Name: Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-02T17:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji ekspresji loci HERV w raku prostaty przy użyciu niestandardowej mikromacierzy. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych biomarkerów diagnostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard i Bertrandowi Bonnaudowi za ich wkład w początkowy rozwój i optymalizację protokołu HERV-V2. Pragniemy również podziękować Haderowi Haidousowi za jego wskazówki dotyczące kwestii etycznych.

<ol><li>Artibani, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landmarks+in+prostate+cancer+diagnosis%3A+the+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers.</a> BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).</li>
<li>Girometti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+predictive+value+for+cancer+in+patients+with+%22gray-zone%22+PSA+level+and+prior+negative+biopsy%3A+preliminary+results+with+multiparametric+3.0+Tesla+MR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).</li>
<li>You, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+modeled+PSA+clearance+on+biochemical+relapse+free+survival+after+radical+prostatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy.</a> Prostate. 69, 1325-1333 (2009).</li>
<li>Vickers, A. J., Brewster, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSA+Velocity+and+Doubling+Time+in+Diagnosis+and+Prognosis+of+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22+Br.+J.+Med.+Surg.+Urol%22%5BJournal%5D)">PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer.</a> Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).</li>
<li>Bussemakers, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DD3%3A+a+new+prostate-specific+gene%2C+highly+overexpressed+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer.</a> Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).</li>
<li>Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+prostate+cancer+3+test%3A+toward+the+age+of+reason%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason.</a> Urology. 75, 447-453 (2010).</li>
<li>Buscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+endogenous+retrovirus-K+transmembrane+envelope%2C+Rec+and+Np9+proteins+in+melanomas+and+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines.</a> Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).</li>
<li>Ishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+HERV-K+gag+antigen+in+prostate+cancer+by+SEREX+using+autologous+patient+serum+and+its+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity.</a> Cancer Immun. 8, 15(2008).</li>
<li>Sauter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endogenous+retrovirus+K10%3A+expression+of+Gag+protein+and+detection+of+antibodies+in+patients+with+seminomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas.</a> J. Virol. 69, 414-421 (1995).</li>
<li>Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aP%C3%A9rot%2C+P+%22Viruses%3A+Essential+Agents+of+Life%22">Viruses: Essential Agents of Life</a>. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).</li>
<li>Stamey, T. A., Kabalin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+specific+antigen+in+the+diagnosis+and+treatment+of+adenocarcinoma+of+the+prostate.+I.+Untreated+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Untreated+patients.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients.</a> Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).</li>
<li>Catalona, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+prostate-specific+antigen+in+serum+as+a+screening+test+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer.</a> New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).</li>
<li>Schroder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+around+the+world.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer around the world. An overview.</a> Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).</li>
<li>Klotz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+surveillance+for+favorable-risk+prostate+cancer%3A+background%2C+patient+selection%2C+triggers+for+intervention%2C+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Urol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes.</a> Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).</li>
<li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration%2C+normalization%2C+and+summaries+of+high+density+oligonucleotide+array+probe+level+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data.</a> Biostatistics. 4, 249-264 (2003).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Storey, J. D., Tibshirani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+significance+for+genomewide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Statistical significance for genomewide studies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).</li>
<li>Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li>
<li>Gentleman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconductor%3A+open+software+development+for+computational+biology+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics.</a> Genome Biol. 5, R80(2004).</li>
<li>de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+human+genes+of+retroviral+origin%3A+identification+and+transcriptome+of+the+genes+with+coding+capacity+for+complete+envelope+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins.</a> J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).</li>
<li>Wang-Johanning, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+expression+of+human+endogenous+retrovirus+E+envelope+transcripts+in+human+prostate+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma.</a> Cancer. 98, 187-197 (2003).</li>
<li>Smallwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+the+expression+of+syncytin+%28HERV-W%29%2C+maternally+imprinted+PEG10%2C+and+SGCE+in+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta.</a> Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).</li>
<li>Okahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analyses+of+human+endogenous+retroviruses+%28HERVs%29%3A+tissue-specific+and+developmental+stage-dependent+expression+of+HERVs%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs.</a> Genomics. 84, 982-990 (2004).</li>
<li>Buscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+endogenous+retrovirus+K+in+melanomas+and+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines.</a> Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).</li>
<li>Forsman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+broadly+targeted+human+endogenous+gammaretroviral+pol-based+real+time+PCRs+Quantitation+of+RNA+expression+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues.</a> J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).</li>
<li>Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+real-time+PCRs+for+detection+and+quantitation+of+human+MMTV-like+%28HML%29+sequences+HML+expression+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues.</a> J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).</li>
<li>Seifarth, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+human+endogenous+retrovirus+transcriptional+activity+in+human+tissues+with+a+retrovirus-specific+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray.</a> J. Virol. 79, 341-352 (2005).</li>
<li>Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+multiplex+degenerate+PCR+for+human+endogenous+retrovirus+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling.</a> Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).</li>
<li>Flockerzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+analysis+of+transcribed+HERV+sequences+is+complicated+by+ex+vivo+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination.</a> Retrovirology. 4, 39(2007).</li>
<li>Flockerzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+transcribed+human+endogenous+retrovirus+HERV-K%28HML-2%29+loci+in+human+tissues+and+the+need+for+a+HERV+Transcriptome+Project%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project.</a> BMC Genomics. 9, 354(2008).</li>
<li>Gosenca, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HERV-E-Mediated+Modulation+of+PLA2G4A+Transcription+in+Urothelial+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma.</a> PLoS ONE. 7, e49341(2012).</li>
<li>Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GREM%2C+a+technique+for+genome-wide+isolation+and+quantitative+analysis+of+promoter+active+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats.</a> Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).</li>
<li>Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+50%25+of+human-specific+HERV-K+%28HML-2%29+long+terminal+repeats+serve+in+vivo+as+active+promoters+for+host+nonrepetitive+DNA+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription.</a> J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).</li>
<li>Gimenez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+human+endogenous+retroviruses+dedicated+microarray+identifies+self-induced+HERV-W+family+elements+reactivated+in+testicular+cancer+upon+methylation+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).</li>
<li>Pérot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+sketches+of+the+HERV+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape.</a> PLoS ONE. 7, e40194(2012).</li>
<li>Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+configuration+to+quantify+expression+levels+and+relative+abundance+of+splice+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants.</a> Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).</li>
<li>Prensner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+across+a+prostate+cancer+cohort+identifies+PCAT-1%2C+an+unannotated+lincRNA+implicated+in+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression.</a> Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).</li>
<li>Tomlins, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+chromosomal+rearrangements+create+oncogenic+ETS+gene+fusions+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer.</a> Nature. 448, 595-599 (2007).</li>
<li>Hermans, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+ETV1%2C+fused+to+novel+tissue-specific+genes%2C+and+full-length+ETV1+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).</li>
<li>Brodziak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+endogenous+retroviruses+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Monit%22%5BJournal%5D)">The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases.</a> Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).</li>
<li>Mullins, C. S., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endogenous+retroviruses+and+cancer%3A+Causality+and+therapeutic+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities.</a> World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).</li>
<li>Young, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+endogenous+retroviruses+in+antibody-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice.</a> Nature. 491, 774-778 (2012).</li>
<li>Vander Kuyl, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+and+HERV+expression%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV infection and HERV expression: a review.</a> Retrovirology. 9, 6(2012).</li>
<li>Smit, A. F. A., Hubley, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmit%2C+AFA+%22RepeatMasker+Open-3.0%22">RepeatMasker Open-3.0</a>. , (1996).</li>
<li>Navarro, G., Raffinot, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNavarro%2C+G+%22Flexible+Pattern+Matching+in+Strings%3A+Practical+On-Line+Search+Algorithms+for+Texts+and+Biological+Sequences%22">Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences</a>. , Cambridge University Press. (2002).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez bioMérieux SA, Hospices Civils de Lyon oraz francuską agencję publiczną OSEO (Advanced Diagnostics for New Therapeutic Approaches, finansowany przez rząd francuski program poświęcony medycynie spersonalizowanej). PP, VC, GO, NM i FM są pracownikami bioMérieux SA. PP, NM i FM złożyły wnioski patentowe obejmujące wyniki tego artykułu.

