Name: Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metody mikroskopii fluorescencyjnej do oceny żywotności bakterii w komórkach ssaków. Technika ta umożliwia bezpośrednią wizualizację żywych i martwych drobnoustrojów w różnych lokalizacjach subkomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Asyi Smirnov i Laurze Gonyar za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez granty NIH R00 TW008042 i R01 AI097312 dla A.K.C. M.B.J. była częściowo wspierana przez NIH T32 AI007046.

1. Ocena żywotności bakterii za pomocą jodku propidyny i SYTO9
<ol>
	<li>Zainfekuj komórki, które przylegają do okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach, interesującymi Cię bakteriami. NIE mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi.</li>
	<li>Raz delikatnie przepłukać komórki w 0,1 M kwasie 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS), pH 7,2, zawierającym 1 mM MgCl2 (MOPS/MgCl2).</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 647 lub lektyną, która wiąże się z interesującymi gatunkami bakterii, w MOPS / MgCl2, w celu wykrycia bakterii zewnętrznych.</li>
</ol>
UWAGA: Przeprowadzaj kontrole z żywymi i martwymi bakteriami, przy braku komórek gospodarza, aby pokazać, że lektyna lub przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania wiąże wszystkie bakterie niezależnie od ich żywotności (Rysunek 1).
<ol start="4">
	<li>Przepłucz komórki dwa razy za pomocą MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i dodać 0,5 ml żywego/martwego roztworu barwiącego. Żywy/martwy roztwór barwiący to 5 μM SYTO9, 30 μM jodku propidyny i 0,1% saponiny (stężenia końcowe) w MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Odwróć szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na szkiełka podstawowe i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Nie używaj nośników montażowych.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy w ciągu 30 minut, używając mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów kompatybilnymi z akwizycją obrazów zielonych, czerwonych i dalekiej czerwieni.</li>
</ol>
UWAGA: Można używać zarówno konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, jak i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Po 30 minutach barwniki fluorescencyjne zaczynają wyciekać z bakterii, a uzyskane dane nie są już dokładne. Obrazy przedstawione w tym artykule zostały uzyskane pionowym mikroskopem fluorescencyjnym Nikon Eclipse E800 z aparatem cyfrowym Hamamatsu Orca-ER przy użyciu oprogramowania Openlab. Fluorescencja Alexa Fluor 647 została wykryta przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 590 - 650 nm i filtra emisyjnego 663 - 735 nm, i jest fałszywie zabarwiona na niebiesko. Fluorescencję jodku propydu wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 540 - 580 nm i filtra emisyjnego o długości 600 - 660 nm. Fluorescencję z SYTO9 wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 465 - 495 nm i filtra emisyjnego o długości 515 - 555 nm.
<ol start="10">
	<li>Ten protokół spowoduje powstanie obrazów, na których zewnętrzne bakterie nieżywotne wydają się niebieskie + czerwone, wewnętrzne bakterie nieżywotne pojawiają się tylko na czerwono, zewnętrzne żywe bakterie są wyświetlane na niebiesko + zielono, a wewnętrzne żywe bakterie wydają się tylko na zielono. Policz na oko liczbę bakterii, które są zewnętrzne nieżywotne, wewnętrzne nieżywotne, zewnętrzne żywotne i wewnętrznie żywotne.</li>
	<li>Oblicz procent bakterii żywotnych zewnętrznie, dzieląc liczbę bakterii żywotnych zewnętrznie przez całkowitą liczbę bakterii zewnętrznych (żywotnych i nieżywotnych). Oblicz procent bakterii żywotnych wewnętrznie, dzieląc liczbę bakterii żywotnych wewnętrznie przez całkowitą liczbę bakterii wewnętrznych (żywotnych i nieżywotnych) (ryc. 4).</li>
	<li>Istnieją dwie podstawowe kontrole, które należy wykonać za pomocą tego protokołu. Najpierw sprawdź, czy wszystkie niezdolne do życia bakterie są dodatnie pod względem jodku propidyny, a wszystkie żywe bakterie są SYTO9-dodatnie. Średnio logarytmiczna hodowla bakterii (przy braku jakichkolwiek komórek gospodarza) powinna być >95% dodatnia pod względem SYTO9. Na rysunku 2 pokazano średniologarytmiczną hodowlę N. gonorrhoeae (w ilości 108 jednostek tworzących kolonie na ml) inkubowaną z żywym/martwym roztworem barwiącym. Po drugie, sprawdź, czy zarówno jodek propidyny, jak i SYTO9 mogą dostać się do przepuszczalnych, zainfekowanych komórek gospodarza.
