Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zapewnienie łatwego i wszechstronnego rozwiązania do monitorowania różnych reaktywnych form tlenu lub ROS i ich lokalizacji oraz zapewnienie dalszego wglądu w mechanizmy komórkowe związane z ROS. Osiąga się to poprzez wykonanie trzech różnych testów, z których pierwszy wykorzystuje koraliki RST w kolorze zielonym lub powlekane OB G oraz mikroskopię na żywo, fluoresceinę i Alexę. Fluor 594 są kowalencyjnie sprzężone z powierzchnią trzech mikronów kulek sica za pośrednictwem BSA.

Emisja fluorescencji z fluoresceiny OBG wskazuje na utlenianie przez ROS, podczas gdy sygnał z Alexa Fluor 594 pomaga zlokalizować kulki i służy jako kontrola kwantyfikacji fluorescencji. Druga metoda wykorzystuje czułą na ponadtlenek sondę dihydro etydynę lub DHE w teście opartym na czytniku płytek. W wyniku utleniania przez ponadtlenk, etydyna jest zdolna do interkalacji do jądrowego i mitochondrialnego DNA oraz przesunęła szczyty wzbudzenia i emisji odpowiednio o 522 nanometry i 605 nanometrów.

Intensywność fluorescencji AUM odpowiada wielkości produkcji ponadtlenkowej, co pozwala na ilościowy pomiar wewnątrzkomórkowego wytwarzania ponadtlenków w komórkach. Trzecią metodą jest również test oparty na czytniku płytek. Wrażliwa na nadtlenek wodoru sonda plex ultra red lub UR służy do ilościowego pomiaru zewnątrzkomórkowej produkcji nadtlenku wodoru.

Intensywność fluorescencji UR OX odpowiada ilości nadtlenku wodoru wytwarzanego na zewnątrz komórek. Uzyskano wyniki, które pokazują lokalizację dynamicznego generowania ROS na podstawie testów O-B-G-D-H-E i UR. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak OB GSA oparte na szybkości płytki, jest to, że dynamicznie wizualizuje generację Al Rotha na poziomie pojedynczej komórki.

Zamiast odzwierciedlać i uśredniać sygnał Rotha z populacji komórek. Takie metody uśredniania populacji mają tendencję do zaciemniania krytycznych informacji z powodu niesynchronicznej fagocytozy. Aby rozpocząć procedurę kodowania kulek za pomocą tlenu, Burta Greena lub OBG, dodaj jeden mililitr zawiesiny karboksylowanych kulek krzemionkowych o grubości 3,0 mikrona do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Szybko zakręć probówką, usuń supernatant. Dodaj jeden mililitr PBS i wiruj w ten sposób. Umyj koraliki trzykrotnie za pomocą PBS.

Po trzecim praniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki. W jednym mililitrze PBS zawierającym 25 miligramów na mililitr cyjanku, roztwór cyjanku musi być świeżo przygotowany za każdym razem przed użyciem inkubować na kole przez 15 minut. Spowoduje to aktywację karboksylowanych kulek krzemionki w celu kowalencyjnego związania wstępnie znakowanego BSA po 15 minutach, odwirowania probówki, usunięcia supernatantu.

Dodać jeden mililitr bufora sprzęgającego i trzykrotnie przepłukać wirem buforem sprzęgającym przez szybkie wirowanie i wirowanie w celu usunięcia nadmiaru cyjanku, wymieszać umyte kulki z 500 mikrolitrami buforu sprzęgającego zawierającego jeden miligram OBGH dwa H-F-F-B-S-A, a następnie napełnić probówkę gazowym azotem ze standardowej puszki z gazem. Po zamknięciu probówki inkubowanej na kole przez 14 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności następnego dnia, schłodzić niereaktywny OBG poprzez dwukrotne przemycie kulek jednym mililitrem buforu hartowniczego przez szybkie wirowanie i wirowanie, a następnie przemyć dwukrotnie buforem sprzęgającym w celu usunięcia buforu hartującego. Po usunięciu supernatantu dodać jeden mililitr buforu sprzęgającego zawierającego 50 mikrogramów LOR 594 cin środkowego estru do koniugacji z BSA.

Napełnij probówkę nasadką azotową i inkubuj na kole przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Pod koniec 1,5 godzinnej inkubacji zatrzymać reakcję, przemywając kulki trzykrotnie jednym mililitrem buforu hartującego. Następnie trzykrotnie myje się koraliki jednym mililitrem PBS.

Na koniec, Ray, zawieś koraliki w jednym mililitrze PBS z dwoma mikrolitrami o wadze 10% na objętość. Azydek do długotrwałego przechowywania. Zmierz stężenie kulek w zawiesinie za pomocą hemocytometru, zwykle jest to od jednego do dwóch razy od 10 do dziewiątych kulek na mililitr.