W ciągu ostatnich 10 lat większość prób pomiaru ekspresji HERV wykorzystywała techniki RT-PCR w celu skupienia się na konkretnym locus20-24 lub w oparciu o względną konserwację genów pol w celu oceny ogólnych trendów w obrębie rodzajów HERV25,26. Dodatkowo, amplifikacje PCR przy użyciu wysoce zdegenerowanych starterów w połączeniu z mikromacierzami o niskiej gęstości przeznaczone do wykrywania i ilościowego określania ekspresji rodzin HERV27,28. Aby prześledzić ekspresję poszczególnych locus w rodzinie, podejścia oparte na amplifikacji PCR konserwatywnych regionów w połączeniu z późniejszym klonowaniem i sekwencjonowaniem umożliwiły identyfikację transkrypcyjnie aktywnych odrębnych elementów rodzin HML-229,30 lub HERV-E4.131 . Technika monitorowania ekspresji powtórzeń genomu, również zakończona etapami klonowania i sekwencjonowania, mająca na celu identyfikację promotorów wśród powtórzeń, zidentyfikowała aktywne pojedyncze pojedyncze LTR dla człowieka specyficzne dla HML-232,33. Sukcesywnie opracowaliśmy dwie generacje mikromacierzy o dużej gęstości dedykowanych do analizy transkryptomu HERV, wprowadzając metodologie odpowiednie do projektowania sond wieloelementowych w celu zminimalizowania reakcji krzyżowych między pierwiastkami paralogicznymi w rodzinie34,35. Chip HERV-V2, który celuje w 2 690 różnych prowirusów i 2 883 pojedyncze LTR z rodzin HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 i HERV-K HML-5, ujawnił ekspresję 1 718 loci HERV (figury 7A i B) w szerokim zakresie tkanek35, zilustrowanych w tym artykule przez identyfikację przypuszczalnych biomarkerów raka prostaty. Ponadto zastosowanie wielu zestawów sond w danym locus dostarcza informacji na temat jego regulacji transkrypcji. Po pierwsze, sygnał ujemny U3 w połączeniu z dodatnim sygnałem U5 klasyfikuje LTR jako promotor i odwrotnie, sygnały dodatnie U3 i ujemne U5 mogą odzwierciedlać rolę poliadenylacji. W ten sposób zidentyfikowaliśmy 326 promotorów LTR w szerokim zakresie tkanek 35 i na podstawie tych dychotomicznych informacji U3-U5 dostarczonych przez matrycę, zaproponowaliśmy i eksperymentalnie potwierdziliśmy dla niektórych wybranych przypadków, że taka autonomiczna transkrypcja była kontrolowana przez proces epigenetyczny zależny od metylacji34 (Figura 8). Po drugie, wykrywanie sygnałów pochodzących np . z niezależnych zestawów sond LTR, gag i env lub wysyłanych z sond ukierunkowanych na określone złącze splicingowe dostarcza informacji na temat strategii splicingu prowirusowego, co ilustruje profil ekspresji ERVWE1 / Syncytyna1 w łożysku lub w jądrze guza34. Wskazuje to, że proces selekcji sondy specyficznej dla HERV jest wystarczająco solidny, aby wspierać identyfikację strategii splicingu związanej z tkanką, równie skutecznie, jak w przypadku konwencjonalnych genów36 (Figura 8).
Metoda ta jest pierwszą próbą identyfikacji indywidualnej ekspresji locus HERV przy użyciu niestandardowej mikromacierzy o wysokiej gęstości opartej na technologii Affymetrix. Wyraźnie zidentyfikowane zalety formatu mikromacierzy do rozszyfrowania transkryptomu HERV polegające na (i) skoordynowanej eksploracji kilku rodzin HERV oraz (ii) jednoczesnej i niezależnej analizie różnych regionów dla każdego locus, np. Domeny U3 i U5 dla pojedynczych i prowirusowych LTR, regionów gag lub env oraz możliwych połączeń splicingowych związanych ze strukturami prowirusowymi, bez żadnych a priori dotyczących funkcjonalności elementu HERR. Perspektywy opierają się na ulepszeniu adnotacji w narzędziach biokomputerowych związanych z mikromacierzami. Powinno to pozwolić na przekształcenie sygnałów chipowych w hipotezy biologiczne, takie jak to, czy udowodnione aktywne HERV napędzają transkrypcję lncRNA, czy modulują mniej lub bardziej proksymalną ekspresję genów kodujących. Rzeczywiście, takie założenie jest poparte ostatnimi badaniami, które zidentyfikowały transkrypty ncRNA związane z rakiem prostaty zawierające składniki wirusowych ORF z endogennej rodziny retrowirusów HERV-K lub części wirusowego regionu promotora LTR37, a także dwa zdarzenia fuzji genów, a mianowicie HERV-K22q11-ETV1 i HERV-K17-ETV38,39. Podsumowując, całe to podejście transkryptomiczne w połączeniu z funkcją LTR i identyfikacją strategii splicingu może pomóc w rozszyfrowaniu markera w porównaniu ze składnikami wyzwalającymi ekspresję HERV w przewlekłych40,41 i chorobach zakaźnych42,43.

