Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego
8 kwietnia 2016
Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.
Ogólnym celem tej metody jest obiektywne ilościowe określenie ekspresji i kolokalizacji białek z wykorzystaniem obrazowania wielospektralnego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w obszarze podstawowych badań naukowych i patologii diagnostycznej, takie jak sposób, w jaki zmienia się ekspresja i lokalizacja białek po zastosowaniu leczenia lub w miarę postępu choroby. Główną zaletą tej techniki jest wyeliminowanie subiektywizmu operatora, który jest nieodłączną cechą tradycyjnych metod ilościowych.
Aby rozpocząć proces kwantyfikacji, otwórz oprogramowanie do obrazowania multispektralnego w celu zbudowania biblioteki widm z wcześniej przygotowanych slajdów kontrolnych barwionych pojedynczymi chromogenami oraz slajdu barwionego hematoksyliną. Następnie otwórz kostkę obrazu pozyskaną ze slajdu kontrolnego i wybierz od czterech do pięciu obszarów wybarwionych dodatnio, aby optycznie zdefiniować chromogen. Powtarzaj te kroki z kostkami obrazów z pozostałych slajdów kontrolnych, aż do utworzenia pełnej biblioteki widm reprezentującej wszystkie chromogeny, a następnie zapisz bibliotekę widm.
Rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu do obrazowania wielospektralnego, wybierając Multispectral lub im3 jako opcję formatu obrazu oraz Brightfield dla formatu próbki. Skonfiguruj projekt, wybierając segment tissue, find features, phenotyping, score oraz export. W razie potrzeby zmień rozdzielczość obrazu, aby przyspieszyć czas analizy.
Zaimportuj wcześniej stworzoną bibliotekę widm i wybierz wszystkie chromogeny, które mają zostać uwzględnione w analizie. Otwórz kostki obrazów do zestawu danych treningowych, wybierając opcję Open Image Cube. Wybierz co najmniej 18% całkowitej liczby obrazów do analizy, aby zapewnić dokładność treningu.
Następnie należy wybrać zestaw obrazów treningowych. Obrazy powinny reprezentować wszystkie stany chorobowe, aby zwiększyć dokładność segmentacji. Do zestawu treningowego należy włączyć liczne obrazy z barwieniem negatywowym, aby uniknąć błędu systematycznego na tym etapie.
Wykonaj balans bieli dla obrazów w zbiorze treningowym, wybierając narzędzie pipety i wskazując obszar w jednym z obrazów, który jest biały. Kliknij przycisk advance, aby przejść do segmentacji tkanek. Następnie użyj panelu kategorii tkanek, aby wybrać rodzaje tkanek do analizy; w celu dokładniejszej lokalizacji białek w tkankach można wykorzystać kategorie tkanek.
Rozpocznij tworzenie algorytmu i definiowanie kategorii tkanek, używając narzędzia pióro do obrysowywania grup komórek na obrazach treningowych. Po zakończeniu pracy nad jedną kategorią tkanki powtórz ten krok dla pozostałych kategorii. Upewnij się, że wybierasz grupy komórek na obrazach, które są charakterystyczne dla danego typu kategorii tkanki.
Wybierz komponenty, które mają zostać uwzględnione w treningu segmentatora tkanek. Wybierz odpowiednią skalę wzorca do wytrenowania segmentatora tkanek. Następnie kliknij przycisk wytrenuj segmentator tkanek.
Obserwuj okno pop-up wyświetlające dokładność proporcji pikseli w prawidłowo zaklasyfikowanych obszarach treningowych. Segmentuj cały zestaw obrazów treningowych, klikając przycisk segment images. Po zakończeniu przejrzyj zestaw treningowy, aby zidentyfikować wszelkie błędnie sklasyfikowane tkanki przy użyciu aktualnego algorytmu treningowego.
Po upewnieniu się co do wyników algorytmu segmentacji tkanek należy wybrać przycisk advance. Przed wyborem cytoplazmy i/lub błony należy upewnić się, że zaznaczone są jądra komórkowe. Wybierz zakładkę nuclei i ustaw odpowiednie parametry segmentacji jąder.
Następnie należy zdecydować, czy w segmentacji zostaną uwzględnione poszczególne, czy wszystkie kategorie tkanek. Wybierz podejście oparte na progu obiektu barwienia kontrastowego (counterstain object based threshold), aby zastosować uproszczoną metodę pozwalającą na uzyskanie dobrych wyników. Następnie wybierz podejście oparte na progu obiektu (object based threshold) przy zastosowaniu wiarygodnego barwienia kontrastowego jąder komórkowych.
