Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Ogólnym celem tej metody jest obiektywne ilościowe określenie ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań podstawowych i patologii diagnostycznej, takie jak to, w jaki sposób białka zmieniają ekspresję i lokalizację po leczeniu lub w progresji choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że usuwa ona subiektywność operatora nieodłącznie związaną z tradycyjnymi metodami kwantyfikacji.

Aby rozpocząć proces kwantyfikacji, otwórz oprogramowanie do obrazowania wielospektralnego, aby zbudować bibliotekę spektralną z wcześniej przygotowanych szkiełek kontrolnych wybarwionych pojedynczymi chromogenami i szkiełka barwionego hematoksyliną. Następnie otwórz kostkę obrazu uzyskaną ze slajdu kontrolnego i wybierz od czterech do pięciu dodatnio zabarwionych obszarów, aby optycznie zdefiniować chromogen. Powtarzaj kroki z kostkami obrazu z innych slajdów kontrolnych, aż zostanie utworzona kompletna biblioteka spektralna reprezentująca wszystkie chromogeny, a następnie zapisz bibliotekę spektralną.

Rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu do obrazowania wielospektralnego, wybierając Multispectral lub im3 jako opcję formatu obrazu i Brightfield jako format próbki. Skonfiguruj projekt, wybierając segment tkanki, znajdź obiekty, fenotypowanie, wynik i eksport. W razie potrzeby zmień rozdzielczość obrazu, aby przyspieszyć czas analizy.

Zaimportuj wcześniej utworzoną bibliotekę spektralną i wybierz wszystkie chromogeny, które mają zostać uwzględnione w analizie. Otwórz kostki obrazu, które mają zostać uwzględnione w zestawie danych treningowych, wybierając opcję Otwórz kostkę obrazu. Wybierz co najmniej 18% całkowitej liczby obrazów do analizy, aby zapewnić dokładność treningu.

Następnie wybierz zestaw obrazów do trenowania. Obrazy reprezentujące wszystkie stany chorobowe w celu zwiększenia dokładności segmentacji. Dołącz do zestawu treningowego liczne obrazy barwienia negatywowego, aby uniknąć stronniczości na tym etapie.

Balans bieli obrazów w zestawie treningowym przez wybranie narzędzia Kroplomierz do oczu i wybranie obszaru na jednym obrazie, który jest biały. Wybierz przycisk przechodzenia dalej, aby przesunąć segmentację tkanki. Następnie użyj panelu kategorii tkanek, aby wybrać typy tkanek do analizy w celu dokładniejszej lokalizacji tkanki białkowej, można użyć wybranych kategorii tkanek.

Rozpocznij tworzenie algorytmu i definiowanie kategorii tkanek za pomocą narzędzia Pióro i rysowania wokół grup komórek na obrazach treningowych. Po zakończeniu z jedną kategorią tkanek powtórz ten krok dla innych kategorii tkanek. Pamiętaj, aby wybrać grupy komórek na obrazach, które są charakterystyczne dla typu kategorii tkanki.

Wybierz komponenty, które mają zostać uwzględnione w szkoleniu dla segmentera tkanek. Wybierz odpowiednią skalę wzorca, aby wytrenować segmenter tkanek. Następnie wybierz przycisk wytrenowanego segmentera tkanek.

Obserwuj wyskakujące okienko wyświetlające dokładność proporcji pikseli w prawidłowo sklasyfikowanych regionach treningowych. Podziel cały zestaw obrazów na segmenty, klikając pozycję Segmentuj obrazy. Po zakończeniu przejrzyj zestaw treningowy, aby znaleźć błędnie sklasyfikowaną tkankę za pomocą bieżącego algorytmu uczenia.

Gdy masz pewność co do wyników algorytmu segmentacji tkanek, wybierz przycisk Advance. Upewnij się, że jądra są już wybrane, aby wybrać cytoplazmę i/lub błonę. Wybrać zakładkę jąder i wybrać odpowiednie ustawienia segmentacji jądra.