Ludzkie endogenne retrowirusy (zwane również HERV) rozprzestrzeniają się po całym naszym genomie. Pochodzą one z rodowych i niezależnych infekcji w obrębie linii zarodkowej, po których następują procesy rozmnażania typu kopiuj-wklej i prowadzą do powstania rodzin wielokopijnych. Dziś nie są już zakaźne, ale zajmują 8% ludzkiego genomu; Dla porównania, eksony obejmują 2% ludzkiego genomu. Dane z projektu ENCODE opublikowane w 2012 r. wykazały, że różne typy RNA pokrywają około 62% genomu, z czego jedną trzecią w regionach międzygenowych. Co więcej, wydaje się, że ilość transkrypcyjnych motywów regulatorowych jest co najmniej 4,5 razy większa niż w przypadku eksonów kodujących białka. Długie końcowe powtórzenia HERV (LTR) reprezentują szeroki zakres potencjalnych elementów regulatorowych transkrypcji, ponieważ jest to ich zwykła funkcja w zakaźnych retrowirusach. Historycznie, poza kilkoma loci ulegającymi ekspresji w łożysku lub jądrze, powszechnie uważano, że HERV milczą ze względu na regulację epigenetyczną. W związku z tym zaprojektowaliśmy mikromacierz o dużej gęstości w formacie Affymetrix, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci HERV, aby lepiej zrozumieć, czy są one aktywne, czy sterują transkrypcją lncRNA, czy modulują ekspresję genów kodujących. To narzędzie, nazwane HERV-V2 GeneChip, integruje 23 583 zestawy sond HERV i może rozróżniać 5 573 odrębne elementy HERV składające się z pojedynczych LTR, a także pełnych i częściowych prowirusów (ryc. 2).
Diagnoza, ocena i plan:
Diagnoza raka prostaty opiera się na dawkowaniu biomarkera antygenu specyficznego dla prostaty (PSA) w laboratorium klinicznym, cyfrowym badaniu odbytnicy w celu oceny morfologicznej zmiany prostaty i wreszcie biopsji prostaty obserwowanej przez patologa. Brak wystarczającej swoistości i czułości wśród konwencjonalnych biomarkerów raka, takich jak PSA dla raka prostaty, został powszechnie uznany po kilku dekadach implikacji klinicznych1. Początkowo PSA zaproponowano w diagnostyce i leczeniu gruczolakoraka gruczołu krokowego11. Później zaproponowano go do badań przesiewowych w kierunku raka i monitorowania rozwoju choroby12. Pozostaje jednak pytanie, które regularnie się pojawia: "jak stosować PSA". (i) szara strefa odpowiadająca stężeniu w surowicy wynoszącym 2,5–10 ng/ml nie pozwala na wyraźne rozróżnienie między rakiem a czynnikiem nienowotworowym2; (ii) dwa duże badania kohortowe, w których wzięły udział setki tysięcy osób w Europie i USA, nie doprowadziły do jednoznacznych wniosków na temat przydatności badań przesiewowych pod względem śmiertelności specyficznej dla choroby13,14; (iii) analiza pooperacyjnych parametrów kinetycznych PSA, takich jak klirens PSA, prędkość PSA i czas podwojenia, choć prosta w teorii, może stanowić poważne wyzwanie w praktycznym zastosowaniu3,4. Możemy się spodziewać, że w nadchodzących latach zastosowania biomarkerów będą wspierać kliniczny wybór między czujnym wyczekiwaniem a mniej lub bardziej agresywnym leczeniem w zależności od fenotypu nowotworu. Jeśli chodzi o diagnozę postawioną przez patologa, pierwszym czynnikiem ograniczającym jest 20% fałszywie ujemna diagnoza w biopsjach prostaty (wiele nowotworów jest pomijanych przez pobieranie próbek). Drugi problem dotyczy konieczności wykonania dodatkowej procedury biopsji po negatywnym wyniku, który może mieć niepożądane skutki.
Radykalna prostatektomia jest obecnie jednym ze standardowych metod leczenia raka prostaty. Proponuje się go u zdrowych pacjentów, w wieku od 45 do 65 lat, zwłaszcza w przypadku agresywnych wzorców (Gleason 7 do 10), guza wieloogniskowego lub guza wyczuwalnego palpacyjnie. Obecnie odbywa się to na naszym oddziale z wykorzystaniem chirurgii wspomaganej robotem. W związku z coraz liczniejszymi dowodami na to, że markery molekularne będą miały ogromne znaczenie w nadchodzących latach, postanowiliśmy zaproponować wszystkim naszym pacjentom możliwość udziału w programie bankowania tkanek prostaty. Mówiąc dokładniej, rozwijające się programy badań molekularnych nad rakiem prostaty spowodowały rosnące zapotrzebowanie na dostęp do wysokiej jakości świeżych tkanek nowotworowych z próbek po prostatektomii. Badania te, a w szczególności podejścia genomiczne, wymagały dużych próbek o wysokiej jakości DNA/RNA. Guz i sąsiednie tkanki "nienowotworowe" od tego samego pacjenta są potrzebne. Zalecenia dotyczące postępowania i leczenia prostatektomii radykalnej mają na celu zachowanie cech patologicznych, które decydują o stanie zaawansowania i marginesu, a tym samym o potencjalnym dalszym leczeniu i rokowaniu. W związku z tym żadna metoda pobierania próbek świeżych tkanek nie powinna utrudniać późniejszych ocen patologicznych, aby mogła zostać zaakceptowana przez diagnozę. Makroskopowe rozwarstwienie prostaty jest trudne i należy zwrócić dużą uwagę na tkanki brzegowe i inwazję torebki: każda sekcja w celu bankowania prostaty powinna być zawsze przeprowadzana przez przeszkolonego uropatologa zgodnie z ustalonym protokołem. Komisja bioetyczna wydziału medycznego i stanowa rada lekarska zgodziły się na te badania i uzyskano świadomą zgodę dla wszystkich pacjentów włączonych do bankowania tkanek prostaty.

