Name: Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Poznaj metody wykrywania i ilościowego określania reaktywnych form tlenu w komórkach ameby za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sond chemiluminescencyjnych. Protokoły te umożliwiają badanie stresu oksydacyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni doktorom Karl-Heinz Krause i Vincentowi Jaquetowi za pomoc i radę. 
opracowali te protokoły, a także podziękowali Christophowi Bauerowi i Jérôme'owi Bossetowi z Platformy Bioobrazowania NCCR oraz dr Navinowi Gopaldassowi za ich wsparcie techniczne. Badania są wspierane przez grant ProDoc Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki.

1. Wizualizacja i jakościowy pomiar produkcji ROS w fagosomach
Koraliki pokryte OBG powinny być przygotowane wcześniej. Procedury powlekania kulkami i technika nakładania agaru są zaadaptowane z opublikowanych pozycji5,14.
<ol>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny karboksylowanych kulek krzemionkowych 3,0 μm (około 1,8 x 109 kulek) do probówki o pojemności 1,5 ml, przemyć kulki 3x 1 ml PBS przez szybkie wirowanie i wirowanie.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 1 ml PBS zawierającego 25 mg/ml cyjanamidu (w celu aktywacji karboksylowanych kulek krzemionkowych w celu kowalencyjnego związania wstępnie znakowanego BSA), inkubować na kole przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć 3x 1 ml buforu sprzęgającego (0,1 M boranu sodu, pH 8,0) przez szybkie wirowanie (wirować z pełną prędkością w mini wirówce stołowej przez 5 sekund lub alternatywnie wirować przy 2 000 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej) i wirować w celu usunięcia nadmiaru cyjanamidu.</li>
	<li>Wymieszać przemyte kulki z 500 μl buforu sprzęgającego zawierającego 1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihydro-2',4,5,6,7,7'-heksafluorofluoresceiny)-BSA, napełnić probówkę gazowym azotem ze standardowej puszki z gazem przed zamknięciem i inkubować na kole przez 14 godzin (noc) w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć kulki 2x 1 ml buforu hartowniczego (250 mM glicyny w PBS) w celu usunięcia nieprzereagowanego OBG i dwukrotnie buforem sprzęgającym w celu usunięcia buforu hartowniczego przez szybkie wirowanie i wirowanie.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu sprzęgającego zawierającego 50 μg estru sukcynimidylowego Alexa fluor 594 do koniugacji z BSA. Napełnij probówkę azotem przed zamknięciem i inkubuj na kole przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć kulki 3x 1 ml buforu hartowniczego przez szybkie wirowanie i wirowanie w celu zatrzymania reakcji, a następnie przemyć kulki 3x 1 ml PBS przez szybkie wirowanie i wirowanie.</li>
	<li>Na koniec ponownie zawiesić kulki w 1 ml PBS z 2 μl 10% w/v azydku w celu długotrwałego przechowywania. Zmierzyć stężenie kulek w zawiesinie za pomocą hemocytometru (zwykle około 1-2 x 109 kulek/ml), napełnić probówkę azotem przed zamknięciem i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Skuteczność powlekania fluoresceiny OBG można zbadać, sprawdzając widmo emisyjne za pomocą wzbudzenia przy 500 nm. Po utlenieniu przezH2O2w obecności peroksydazy chrzanowej (HRP) intensywność fluorescencji utlenionych kulek w momencie piku emisji (538 nm) jest 11-12 razy wyższa niż w przypadku kulek nieutlenionych powlekanych.</li>
