Name: Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego oraz obrazowania wielospektralnego. Technika ta eliminuje subiektywność operatora, zwiększając powtarzalność wyników w badaniach naukowych i diagnostyce patologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują laboratorium University of Wisconsin Translational Research Initiatives in Pathology, częściowo wspieranemu przez Wydział Patologii i Medycyny Laboratoryjnej UW oraz grant UWCCC P30 CA014520, za korzystanie z jego obiektów i usług.

<ol><li>Valdman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+redox+pathway+enzymes+in+human+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Quant+Cytol+Histol%22%5BJournal%5D)">Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue.</a> Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+tissue+by+construction+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amplification of tissue by construction of tissue microarrays.</a> Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).</li>
<li>Jonmarker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+PDX-1+in+prostate+cancer%2C+prostatic+intraepithelial+neoplasia+and+benign+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue.</a> APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).</li>
<li>McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarty%2C+KS+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22">Arch Pathol Lab Med</a>. 109 (8), 716-721 (1985).</li>
<li>Volante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+type+2A+immunohistochemistry+in+neuroendocrine+tumors%3A+a+proposal+of+scoring+system+correlated+with+somatostatin+receptor+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy.</a> Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).</li>
<li>Muris, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+profiling+of+caspase+signaling+pathways+predicts+clinical+response+to+chemotherapy+in+primary+nodal+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas.</a> Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).</li>
<li>Jaraj, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interobserver+reproducibility+of+interpretation+of+immunohistochemical+stains+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer.</a> Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).</li>
<li>Peters, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+tissue+organelles+by+a+combination+of+analytical+subcellular+fractionation+and+enzymic+microanalysis%3A+a+new+approach+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology.</a> J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorful+future+of+quantitative+pathology%3A+validation+of+Vectra+technology+using+chromogenic+multiplexed+immunohistochemistry+and+prostate+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays.</a> Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Path%3A+A+Watson-Like+Visit+to+the+Pathology+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab.</a> Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).</li>
<li>Fiore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+multispectral+imaging+in+automated+quantitative+scoring+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Rizzardi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+immunohistochemical+staining+measured+by+digital+image+analysis+versus+pathologist+visual+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring.</a> Diagn Pathol. 7, 42(2012).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fibrillar+collagens+and+extracellular+matrix+of+glandular+benign+prostatic+hyperplasia+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules.</a> PLoS One. 9 (10), e109102(2014).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+is+elevated+in+human+benign+prostatic+hyperplasia+specimens+compared+to+histologically+normal+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Exp+Urol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue.</a> Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).</li>
<li>Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+expression+predicts+biochemical+recurrence+after+prostatectomy+independent+of+histologic+and+pathologic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features.</a> BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finasteride+treatment+alters+tissue+specific+androgen+receptor+expression+in+prostate+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues.</a> Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).</li>
<li>Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+receptor+expression+and+localization+in+benign+prostatic+hyperplasia+varies+with+tissue+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment.</a> Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Ong, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+pathological+immunohistochemistry+scoring+is+more+time-effective+than+conventional+scoring%2C+but+provides+no+analytical+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage.</a> Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zastosowanie tradycyjnej immunohistochemii do oceny ekspresji białek jest ograniczone przez subiektywne, półilościowe metody analizy 22,23. Stworzono zaawansowane platformy do wysokoprzepustowej analizy ekspresji i lokalizacji biomarkerów. Szczegółowa segmentacja zarówno przedziałów tkankowych, jak i subkomórkowych pozwala użytkownikom badać ekspresję, lokalizację i kolokalizację biomarkerów z innymi markerami będącymi przedmiotem zainteresowania. W poprzednich badaniach wykazaliśmy użyteczność IHC i obrazowan...