	<ol>
		<li>Aby wygenerować populację martwych bakterii, zbierz 2 x 108 jednostek tworzących kolonie bakteryjne w probówce o pojemności 1,5 ml, dodaj 70% izopropanolu i pozostaw na 10 minut. Umieść bakterie w mikrofugach i umyj bakterie dwukrotnie w PBS, aby usunąć resztki izopropanolu. Następnie postępuj zgodnie z krokami protokołu 1.5 - 1.7. Dodać 5 μl zawiesiny bakteryjnej do szkiełka podstawowego i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Próbki obrazów jak w kroku 1.9 protokołu. W tych warunkach 100% populacji powinno być dodatnie pod względem jodku propidynowego (ryc. 2). U niektórych gatunków bakterii jodek propidyny może nie przytłoczyć całkowicie barwienia SYTO9, a nieżywotne bakterie mogą wydawać się żółte lub pomarańczowe.</li>
		<li>W przypadku komórek fagocytarnych, takich jak neutrofile, wystaw komórki na działanie bakterii zabitych izopropanolem i upewnij się, że 100% bakterii wewnątrzkomórkowych jest dodatnich pod względem jodku propidyny (ryc. 3). W przypadku komórek niefagocytarnych, które mogą nie internalizować martwych bakterii, wystarczające może być potraktowanie zakażonych komórek azydkiem sodu lub innymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi przenikającymi komórkę przed dodaniem żywego/martwego roztworu barwiącego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena żywotności bakterii za pomocą SYTOX Green i DAPI
<ol>
	<li>Oznacz interesujące bakterie za pomocą 10 μg/ml DAPI w pożywce Morse'a Defined Medium 25 przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Zainfekuj komórki, które przylegają do okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach, bakteriami znakowanymi DAPI. NIE mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi.</li>
	<li>Przepłucz komórki raz za pomocą MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 647 lub lektyną, która wiąże się z interesującymi gatunkami bakterii, w MOPS / MgCl2, w celu wykrycia bakterii zewnętrznych. Patrz uwaga w kroku 1.3 protokołu, aby zapoznać się z sugerowanymi elementami sterującymi.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i dodać 0,5 ml 0,4 μM SYTOX Green w MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Umyj komórki jeden raz w MOPS/MgCl2 przez 5 minut.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy w ciągu 30 minut za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zobacz krok 1.9 protokołu, aby zapoznać się z opisem mikroskopu, aparatu cyfrowego i oprogramowania do akwizycji.</li>
</ol>
UWAGA: Fluorescencja z Alexa Fluor 647 została wykryta przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 590 - 650 nm i filtra emisyjnego 663 - 735 nm, i jest fałszywie zabarwiona na czerwono. Fluorescencję z SYTOX Green wykryto przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 465 - 495 nm i filtra emisyjnego o długości fali 515 - 555 nm. Fluorescencję z DAPI wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 355 - 375 nm i filtra barierowego 400 nm.