Następnie wybierz, czy segmentacją mają być objęte poszczególne, czy wszystkie kategorie tkanek. Wybierz podejście progowe oparte na obiekcie przeciwstawnym, aby uzyskać uproszczoną metodę, aby uzyskać dobre wyniki. Następnie wybierz podejście progowe oparte na obiekcie na niezawodnym przeciwbarwieniu jądrowym.

Wybierz parametry w kształcie cytoplazmy, wybierając zakładkę cytoplazmy. Następnie wybierz odległość zewnętrzną do jądra. Następnie wybierz minimalny rozmiar.

Wybierz następny komponent opcji z podstawowym, drugorzędnym i wybierz trzeciorzędny jako drugorzędne opcje. Przejdź do zakładki membrana. Wybierz najpierw dla użytego markera specyficznego dla membrany.

Dostosuj gęstość optyczną lub OD w pełnej skali, aby znaleźć minimalny próg lub dodatni dla każdego markera na błonach komórkowych. Kontynuując na karcie membrany, wybierz maksymalny rozmiar komórki. Po wybraniu wszystkich opcji wybierz segment wszystkich.

Zastosuj ustawienia do obrazów i obserwuj je. Wybierz opcję zaawansowanie, aby przejść do kroku punktacji IHC i wybierz kategorię tkanki, która ma zostać oceniona. Wybierz żądany typ punktacji i wybierz przedział komórek, który ma być używany w analizie punktacji.

Następnie wybierz wyświetl dane komponentów i przesuń kursor nad obrazy treningowe, aby znaleźć odpowiedni minimalny próg barwienia gęstości optycznej dla komórek dodatnich dla interesujących nas składników. Wyeksportuj dane dla zestawu treningowego, aby przetestować algorytm utworzony za pomocą segmentacji tkanek, segmentacji komórek i wartości oceniania, postępuj zgodnie z monitami, aby utworzyć nowy folder dla katalogu eksportu. Wybierz obrazy i tabele, które mają zostać utworzone i uwzględnione w analizie.

Następnie przeprowadź analizę, wybierając opcję Eksportuj dla wszystkich. Po zakończeniu analizy wyświetl dane dotyczące segmentacji komórek i punktacji dla obrazów o wysokim i niskim zabarwieniu, aby ocenić dokładność ustawień. Po uzyskaniu zadowolenia z ustawień kliknij kartę analizy wsadowej, aby skopiować algorytm do aktywnego projektu.

Następnie wybierz nowy katalog eksportu i wybierz obrazy i tabele, które mają zostać uwzględnione w analizie. W opcji plików wejściowych wybierz wszystkie obrazy, które mają zostać uwzględnione w analizie wsadowej. Wybierz opcję uruchom, aby przeprowadzić analizę.

Po zakończeniu przejdź do karty scalania recenzji. Wybierz opcję Uwzględnij wszystko i wybierz pozycję Scal, aby utworzyć arkusze danych z danymi podsumowania do analizy. Trening przeprowadzono na tkankach prostaty w celu segmentacji obrazów na części nabłonkowe i zrębowe.

Wraz z komorą nietkankową. Zestaw obrazów treningowych został zaimportowany do oprogramowania do obrazowania wielospektralnego, reprezentujących typy tkanek i stany chorobowe całego zestawu obrazów. Stworzono kategorie tkanek, w tym zręb, nabłonek i nietkanki, a kategorie zdefiniowano poprzez ręczne rysowanie na obrazach treningowych.

Stworzono algorytm segmentacji tkanek i zastosowano go do zestawu obrazów treningowych. Dokładna segmentacja tkanek. Korzystając z techniki immunohistochemicznej multipleksu, komórki dodatnie pod kątem ekspresji jądrowej ER-alfa widzianej jako czerwona i AR widziana jako brązowa zostały zidentyfikowane pomimo nakładających się sygnałów kolorów i metryk Specyficzną dla błony komórkowej ekspresję CD-147 określono ilościowo za pomocą E-katheryny widzianej jako jako białko markerowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ekspresję białka i kolokalizację, informować i naprawiać tkanki osadzone w parafinie.