Immunohistochemia (IHC) jest standardową techniką laboratoryjną do wykrywania białek w tkance, a IHC jest nadal szeroko stosowana zarówno w badaniach, jak i diagnostyce patologicznej. Ocena barwienia IHC jest często częściowo ilościowa, co wprowadza potencjalny błąd systematyczny do interpretacji wyników. Opracowano wiele podejść półilościowych, które uwzględniają zarówno intensywność barwienia, jak i zakres barwienia w ostatecznej diagnozie 1-4. Inne systemy obejmują intensywność punktacji i lokalizację subkomórkową w celu lepszej lokalizacji ekspresji 5. Uwzględnienie średnich wyników od wielu widzów jest często wykorzystywane w celu zminimalizowania skutków stronniczości jednego widza 6. Pomimo tych wysiłków, subiektywizm w analizie nadal pozostaje, szczególnie przy ocenie zakresu barwienia 7. Standaryzacja protokołów i minimalizacja subiektywności wynikającej z wkładu człowieka ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych, powtarzalnych wyników IHC.
Istnieją inne opcje oprócz IHC do określania ekspresji białek w tkankach. W środowisku badawczym immunohistochemia jest tradycyjnie postrzegana jako sposób na badanie lokalizacji białek 8, podczas gdy inne techniki, takie jak immunoblotting, są postrzegane jako złoty standard w badaniu ekspresji białek. Określenie ekspresji specyficznej dla tkanki lub przedziału komórkowego jest trudne bez zastosowania zaawansowanych technik, takich jak frakcjonowanie komórek lub mikrodysekcja laserowa 9,10. Zastosowanie przeciwciał fluorescencyjnych na szkiełkach tkankowych stanowi rozsądny kompromis, ale autofluorescencja tła spowodowana NADPH, lipofuscynami, włóknami siatkowatymi, kolagenem i elastyną może utrudnić dokładne określenie ilościowe 11.
Zautomatyzowane platformy patologii obliczeniowej są obiecującym kierunkiem dla bardziej obiektywnej oceny ilościowej barwienia patologii 12-15. Połączenie obrazowania wielospektralnego z mikromacierzami tkankowymi ułatwia wysokoprzepustową analizę ekspresji białek w dużych próbkach. Dzięki tym technikom możliwa jest analiza kolokalizacji białek, niejednorodności barwienia oraz lokalizacji tkankowej i subkomórkowej, przy jednoczesnym znacznym zmniejszeniu zarówno wrodzonych uprzedzeń, jak i czasu niezbędnego do analizy, przy jednoczesnym zwracaniu danych w formacie ciągłym, a nie kategorycznym 16. Dlatego celem tego badania było wykazanie użyteczności i metodologii wykonywania multipleksowanej immunohistochemii z analizą, przy użyciu oprogramowania do obrazowania wielospektralnego.
Ten protokół jest napisany do ręcznego, multipleksowego barwienia immunohistochemicznego pojedynczego szkiełka tkankowego z czterema zoptymalizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi. Jako reprezentatywny eksperyment, jądrowy receptor estrogenowy alfa (ERα) i receptor androgenowy (AR) są multipleksowane z błoną anty-mysią CD147 i związaną błoną anty-myszą E-kadheryną. Dowolne przeciwciało z wyboru może zostać zastąpione przeciwciałami wymienionymi w niniejszym dokumencie, ale każda kombinacja przeciwciał wymaga oddzielnej optymalizacji. Wstępne leczenie wszystkich przeciwciał musi być identyczne. Przeciwciała AR i CD147 powinny być optymalizowane indywidualnie, a następnie jako koktajl. Każde przeciwciało jest wykrywane za pomocą systemu polimerowego wolnego od biotyny i jednego z 4 unikalnych chromogenów.