Wybierz parametry kształtu cytoplazmy, wybierając zakładkę cytoplasm. Następnie wybierz odległość zewnętrzną do jądra (outer distance to nucleus). Następnie wybierz rozmiar minimalny (minimum size).
Wybierz kolejny komponent opcji z opcjami główną, wtórną i wybierz trzeciorzędną jako opcje wtórne. Przejdź do karty błony. Wybierz pierwszy marker specyficzny dla błony, który został użyty.
Dostosuj pełną skalę gęstości optycznej lub OD, aby wyznaczyć próg minimalny lub wartość dodatnią dla każdego markera na błonach komórkowych. Następnie, w zakładce błona (membrane), wybierz maksymalny rozmiar komórki. Po wybraniu wszystkich opcji wybierz pole segmentuj wszystko (segment all).
Zastosuj ustawienia do obrazów i poddaj je obserwacji. Wybierz opcję advance, aby przejść do etapu oceny IHC, a następnie wybierz kategorię tkanki do oceny. Wybierz pożądany typ oceny oraz przedział komórkowy, który zostanie wykorzystany w analizie oceny.
Następnie wybierz opcję wyświetlania danych komponentów i przesuń kursor nad obrazy treningowe, aby znaleźć odpowiedni minimalny próg gęstości optycznej barwienia dla komórek pozytywnych w odniesieniu do interesujących nas komponentów. Wyeksportuj dane dla zbioru treningowego, aby przetestować algorytm stworzony poprzez segmentację tkanki, segmentację komórek i wartości punktacji; postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nowy folder dla katalogu eksportu. Wybierz obrazy oraz tabele, które mają zostać utworzone i uwzględnione w analizie.
Następnie przeprowadź analizę, wybierając opcję eksportu dla wszystkich (export for all). Po zakończeniu analizy przejrzyj dane dotyczące segmentacji komórek i punktacji dla obrazów o wysokim i niskim stopniu barwienia, aby ocenić dokładność ustawień. Po upewnieniu się, że ustawienia są poprawne, przejdź do karty analizy seryjnej (batch analysis), aby skopiować algorytm do aktywnego projektu.
Następnie należy wybrać nowy katalog eksportu oraz zaznaczyć obrazy i tabele, które mają zostać uwzględnione w analizie. W opcji plików wejściowych (input files) należy wybrać wszystkie obrazy, które mają zostać objęte analizą seryjną. Wybierz opcję uruchomienia (run), aby przeprowadzić analizę.
Po zakończeniu przejdź do karty przeglądu i łączenia (review merge). Wybierz opcję „dołącz wszystko” (include all) i kliknij „połącz” (merge), aby utworzyć arkusze danych z danymi podsumowującymi do analizy. Trening przeprowadzono na tkankach prostaty w celu segmentacji obrazów na części nabłonkową i zrębową.
Wraz z przedziałem nietkankowym. Do oprogramowania do obrazowania wielospektralnego zaimportowano zestaw obrazów szkoleniowych reprezentujących typy tkanek i stany chorobowe całego zestawu obrazów. Utworzono kategorie tkanek, obejmujące zręb, nabłonk i obszary nietkankowe, a kategorie zdefiniowano poprzez ręczne zaznaczanie obszarów na obrazach szkoleniowych.
Opracowano algorytm segmentacji tkanek, który zastosowano do zbioru treningowego obrazów, aby precyzyjnie wyodrębnić tkanki. Przy zastosowaniu techniki wielokrotnej immunohistochemii zidentyfikowano komórki wykazujące ekspresję jądrową ER-alpha (kolor czerwony) oraz AR (kolor brązowy), mimo nakładających się sygnałów kolorystycznych i metrycznych. Ekspresję CD-147 specyficzną dla błony komórkowej określono ilościowo, wykorzystując E-kadherynę (kolor czarny) jako białko markerowe.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić ekspresję białek oraz ich ko-lokalizację w tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia metodę multipleksowej immunohistochemii, która wykorzystuje obrazowanie multispektralne do obiektywnego ilościowego określania ekspresji białek oraz ich ko-lokalizacji. Technika ta ma na celu wyeliminowanie subiektywizmu operatora występującego w tradycyjnych metodach kwantyfikacji, co zwiększa powtarzalność badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Patologia
- Immunohistochemia
Wstęp
- Immunohistochemia pozwala ocenić lokalizację i ekspresję białek.
- Obecne metody często wprowadzają subiektywizm i niepowtarzalność wyników.
- Obrazowanie multispektralne stanowi rozwiązanie tych problemów.
- Metoda ta może być stosowana zarówno w badaniach podstawowych, jak i w patomorfologii diagnostycznej.
Cel badania
- Aby obiektywnie ilościowo określić ekspresję białek oraz ich ko-lokalizację.
