Name: Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Poznaj metody wykrywania i ilościowego określania reaktywnych form tlenu w komórkach ameby za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sond chemiluminescencyjnych. Protokoły te umożliwiają badanie stresu oksydacyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni doktorom Karl-Heinz Krause i Vincentowi Jaquetowi za pomoc i radę. 
opracowali te protokoły, a także podziękowali Christophowi Bauerowi i Jérôme'owi Bossetowi z Platformy Bioobrazowania NCCR oraz dr Navinowi Gopaldassowi za ich wsparcie techniczne. Badania są wspierane przez grant ProDoc Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki.

1. Wizualizacja i jakościowy pomiar produkcji ROS w fagosomach
Koraliki pokryte OBG powinny być przygotowane wcześniej. Procedury powlekania kulkami i technika nakładania agaru są zaadaptowane z opublikowanych pozycji5,14.
<ol>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny karboksylowanych kulek krzemionkowych 3,0 μm (około 1,8 x 109 kulek) do probówki o pojemności 1,5 ml, przemyć kulki 3x 1 ml PBS przez szybkie wirowanie i wirowanie.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 1 ml PBS zawierającego 25 mg/ml cyjanamidu (w celu aktywacji karboksylowanych kulek krzemionkowych w celu kowalencyjnego związania wstępnie znakowanego BSA), inkubować na kole przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć 3x 1 ml buforu sprzęgającego (0,1 M boranu sodu, pH 8,0) przez szybkie wirowanie (wirować z pełną prędkością w mini wirówce stołowej przez 5 sekund lub alternatywnie wirować przy 2 000 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej) i wirować w celu usunięcia nadmiaru cyjanamidu.</li>
	<li>Wymieszać przemyte kulki z 500 μl buforu sprzęgającego zawierającego 1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihydro-2',4,5,6,7,7'-heksafluorofluoresceiny)-BSA, napełnić probówkę gazowym azotem ze standardowej puszki z gazem przed zamknięciem i inkubować na kole przez 14 godzin (noc) w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć kulki 2x 1 ml buforu hartowniczego (250 mM glicyny w PBS) w celu usunięcia nieprzereagowanego OBG i dwukrotnie buforem sprzęgającym w celu usunięcia buforu hartowniczego przez szybkie wirowanie i wirowanie.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu sprzęgającego zawierającego 50 μg estru sukcynimidylowego Alexa fluor 594 do koniugacji z BSA. Napełnij probówkę azotem przed zamknięciem i inkubuj na kole przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć kulki 3x 1 ml buforu hartowniczego przez szybkie wirowanie i wirowanie w celu zatrzymania reakcji, a następnie przemyć kulki 3x 1 ml PBS przez szybkie wirowanie i wirowanie.</li>
	<li>Na koniec ponownie zawiesić kulki w 1 ml PBS z 2 μl 10% w/v azydku w celu długotrwałego przechowywania. Zmierzyć stężenie kulek w zawiesinie za pomocą hemocytometru (zwykle około 1-2 x 109 kulek/ml), napełnić probówkę azotem przed zamknięciem i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Skuteczność powlekania fluoresceiny OBG można zbadać, sprawdzając widmo emisyjne za pomocą wzbudzenia przy 500 nm. Po utlenieniu przezH2O2w obecności peroksydazy chrzanowej (HRP) intensywność fluorescencji utlenionych kulek w momencie piku emisji (538 nm) jest 11-12 razy wyższa niż w przypadku kulek nieutlenionych powlekanych.</li>