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>Ocena NFPA: Zdrowie &ndash; 2, Ogień &ndash; 3 , Reaktywność &ndash; 0</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy-200 proof</td><td>Fisher Scientific 4355223</td><td></td><td>Ocena NFPA: Zdrowie &ndash; 0, Ogień &ndash; 3 , Reaktywność &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Ocena NFPA: Zdrowie &ndash; 2, Ogień &ndash; 0 , Reaktywność &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>NFPA ocena: Zdrowie &ndash; 2, Ogień &ndash; 0 , Reaktywność &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>Ocena NFPA: Zdrowie &ndash; 0, Ogień &ndash; 1 , Reaktywność &ndash; 0</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>Ocena NFPA: Zdrowie &ndash; 1, Ogień &ndash; 0 , Reaktywność &ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroxidazed</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Może powodować podrażnienie skóry i uszkodzenie oczu.</td></tr><tr><td>Receptor estrogenowy alfa</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>Receptor androgenowy</td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>CD147</td><td>Biodesign</td><td>P87535M</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>E-kadheryna</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>Renoir Red Andibody Diluent</td><td>Biocare Medyczny</td><td>PD904</td><td>Jest specjalnie zaprojektowany do pracy z przeciwciałami na bazie Tris</td></tr><tr><td>Komora DeCloakingowa&nbsp;</td><td>Biocare</td><td>Medical Model DC2002</td><td>Podejmij normalne środki ostrożności podczas korzystania z szybkowaru</td></tr><tr><td>Długopis barierowy-Immuno Edge&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do denaturacji-etap elucji</td><td>Biocare Medical</td><td>DNS001H</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>RALP525</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>Mach 2 Goat anty-mysi polimer</td> <td>HRPBiocare Medical</td><td>M3M530</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>Betazoid DAB Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. Wiadomo, że DAB jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. 2. Nie wystawiaj komponentów DAB na działanie silnego światła lub bezpośredniego światła słonecznego. 3. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i odzież. 4. DAB może powodować uczulenie skóry. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Przestrzegaj wszystkich federalnych, stanowych i lokalnych przepisów środowiskowych dotyczących utylizacji</td></tr><tr><td>Warp Red Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>Corrosive. Kwas, który może powodować podrażnienie skóry lub uszkodzenie oczu.</td></tr><tr><td>Vina Green Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>Działa szkodliwie po połknięciu</td></tr><tr><td>Bajoran Purple Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>Łatwopalna ciecz. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, płomieni i iskier. Działa szkodliwie po spożyciu lub wchłonięciu. Unikać kontaktu ze skórą lub oczami i unikać wdychania.</td></tr><tr><td>Kot Hematoxylin</td><td>Biocare Medyczny</td><td>CATHE Fioletowy</td><td>&nbsp; Rozwiązanie &nbsp; z &nbsp; a &nbsp; łagodny &nbsp; octowy &nbsp; Kwas &nbsp; (ocet winny) &nbsp; zapach. &nbsp; Maj &nbsp; be &nbsp; irytujące &nbsp; do &nbsp; Skóra &nbsp; lub &nbsp; oczy. &nbsp; Unikaj &nbsp; Kontakt &nbsp; z &nbsp; Skóra &nbsp; oraz &nbsp; oczy. &nbsp; Unikaj &nbsp; Spożyciu.