	<li>Zbierz wykładniczo rosnące komórki Dictyostelium z 10-centymetrowej szalki Petriego, ułóż komórki o różnej gęstości na 3-centymetrowych szalkach z optycznie przezroczystym dnem z tworzywa sztucznego lub szkła i hoduj je przez noc. Wybierz potrawy, które są w około 80% zlewające się do eksperymentu. Opublikowano szczegółowy protokół hodowli komórek Dictyostelium 15.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką LoFlo (pożywką LF), inkubuj przez 2 godziny przed eksperymentem w celu zmniejszenia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzendosomalnej autofluorescencji pożywki hodowlanej HL5C.</li>
	<li>Równolegle rozpuść 10 ml 1,5% bakto agaru w pożywce LF, wylej agar na płaską powierzchnię (tj. szklaną płytkę o wymiarach 10 cm x 10 cm) w celu utworzenia warstwy agaru o grubości około 1 mm, odczekaj 10-15 minut do zastygnięcia. Pokrój warstwę agaru na kwadraty o wymiarach 2 cm x 2 cm i umieść w podłożu LF do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj mikroskop z wirującym dyskiem lub mikroskop szerokokątny, ustaw temperaturę komory środowiskowej na 22 °C i dostosuj ustawienia do tego eksperymentu. (Zobacz dodatkowe komentarze w dyskusji).</li>
	<li>Po 2 godzinach inkubacji odessać pożywkę LF z 3-centymetrowej szalki, ale monowarstwa komórek powinna być nadal pokryta cienką warstwą pożywki. Rozcieńczyć powlekane kulki do 1,5 x 107 kulek/ml i dodać 10 μl na warstwę komórek.</li>
	<li>Weź jeden kwadratowy arkusz agaru, odcedź nadmiar płynu, ale utrzymuj mokry. Delikatnie połóż kwadrat agaru na wierzchu warstwy komórek. Nie przesuwaj kwadratu agaru, gdy leży na komórkach. Nakładka agarowa służy do zwiększenia kontaktu między kulkami a komórkami, poprawiając w ten sposób wchłanianie, a także nieznacznie ściska komórki, utrzymując je lepiej w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na naczyniu, umieść ją na stoliku mikroskopu i automatycznie rób zdjęcia w kanale czerwonym, zielonym i fazowym co 1 minutę przez 2 godziny lub dłużej.</li>
	<li>Wybierz i skup się na zdarzeniach komórkowych, które zawierają cały proces fagocytozy. Połącz zoptymalizowane 3 kanały i zmontuj obrazy w film za pomocą profesjonalnego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Określ ilościowo intensywność fluorescencji każdego wybranego koralika w kanałach czerwonym i zielonym, a stosunek koloru zielonego do czerwonego będzie odzwierciedlał dynamiczną fagosomalną produkcję ROS w komórkach.</li>
</ol>
2. Ilościowy i średnioprzepustowy pomiar wewnątrzkomórkowej produkcji ponadtlenkowej
<ol>
	<li>Zbierz jedno 80% naczynie z Dictyostelium w 10 ml pożywki HL5C. Odwirować komórki Dictyostelium przy 850 x g przez 5 minut, ostrożnie i całkowicie odessać nadmiar pożywki. Ponownie zawiesić komórki w buforze SS6.4 [0,12 M sorbitolu w buforze Sorensena (14,69 mM KH2PO4 i 6,27 mM Na2HPO4), pH 6,4], zliczyć komórki i rozcieńczyć do końcowej gęstości 6 x 106 komórek/ml (patrz dodatkowe komentarze w dyskusji).</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka białej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej (patrz dodatkowe komentarze w dyskusji).</li>
	<li>Rozcieńczyć zapas DHE (30 mM w DMSO) 500 razy za pomocą SS6.4, w razie potrzeby odpipetować 50 μl rozcieńczonego DHE do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Końcowe stężenie DHE wynosi 30 μM. Reakcja zaczyna się natychmiast.</li>
	<li>Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami.</li>
	<li>Stosować tryb "odczytu od góry" punktu końcowego czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, z wzbudzeniem/emisją fluorescencji przy 522 nm/605 nm, odczytywać co 2 minuty przez 1 godzinę, wstrząs medium 5 sekund/min, w temperaturze 22 °C.</li>
