Wykrywanie biomarkerów ludzkiego antygenu leukocytów w raku piersi z wykorzystaniem technologii biosensorów bez znaczników

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar ludzkiego antygenu leukocytarnego lub antygenów nowotworowych związanych z HLA w płynach pacjenta w celu stratyfikacji pacjentów do odpowiedniej immunoterapii. Osiąga się to poprzez unieruchomienie przeciwciał naśladujących receptor limfocytów T, znanych jako TCRM, na powierzchni MICROPLATE. Drugim krokiem jest dodanie próbki pacjenta wraz z seryjnym rozcieńczeniem monomerów HLA peptydu docelowego w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, która pozwala na ilościowe określenie docelowego antygenu w próbkach pacjentów.

Następnie monitorowane jest wiązanie antygenu docelowego z przeciwciałem w systemie testów biologicznych z wolną etykietą, aż do osiągnięcia równowagi. Ostatnim krokiem jest analiza uzyskanych danych przy użyciu krzywej standardowej do ilościowego określenia ilości docelowego antygenu w próbkach pacjentów. Ostatecznie, technologia biosensorów bez znaczników jest wykorzystywana do wykrywania biomarkerów nowotworowych w próbkach pobranych od pacjentów.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak lc MSS, jest szybkie, wysokowydajne wykrywanie antygenów związanych z HLA. Pozwala to na szybką stratyfikację pacjentów z rakiem w zależności od metod leczenia, ponieważ służy jako platforma do wykrywania biomarkerów. Chociaż metoda ta jest związana z badaniami przesiewowymi biomarkerów raka, system ma zastosowanie w wielu zastosowaniach, w tym w testach komórkowych, hybrydowych badaniach przesiewowych immunofenotypowania lub badaniach przesiewowych bibliotek małych cząsteczek.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy opracowywaliśmy terapeutyczne przeciwciało naśladujące receptor limfocytów T. Zadaliśmy sobie pytanie, w jaki sposób zidentyfikowalibyśmy pacjentów, którzy odnieśliby największe korzyści z tego typu terapii? Tę procedurę zademonstruje Kristen Dahl, doktorantka biotechnologii pracująca w moim laboratorium.

Rozpocznij od wstępnej inkubacji soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aby zminimalizować zmiany rezonansu związane z temperaturą. Dodaj 50 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS o pH 7,2 do studzienek płytek pokrytych pochodną awadonu. Następnie otwórz oprogramowanie skanera testów biologicznych.

Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora konfiguracji, aby zdefiniować procedurę eksperymentalną, która obejmuje wybór ślepych prób, wzorców i próbek w układzie płytki, ustawienie temperatury, liczbę skanów na minutę i długość eksperymentu. Następnie włóż przygotowaną płytkę testową do bezpłatnego skanera testów biologicznych i rozpocznij pierwsze skanowanie. Punktem odniesienia jest początkowy zestaw skanów zebranych na początku eksperymentu.

Jeśli jest to pierwszy odczyt wykonywany na tej konkretnej płytce, pozwól skanerowi pracować wystarczająco długo, aby zrównoważyć temperaturę i wyeliminować dryft w linii bazowej. Po ustabilizowaniu się linii bazowej lub po co najmniej pięciu skanowaniach wstrzymaj odczyt i wysuń płytkę. Wylej PBS i dodaj 50 mikrolitrów RL 21, biotynylowanego przeciwciała, do wszystkich dołków kontrolnych na płytce, z wyjątkiem studzienek kontrolnych.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS do studzienek kontrolnych. Następnie włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów odczyt, aż do osiągnięcia nasycenia. Po około 1,5 godziny wstrzymaj odczyt i wysuń płytkę.

Następnie umyj płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami na studzienkę PBS plus 0,05% Tween 20 lub PBST. Po umyciu wykonaj trzy płukania po 200 mikrolitrów na studzienkę PBS pH 7,2 bez detergentu. Postukaj nadmiar PBS z talerza na ręczniki papierowe przed przejściem do następnego kroku.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS do wszystkich aktywnych studzienek. Następnie włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów odczyt, aby monitorować rezonans po praniu. Po odczytaniu przerwij odczyt i wysuń płytę.

Aby dodać analit. Usunąć PBS i dodać 50 mikrolitrów na studzienkę odpowiedniego buforu testowego dla tego testu. Dostępną w handlu normalną surowicę ludzką rozcieńczono od 1 do 20 w PBS.

Następnie otwórz oprogramowanie skanera testów biologicznych i postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora konfiguracji. Aby zdefiniować procedurę eksperymentalną, włóż płytkę do skanera testów biologicznych i rozpocznij odczyt linii bazowej Po ustabilizowaniu się linii bazowej lub po co najmniej pięciu skanach wstrzymaj odczyt i wysuń płytkę. Następnie usunąć bufor testowy ze studzienek.

Następnie nakłuć kontrole monomerem HLAA oh 2 0 1 zawierającym istotne lub nieistotne peptydy w stężeniach od 0,625 do 10 mikrogramów na mililitr w buforze testowym. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wzorców do studzienek kontrolnych płytki. Następnie dodaj 50 mikrolitrów analitu w buforze testowym do dołków na próbki płytki.

Do tego testu użyto wzbogaconej dostępnej na rynku surowicy ludzkiej. Włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów odczyt, aż nasycenie zostanie osiągnięte około 30 do 60 minut po nasyceniu, wstrzymaj odczyt i wysuń płytkę. Przystąpić do trzykrotnego mycia płytki 200 mikrolitrami na studzienkę PBST, a następnie trzykrotnie płukać 200 mikrolitrami na studzienkę PBS, jak poprzednio, a następnie dodać 50 mikrolitrów buforu do oznaczania do wszystkich aktywnych studzienek.

Teraz włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów czytanie, aby monitorować rezonans po umyciu przed zatrzymaniem odczytu i wysunięciem płytki. Na koniec przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania skanera testów biologicznych lub wyeksportuj pliki surowych danych do preferowanego oprogramowania do analizy statystycznej. Oprogramowanie skanera do testów biologicznych automatycznie generuje krzywą wiązania na podstawie układu płytki dostarczonego podczas konfiguracji eksperymentalnej.

Biotynylowany RL 21 A-T-C-R-M lub IgG dwa A unieruchomiono na płytce testowej AVID AVIDAN, reprezentatywne wyniki wskazują na wykrycie docelowego antygenu nowotworowego F-L-S-L-H-L-A w próbce osocza pacjenta w stanie równowagi i po umyciu. IgG dwa A stosuje się jako kontrolę dla niespecyficznych skrawków tkanki wiążącej, które barwiono kontrolą pozytywną i kontrolami ujemnymi. A dla RL 21 barwienie tkanki nowotworowej przez RL 21 A potwierdza obecność kompleksów F-L-S-L-H-L-A.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć biomarkery związane z HLA w płynach pacjenta za pomocą przeciwciał naśladujących receptor limfocytów T i monitorować wiązanie docelowego antygenu z przeciwciałem w systemie testów biologicznych bez znaczników. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o inkubacji wszystkich próbek przed użyciem, aby uniknąć skoków temperatury i używać właściwego bufora próbki dla każdego etapu.