<table><tbody><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNA poli-A zapas kontrolny</td><td>Affymetrix</td><td>900433</td><td></td></tr><tr><td>DNAza 1</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>1,000 U (1 U/&mikro; l)</td></tr> <tr><td>Transferaza końcowa</td><td>Roche</td><td>3333574001</td><td>400 j. W tym enzym i koenzym (CoCl2).</td></tr><tr><td>DLR-1a</td><td>Affymetrix</td><td>900542</td><td></td></tr><tr><td>Hybrydyzacja Kontrole wewnętrzne B2 i 20x Kontrola hybrydyzacji eukariotycznej</td><td>Affymetrix</td><td>900454</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Hybrydyzacja, mycie i barwienie</td><td>Affymetrix</td><td>900720</td><td>Z mieszanką prehybrydyzacyjną i 2x mieszanką hybrydyzacyjną dla 30 reakcji</td></tr><tr><td>10x bufor One-Phor-All PLUS</td><td></td><td></td><td>Skład w wodzie uzdatnionej DEPC: 100 mM octan trisu pH 7,5; 100 mM octan magnezu; 500 mM octanu potasu.</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Protokół oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>System amplifikacji RNA WT-Ovation Nugen</td><td></td><td>2210-24</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquik PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nazwa materiału</td><td></td> Firma <td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Skaner Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 3000 7G</td><td>Affymetrix</td><td>GS30007G</td><td>Opcjonalnie: autoloader</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>Affymetrix</td><td>FS450</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization 640 Piekarnik</td><td>Affymetrix</td><td>640</td><td>Zawiera 4 nośniki</td></tr> <tr><td>macierzy GeneChip ProbeStacja robocza wyposażona w oprogramowanie operacyjne GeneChip (GCOS), w tym GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERV-V2 chip</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>Custom array. W sprawie dostępności mikromacierzy (wyłącznie do użytku badawczego) prosimy o kontakt: Fran&ccedil; ois Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&eacute; rieux Dział Diagnostyki Medycznej Centre Hospitalier Lyon Sud, B&acirc; timent 3F 69495, Pierre B&eacute; nite cedex Francja Telefon: 33 (0)4 72 67 87 85 E-mail: francois.mallet@biomerieux.com</td></tr><tr><td colspan="4">HERV-V2 conception Dedykowana baza danych i adnotacje Budowa dedykowanej bazy danych, grupującej genomowe sekwencje HERV należące do 6 rodzin HERV, osiągnięto za pomocą następującej procedury: (i) najbardziej kompletną i reprezentatywną sekwencję z każdej rodziny HERV wybrano z literatury i zdefiniowano jako sekwencję prototypową (Rysunek 2). (ii) 6 prototypów zostało funkcjonalnie opatrzonych adnotacjami w odniesieniu do ich LTR (U3/R/U5) i części wewnętrznych (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 został następnie zastosowany przy użyciu tych sekwencji funkcjonalnych jako bibliotek wejściowych. Przeprowadzono przeszukiwanie całego genomu wszystkich powiązanych sekwencji w ludzkim genomie na podstawie co najmniej 80% homologii (NCBI 36/hg18). (iv) Wreszcie, sekwencje funkcjonalne odzyskane w tym procesie zostały połączone w odrębne loci na podstawie ich lokalizacji genomowej i ostatecznie zaimplementowane w dedykowanej bazie danych HERV. Ta baza danych, nazwana HERV-gDB3, zawiera 10 035 indywidualnych loci35. Locus specyficzne dla sond design Począwszy od HERV-gDB3, najpierw wygenerowano nakładające się na siebie ścieżki 25-merowych sond kandydujących. Każda potencjalna sonda została następnie dopasowana do ludzkiego genomu za pomocą KASH 45 w celu oceny potencjału hybrydyzacji krzyżowej. To ostatnie oszacowanie zostało przeprowadzone za pomocą modelu opracowanego specjalnie w tym celu i określanego jako EDA+. Krótko mówiąc, zasada EDA+ polega na uwzględnieniu niestabilności spowodowanej niedopasowaniami i lukami w 25-merowym kompleksie hybrydyzacyjnym cel/sonda. Sondy kandydujące wykazujące niskie ryzyko hybrydyzacji krzyżowej (tj. niska liczba niespecyficznych celów genomowych) są wybierane i ostatecznie łączone w probesety. Niestandardowa mikromacierz HERV GeneChip Niestandardowy HERV GeneChip integruje 23 583 zestawy sond HERV i może rozróżniać 5 573 różne elementy HERV, składa się z pojedynczych LTR, pełnych i częściowych prowirusów (Rysunek 2). W mikromacierzy uwzględniono również standardowe sondy kontrolne Affymetrix do bezstronnej amplifikacji i hybrydyzacji.</td></tr></tbody></table>