	<li>Zbierz wykładniczo rosnące komórki Dictyostelium z 10-centymetrowej szalki Petriego, ułóż komórki o różnej gęstości na 3-centymetrowych szalkach z optycznie przezroczystym dnem z tworzywa sztucznego lub szkła i hoduj je przez noc. Wybierz potrawy, które są w około 80% zlewające się do eksperymentu. Opublikowano szczegółowy protokół hodowli komórek Dictyostelium 15.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką LoFlo (pożywką LF), inkubuj przez 2 godziny przed eksperymentem w celu zmniejszenia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzendosomalnej autofluorescencji pożywki hodowlanej HL5C.</li>
	<li>Równolegle rozpuść 10 ml 1,5% bakto agaru w pożywce LF, wylej agar na płaską powierzchnię (tj. szklaną płytkę o wymiarach 10 cm x 10 cm) w celu utworzenia warstwy agaru o grubości około 1 mm, odczekaj 10-15 minut do zastygnięcia. Pokrój warstwę agaru na kwadraty o wymiarach 2 cm x 2 cm i umieść w podłożu LF do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj mikroskop z wirującym dyskiem lub mikroskop szerokokątny, ustaw temperaturę komory środowiskowej na 22 °C i dostosuj ustawienia do tego eksperymentu. (Zobacz dodatkowe komentarze w dyskusji).</li>
	<li>Po 2 godzinach inkubacji odessać pożywkę LF z 3-centymetrowej szalki, ale monowarstwa komórek powinna być nadal pokryta cienką warstwą pożywki. Rozcieńczyć powlekane kulki do 1,5 x 107 kulek/ml i dodać 10 μl na warstwę komórek.</li>
	<li>Weź jeden kwadratowy arkusz agaru, odcedź nadmiar płynu, ale utrzymuj mokry. Delikatnie połóż kwadrat agaru na wierzchu warstwy komórek. Nie przesuwaj kwadratu agaru, gdy leży na komórkach. Nakładka agarowa służy do zwiększenia kontaktu między kulkami a komórkami, poprawiając w ten sposób wchłanianie, a także nieznacznie ściska komórki, utrzymując je lepiej w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na naczyniu, umieść ją na stoliku mikroskopu i automatycznie rób zdjęcia w kanale czerwonym, zielonym i fazowym co 1 minutę przez 2 godziny lub dłużej.</li>
	<li>Wybierz i skup się na zdarzeniach komórkowych, które zawierają cały proces fagocytozy. Połącz zoptymalizowane 3 kanały i zmontuj obrazy w film za pomocą profesjonalnego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Określ ilościowo intensywność fluorescencji każdego wybranego koralika w kanałach czerwonym i zielonym, a stosunek koloru zielonego do czerwonego będzie odzwierciedlał dynamiczną fagosomalną produkcję ROS w komórkach.</li>
</ol>
2. Ilościowy i średnioprzepustowy pomiar wewnątrzkomórkowej produkcji ponadtlenkowej
<ol>
	<li>Zbierz jedno 80% naczynie z Dictyostelium w 10 ml pożywki HL5C. Odwirować komórki Dictyostelium przy 850 x g przez 5 minut, ostrożnie i całkowicie odessać nadmiar pożywki. Ponownie zawiesić komórki w buforze SS6.4 [0,12 M sorbitolu w buforze Sorensena (14,69 mM KH2PO4 i 6,27 mM Na2HPO4), pH 6,4], zliczyć komórki i rozcieńczyć do końcowej gęstości 6 x 106 komórek/ml (patrz dodatkowe komentarze w dyskusji).</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka białej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej (patrz dodatkowe komentarze w dyskusji).</li>
	<li>Rozcieńczyć zapas DHE (30 mM w DMSO) 500 razy za pomocą SS6.4, w razie potrzeby odpipetować 50 μl rozcieńczonego DHE do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Końcowe stężenie DHE wynosi 30 μM. Reakcja zaczyna się natychmiast.</li>
	<li>Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami.</li>
	<li>Stosować tryb "odczytu od góry" punktu końcowego czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, z wzbudzeniem/emisją fluorescencji przy 522 nm/605 nm, odczytywać co 2 minuty przez 1 godzinę, wstrząs medium 5 sekund/min, w temperaturze 22 °C.</li>