<ol start="10">
	<li>Protokół ten spowoduje powstanie obrazów, na których zewnętrzne bakterie niezdolne do życia będą wyświetlane na czerwono + na zielono, wewnętrzne bakterie niezdolne do życia będą wyświetlane na zielono + niebiesko, zewnętrzne żywe bakterie będą wyświetlane na czerwono + niebiesko, a wewnętrzne żywe bakterie będą wyświetlane tylko na niebiesko (ryc. 4). Określ ilościowo procent bakterii zewnętrznych i wewnętrznych zgodnie z opisem w kroku 1.11 protokołu.</li>
	<li>Kontrole opisane w kroku 1.12 protokołu należy wykonywać przy użyciu kombinacji zielonego barwnika DAPI/SYTOX (rysunki 2 i 3).</li>
</ol>
3. Ocena żywotności bakterii wraz z lokalizacją subkomórkową
<ol>
	<li>Oznacz interesujące bakterie za pomocą 10 μg/ml DAPI w pożywce zdefiniowanej przez Morse'a przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Zainfekuj komórki, które przylegają do okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach, bakteriami znakowanymi DAPI. NIE mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi.</li>
	<li>Przepłucz komórki raz za pomocą MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 647 lub lektyną, która wiąże się z interesującymi gatunkami bakterii, w MOPS/MgCl2, w celu wykrycia bakterii zewnętrznych. Patrz uwaga w kroku 1.3 protokołu, aby zapoznać się z sugerowanymi elementami sterującymi.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i dwukrotnie przepłukać komórki w MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 555 przeciwko badanemu markerowi subkomórkowemu przez 20 minut, w MOPS/MgCl2 zawierającym 0,2% saponiny.</li>
	<li>Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Umyj komórki jeden raz w MOPS/MgCl2 przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i dodać 0,4 μM SYTOX Green do MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl2.</li>
	<li>Umyj komórki jeden raz w MOPS/ MgCl2 przez 5 minut.</li>
	<li>Pozyskaj obrazy szkiełek w ciągu 30 minut pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zobacz krok 1.9 protokołu, aby zapoznać się z opisem mikroskopu, aparatu cyfrowego i oprogramowania do akwizycji.</li>
</ol>
UWAGA: Fluorescencja z Alexa Fluor 647 została wykryta za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 590 - 650 nm i filtra emisyjnego 663 - 735 nm, i ma fałszywy kolor fioletowy. Fluorescencja z Alexa Fluor 555 została wykryta za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 540 - 580 nm i filtra emisyjnego 600 - 660 nm. Fluorescencję z SYTOX Green wykryto przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 465 - 495 nm i filtra emisyjnego o długości fali 515 - 555 nm. Fluorescencję z DAPI wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 355 - 375 nm i filtra barierowego 400 nm.
<ol start="14">
	<li>Protokół ten spowoduje powstanie obrazów, w których zewnętrzne bakterie nieżywotne wydają się fioletowe + zielone, wewnętrzne bakterie nieżywotne pojawiają się na zielono + niebieskie, zewnętrzne żywe bakterie pojawiają się na fioletowo + niebiesko, wewnętrzne żywe bakterie pojawiają się tylko na niebiesko, a białko subkomórkowe wydaje się czerwone (ryc. 4). Określ ilościowo zawartość zewnętrznych i wewnętrznych żywotnych bakterii, jak opisano w krokach protokołu 1.11.</li>
	<li>Kontrole opisane w kroku 1.12 protokołu należy wykonywać przy użyciu kombinacji zielonego barwnika DAPI/SYTOX (rysunki 2 i 3).</li>
	<li>Oprócz liczenia bakterii żywotnych i nieżywotnych, sklasyfikuj każdą bakterię jako dodatnią lub ujemną pod kątem kolokalizacji z interesującym markerem subkomórkowym.</li>
	<li>Oblicz procent żywotnych bakterii kolokalizowanych z markerem subkomórkowym, dzieląc liczbę kolokalizowanych żywych bakterii przez całkowitą liczbę żywotnych bakterii. Oblicz procent niezdolnych do życia bakterii kolokalizowanych z markerem subkomórkowym, dzieląc liczbę nieżywotnych bakterii kolokalizowanych przez całkowitą liczbę nieżywotnych bakterii.</li>
</ol>

<ol><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77(2011).</li>
<li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li>
<li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li>
<li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li>
<li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693(2011).</li>
<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+absolute%2C+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li>
<li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128%2C+a+fresh-produce+washing+aid%2C+in+chlorinated+wash+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li>
<li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry%3A+a+comparison+to+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745(2008).</li>
<li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells%3A+clinical+and+pathogenetic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li>
<li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53(2006).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination%3A+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li>
<li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li>
<li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li>
<li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li>
<li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li>
<li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate%2C+Tetrahymena+sp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li>
<li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+the+requirement+for+hypoxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li>
<li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain%5BTitle%5D)+AND+%22BacLight.+Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiono tutaj dwa protokoły, które wykorzystują barwniki wiązania DNA i żywotności w połączeniu z fluorescencyjną lektyną do identyfikacji żywych i martwych bakterii przyczepionych do i wewnątrz komórek ludzkich. Ponieważ oba protokoły skutecznie odróżniają żywe bakterie od martwych, wybór protokołu zależy od celu eksperymentu. Pierwszy protokół wykorzystuje jodek propidyny do wykrywania bakterii niezdolnych do życia i SYTO9 do wykrywania nienaruszonych bakterii. Na rycinie 4A przedstawiono repreze...