- Aby odpowiedzieć na pytania dotyczące zmian w poziomach białek po zastosowaniu leczenia lub w wyniku progresji choroby.
- Aby poprawić dokładność metod kwantyfikacji stosowanych w badaniach.
Zastosowane metody
- Tworzenie biblioteki widmowej na podstawie slajdów kontrolnych barwionych poszczególnymi chromogenami.
- Wykorzystanie oprogramowania do obrazowania wielospektralnego w celu analizy kostek obrazu ze slajdów kontrolnych.
- Optyczne definiowanie obszarów chromogenów w celu usprawnienia kwantyfikacji.
- Zapisywanie biblioteki widmowej do przyszłych analiz.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie eliminuje subiektywizm operatora.
- Stanowi ona niezawodny sposób oceny lokalizacji i ekspresji białek.
- Wyniki mogą być powtarzalne w różnych eksperymentach.
- Technika ta może przyczynić się do poszerzenia wiedzy w różnych dziedzinach badawczych.
Wnioski
- Multipleksowa immunohistochemia z obrazowaniem wielospektralnym jest cennym narzędziem.
- Metoda ta zwiększa obiektywizm ilościowego oznaczania białek.
- Ma ona istotne znaczenie zarówno dla badań naukowych, jak i diagnostyki klinicznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa multipleksowa immunohistochemia z obrazowaniem wielospektralnym odpowiada na krytyczną potrzebę uzyskania obiektywnych i powtarzalnych danych dotyczących ekspresji białek oraz ich kolokalizacji w badaniach odkrywczych opartych na tkankach. Poprzez eliminację subiektywizmu operatora, ten schemat pracy zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych walidacji celów i badań translacyjnych. Podejście to wspiera rzetelną ocenę biomarkerów, umożliwiając podejmowanie decyzji dotyczących portfolio z uwzględnieniem ryzyka we wczesnej fazie rozwoju i w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia obiektywną kwantyfikację ekspresji białek i ich lokalizacji przestrzennej w kontekście tkankowym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez rozróżnianie subkomórkowych i tkankowo specyficznych wzorców ekspresji.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki analizie ko-lokalizacji wielu biomarkerów.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy przekazywaniu celów do dalszych etapów screeningu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowane, wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów w celu zapewnienia powtarzalności testu.
- Dostarcza ilościowe odczyty specyficzne dla poszczególnych przedziałów komórkowych, odpowiednie dla procesów przesiewowych.
- Umożliwia rzetelne porównanie wpływu związków na lokalizację i ekspresję białek.
- Wspiera skalowalność platformy i możliwość jej ponownego wykorzystania w różnych modelach tkankowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica oznaczanie ilościowe biomarkerów z tkankami i przedziałami subkomórkowymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając obiektywne porównania między badaniami.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne dzięki możliwości analizy populacji komórek podwójnie dodatnich, pojedynczo dodatnich oraz ujemnych.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju kandydatów na biomarkery w oparciu o dane.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten zmultiplexowany proces obrazowania integruje etapy od wczesnego odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz translacyjną ocenę biomarkerów.
- Biologia odkrywcza: Obiektywnie kwantyfikuje ekspresję białek i ich kolokalizację w celu wyjaśnienia szlaków biologicznych i walidacji celów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Generuje specyficzne dla przedziałów komórkowych, statystycznie wiarygodne pomiary do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Dostosowuje analizę biomarkerów do architektury tkanek i populacji komórek istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, zestandaryzowaną platformę obrazowania i analizy do wdrożenia w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad celami terapeutycznymi i biomarkerami.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pozyskiwanie i analizę obrazów, poprawiając powtarzalność i wydajność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfelu projektów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zwalidowanych celów terapeutycznych i biomarkerów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu immunohistochemii, obrazowania multispektralnego oraz oprogramowania do analizy obrazu.
- Wymagany jest dostęp do zautomatyzowanych skanerów preparatów oraz kompatybilnych platform do obrazowania multispektralnego.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów barwienia i algorytmów analizy pomiędzy zespołami.
- Możlizna może być konieczność adaptacji metody do różnych typów tkanek i modeli chorobowych.
- Wybór zestawu treningowego oraz walidacja algorytmu są kluczowe dla uzyskania rzetelnej i obiektywnej kwantyfikacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Automated Image Acquisition and Analysis
1:43
Tissue Segmentation
3:48
Cell Segementation
5:16
Scoring and IHC and Co-localization
5:50
Applying the Algorithm and Batch Analysis
7:08
Results: Successful Cell and Tissue Segmentation
8:18
Conclusion