</ol>
3. Ilościowy i wysokoprzepustowy pomiar zewnątrzkomórkowej produkcjiH2O2
<ol>
	<li>Wykonaj te same czynności, które opisano w 2.1 i 2.2.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczony HRP, dodając 5 μl bulionu HRP (100 U/ml w wodzie destylowanej) do 10 ml SS6.4, odwirować lub odwrócić probówkę, aby dobrze wymieszać i trzymać na lodzie do późniejszego użycia. Rozcieńczony roztwór HRP ma stężenie 0,05 j./ml.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną AUR, mieszając zapas AUR (10 mM AUR w DMSO) i rozcieńczony roztwór HRP w buforze SS6.4 do końcowych stężeń odpowiednio 6,25 μM i 0,005 U/ml. Na przykład, aby przygotować mieszaninę reakcyjną dla 40 reakcji, zmieszaj 1600 μl SS6.4 z 400 μl rozcieńczonego HRP i 2,5 μl roztworu podstawowego AUR.</li>
	<li>W razie potrzeby dodać 50 μl mieszaniny AUR do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Teraz zaczyna się reakcja.</li>
	<li>Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami.</li>
	<li>Stosować tryb "odczytu od góry" punktu końcowego czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, ze wzbudzeniem/emisją fluorescencji przy 530 nm/590 nm, odczytywać co 2 minuty przez 1 godzinę, pożywka drgać 5 sekund/min, w temperaturze 22 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W porównaniu z poprzednio opisanymi metodami, test OBG dynamicznie wizualizuje proces generowania fagosomalnych ROS na poziomie pojedynczej komórki, zamiast mierzyć średni sygnał ROS z populacji komórek. Takie metody uśredniania populacji mają tendencję do zaciemniania krytycznych informacji spowodowanych niesynchroniczną fagocytozą. Z powodzeniem dostosowaliśmy testy DHE i AUR do Dictyostelium i zoptymalizowaliśmy protokoły. Co najważniejsze, określiliśmy typy i subkomórkowe lokalizacje ROS mierzone za pomocą t...

Reaktywne formy tlenu (ROS) biorą udział w wielu różnych procesach biologicznych, takich jak obrona gospodarza, sygnalizacja, rozwój tkanek i reakcja na uraz, a także nadciśnienie i rak. Dobrze zbadana maszyneria oksydazy fagosomalnej NADPH jest przeznaczona do szybkiego generowania ROS, znanego jako wybuch oksydacyjny, w celu zabicia bakterii połkniętych w fagosomach neutrofili1. Ponadto wcześniej uważano, że wyciek elektronów jako produkt uboczny mitochondrialnego łańcucha oddechowego jest odpowiedzialny tylko za nieuregulowane źródło ROS. Ale ostatnio został zidentyfikowany jako ważny mechanizm przyczyniający się do dofagosomalnego zabijania bakterii w makrofagach myszy2. W ostatnich latach ameba społeczna, Dictyostelium, stała się potężnym i popularnym modelem do badania wewnętrznych mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej komórek. Rzeczywiście, Dictyostelium i ludzkie fagocyty mają zaskakująco wysoki poziom zachowania w maszyneriach molekularnych odpowiedzialnych za wykrywanie, pochłanianie i zabijaniebakterii 3,4. Homologi białek i enzymów związanych z produkcją ROS lub detoksykacją, takie jak oksydazy NADPH, katalazy, dysmutazy ponadtlenkowe, można znaleźć zarówno u ludzi, jak i u Dictyostelium. Jako najlepiej przebadana ameba, Dictyostelium ma kilka unikalnych zalet w porównaniu z systemem modelowym ssaków. Rosną w temperaturze pokojowej bez konieczności stosowania CO2 , z czasem podwojenia 8-10 godzin. Można je łatwo przechowywać jako kultury przylegające lub zawiesinowe. Ponadto, dzięki w pełni zsekwencjonowanemu i opisanemu haploidalnemu genomowi oraz łatwej manipulacji genetycznej, Dictyostelium stał się bardzo atrakcyjnym eksperymentalnym organizmem modelowym.