Napełnij probówkę nakrętką azotową i przechowuj ją w ciemności o czterech stopniach Celsjusza. Rozpocznij tę procedurę od zebrania wykładniczo rosnących komórek alium z 10-centymetrowej płytki szalki Petriego. Różne gęstości komórek na trzycentymetrowych szalkach z optycznie przezroczystym dnem z tworzywa sztucznego lub szkła i hoduj je przez noc następnego ranka.

Wybierz potrawy, które są w około 80% zlewające się do wykorzystania w eksperymencie. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką o niskim przepływie lub pożywką LF i inkubuj przez dwie godziny przed eksperymentem w celu zmniejszenia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzendosomalnej autofluorescencji pożywki hodowlanej HL 5C. Rozpuść 10 mililitrów 1,5% agaru BDO w podłożu LF i wylej agar na płaską powierzchnię, aby utworzyć warstwę agaru o grubości około jednego milimetra.

Poczekaj od 10 do 15 minut, aż agar stężeje. Pokrój warstwę agaru na kwadraty o wymiarach dwa na dwa centymetry i umieść w podłożu LF na później. Używać. Napraw mikroskop szerokokątny.

Ustaw temperaturę komory środowiskowej na 22 stopnie Celsjusza i dostosuj ustawienia wymagane do eksperymentu. Po dwóch godzinach inkubacji odessać pożywkę LF z trzycentymetrowej szalki, ale pozostawić monowarstwę komórki przykrytą cienką warstwą pożywki. Rozcieńczyć wcześniej przygotowane kulki pokryte OBG 1,5 razy 10 do siódmych kulek na mililitr i dodać 10 mikrolitrów na warstwę komórkową.

Weź jeden kwadratowy arkusz agaru i odcedź nadmiar płynu, ale agar powinien być mokry. Delikatnie połóż kwadrat agaru na wierzchu warstwy komórek. Nakładka agarowa zwiększa kontakt między kulkami a komórkami, poprawiając w ten sposób wchłanianie.

Lekko kompresuje również komórki, utrzymując je lepiej w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Umieść pokrywkę na naczyniu Dla powodzenia eksperymentu. Nie przesuwaj nakładki AGA, gdy zakrywa ona komórki, a także bardzo ważne jest, aby natychmiast rozpocząć etap obrazowania.

Następnie umieść czaszę na stoliku mikroskopu i automatycznie rób zdjęcia w kanale czerwonym, zielonym i fazowym co minutę przez dwie godziny lub dłużej. Aby zmierzyć produkcję ROS, wybierz i skup się na zdarzeniach komórkowych, które zawierają cały proces fagocytozy. Korzystając z profesjonalnego oprogramowania do przetwarzania obrazu, połącz zoptymalizowane trzy kanały i złóż obrazy w film.

Określ ilościowo intensywność fluorescencji każdego z wybranych koralików w kanałach czerwonym i zielonym. Stosunek koloru czerwonego do zielonego będzie odzwierciedlał dynamiczną produkcję FOMO R os w komórkach. Aby najpierw zmierzyć wewnątrzkomórkową produkcję ponadtlenku, zbierz 180% zlewane naczynie z alium w 10 mililitrach pożywki HL z pięcioma C, a następnie odwiruj komórki alu przy 850 razy G przez pięć minut i ostrożnie i całkowicie zassaj komórki do zawieszenia rezolu w komórkach buforowych SS 6.4 i rozcieńczyć do końcowej gęstości sześć razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki białej, nieprzezroczystej 96-dołkowej płytki, rozcieńczonej dihydroetydyną lub DHE, 500-krotnie z buforem SS 6,4. A następnie użyj pipety wielokanałowej, aby dozować 50 mikrolitrów rozcieńczonego DHE do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Końcowe stężenie DHE wynosi 30 mikromolowych.

Reakcja rozpocznie się natychmiast. Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami. Inkubować komórki z pożywką, wstrząsając w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Odczytuj fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych co dwie minuty przez godzinę. Użyj trybu odczytu od góry punktu końcowego ze wzbudzeniem fluorescencji na 522 nanometrach i emisją na 605 nanometrach. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 96-dołkowej płytki z komórkami dium, jak pokazano w poprzednim segmencie.

Przygotuj rozcieńczoną peroksydazę chrzanowego lub HRP, dodając pięć mikrolitrów bulionu HRP do 10 mililitrów buforu SS 6,4. Odwróć rurkę, aby dobrze wymieszać i trzymaj na lodzie. Rozcieńczony roztwór HRP ma zawartość 0,05 jednostki na mililitr.