Istnieje dynamiczna interakcja i koewolucja między bakteriami a gospodarzami, w których przebywają. Bakterie wykształciły organelle adhezyjne, systemy wydzielania i/lub zdolność do wytwarzania toksyn, które umożliwiają im produktywną infekcję komórek fagocytarnych i niefagocytarnych gospodarza. Bakterie muszą również zmagać się z rozpoznawaniem i aktywnością przeciwdrobnoustrojową układu odpornościowego gospodarza. Układ odpornościowy gospodarza składa się z elementów wrodzonych i adaptacyjnych, w tym barier fizycznych i chemicznych, komórek odpornościowych, układu dopełniacza i innych składników odporności humoralnej. Podczas gdy wiele bakterii jest podatnych na zabijanie i usuwanie przez wielowarstwową odpowiedź immunologiczną gospodarza, niektóre bakterie chorobotwórcze i oportunistyczne wyewoluowały mechanizmy infekowania różnych komórek gospodarza i podważania klirensu przez odpowiedź immunologiczną gospodarza 1. Neisseria gonorrhoeae jest jednym z przykładów patogenu bakteryjnego, który jest wysoce przystosowany do przetrwania w organizmie ludzkiego gospodarza. N. gonorrhoeae łatwo kolonizuje powierzchnie świetlne komórek nabłonka błony śluzowej dróg moczowo-płciowych, gardła, spojówki i odbytnicy. Kolonizacja wyzwala obfitą rekrutację neutrofili w miejscach błony śluzowej. Neutrofile to profesjonalne fagocyty, które posiadają różnorodne procesy przeciwdrobnoustrojowe w celu zabijania mikroorganizmów; jednak N. gonorrhoeae jest zdolny do przetrwania w obecności neutrofili 2-5. Zrozumienie, w jaki sposób patogeny bakteryjne, takie jak N. gonorrhoeae, osłabiają, tłumią i przejmują kontrolę nad odpowiedzią immunologiczną, aby ostatecznie przetrwać w normalnie wrogim środowisku gospodarza, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii zwalczania chorób zakaźnych.