</td></tr><tr><td>XYL Nośnik montażowy</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>Ocena NFPA: Zdrowie &ndash; 2, Ogień &ndash; 3 , Reaktywność &ndash; 0</td></tr><tr><td>1.5 Szkiełka nakrywkowe</td><td>Marka Fisher 22266858</td><td></td><td>Ostre krawędzie</td></tr><tr><td>Inkubacja (wilgotność)Komora</td><td>przestarzała przestarzała</td><td>Dostępnych</td><td>jest wielu dostawców</td></tr><tr><td>Piec konwekcyjny</td><td>Stabil- Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>Tło Odczynnik blokujący Punisher</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>Ten produkt nie jest klasyfikowany jako niebezpieczny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie inForm</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>Podstawowe oprogramowanie do obrazowania wielospektralnego używane w manuskryptach</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nuance</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>Oprogramowanie służące do tworzenia bibliotek spektralnych w rękopisie</td></tr><tr><td>Mikroskop Vectra i skaner preparatów</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>Automatyczny skaner preparatów i mikroskop do uzyskiwania kostek obrazu IM3</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemia jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania klinicznego i badawczego do badania ekspresji i lokalizacji białek w tkankach. Opracowano wiele półilościowych systemów oceny ekspresji za pomocą immunohistochemii, ale nieodłączna subiektywność ogranicza odtwarzalność i dokładność wyników. Co więcej, badanie przestrzennie nakładających się biomarkerów, takich jak jądrowe czynniki transkrypcyjne, jest trudne przy użyciu obecnych technik immunohistochemicznych. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy system do jednoczesnego badania wielu białek przy użyciu wysokoprzepustowych metod immunohistochemii multipleksowanej i obrazowania wielospektralnego. Immunohistochemia multipleksowa jest przeprowadzana przez sekwencyjne stosowanie przeciwciał pierwszorzędowych z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną. Do wykrywania każdego interesującego białka stosuje się różne chromogeny. Wybarwione preparaty są ładowane do automatycznego skanera slajdów i tworzony jest protokół do automatycznego pozyskiwania obrazów. Biblioteka spektralna jest tworzona przez barwienie zestawu szkiełek pojedynczym chromogenem na każdym z nich. Podzbiór reprezentatywnych barwionych obrazów jest importowany do oprogramowania do obrazowania wielospektralnego, a algorytm rozróżniania typu tkanki jest tworzony poprzez zdefiniowanie przedziałów tkankowych na obrazach. Przedziały subkomórkowe są segmentowane za pomocą barwienia przeciwstawnego hematoksyliny i dostosowania wewnętrznego algorytmu. Progowanie stosuje się w celu określenia dodatniości i kolokalizacji białek. Ostateczny algorytm jest następnie stosowany do całego zestawu tkanek. Uzyskane dane pozwalają użytkownikowi ocenić ekspresję białka w oparciu o typ tkanki (np. nabłonek vs. zrąb) i przedział subkomórkowy (jądro vs. cytoplazma vs. błona plazmatyczna). Analiza kolokalizacji pozwala na badanie podwójnie dodatnich, podwójnie ujemnych i jedno-dodatnich typów komórek. Połączenie obrazowania wielospektralnego z immunohistochemią multipleksową i zautomatyzowaną akwizycją obrazu jest obiektywną, wysokoprzepustową metodą badania biomarkerów w tkankach.

Na Rysunku 1 przeprowadzono trening na tkankach prostaty w celu segmentacji obrazów na części nabłonkowe i zrębowe, wraz z przedziałem nietkankowym. Przy użyciu markera błony nabłonkowej E-cadherin przeprowadzono segmentację komórek w celu oddzielenia części jądra, cytoplazmy i błony, co przedstawiono na Rysunku 2.
W jednym z eksperymentów zastosowaliśmy multipleksową IHC, aby zbadać ekspresję i...