W poprzednich badaniach, różne chlorowane i fluorowane pochodne fluoresceiny (łącznie znane jako OxyBurst Green, OBG), które emitują fluorescencję po utlenieniu przez ROS, były używane jako reporter ROS. Estryfikowane pochodne permetyczne przez komórkę są używane do pomiaru cytoplazmatycznego ROS, podczas gdy nieprzepuszczalne dla komórek pochodne sprzężone z dektranem lub białkiem są używane do pomiaru zewnątrzkomórkowego ROS. W szczególności kulki pokryte OBG BSA były już wykorzystywane do wykrywania fagosomalnej produkcji ROS w komórkach ssaków5. Jednak podejście oparte na czytniku mikropłytek może dać tylko uśrednioną krzywą generowania ROS z populacji komórek. Dzięki obecnemu protokołowi, dzięki zastosowaniu Dictyostelium , profesjonalnego fagocytu i zoptymalizowanych warunków eksperymentalnych, uzyskujemy stabilną i wydajną fagocytozę bez sprzężenia opsoniny z kulkami. DHE jest używany w różnych systemach modelowych, takich jak neutrofile i makrofagi ssaków, do wykrywania produkcji ROS6-9. Tymczasem istnieją pewne kontrowersje co do specyficzności i czułości metody8,10. Jako ulepszona wersja Amplex Red, intensywność fluorescencji AUR jest mniej wrażliwa na pH, co czyni go bardziej odpowiednim do pomiaru ROS w środowiskach nieobojętnych lub słabo kwaśnych. AUR został ostatnio zastosowany w kilku systemach ssaków11,12, ale jego zastosowanie w modelach niessaków, które dość często wymagają słabo kwaśnych pożywek wzrostowych, nie zostało jeszcze zgłoszone. Ponadto nie ma opublikowanego protokołu do ilościowego i dynamicznego pomiaru produkcji i lokalizacji ROS w amebie społecznej Dictyostelium.
Celem prezentowanego zestawu protokołów jest dostarczenie łatwego i wszechstronnego rozwiązania do monitorowania różnych ROS i ich lokalizacji, a także dalsze dostarczanie wglądu w mechanizmy komórkowe związane z ROS. W teście OBG wykorzystaliśmy mikroskopię na żywo do monitorowania całego procesu wytwarzania fagosomalnych ROS po wychwycie kulek pokrytych OBG przez komórki Dictyostelium i zapewniliśmy nowe podejście do badania mechanizmu wewnątrzfagosomalnego zabijania bakterii. Zoptymalizowaliśmy średnioprzepustowe testy DHE i AUR w Dictyostelium, aby zmierzyć odpowiednio wewnątrzkomórkową produkcję ponadtlenkową i zewnątrzkomórkowąH2O2, używając LPS jako silnego stymulatora ROS. Należy zauważyć, że niedawno wykazano, że LPS zwiększa aktywność bakteriobójczą Dictyostelium w stosunku do bakterii fagocytozowanych13. Ponadto leczenie DEDTC i katalazą wyraźnie potwierdziło, że te dwie metody specyficznie mierzą różne typy i subkomórkowe lokalizacje ROS w Dictyostelium. Wreszcie, test OBG można dostosować do dowolnej przylegającej komórki fagocytarnej, poprzez dalszą opsonizację kulek ligandami dla receptorów fagocytarnych komórek zwierzęcych. Zasadniczo, testy DHE i AUR mogą być również precyzyjnie dostrojone do pomiarów w dowolnej komórce przylegającej lub nieprzylegającej w odpowiednich warunkach eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Karboksylowane kulki krzemionkowe</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>ForMedium HLC0102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Dietyloditiokarbaminian (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanamid</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>SPRZĘT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-Naczynie 35 mm, wysokie</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Dno wykonane z optycznie przezroczystego tworzywa</td></tr><tr><td>sztucznego Szalka MatTek 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Spód wykonany z szkiełko nakrywkowe</td></tr><tr><td>Scepter Licznik komórek</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Biała 96-dołkowa płytka</td><td>Wirówka Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu amoeba

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reaktywne formy tlenu (ROS) obejmują szereg reaktywnych i krótkożyciowych cząsteczek zawierających tlen, które są dynamicznie przekształcane lub eliminowane katalitycznie lub spontanicznie. Ze względu na krótką żywotność większości ROS oraz różnorodność ich źródeł i lokalizacji subkomórkowych, pełny obraz można uzyskać tylko poprzez dokładne pomiary przy użyciu kombinacji protokołów. W tym miejscu przedstawiamy zestaw trzech różnych protokołów wykorzystujących kulki pokryte OxyBurst Green (OBG) lub dihydroethidium (DHE) i Amplex UltraRed (AUR), do jakościowego i ilościowego monitorowania różnych ROS w profesjonalnych fagocytach, takich jak Dictyostelium. Zoptymalizowaliśmy procedury powlekania kulek i wykorzystaliśmy kulki pokryte powłoką OBG oraz mikroskopię na żywo, aby dynamicznie wizualizować wewnątrzfagosomalne generowanie ROS na poziomie pojedynczej komórki. Zidentyfikowaliśmy lipopolisacharyd (LPS) z E. coli jako silny stymulator wytwarzania ROS w Dictyostelium. Ponadto opracowaliśmy średnioprzepustowe testy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem DHE i AUR do ilościowego pomiaru odpowiednio wewnątrzkomórkowej produkcji ponadtlenkowej i zewnątrzkomórkowejH2O2.