identyfikacja ekspresji poszczególnych loci herv w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Antygen specyficzny dla prostaty (PSA) jest głównym biomarkerem diagnostycznym raka prostaty w użyciu klinicznym, ale brakuje mu swoistości i czułości, szczególnie w niskich dawkach1. "Jak stosować PSA" pozostaje aktualnym problemem, zarówno w przypadku diagnozy jako szara strefa odpowiadająca stężeniu w surowicy 2,5-10 ng/ml, która nie pozwala na wyraźne rozróżnienie między rakiem a nierakiem2 lub do obserwacji pacjenta, ponieważ analiza pooperacyjnych parametrów kinetycznych PSA może stanowić poważne wyzwanie dla ich praktycznego zastosowania3,4. Alternatywnie, niekodujące RNA (ncRNA) stają się kluczowymi cząsteczkami w nowotworach u ludzi, które mogą służyć jako nowe markery choroby, np. PCA3 w raku prostaty5,6 i ujawniać niescharakteryzowane aspekty biologii nowotworu. Co więcej, dane z projektu ENCODE opublikowane w 2012 r. wykazały, że różne typy RNA pokrywają około 62% genomu. Wydaje się również, że ilość transkrypcyjnych motywów regulatorowych jest co najmniej 4,5 razy większa niż w przypadku eksonów kodujących białka. Tak więc długie końcowe powtórzenia (LTR) ludzkich endogennych retrowirusów (HREV) stanowią szeroki zakres przypuszczalnych/kandydujących transkrypcyjnych sekwencji regulatorowych, ponieważ jest to ich podstawowa funkcja w zakaźnych retrowirusach. HERV, które rozprzestrzeniają się w całym ludzkim genomie, pochodzą z rodowych i niezależnych infekcji w linii zarodkowej, po których następują procesy rozmnażania kopiuj-wklej i prowadzą do rodzin wielokopijnych zajmujących 8% ludzkiego genomu (należy zauważyć, że eksony obejmują 2% naszego genomu). Niektóre loci HERV nadal wyrażają białka, które są związane z kilkoma patologiami, w tym rakiem7-10. Zaprojektowaliśmy mikromacierz o dużej gęstości w formacie Affymetrix, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci HERV, aby lepiej zrozumieć, czy mogą one być aktywne, czy sterują transkrypcją ncRNA, czy modulują ekspresję genów kodujących. Narzędzie to zostało zastosowane w dziedzinie raka prostaty (ryc. 1).