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Ogólnym celem tej metody jest obiektywne ilościowe określenie ekspresji i kolokalizacji białek z wykorzystaniem obrazowania wielospektralnego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w obszarze podstawowych badań naukowych i patologii diagnostycznej, takie jak sposób, w jaki zmienia się ekspresja i lokalizacja białek po zastosowaniu leczenia lub w miarę postępu choroby. Główną zaletą tej techniki jest wyeliminowanie subiektywizmu operatora, który jest nieodłączną cechą tradycyjnych metod ilościowych.Aby rozpocząć proces kwantyfikacji, otwórz oprogramowanie do obrazowania multispektralnego w celu zbudowania biblioteki widm z wcześniej przygotowanych slajdów kontrolnych barwionych pojedynczymi chromogenami oraz slajdu barwionego hematoksyliną. Następnie otwórz kostkę obrazu pozyskaną ze slajdu kontrolnego i wybierz od czterech do pięciu obszarów wybarwionych dodatnio, aby optycznie zdefiniować chromogen. Powtarzaj te kroki z kostkami obrazów z pozostałych slajdów kontrolnych, aż do utworzenia pełnej biblioteki widm reprezentującej wszystkie chromogeny, a następnie zapisz bibliotekę widm.Rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu do obrazowania wielospektralnego, wybierając Multispectral lub im3 jako opcję formatu obrazu oraz Brightfield dla formatu próbki. Skonfiguruj projekt, wybierając segment tissue, find features, phenotyping, score oraz export. W razie potrzeby zmień rozdzielczość obrazu, aby przyspieszyć czas analizy.Zaimportuj wcześniej stworzoną bibliotekę widm i wybierz wszystkie chromogeny, które mają zostać uwzględnione w analizie. Otwórz kostki obrazów do zestawu danych treningowych, wybierając opcję Open Image Cube. Wybierz co najmniej 18% całkowitej liczby obrazów do analizy, aby zapewnić dokładność treningu.Następnie należy wybrać zestaw obrazów treningowych. Obrazy powinny reprezentować wszystkie stany chorobowe, aby zwiększyć dokładność segmentacji. Do zestawu treningowego należy włączyć liczne obrazy z barwieniem negatywowym, aby uniknąć błędu systematycznego na tym etapie.Wykonaj balans bieli dla obrazów w zbiorze treningowym, wybierając narzędzie pipety i wskazując obszar w jednym z obrazów, który jest biały. Kliknij przycisk advance, aby przejść do segmentacji tkanek. Następnie użyj panelu kategorii tkanek, aby wybrać rodzaje tkanek do analizy; w celu dokładniejszej lokalizacji białek w tkankach można wykorzystać kategorie tkanek.Rozpocznij tworzenie algorytmu i definiowanie kategorii tkanek, używając narzędzia pióro do obrysowywania grup komórek na obrazach treningowych. Po zakończeniu pracy nad jedną kategorią tkanki powtórz ten krok dla pozostałych kategorii. Upewnij się, że wybierasz grupy komórek na obrazach, które są charakterystyczne dla danego typu kategorii tkanki.Wybierz komponenty, które mają zostać uwzględnione w treningu segmentatora tkanek. Wybierz odpowiednią skalę wzorca do wytrenowania segmentatora tkanek. Następnie kliknij przycisk wytrenuj segmentator tkanek.Obserwuj okno pop-up wyświetlające dokładność proporcji pikseli w prawidłowo zaklasyfikowanych obszarach treningowych. Segmentuj cały zestaw obrazów treningowych, klikając przycisk segment images. Po zakończeniu przejrzyj zestaw treningowy, aby zidentyfikować wszelkie błędnie sklasyfikowane tkanki przy użyciu aktualnego algorytmu treningowego.Po upewnieniu się co do wyników algorytmu segmentacji tkanek należy wybrać przycisk advance. Przed wyborem cytoplazmy i/lub błony należy upewnić się, że zaznaczone są jądra komórkowe. Wybierz zakładkę nuclei i ustaw odpowiednie parametry segmentacji jąder.Następnie należy zdecydować, czy w segmentacji zostaną uwzględnione poszczególne, czy wszystkie kategorie tkanek. Wybierz podejście oparte na progu obiektu barwienia kontrastowego (counterstain object based threshold), aby zastosować uproszczoną metodę pozwalającą na uzyskanie dobrych wyników. Następnie wybierz podejście oparte na progu obiektu (object based threshold) przy