz późniejsze projektowanie starterów PCR do walidacji RT PCR. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opanować krytyczne etapy związane z przygotowaniem próbki i celu, które są warunkami wstępnymi jakości, aby odnieść sukces w użyciu mikropromieniowania dla Ziemi, a także w konwencjonalnym odkrywaniu biomarkerów. Zaprojektowaliśmy mikromacierz o wysokiej gęstości w formacie ametri, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci, aby lepiej zrozumieć, czy mogą one być aktywne, jeśli sucha transkrypcja NA w obszarze non-con lub moduluje ekspresję genu kodującego.

Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się chorobami przewlekłymi i zakaźnymi, ponieważ systematyczna identyfikacja aktywnych wokali może ujednolicić hipotezy genetyczne, wirusowe i środowiskowe jako czynniki wyzwalające różne patologie. Praca z ograniczoną liczbą próbek w eksperymencie technicznym potwierdzającym słuszność koncepcji może być trudna do pomyślnego odkrycia, podjęcia środków ostrożności przez biomarkery, takich jak przestrzeganie statystycznie zweryfikowanego przepływu pracy, w tym solidności metody i reprezentatywnego próbkowania docelowej populacji pacjentów.