Generowanie ROS w fagosomach można wizualizować jakościowo i dynamicznie za pomocą mikroskopii (Plik S1). Czerwona fluorescencja emitowana przez Alexa fluor 594 jest niewrażliwa na pH i pozostaje stała w środowisku fagosomalnym, podczas gdy utlenianie OBG zwiększa jego fluorescencję w kanale zielonym. Widma emisji kulek powlekanych OBG utlenionych in vitro oraz nieutlenionych porównano na Ryc. 1B, co wykazuje znaczący wzrost intensywności po utlenianiu. Aby ułatwić wizualizację ...

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zapewnienie prostego i wszechstronnego rozwiązania do monitorowania różnych reaktywnych form tlenu (ROS) oraz ich lokalizacji, a także dostarczenie dalszych informacji na temat związanych z nimi mechanizmów komórkowych. Zostaje to osiągnięte poprzez przeprowadzenie trzech różnych analiz, z których pierwsza wykorzystuje kulek powlekanych RST green lub OB G oraz mikroskopię żywych komórek; ob g fluorescein i Alexa Fluor 594 są kowalencyjnie sprzężone z powierzchnią kulek z krzemionki o średnicy 3 µm za pomocą BSA.Emisja fluorescencji z fluoresceiny OBG wskazuje na utlenianie przez ROS, podczas gdy sygnał z Alexa Fluor 594 pomaga zlokalizować kuleczki i służy jako kontrola do ilościowego oznaczenia fluorescencji. Druga metoda wykorzystuje sondę wrażliwą na aniony ponadtlenkowe, dihydroetydium (DHE), w badaniu opartym na czytniku płytek. W wyniku utleniania przez aniony ponadtlenkowe etydium jest w stanie wbudować się w DNA jądrowe i mitochondrialne, a jego piki wzbudzenia i emisji przesuwają się odpowiednio na 522 nanometrów i 605 nanometrów.Intensywność fluorescencji AUM odpowiada ilości produkowanego anionorodnika ponadtlenkowego, co umożliwia ilościowy pomiar wewnątrzkomórkowej generacji nadtlenku w komórkach. Trzecia metoda jest również testem opartym na czytniku płytek. Sonda wrażliwa na nadtlenek wodoru plex ultra red lub a UR jest stosowana do ilościowego pomiaru pozakomórkowej produkcji nadtlenku wodoru.Intensywność fluorescencji w badaniu UR OX odpowiada ilości nadtlenku wodoru wytworzonego poza komórkami. Uzyskane wyniki wskazują na lokalizację dynamicznej generacji ROS na podstawie testów O-B-G-D-H-E oraz UR. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak OB GSA oparte na szybkości w płytkach, jest możliwość dynamicznej wizualizacji generowania Al Roth na poziomie pojedynczej komórki.Zamiast odzwierciedlać uśredniony sygnał Roth z populacji komórek. Takie metody uśredniania populacyjnego mają tendencję do zacierania krytycznych informacji ze względu na niesynchroniczną fagocytozę. Aby rozpocząć procedurę kodowania kulek za pomocą oxy, Burt Green lub OBG, należy dodać 1 ml zawiesiny karboksylowanych kulek krzemionkowych o rozmiarze 3,0 µm do probówki o pojemności 1,5 ml.Wirować probówkę i szybko usunąć nadsącz. Dodać 1 ml PBS i wymieszać na wortexie w ten sam sposób. Przemyć kuleczki trzy razy za pomocą PBS.Po trzecim przemyciu usuń nadsącz i resuspender koraliki. W 1 ml PBS zawierającego 25 mg/ml cyjanku – roztwór cyjanku musi być każdorazowo świeżo przygotowany przed użyciem – inkubuj na rotatorze przez 15 minut. Aktywuje to karboksylowane koraliki krzemionkowe w celu kowalencyjnego związania uprzednio znakowanego BSA; po 15 minutach odwiruj probówkę i usuń nadsącz.Dodaj 1 ml buforu sprzęgającego i trzykrotnie przemyj koraliki buforem sprzęgającym, stosując szybkie wirowanie i mieszanie w wirówce typu vortex, aby usunąć nadmiar cyjanku. Wymieszaj przemyte koraliki z 500 µl buforu sprzęgającego zawierającego 1 mg OBGH two H-F-F-B-S-A, a następnie napełnij probówkę