zastosowaniu wiarygodnego barwienia kontrastowego jąder komórkowych.Wybierz parametry kształtu cytoplazmy, wybierając zakładkę cytoplasm. Następnie wybierz odległość zewnętrzną do jądra (outer distance to nucleus). Następnie wybierz rozmiar minimalny (minimum size).Wybierz kolejny komponent opcji z opcjami główną, wtórną i wybierz trzeciorzędną jako opcje wtórne. Przejdź do karty błony. Wybierz pierwszy marker specyficzny dla błony, który został użyty.Dostosuj pełną skalę gęstości optycznej lub OD, aby wyznaczyć próg minimalny lub wartość dodatnią dla każdego markera na błonach komórkowych. Następnie, w zakładce błona (membrane), wybierz maksymalny rozmiar komórki. Po wybraniu wszystkich opcji wybierz pole segmentuj wszystko (segment all).Zastosuj ustawienia do obrazów i poddaj je obserwacji. Wybierz opcję advance, aby przejść do etapu oceny IHC, a następnie wybierz kategorię tkanki do oceny. Wybierz pożądany typ oceny oraz przedział komórkowy, który zostanie wykorzystany w analizie oceny.Następnie wybierz opcję wyświetlania danych komponentów i przesuń kursor nad obrazy treningowe, aby znaleźć odpowiedni minimalny próg gęstości optycznej barwienia dla komórek pozytywnych w odniesieniu do interesujących nas komponentów. Wyeksportuj dane dla zbioru treningowego, aby przetestować algorytm stworzony poprzez segmentację tkanki, segmentację komórek i wartości punktacji; postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nowy folder dla katalogu eksportu. Wybierz obrazy oraz tabele, które mają zostać utworzone i uwzględnione w analizie.Następnie przeprowadź analizę, wybierając opcję eksportu dla wszystkich (export for all). Po zakończeniu analizy przejrzyj dane dotyczące segmentacji komórek i punktacji dla obrazów o wysokim i niskim stopniu barwienia, aby ocenić dokładność ustawień. Po upewnieniu się, że ustawienia są poprawne, przejdź do karty analizy seryjnej (batch analysis), aby skopiować algorytm do aktywnego projektu.Następnie należy wybrać nowy katalog eksportu oraz zaznaczyć obrazy i tabele, które mają zostać uwzględnione w analizie. W opcji plików wejściowych (input files) należy wybrać wszystkie obrazy, które mają zostać objęte analizą seryjną. Wybierz opcję uruchomienia (run), aby przeprowadzić analizę.Po zakończeniu przejdź do karty przeglądu i łączenia (review merge). Wybierz opcję „dołącz wszystko” (include all) i kliknij „połącz” (merge), aby utworzyć arkusze danych z danymi podsumowującymi do analizy. Trening przeprowadzono na tkankach prostaty w celu segmentacji obrazów na części nabłonkową i zrębową.Wraz z przedziałem nietkankowym. Do oprogramowania do obrazowania wielospektralnego zaimportowano zestaw obrazów szkoleniowych reprezentujących typy tkanek i stany chorobowe całego zestawu obrazów. Utworzono kategorie tkanek, obejmujące zręb, nabłonk i obszary nietkankowe, a kategorie zdefiniowano poprzez ręczne zaznaczanie obszarów na obrazach szkoleniowych.Opracowano algorytm segmentacji tkanek, który zastosowano do zbioru treningowego obrazów, aby precyzyjnie wyodrębnić tkanki. Przy zastosowaniu techniki wielokrotnej immunohistochemii zidentyfikowano komórki wykazujące ekspresję jądrową ER-alpha (kolor czerwony) oraz AR (kolor brązowy), mimo nakładających się sygnałów kolorystycznych i metrycznych. Ekspresję CD-147 specyficzną dla błony komórkowej określono ilościowo, wykorzystując E-kadherynę (kolor czarny) jako białko markerowe.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić ekspresję białek oraz ich ko-lokalizację w tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.

quantitation-protein-expression-co-localization-using-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Poznaj metodę kwantyfikacji ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego oraz obrazowania wielospektralnego. Technika ta eliminuje subiektywność operatora, zwiększając powtarzalność wyników w badaniach naukowych i diagnostyce patologicznej.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Przeglądaj więcej filmów