</ol>
3. Ilościowy i wysokoprzepustowy pomiar zewnątrzkomórkowej produkcjiH2O2
<ol>
	<li>Wykonaj te same czynności, które opisano w 2.1 i 2.2.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczony HRP, dodając 5 μl bulionu HRP (100 U/ml w wodzie destylowanej) do 10 ml SS6.4, odwirować lub odwrócić probówkę, aby dobrze wymieszać i trzymać na lodzie do późniejszego użycia. Rozcieńczony roztwór HRP ma stężenie 0,05 j./ml.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną AUR, mieszając zapas AUR (10 mM AUR w DMSO) i rozcieńczony roztwór HRP w buforze SS6.4 do końcowych stężeń odpowiednio 6,25 μM i 0,005 U/ml. Na przykład, aby przygotować mieszaninę reakcyjną dla 40 reakcji, zmieszaj 1600 μl SS6.4 z 400 μl rozcieńczonego HRP i 2,5 μl roztworu podstawowego AUR.</li>
	<li>W razie potrzeby dodać 50 μl mieszaniny AUR do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Teraz zaczyna się reakcja.</li>
	<li>Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami.</li>
	<li>Stosować tryb "odczytu od góry" punktu końcowego czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, ze wzbudzeniem/emisją fluorescencji przy 530 nm/590 nm, odczytywać co 2 minuty przez 1 godzinę, pożywka drgać 5 sekund/min, w temperaturze 22 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W porównaniu z poprzednio opisanymi metodami, test OBG dynamicznie wizualizuje proces generowania fagosomalnych ROS na poziomie pojedynczej komórki, zamiast mierzyć średni sygnał ROS z populacji komórek. Takie metody uśredniania populacji mają tendencję do zaciemniania krytycznych informacji spowodowanych niesynchroniczną fagocytozą. Z powodzeniem dostosowaliśmy testy DHE i AUR do Dictyostelium i zoptymalizowaliśmy protokoły. Co najważniejsze, określiliśmy typy i subkomórkowe lokalizacje ROS mierzone za pomocą t...

Reaktywne formy tlenu (ROS) biorą udział w wielu różnych procesach biologicznych, takich jak obrona gospodarza, sygnalizacja, rozwój tkanek i reakcja na uraz, a także nadciśnienie i rak. Dobrze zbadana maszyneria oksydazy fagosomalnej NADPH jest przeznaczona do szybkiego generowania ROS, znanego jako wybuch oksydacyjny, w celu zabicia bakterii połkniętych w fagosomach neutrofili1. Ponadto wcześniej uważano, że wyciek elektronów jako produkt uboczny mitochondrialnego łańcucha oddechowego jest odpowiedzialny tylko za nieuregulowane źródło ROS. Ale ostatnio został zidentyfikowany jako ważny mechanizm przyczyniający się do dofagosomalnego zabijania bakterii w makrofagach myszy2. W ostatnich latach ameba społeczna, Dictyostelium, stała się potężnym i popularnym modelem do badania wewnętrznych mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej komórek. Rzeczywiście, Dictyostelium i ludzkie fagocyty mają zaskakująco wysoki poziom zachowania w maszyneriach molekularnych odpowiedzialnych za wykrywanie, pochłanianie i zabijaniebakterii 3,4. Homologi białek i enzymów związanych z produkcją ROS lub detoksykacją, takie jak oksydazy NADPH, katalazy, dysmutazy ponadtlenkowe, można znaleźć zarówno u ludzi, jak i u Dictyostelium. Jako najlepiej przebadana ameba, Dictyostelium ma kilka unikalnych zalet w porównaniu z systemem modelowym ssaków. Rosną w temperaturze pokojowej bez konieczności stosowania CO2 , z czasem podwojenia 8-10 godzin. Można je łatwo przechowywać jako kultury przylegające lub zawiesinowe. Ponadto, dzięki w pełni zsekwencjonowanemu i opisanemu haploidalnemu genomowi oraz łatwej manipulacji genetycznej, Dictyostelium stał się bardzo atrakcyjnym eksperymentalnym organizmem modelowym.