Eksperymentalne protokoły często używane do badania przeżywalności bakterii w komórkach gospodarza obejmują testy liczenia kolonii, testy ochrony gentamycyny i mikroskopię elektronową. W testach liczenia kolonii populacja zakażonych komórek jest poddawana lizie (na przykład za pomocą detergentu, na który bakterie są odporne) w celu uwolnienia bakterii. Lizaty rozcieńcza się i posiewa na pożywkach na bazie agaru, a jednostki tworzące kolonie w lizatach są wyliczane dla każdego punktu czasowego i/lub warunków doświadczalnych. Takie podejście informuje o żywotności całej populacji bakterii, ale nie jest w stanie różnicować przeżycia wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego. Odmiana testu liczby kolonii, test ochrony gentamycyny, w szczególności mierzy przeżycie bakterii wewnątrzkomórkowych, w oparciu o niezdolność antybiotyku gentamycyny do przekroczenia eukariotycznej błony plazmatycznej 6. Jednak test ten jest zależny od tego, czy bakterie są podatne na zabijanie przez gentamycynę (lub inny antybiotyk, który jest podobnie nieprzepuszczalny dla błony eukariotycznej) i niezdolność antybiotyku do dostępu do bakterii wewnętrznych. W związku z tym test ochrony gentamycyny może nie być skuteczny w badaniu wszystkich gatunków bakterii lub podczas badania przeżywalności bakterii w komórkach o wysokim poziomie pinocytów, takich jak neutrofile. Żadne z tych podejść nie ujawnia lokalizacji subkomórkowej ani innego zachowania poszczególnych bakterii (np. jeśli bakterie tworzą agregaty lub mikrokolonie, które zachowują się inaczej niż pojedyncze komórki bakteryjne). Innym często stosowanym podejściem do badania żywotności poszczególnych bakterii zewnętrznych i wewnętrznych jest cienkowarstwowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Takie podejście jest korzystne, ponieważ może dostarczyć informacji dotyczących lokalizacji bakterii w komórkach gospodarza (np. fagosomie, cytoplazmie, autofagosomie), które można dalej badać za pomocą mikroskopii immunoelektronowej z przeciwciałami sprzężonymi ze złotem przeciwko markerom subkomórkowym. Jednak mikroskopia elektronowa nie jest szczególnie czuła w ocenie żywotności bakterii. Gdy osadzone skrawki są barwione octanem uranylu, cytrynianem ołowiu lub innymi odczynnikami o dużej gęstości elektronów i obrazowane za pomocą mikroskopii elektronowej, bakterie o dużej gęstości elektronów są uważane za żywotne, a przezroczyste elektronowo za nieżywotne 7,8. Jednak to założenie przecenia żywotność bakterii, ponieważ tylko te martwe bakterie z poważnie przerwanymi błonami i pozbawione cytoplazmy wydają się przezroczyste dla elektronów. Ponadto niektóre gatunki bakterii mogą wykazywać szereg gęstości elektronów w zależności od etapu wzrostu, co utrudnia określenie żywotności.
Jako alternatywę lub dodatek do tych powszechnie stosowanych metod, tutaj podajemy protokoły i uzasadnienie dla stosowania barwników fluorescencyjnych, które wskazują na żywotność bakterii, aby ocenić przeżywalność bakterii przyczepionych i internalizowanych przez komórki gospodarza. Aby zidentyfikować bakterie zewnątrzkomórkowe, zakażone komórki są najpierw wystawione na działanie odczynnika fluorescencyjnego, takiego jak lektyna lub przeciwciało specyficzne dla bakterii. Zainfekowane komórki są następnie przepuszczane i wystawiane na działanie barwników specyficznych dla DNA, które są różnie dostępne dla bakterii z nienaruszonymi i zdegradowanymi błonami, jako substytut żywotności bakterii. W pierwszym protokole przepuszczalny dla błony barwnik SYTO9 identyfikuje całą populację bakterii, podczas gdy jodek propidyny jest dostępny tylko dla tych bakterii, które mają uszkodzone błony i dlatego są uważane za niezdolne do życia. Jodek propidyny i SYTO9 wykorzystano do oceny żywotności bakterii w biofilmach, odróżnienia bakterii chorobotwórczych od niepatogennych i wyliczenia żywotnych bakterii przenoszonych przez wodę 9-12. W drugim protokole 4',6'-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) identyfikuje bakterie ogółem, podczas gdy SYTOX Green jest dostępny tylko dla populacji niezdolnej do życia. Te pary barwników żywotności można połączyć z immunofluorescencją w celu określenia lokalizacji każdej bakterii w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład w celu określenia lokalizacji subkomórkowej bakterii. Zastosowanie tych testów dostarcza kluczowych informacji na temat interakcji, które skutkują zabijaniem lub przeżywalnością bakterii podczas infekcji komórek gospodarza. Protokoły przedstawione w tym artykule zostały wykorzystane do oceny żywotności N. gonorrhoeae, która jest przyczepiona do pierwotnych ludzkich neutrofili i wewnątrz nich, w tym w różnych populacjach fagosomów neutrofili 5,13,14. Jednak protokoły te można zastosować do oceny żywotności bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w fagocytach profesjonalnych, fagocytach nieprofesjonalnych i pierwotniakach 15-24.