azotem z gazowej butli standardowej. Po zamknięciu probówki inkubuj na rotatorze przez 14 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnego dnia zneutralizuj niereaktywny OBG, przemywając koraliki dwukrotnie 1 ml buforu neutralizującego poprzez szybkie wirowanie i mieszanie w wirówce typu vortex, a następnie przemyj je dwukrotnie buforem sprzęgającym w celu usunięcia buforu neutralizującego. Po usunięciu supernatantu dodaj 1 ml buforu sprzęgającego zawierającego 50 µg LOR 594 cin middle ester w celu sprzęgnięcia z BSA.Napełnić probówkę azotem, zakręcić i inkubować na rotatorze przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po zakończeniu 1,5-godzinnej inkubacji zatrzymać reakcję, przemywając koraliki trzykrotnie 1 ml buforu gaszącego. Następnie koraliki należy przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.Na koniec, Ray, zawieś kuleczki w 1 mL PBS z dodatkiem 2 µL 10% (masa/objętość) azotku sodu do długoterminowego przechowywania. Zmierz stężenie kuleczek w zawiesinie za pomocą hemocytometru; zazwyczaj wynosi ono od 1 do 2 × 10⁹ kuleczek na 1 mL.Napełnij probówkę azotem, zamknij korkiem i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Rozpocznij tę procedurę od zebrania komórek alium w fazie wzrostu wykładniczego z 10 centymetrowej płytki Petriego. Rozmieść komórki o różnych gęstościach na płytkach trzech centymetrowych z optycznie przezroczystym dnem plastikowym lub szklanym i inkubuj je przez noc do następnego ranka.Wybierz naczynia, w których konfluencja wynosi około 80%, do wykorzystania w doświadczeniu. Przed rozpoczęciem eksperymentu wymień pożywkę hodowlaną na pożywkę o niskim przepływie (LF) i inkubuj przez dwie godziny, aby zmniejszyć autofluorescencję pozakomórkową i wewnątrzendosomalną pożywki HL-5C. Rozpuść 10 ml 1,5% agaru BDO w pożywce LF i wlej agar na płaską powierzchnię, aby utworzyć warstwę agaru o grubości około 1 mm.Odczekać 10–15 minut do czasu zestalenia się agaru. Wyciąć warstwę agaru w kwadraty o boku dwóch centymetrów i umieścić w podłożu LF do późniejszego użycia. Przygotować mikroskop szerokopolowy.Ustaw temperaturę w komorze klimatycznej na 22 °C i dostosuj ustawienia wymagane do przeprowadzenia eksperymentu. Po dwóch godzinach inkubacji odessać pożywkę LF z płytki o średnicy trzech centymetrów, pozostawiając monowarstwę komórek pokrytą cienką warstwą pożywki. Rozcieńczyć wcześniej przygotowane koraliki pokryte OBG do stężenia 1,5 × 10⁷ koralików/ml i dodać 10 µL na warstwę komórek.Pobierz jeden kwadratowy arkusz agarozy i odlej nadmiar płynu, zachowując jednak wilgotność agarozy. Delikatnie połóż kwadrat agarozy na warstwie komórek. Warstwa agarozy zwiększa kontakt między koralikami a komórkami, co poprawia wydajność poboru.Powoduje to również lekkie ściśnięcie komórek, co pozwala na ich lepsze utrzymanie w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Aby eksperyment zakończył się sukcesem, należy nałożyć pokrywkę na szalkę. Nie wolno przesuwać warstwy AGA, gdy ta pokrywa komórki; krytyczne jest również natychmiastowe rozpoczęcie etapu obrazowania.Następnie umieść szalkę na stole mikroskopu i wykonuj automatycznie zdjęcia w kanałach czerwonym, zielonym oraz w kontraście fazowym w odstępach jednominutowych przez dwie godziny lub dłużej. Aby zmierzyć produkcję ROS, wybierz i ustaw ostrość na zdarzenia komórkowe obejmujące cały proces fagocytozy. Używając profesjonalnego oprogramowania do przetwarzania obrazów, połącz zoptymalizowane trzy kanały i zmontuj zdjęcia w film.Ilościowo określ intensywność fluorescencji każdego z wybranych kulek w kanałach