W poprzednich badaniach, różne chlorowane i fluorowane pochodne fluoresceiny (łącznie znane jako OxyBurst Green, OBG), które emitują fluorescencję po utlenieniu przez ROS, były używane jako reporter ROS. Estryfikowane pochodne permetyczne przez komórkę są używane do pomiaru cytoplazmatycznego ROS, podczas gdy nieprzepuszczalne dla komórek pochodne sprzężone z dektranem lub białkiem są używane do pomiaru zewnątrzkomórkowego ROS. W szczególności kulki pokryte OBG BSA były już wykorzystywane do wykrywania fagosomalnej produkcji ROS w komórkach ssaków5. Jednak podejście oparte na czytniku mikropłytek może dać tylko uśrednioną krzywą generowania ROS z populacji komórek. Dzięki obecnemu protokołowi, dzięki zastosowaniu Dictyostelium , profesjonalnego fagocytu i zoptymalizowanych warunków eksperymentalnych, uzyskujemy stabilną i wydajną fagocytozę bez sprzężenia opsoniny z kulkami. DHE jest używany w różnych systemach modelowych, takich jak neutrofile i makrofagi ssaków, do wykrywania produkcji ROS6-9. Tymczasem istnieją pewne kontrowersje co do specyficzności i czułości metody8,10. Jako ulepszona wersja Amplex Red, intensywność fluorescencji AUR jest mniej wrażliwa na pH, co czyni go bardziej odpowiednim do pomiaru ROS w środowiskach nieobojętnych lub słabo kwaśnych. AUR został ostatnio zastosowany w kilku systemach ssaków11,12, ale jego zastosowanie w modelach niessaków, które dość często wymagają słabo kwaśnych pożywek wzrostowych, nie zostało jeszcze zgłoszone. Ponadto nie ma opublikowanego protokołu do ilościowego i dynamicznego pomiaru produkcji i lokalizacji ROS w amebie społecznej Dictyostelium.
Celem prezentowanego zestawu protokołów jest dostarczenie łatwego i wszechstronnego rozwiązania do monitorowania różnych ROS i ich lokalizacji, a także dalsze dostarczanie wglądu w mechanizmy komórkowe związane z ROS. W teście OBG wykorzystaliśmy mikroskopię na żywo do monitorowania całego procesu wytwarzania fagosomalnych ROS po wychwycie kulek pokrytych OBG przez komórki Dictyostelium i zapewniliśmy nowe podejście do badania mechanizmu wewnątrzfagosomalnego zabijania bakterii. Zoptymalizowaliśmy średnioprzepustowe testy DHE i AUR w Dictyostelium, aby zmierzyć odpowiednio wewnątrzkomórkową produkcję ponadtlenkową i zewnątrzkomórkowąH2O2, używając LPS jako silnego stymulatora ROS. Należy zauważyć, że niedawno wykazano, że LPS zwiększa aktywność bakteriobójczą Dictyostelium w stosunku do bakterii fagocytozowanych13. Ponadto leczenie DEDTC i katalazą wyraźnie potwierdziło, że te dwie metody specyficznie mierzą różne typy i subkomórkowe lokalizacje ROS w Dictyostelium. Wreszcie, test OBG można dostosować do dowolnej przylegającej komórki fagocytarnej, poprzez dalszą opsonizację kulek ligandami dla receptorów fagocytarnych komórek zwierzęcych. Zasadniczo, testy DHE i AUR mogą być również precyzyjnie dostrojone do pomiarów w dowolnej komórce przylegającej lub nieprzylegającej w odpowiednich warunkach eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Karboksylowane kulki krzemionkowe</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>ForMedium HLC0102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Dietyloditiokarbaminian (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanamid</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>SPRZĘT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-Naczynie 35 mm, wysokie</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Dno wykonane z optycznie przezroczystego tworzywa</td></tr><tr><td>sztucznego Szalka MatTek 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Spód wykonany z szkiełko nakrywkowe</td></tr><tr><td>Scepter Licznik komórek</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Biała 96-dołkowa płytka</td><td>Wirówka Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu amoeba

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reaktywne formy tlenu (ROS) obejmują szereg reaktywnych i krótkożyciowych cząsteczek zawierających tlen, które są dynamicznie przekształcane lub eliminowane katalitycznie lub spontanicznie. Ze względu na krótką żywotność większości ROS oraz różnorodność ich źródeł i lokalizacji subkomórkowych, pełny obraz można uzyskać tylko poprzez dokładne pomiary przy użyciu kombinacji protokołów. W tym miejscu przedstawiamy zestaw trzech różnych protokołów wykorzystujących kulki pokryte OxyBurst Green (OBG) lub dihydroethidium (DHE) i Amplex UltraRed (AUR), do jakościowego i ilościowego monitorowania różnych ROS w profesjonalnych fagocytach, takich jak Dictyostelium. Zoptymalizowaliśmy procedury powlekania kulek i wykorzystaliśmy kulki pokryte powłoką OBG oraz mikroskopię na żywo, aby dynamicznie wizualizować wewnątrzfagosomalne generowanie ROS na poziomie pojedynczej komórki. Zidentyfikowaliśmy lipopolisacharyd (LPS) z E. coli jako silny stymulator wytwarzania ROS w Dictyostelium. Ponadto opracowaliśmy średnioprzepustowe testy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem DHE i AUR do ilościowego pomiaru odpowiednio wewnątrzkomórkowej produkcji ponadtlenkowej i zewnątrzkomórkowejH2O2.