Wartość badań transkryptomicznych zależy przede wszystkim od jakości wyjściowego materiału biologicznego. Jeśli ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona w optymalnych warunkach, wskaźnik integralności RNA (RIN) zazwyczaj wynosi 7 lub więcej (Rysunek 4A). Konieczność hybrydyzacji 2 µg cDNA na chipie Affymetrix HERV-V2 wiąże się z zastosowaniem procesu amplifikacji. Pomyślny etap amplifikacji prowadzi do uzyskania rozkładu w kształcie dzwonu (Rysunek 4B). Następnie przeprowadza się fragmentację za pomocą DNAse1 w celu ujednolicenia rozkładu wielkości cDNA wokół 100 nukleotydów przed hybrydyzacją (Rysunek 4C). Po hybrydyzacji i skanowaniu (Rysunek 4D) wizualna inspekcja obrazu pozwala sprawdzić, czy siatka jest prawidłowo dopasowana do plamek (Rysunek 4E) oraz czy kontrole hybrydyzacji są spójne (Rysunek 4F). Etap ten jest również przydatny do wykluczenia mikrotablic, w których podczas eksperymentu pojawiły się pęcherzyki powietrza lub błędy.
Po przejściu chipów przez kontrolę jakości QC (Rycina 5) i po normalizacji, analiza statystyczna 5 par dopasowanych próbek RNA z guza i zdrowej tkanki prostaty z Lyon-Sud Hospital doprowadziła do zidentyfikowania 207 zestawów sond (probesets) HERV o wartościach ekspresji różnicowej (p.val &lt;0,05) (Rycina 6A). Aby wesprzeć te wyniki i uzyskać informacje specyficzne dla prostaty, do analizy dodano 35 dodatkowych par dopasowanych próbek (jelita grubego, jajnika, jądra, piersi, płuc i prostaty), a procedura SAM-FDR (FDR = 20%) ostatecznie zidentyfikowała 44 specyficzne dla prostaty zestawy sond HERV. Wśród nich opisano 10 najistotniejszych struktur HERV (Rycina 6B). Dalsze badania kliniczne będą wymagane w celu oceny czułości i swoistości tych potencjalnych biomarkerów.
<img alt="Schemat ekstrakcji i analizy RNA; amplifikacja RNA WT-Ovation; mapa ciepła loci HERV; analiza SAM-FDR." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat całej procedury od etapu klinicznego (1: prostatektomia wykonana przez lekarza i przygotowanie tkanki przez patomorfologa) po etap laboratoryjny (2-6: przygotowanie próbek, przygotowanie celu, procesy mikroarray), prowadzący do identyfikacji potencjalnych biomarkerów (7: analiza bioinformatyczna mikroarray HERV). Kwasy nukleinowe pochodzące z tkanki prawidłowej przedstawiono na pomarańczowo; kwasy nukleinowe z obszaru guza składają się z mieszaniny kwasów nukleinowych prawidłowych (pomarańczowych) i specyficznych dla nowotworu (czarnych). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Schemat procesu identyfikacji HERV, analiza genomiczna, zestawianie bazy danych, metoda wyboru sond." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Koncepcja i zawartość chipa HERV-V2: Sekwencje HERV pobrane z ludzkiego genomu są przechowywane w bazie danych zwanej HERV-gDB3, następnie 25-merowe sondy kandydackie przechodzą przez dedykowaną procedurę modelowania hybrydyzacji (EDA+), zanim zostaną ostatecznie zsyntetyzowane na macierzy (wynikowe ukierunkowane podregiony przedstawiono dla każdej rodziny). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Etapy utrwalania tkanek; panele A-G, biopsje skalpelem, strzykawka; badanie medyczne." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przygotowanie prostaty przez patomorfologa. (A) Świeży preparat po radykalnej prostatektomii zostaje przekazany do laboratorium. (B-C) Prostata zostaje oznakowana (kolor zielony po prawej stronie, czarny po lewej stronie). (D) Duży przekrój poprzeczny gruczołu od strony tylnej. (E) Pozostawiając marginesy nienaruszone, wycina się fragmenty tkanek z różnych obszarów gruczołu przedstawczego. (F) Rdzenie tkankowe zostają umieszczone w probówce Eppendorf. (G) Nitka chirurgiczna służy do zamknięcia prostaty w celu zapobiegania zniekształceniu gruczołu i minimalizacji naruszenia marginesu chirurgicznego. Następnie preparat po radykalnej prostatektomii jest gotowy do utrwalenia w formalinie zgodnie ze standardową procedurą analizy histologicznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Analiza fragmentacji DNA; wykresy elektroferogramów, wykresy rozrzutu; badanie hybrydyzacji mikrociągu." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Kontrola jakości preparatyki kwasów nukleinowych i wydajności hybrydyzacji. (A) integralność RNA, (B) amplifikowane cele cDNA oraz (C) pofragmentowane cele użyte na etapie hybrydyzacji. Te trzy kontrole jakości uzyskano za pomocą Bioanalyzer, stosując RNA nano chips oraz test Eukaryote Nano Serie II. (D) Ogólny obraz obszaru hybrydyzacji mikrociągu HERV-V2 po skanowaniu, (E) powiększenie lewego górnego rogu pokazujące kontrole wyrównania siatki oraz (F) powiększenie obszaru centralnego pokazujące kontrole hybrydyzacji naniesionych punktów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykresy analizy ekspresji genów przedstawiające metryki QC i rozkład częstotliwości." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Przetwarzanie sygnałów. (A) Kontrole amplifikacji polyA spike-in firmy Affymetrix. Kontrole polyA dla transkryptów Dap, Thr, Phe i Lys z genów B. subtilis są dodawane do próbki RNA i służą do oceny ogólnego sukcesu etapów przygotowania celu. Intensywność powinna być wykrywana przy malejących wartościach wśród tych kontroli spike-in, aby upewnić się, że podczas amplifikacji WT-Ovation nie wystąpiło obciążenie (bias) między genami o wysokiej i niskiej ekspresji. (B) Kontrole hybrydyzacji spike-in firmy Affymetrix. Cele te, wyizolowane z E. coli oraz bakteriofaga P1, są dodawane przed procedurą znakowania. Rosnące wartości dla BioB, BioC, BioD i Cre wskazują na ogólny sukces hybrydyzacji. (C) Rozkład intensywności sygnałów z chipa po normalizacji RMA. Większość zestawów sond (probesets) wykazuje sygnały o wartościach niższych niż 26 (tło), co wskazuje na ogólną ekspresję ograniczoną głównie do niektórych specyficznych loci HERV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Mapa ciepła ekspresji HERV i tabela 10 najważniejszych struktur prowirusowych; analiza różnicowej ekspresji genów." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig6.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Analiza danych. (A) Analiza hierarchicznego grupowania próbek prawidłowych i nowotworowych. W odniesieniu do znormalizowanych wartości ekspresji zastosowano algorytm grupowania partycyjnego z funkcją odległości euklidesowej, co pozwoliło na pogrupowanie zestawów sond w zależności od nadekspresji (kolor czerwony) i niedoekspresji (kolor niebieski) w próbkach prawidłowych i nowotworowych. (B) Wybór 10 najważniejszych struktur HERV zidentyfikowanych jako potencjalne biomarkery raka prostaty. Dla każdego elementu HERV podano powiązaną rodzinę HERV, współrzędne genomiczne (NCBI 36/hg18) oraz krótki opis struktury HERV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykresy kołowe składu genomowego DNA; procenty niekodujących i transkrybowanych sekwencji; wyniki analizy genetycznej." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Repertuar HERV. (A) Sekwencjonowanie ludzkiego genomu ujawniło 25 000 genów kodujących białka (egzony, 2%) oraz ogromną liczbę elementów transpozycyjnych, w tym 200 000 retrotranspozonów z długimi powtórzeniami końcowymi (LTR) (HERV, 8%). (B) Ekstrapolacja z zawartości chipa HERV-V2 i powiązanych danych o ekspresji (79 próbek pochodzących z 8 typów tkanek prawidłowych w porównaniu z nowotworowymi) sugeruje, że jedna trzecia repertuaru HERV jest aktywna transkrypcyjnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Schemat locus ERVWE1; kontrola epigenetyczna, strategia splicingu; sondy Affymetrix; analiza jąder." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Interpretacja funkcjonalna sygnałów z chipa. (A) Identyfikacja promotora i kontrola epigenetyczna: ujemny sygnał U3 (czerwona sonda, 5'LTR) versus dodatni sygnał R-U5 (niebieska sonda, 5'LTR) sugerują transkrypcję sterowaną przez U3, co potwierdza różny poziom metylacji CpG (pełne czarne kółka) w obrębie U3 w tkankach prawidłowych okołoguzowych versus tkankach nowotworowych. (B) Strategia splicingu: domniemany mRNA kodujący otoczkę o długości 3,1 kb, ekspresowany wyłącznie w guzie, zidentyfikowano za pomocą sondy nakładającej się na złącze splicingowe SD1/SA2. *Wnioskowane na podstawie porównania z innymi tkankami pozapłodowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

Ludzkie endogenne retrowirusy (HERV), które zajmują 8% ludzkiego genomu, zachowują ograniczone zdolności kodowania, ale sto tysięcy długich powtórzeń końcowych (LTR). Niestandardowa mikromacierz Affymetrix została zaprojektowana w celu identyfikacji indywidualnej ekspresji locus HERV i została wykorzystana w tkankach raka prostaty jako dowód słuszności koncepcji dla przyszłych badań klinicznych.