<table><tbody><tr><td>Igły motylkowe 21 G 3/4 do pobierania krwi</td><td>Becton Dickinson</td><td>367251</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi z heparyną sodową 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterylna woda do irygacji</td><td>Baxter</td><td>07-09-64-070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dekstran 500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S641</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>RDCD0200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS firmy Dulbecco no Ca2+ lub Mg2+</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3002802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe szklane 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zbiorcze serum ludzkie</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Mediatech</td><td>15-040-CV&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzka interleukina-8</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL/CF&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Technologie życia</td> <td>jodku propidyny</td><td>L7007 lub L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 lub L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Fluka Analityczna</td><td>47036</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-sprzężona lektyna sojowa</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Badania rozwojowe <td>myszy anty-CD63</td><td>Hybridoma Bank</td><td>H5C6</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 555 Life Technologies</td><td></td><td>A20187</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemacytometr Jasna Linia</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend RT +</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne. Obecne protokoły mające na celu rozwiązanie tych problemów obejmują testy liczby kolonii, testy ochrony gentamycyny i mikroskopię elektronową. Testy liczby kolonii i ochrony gentamycyny oceniają jedynie żywotność całej populacji bakterii i nie są w stanie określić żywotności poszczególnych bakterii. Mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do określenia żywotności poszczególnych bakterii i dostarczenia informacji dotyczących ich lokalizacji w komórkach gospodarza. Jednak bakterie często wykazują różne gęstości elektronów, co utrudnia ocenę żywotności. W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi. Testy te zostały pierwotnie opracowane w celu oceny przeżywalności Neisseria gonorrhoeae w pierwotnych ludzkich neutrofilach, ale powinny mieć zastosowanie do każdej interakcji bakteria-komórka gospodarza. Protokoły te łączą przepuszczalne przez błonę barwniki fluorescencyjne (SYTO9 i 4',6-diamidino-2-fenyloindol [DAPI]), które barwią wszystkie bakterie, z nieprzepuszczalnymi dla błony barwnikami fluorescencyjnymi (jodek propidyny i SYTOX Green), które są dostępne tylko dla bakterii niezdolnych do życia. Przed przenikaniem komórek eukariotycznych dodaje się przeciwciało lub odczynnik fluorescencyjny w celu identyfikacji bakterii zewnątrzkomórkowych. W ten sposób testy te rozróżniają żywotność bakterii przylegających do komórek eukariotycznych i wewnątrz nich. Przewidziano również protokół stosowania barwników żywotności w połączeniu z fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko markerom komórek eukariotycznych w celu określenia lokalizacji subkomórkowej poszczególnych bakterii. Barwniki żywotności bakterii omówione w tym artykule są czułym uzupełnieniem i/lub alternatywą dla tradycyjnych technik mikrobiologicznych do oceny żywotności poszczególnych bakterii i dostarczają informacji o tym, gdzie bakterie przeżywają w komórkach gospodarza.

Opisane protokoły zostały wykorzystane do zbadania przeżywalności N. gonorrhoeae po ekspozycji na pierwotne ludzkie neutrofile 5,26. Neutrofile zainfekowano N. gonorrhoeae i poddano obróbce zgodnie z protokołem 1, wykorzystując zielony fluorescencyjny barwnik żywotności SYTO9 oraz czerwony fluorescencyjny jodek propidyny (Rysunek 4A). Barwniki dodano w obecności saponiny, która wiąże cholesterol, aby preferencyjnie przepuszczczać błony plazmatyczne komórek gospodarza, a nie b...