Generowanie ROS w fagosomach można wizualizować jakościowo i dynamicznie za pomocą mikroskopii (Plik S1). Czerwona fluorescencja emitowana przez Alexa fluor 594 jest niewrażliwa na pH i pozostaje stała w środowisku fagosomalnym, podczas gdy utlenianie OBG zwiększa jego fluorescencję w kanale zielonym. Widma emisji kulek powlekanych OBG utlenionych in vitro oraz nieutlenionych porównano na Ryc. 1B, co wykazuje znaczący wzrost intensywności po utlenianiu. Aby ułatwić wizualizację ...

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zapewnienie prostego i wszechstronnego rozwiązania do monitorowania różnych reaktywnych form tlenu (ROS) oraz ich lokalizacji, a także dostarczenie dalszych informacji na temat związanych z nimi mechanizmów komórkowych. Zostaje to osiągnięte poprzez przeprowadzenie trzech różnych analiz, z których pierwsza wykorzystuje kulek powlekanych RST green lub OB G oraz mikroskopię żywych komórek; ob g fluorescein i Alexa Fluor 594 są kowalencyjnie sprzężone z powierzchnią kulek z krzemionki o średnicy 3 µm za pomocą BSA.Emisja fluorescencji z fluoresceiny OBG wskazuje na utlenianie przez ROS, podczas gdy sygnał z Alexa Fluor 594 pomaga zlokalizować kuleczki i służy jako kontrola do ilościowego oznaczenia fluorescencji. Druga metoda wykorzystuje sondę wrażliwą na aniony ponadtlenkowe, dihydroetydium (DHE), w badaniu opartym na czytniku płytek. W wyniku utleniania przez aniony ponadtlenkowe etydium jest w stanie wbudować się w DNA jądrowe i mitochondrialne, a jego piki wzbudzenia i emisji przesuwają się odpowiednio na 522 nanometrów i 605 nanometrów.Intensywność fluorescencji AUM odpowiada ilości produkowanego anionorodnika ponadtlenkowego, co umo

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowa ocena wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelowym ameb

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Ten film opisuje technikę wizualizacji stresu oksydacyjnego w hodowanych organoidach. Praca ta pomaga w zrozumieniu poziomu stresu oksydacyjnego spowodowanego akumulacją ROS w różnych typach komórek obecnych w organoidzie po leczeniu różnymi modulatorami ROS.

Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Escherichia coli jest główną przyczyną Gram-ujemnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Podczas infekcji bakteryjnej główną rolę bakteriobójczą odgrywają reaktywne formy tlenu wytwarzane przez neutrofile. Tutaj przedstawiamy metodę wykrywania reaktywnych form tlenu w neutrofilach w odpowiedzi na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych E. coli.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Poznaj metody wykrywania i ilościowego określania reaktywnych form tlenu w komórkach ameby za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sond chemiluminescencyjnych. Protokoły te umożliwiają badanie stresu oksydacyjnego.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Przeglądaj więcej filmów