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Ta analiza transkryptomiczna tkanek ludzkiego raka prostaty identyfikuje indywidualne endogenne loci ekspresji retrowirusa człowieka w celu oceny niestandardowej mikromacierzy o dużej gęstości jako narzędzia przesiewowego do odkrywania biomarkerów. Po usunięciu przez chirurga narządu prostaty od pacjenta, patolog przygotowuje oddzielnie tkanki nowotworowe i sąsiednie normalne tkanki w laboratorium, ekstrahuje, oczyszcza i kwalifikuje MR. NA z tkanek prawidłowych i nowotworowych amplifikuje mRNA za pomocą całego zestawu owacji transkryptomu, a następnie rozszczepia i znakuje powstałe amplifikowane produkty. Następnie sekwencyjnie przetwarzaj dwumacierz H-E-R-V-V poprzez napełnianie, hybrydyzację, mycie i skanowanie.Ostatecznie, korzystając z metod biokomputerowych, można śledzić zestawy sond wykazujące znaczny sygnał i ekspresję różnicową, co prowadzi do identyfikacji aktywnych transkrypcyjnie poszczególnych loci. Wiele lat temu badaliśmy zachowanie rodziny IRV W w różnych kontekstach, w tym w próbkach stwardnienia rozsianego. Łożysko jądra.Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy zaczęliśmy rozumieć, że wyrażają się nakładające się lub nienakładające się na siebie podgrupy elementów IRV w rodzinie. W zależności od kontekstu. Wykorzystanie technologii okrętowej pozwala na skoordynowaną eksplorację kilku jej rodzin i jednoczesną analizę różnych regionów dla każdego miejsca.Na przykład domena US three i UF dla LTR, która może wspierać bezpośrednią rolę w patologii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak diagnostyka raka prostaty, w którym istniejące biomarkery białkowe, takie jak PSA, nie są swoiste i czułe. Tymczasem niekodujące RNA, takie jak PCA 3, wydają się bardziej obiecujące, Demonstracja procedury postępowania z prostatą sprzeda Michelowi technika z wydziału patologii.Philippe Per zademonstruje ekstrakcję RNA, przygotowanie i analizę, a technik z laboratorium John Unit zademonstruje procedurę statku. Zamontuj zamrożoną tkankę pionowo na małym kopcu OCT przy kriostacie. Weź pojedynczy wycinek o grubości pięciu mikronów, wybarwić go Blu udine, a następnie wykonaj szybkie badanie histologiczne, aby zbadać charakter tkanki nowotworowej.Oszacuj ilość komórek turalnych i wybierz tylko rdzenie z więcej niż 80% komórek nowotworowych. Wytnij kolejny odcinek o grubości pięciu mikronów i zabejcuj hematyną, eoiną i szafranem. Teraz wytnij 15 odcinków o grubości 30 mikronów i przenieś je do probówki z orphem bez RNA.Następnie weź ostatni pięciomikronowy odcinek do barwienia hematyną, eoiną i szafranem, aby kontrolować ilość komórek nowotworowych. Pod koniec procedury próbki na suchym lodzie należy przenieść do laboratorium biologii molekularnej. Homogenizować tkankę w roztworze Triol na lodzie, używając ręcznego młynka, aż do całkowitego rozpuszczenia tkanki.Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 300 mikrolitrów chloroformu i wiruj przez 15 sekund. Po dwóch minutach w temperaturze pokojowej wirować w temperaturze 12 000 G przez 15 minut w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.W przypadku RNA ostrożnie przenieś górną fazę wodną do nowej probówki. Dodaj 750 mikrolitrów izopropanolu, wymieszaj przez odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwirować próbki, aby osadzać wytrącone RNA, przemyć granulkę RNA jednym mililitrem 80% etanolu.Następnie odwirować próbki o sile 7,500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant za pomocą końcówek P 1000 i P 10. Pozostaw pozostały etanol do wyschnięcia na powietrzu.Następnie dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od RNA. Przenieś próbki do bloku grzewczego o temperaturze 70 stopni Celsjusza. Aby rozpuścić osad, sprawdź jakość RNA i integralność RNA za pomocą bioanalizatora i NanoDrop zgodnie z instrukcjami producenta.W idealnej ekstrakcji RNA liczba integralności RNA wynosi zwykle siedem lub więcej. Kontynuuj z całą owacją transkryptomu, zestawem do amplifikacji RNA zgodnie z instrukcjami dostawcy. Następnie oczyść powstały jednoniciowy produkt CD NA.Sprawdź wydajność i rozkład wielkości jednoniciowego CDNA za pomocą bioanalizatora i NanoDrop zgodnie z instrukcjami producenta. Rozkład wielkości wzmocnionej CD NA powinien zazwyczaj wynosić od 101 do 500 zasad długości ze szczytem około 600 zasad i mieć ogólny rozkład w kształcie dzwonu. Następnie rozdrobnić CDNA, dodaj 6,6 mikrolitra mieszanki fragmentacyjnej do dwóch mikrogramów CD NA w 30 mikrolitrach wirowania i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie dezaktywuj DNA w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut i trzymaj na lodzie. Porcjować jeden mikrolitr rozdrobnionego CDNA do weryfikacji rozkładu wielkości na podstawie Agilent. Jeden zabieg DNA homogenizuje rozkład wielkości CD NA do około 100 nukleotydów przed hybrydyzacją.Sprawdź rozkład wielkości jednoniciowej płyty CD NA za pomocą wstępnie zwilżonego bioanalizatora firmy Pfizer. Chip genu HERV z 200 mikrolitrami wstępnej hybrydyzacji. Mieszaj i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza, 60 obr./min przez 10 minut.Dodaj 131 mikrolitrów mieszanki hybrydyzacyjnej do 69 mikrolitrów rozdrobnionej i oznakowanej płyty CD NA w temperaturze pokojowej i w naturze przez dwie minuty w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez pięć minut i wirować z maksymalną prędkością przez pięć minut. Teraz opróżnij wstępnie zwilżony chip genu HERV i załaduj preparat docelowy o pojemności 200 mikrolitrów.Zastosuj twarde miejsca na dwóch hybrydyzacjach SEPTA w temperaturze 50 stopni Celsjusza, 60 obr./min przez 18 godzin. Opróżnij chip genu HERV i napełnij sondę. Umieść w tablicy 250 mikrolitrów buforu do mycia, umieść 600 mikrolitrów mieszaniny roztworu SAPE i 600 mikrolitrów mieszaniny roztworu przeciwciała w pozycjach numer jeden i numer dwa, umieść 800 mikrolitrów buforu do przechowywania macierzy w pozycji.Po trzecie, wciśnij igły. Przypisz odpowiedni układ scalony do każdego modułu. Wybierz protokół FS 4 5 0 0 0 4 i uruchom każdy moduł zgodnie z instrukcjami oprogramowania.Nałóż twarde miejsca na SEPTA, aby zapobiec przeciekaniu. Następnie załaduj chip do automatycznego podajnika lub alternatywnie bezpośrednio do skanera. Rozpocznij skanowanie.Po zeskanowaniu chip dot pliki CEL są generowane, sprawdź obraz i wyrównaj siatkę do miejsca, aby zidentyfikować komórki sondy. Poddaj również chipy kilku pomiarom kontroli jakości. Teraz znormalizuj chipy i zastosuj hierarchiczne podejście do grupowania w celu zbadania zestawu danych po normalizacji, przeprowadzono istotną analizę w celu wyszukania genów o zróżnicowanej ekspresji z procedury mikromacierzy, a następnie nastąpiła korekta wskaźnika fałszywego wykrywania na pięciu próbkach RNA guza z pasującą parą i normalną prostatą.Doprowadziło to do zidentyfikowania 207 zestawów sond HERV z różnicowymi wartościami wyrażenia. Dalsza analiza 35 dodatkowych próbek par dopasowań z innych tkanek nowotworowych zidentyfikowała 44 zestawy sond HERV specyficzne dla prostaty. Oto 10 najistotniejszych struktur HERV.Wreszcie, analizę funkcjonalną można przeprowadzić w dedykowanym interfejsie składającym się z adnotowanych sekwencji będących przedmiotem zainteresowania, zilustrowanych jednym elementem H-E-R-V-W wybranym z 10 najlepszych zidentyfikowanych struktur prowirusowych oznaczonych na górze za pomocą dedykowanych specyficznych sond obecnych na dwóch matrycach H-E-R-V-V i oznaczonych funkcjonalnymi regionami retrowirusowymi LTR gag POLE N, a także z naciskiem na pięć głównych subdomen LTRU trzy i U pięć, oraz późniejsze projektowanie starterów PCR do walidacji RT PCR. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opanować krytyczne etapy związane z przygotowaniem próbki i celu, które są warunkami wstępnymi jakości, aby odnieść sukces w użyciu mikropromieniowania dla Ziemi, a także w konwencjonalnym odkrywaniu biomarkerów. Zaprojektowaliśmy mikromacierz o wysokiej gęstości w formacie ametri, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci, aby lepiej zrozumieć, czy mogą one być aktywne, jeśli sucha transkrypcja NA w obszarze non-con lub moduluje ekspresję genu kodującego.Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się chorobami przewlekłymi i zakaźnymi, ponieważ systematyczna identyfikacja aktywnych wokali może ujednolicić hipotezy genetyczne, wirusowe i środowiskowe jako czynniki wyzwalające różne patologie. Praca z ograniczoną liczbą próbek w eksperymencie technicznym potwierdzającym słuszność koncepcji może być trudna do pomyślnego odkrycia, podjęcia środków ostrożności przez biomarkery, takich jak przestrzeganie statystycznie zweryfikowanego przepływu pracy, w tym solidności metody i reprezentatywnego próbkowania docelowej populacji pacjentów.