czerwonym i zielonym. Stosunek sygnału czerwonego do zielonego będzie odzwierciedlać dynamiczną produkcję FOMO R os w komórkach. Aby najpierw zmierzyć wewnątrzkomórkową produkcję anionu ponadtlenkowego, zebrać komórki alium z naczynia o 180% konfluencji w 10 mililitrach pożywki HL five C, następnie odwirować komórki alium przy 850 ×g przez pięć minut i ostrożnie oraz całkowicie odessać pożywkę, resuspendować komórki w buforze SS 6.4, policzyć komórki i rozcieńczyć je do końcowej gęstości 6 × 10⁶ komórek na mililitr.Do każdego dołka białej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej dodaj 50 µL zawiesiny komórkowej. Roztwór stokowy dihydroetydium (DHE) rozcieńcz 500-krotnie w buforze SS 6.4. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 50 µL rozcieńczonego DHE do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Końcowe stężenie DHE wynosi 30 µM.Reakcja rozpocznie się natychmiast. W tym momencie lub w innych punktach czasowych, zgodnie z konkretnymi potrzebami, można dodać bodźce lub inhibitory. Inkubować komórki w pożywce przy wstrząsaniu w temperaturze 22 °C.Odczytuj fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych co dwie minuty przez jedną godzinę. Użyj trybu odczytu końcowego (endpoint top reading) z wzbudzeniem fluorescencji przy 522 nanometrach i emisją przy 605 nanometrach. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania płytki 96-dołkowej z komórkami dium, zgodnie z instrukcją w poprzednim segmencie.Przygotuj rozcieńczoną peroksydazę chrzanową lub HRP, dodając 5 µL roztworu zapasowego HRP do 10 mL buforu SS 6,4. Odwróć probówkę, aby dokładnie wymieszać zawartość, i przechowuj na lodzie. Stężenie rozcieńczonego roztworu HRP wynosi 0,05 jednostek na mL.Przygotować mieszaninę reakcyjną Plex Ultra Red (UR), mieszając zapas UR i rozcieńczony roztwór HRP w buforze SS 6.4 do stężeń końcowych 6,25 µM UR oraz 0,005 jednostek na ml HRP. Do każdej studzienki dodać 50 µl mieszaniny UR.Reakcja rozpocznie się natychmiast. W tym momencie lub w innych punktach czasowych, zgodnie z konkretnymi potrzebami, można dodać stymulatory lub inhibitory. Inkubować komórki w pożywce z wytrząsaniem w temperaturze 22 °C.Odczytuj fluorescencję za pomocą mikroplatejskiego czytnika fluorescencji co dwie minuty przez jedną godzinę. Użyj trybu odczytu końcowego (endpoint top reading) z wzbudzaniem fluorescencji przy 530 nanometrach i emisją przy 590 nanometrach. Wydajność powlekania OB g fluoresceiny testuje się, wykorzystując nadtlenek wodoru i HRP do utlenienia powlekanych kulek in vitro oraz sprawdzając widmo emisji przy wzbudzaniu przy 500 nanometrach.Jak pokazano na tym wykresie, utlenione kuleczki wykazują znaczący pik emisji przy 538 nanometrach w porównaniu z kuleczkami nieutlenionymi, przy stosunku intensywności wynoszącym co najmniej od 11 do 12 razy. Generowanie ROS w fagosomach w komórkach dium można wizualizować jakościowo i dynamicznie za pomocą mikroskopii, co przedstawiono w tym reprezentatywnym filmie poklatkowym, nagranym przez 40 minut z sześciokrotnym powiększeniem w ciągu pierwszej minuty po pobraniu. W wyniku fagocytozy fluorescencja kuleczek powlekanych OBG zmieniła się z czerwonej na jaskrawopomarańczową, co wskazuje, że ROS były prawdopodobnie produkowane bezpośrednio wewnątrz fagosomów.Wewnątrzkomórkową produkcję anionu ponadtlenkowego oraz zewnątrzkomórkową produkcję nadtlenku wodoru mierzy się ilościowo odpowiednio za pomocą testów DHE i UR. Przedstawiono podsumowanie reakcji biochemicznych związanych z tymi dwoma analizami. W teście DHE anion ponadtlenkowy jest