Przygotować mieszaninę reakcyjną plex ultra red lub UR, mieszając podstawowy UR i rozcieńczony roztwór HRP z buforem SS 6,4 do końcowych stężeń 6,25. Mikromolowy a UR i 0,005 jednostki na mililitr. HRP dodać 50 mikrolitrów mieszaniny UR do każdej studzienki.

Reakcja rozpocznie się natychmiast. Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami. Inkubować komórki z pożywką, wstrząsając w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Odczytuj fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych co dwie minuty przez godzinę. Użyj trybu odczytu od góry punktu końcowego ze wzbudzeniem fluorescencji na 530 nanometrach i emisją na 590 nanometrach. Skuteczność powlekania fluoresceiny OB g bada się przy użyciu nadtlenku wodoru i HRP do utleniania powlekanych kulek in vitro i sprawdzając widmo emisyjne za pomocą wzbudzenia przy 500 nanometrach.

Jak pokazano na tym wykresie, utlenione kulki wykazują znaczny szczyt emisji na poziomie 538 nanometrów w porównaniu z nieutlenionymi kulkami o współczynniku intensywności co najmniej 11 do 12 razy. Wytwarzanie ROS w fagosomach w komórkach dium można wizualizować jakościowo i dynamicznie za pomocą mikroskopii, jak pokazano na tym reprezentatywnym filmie poklatkowym nagrywanym przez 40 minut przy użyciu sześciokrotnego powiększenia w ciągu pierwszej minuty po wzroście. W wyniku fagocytozy fluorescencja kulek pokrytych fluoryzacją OBG zmieniła się z czerwonej na jasnopomarańczową, co wskazuje, że ROS prawdopodobnie były wytwarzane bezpośrednio wewnątrz fagosomów.

Wewnątrzkomórkowa produkcja nadtlenku i zewnątrzkomórkowego nadtlenku wodoru jest mierzona ilościowo odpowiednio za pomocą testów DHE i UR. Przedstawiono podsumowanie reakcji biochemicznych związanych z tymi dwoma testami. Nadtlenek jest przekształcany w nadtlenek wodoru przez dysmutazę ponadtlenkową lub SOD, a nadtlenek wodoru jest przekształcany w wodę i tlen przez katalazę w teście DHE.

Czytnik mikropłytek służy do średnioprzepustowego pomiaru ilościowego wewnątrzkomórkowego ponadtlenku. Reprezentatywny eksperyment pokazuje, że po stymulacji lipopolisacharydem LPSA z E. coli, dynamiczna produkcja ponadtlenków z dwóch komórek AX jest znacznie wyższa niż poziom podstawowy z niestymulowanych dwóch komórek AX, a tło reakcji w buforze, spadek niebieskiej fluorescencji i wzrost czerwonej fluorescencji są odwrotnie skorelowane. Zgodnie z oczekiwaniami.

Lokalizacja produkcji R os mierzona za pomocą testu DHE jest potwierdzona następującymi wynikami. Dodanie inhibitora dysmutazy ponadtlenkowej przepuszczalnego przez błonę D-E-D-T-C-A zwiększyło sygnał DHE w sposób zależny od dawki, co wskazuje, że D-E-D-T-C spowodował akumulację substratu dysmutazy ponadtlenkowej. Alternatywnie, dodanie membranowego wygaszacza nadtlenku wodoru IMP nie wpłynęło na produkcję ponadtlenków w teście A UR.

Czytnik mikropłytek służy do średnioprzepustowego pomiaru ilościowego zewnątrzkomórkowej produkcji nadtlenku wodoru. Reprezentatywny eksperyment pokazuje, że po stymulacji LPS dynamiczna produkcja nadtlenku wodoru z dwóch komórek AX jest znacznie wyższa niż poziom podstawowy z niestymulowanych dwóch komórek AX, a reakcja tła po potraktowaniu różnymi stężeniami D-E-D-T-C lub katalazy, sygnał A UR zmniejsza się w sposób zależny od dawki z powodu odpowiednio hamowania produkcji nadtlenku wodoru z wewnątrzkomórkowego ponadtlenku i wyczerpania zewnątrzkomórkowego nadtlenku wodoru. Leczenie D-E-D-T-C i katalazą wyraźnie potwierdziło, że testy DHE i UR konkretnie mierzą różne typy i subkomórkowe lokalizacje ROS Indicum po tej procedurze.

Inne metody, takie jak odbicie pokolenia Rossa podczas infekcji bakteriami chorobotwórczymi lub niepatogennymi, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jak ogier Dictal zareaguje na różne infekcje bakteryjne pod względem generowania strat. I nie zapominaj, że praca z bakteriami chorobotwórczymi, takimi jak mikrobakterie marum, może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak odpowiednie BSL, podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podjąć dwa środki.