microarray-based-identification-individual-herv-loci-expression

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Identyfikacja ekspresji poszczególnych locus HERV opartych na mikroarrayach: Zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Protokół ma na celu optymalizację konstrukcji i jakości mikromacierzy tkankowych do badań nad biomarkerami. Obejmuje aspekty planowania i projektowania, patologii cyfrowej, wirtualnych adnotacji do slajdów i automatycznego układania tkanek.

Protokół mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) do badań biomarkerów

Nienaruszone kompleksy HLA/peptydowe klasy I są wydalane przez komórki rakowe, co stanowi potencjalnie istotny biomarker raka. Wykorzystując technologię czujników bezznacznikowych i przeciwciała monoklonalne naśladujące receptor limfocytów T, demonstrowano wykrywanie wydalanych kompleksów MIF/HLA-A*02:01 w supernatantach komórkowych MDA-MB-231, wzbogaconej surowicy ludzkiej i osoczu pacjenta, co umożliwiło opracowanie nowej platformy diagnostycznej raka.

Wykrywanie biomarkerów ludzkiego antygenu leukocytów w raku piersi z wykorzystaniem technologii biosensorów bez znaczników

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Tutaj prezentujemy protokół do badania biomarkera i predyktora przeżycia raka piersi na podstawie kompleksowej analizy zbiorczych zestawów danych klinicznych pochodzących z różnych publicznie dostępnych baz danych, wykorzystując strategię ekspresji, korelacji i analizy przeżycia krok po kroku.

Eksploracja danych i analiza integracyjna biomarkera raka piersi przy użyciu wielu publicznie dostępnych baz danych

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

RPPA umożliwia jednoczesne badanie ekspresji białek setek próbek, wydrukowanych na szkiełkach nitrocelulozowych, przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Technika ta została zastosowana do zbadania wpływu heterogeniczności leczenia farmakologicznego w obrębie jasnokomórkowego raka nerki.

Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych

Poznaj metodę identyfikacji ekspresji loci HERV w raku prostaty przy użyciu niestandardowej mikromacierzy. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych biomarkerów diagnostycznych.

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Przeglądaj więcej filmów