przekształcany w nadtlenek wodoru przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD), a nadtlenek wodoru jest przekształcany w wodę i tlen przez katalazę.Czytnik mikropłytek jest wykorzystywany do ilościowego pomiaru wewnątrzkomórkowego anionu ponadtlenkowego przy średniej przepustowości. Reprezentatywny eksperyment wykazuje, że po stymulacji lipopolisacharydem LPSA z e coli, dynamiczna produkcja anionu ponadtlenkowego w komórkach AX two jest znacznie wyższa niż poziom bazowy w niestymulowanych komórkach AX two oraz tło reakcji w buforze; spadek fluorescencji niebieskiej i wzrost fluorescencji czerwonej są ze sobą odwrotnie skorelowane, zgodnie z oczekiwaniami.Lokalizacja produkcji R os mierzona testem DHE została potwierdzona przez następujące wyniki. Dodatek D-E-D-T-C-A, inhibitora dysmutazy ponadtlenkowej przenikającego przez błony, zwiększył sygnał DHE w sposób zależny od dawki, co wskazuje, że D-E-D-T-C spowodował akumulację substratu dysmutazy ponadtlenkowej. Z kolei dodatek IMP, wygaszacza nadtlenku wodoru przenikającego przez błony, nie wpłynął na produkcję ponadtlenku w teście A UR.Czytnik mikropłytek jest wykorzystywany do ilościowego pomiaru produkcji pozakomórkowego nadtlenku wodoru o średniej przepustowości. Reprezentatywny eksperyment wykazuje, że po stymulacji LPS dynamiczna produkcja nadtlenku wodoru z komórek AX two jest znacznie wyższa niż poziom podstawowy z niestymulowanych komórek AX two; natomiast podczas reakcji tła, po zastosowaniu różnych stężeń D-E-D-T-C lub katalazy, sygnał a UR spada w sposób zależny od dawki, co wynika odpowiednio z zahamowania produkcji nadtlenku wodoru z wewnątrzkomórkowego anionu ponadtlenkowego oraz z usunięcia pozakomórkowego nadtlenku wodoru. Zabiegi z użyciem D-E-D-T-C i katalazy jednoznacznie potwierdziły, że testy DHE oraz a UR specyficznie mierzą różne rodzaje i lokalizacje subkomórkowe ROS Indicum zgodnie z opisaną procedurą.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak reakcja konia Dictal na zakażenia różnymi bakteriami w kontekście utraty potomstwa, można zastosować inne metody, np. odwzorowanie generacji Rossa podczas zakażenia bakteriami patogennymi lub niepatogennymi. Należy pamiętać, że praca z bakteriami patogennymi, takimi jak microbacteria marum, może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki bezpieczeństwa BSL 2.

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowa ocena wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelowym ameb

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Ten film opisuje technikę wizualizacji stresu oksydacyjnego w hodowanych organoidach. Praca ta pomaga w zrozumieniu poziomu stresu oksydacyjnego spowodowanego akumulacją ROS w różnych typach komórek obecnych w organoidzie po leczeniu różnymi modulatorami ROS.

Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Escherichia coli jest główną przyczyną Gram-ujemnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Podczas infekcji bakteryjnej główną rolę bakteriobójczą odgrywają reaktywne formy tlenu wytwarzane przez neutrofile. Tutaj przedstawiamy metodę wykrywania reaktywnych form tlenu w neutrofilach w odpowiedzi na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych E. coli.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Poznaj metody wykrywania i ilościowego określania reaktywnych form tlenu w komórkach ameby za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sond chemiluminescencyjnych. Protokoły te umożliwiają badanie stresu oksydacyjnego.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Przeglądaj więcej filmów