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne. W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Niniejszy eksperyment z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej służy do oceny żywotności poszczególnych bakterii związanych z komórkami gospodarza oraz określenia żywotności bakterii w różnych lokalizacjach wewnątrzkomórkowych. Najpierw, aby zidentyfikować bakterie zewnętrzne, należy poddać zakażone komórki działaniu odczynnika fluorescencyjnego specyficznego dla permeazy bakteryjnej, a następnie poddać zakażonego gospodarza działaniu barwników fluorescencyjnych, które odróżniają bakterie żywe od nieżyjących na podstawie integralności błony bakteryjnej. Następnie, aby wskazać miejsce występowania bakterii wewnątrz komórek gospodarza, należy inkubować zakażone komórki z przeciwciałem sprzężonym z fluoroforem, skierowanym przeciwko wybranemu markerowi.Otrzymane obrazy immunofluorescencyjne pozwalają określić procent żywych bakterii wewnątrz i na zewnątrz komórek gospodarza oraz lokalizację subkomórkową bakterii wewnątrzkomórkowych żywych w porównaniu z niez żywymi. W przeciwieństwie do metod liczenia kolonii, testów ochrony gentamycyną oraz mikroskopii elektronowej, metoda ta umożliwia bezpośrednią ocenę żywotności poszczególnych bakterii. Może ona również wykazać, czy bakterie znajdujące się w różnych przedziałach subkomórkowych różnią się pod względem żywotności.Procedurę tę zaprezentuje Brittany Johnson, doktorantka z mojego laboratorium. Do komórek hodowanych na okrągłych szkiełkach podstawkowych w płytkach 24-dołkowych należy dodać odpowiednie bakterie i inkubować przez wymagany czas. Zainfekowane komórki należy raz delikatnie wypłukać. Następnie należy dodać przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 647 lub lektynę specyficzną dla bakterii w celu wykrycia bakterii zewnętrznych i inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.Po dwukrotnym płukaniu odessać medium i dodać 0,5 milliliters roztworu do barwienia żywych i martwych komórek zawierającego cyto nine oraz jodek propidyny. Inkubować komórki przez 15 minutes w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie wypłukać dwukrotnie w mops magnesium chloride. Odwrócić szkiełka nakrywkowe stroną roboczą do dołu na szkiełkach podstawowych.Uszczelnić bezbarwnym lakierem do paznokci. Obrazy należy wykonać w ciągu 30 minut przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów opisanymi w protokole tekstowym w celu oznakowania bakterii. Dodać 10 µg/mL DPI w pożywce zdefiniowanej mors i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie należy zainfekować adherentne komórki bakteriami znakowanymi DPI. Nie utrwalać komórek za pomocą aldehydów ani rozpuszczalników organicznych. Płukać komórki jednokrotnie.Następnie dodać przeciwciało lub lektynę sprzężoną z Alexa Fluor 647 i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po dwukrotnym płukaniu buforem MOPS, dodać przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 555 przeciwko wybranemu markerowi subkomórkowemu i inkubować przez 20 minut. Po dwukrotnym płukaniu buforem MOPS, raz przemyć komórki buforem MOPS z chlorkiem magnezu. Następnie odessać medium i dodać 0,4 µM cyt green, inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie dwukrotnie wypłukać komórki w buforze MOPS z chlorkiem magnezu.Następnie należy wypłukać komórki. Jeszcze raz w buforze MOPS z chlorkiem magnezu przez pięć minut. Odwrócić szkiełka podstawowe stroną z próbką do dołu na laminki szklane, uszczelnić bezbarwnym lakierem do paznokci i w ciągu 30 minut wykonać zdjęcia preparatów przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.W tym doświadczeniu ludzkie neutrofile zainfekowano rzeżączką. Lektyna sojowa sprzężona z Alexa Fluor 647 wykrywa zewnątrzkomórkowe drobnoustroje rzeżączki. Następnie, w obecności saponiny, dodano zieloną fluorescencyjną barwnik żywotności oraz czerwony fluorescencyjny jodek propidyny; saponina wiąże cholesterol, co pozwala na preferencyjne przepuszczanie błon plazmatycznych komórek gospodarza, lecz nie przenika przez błonę rzeżączki w zainfekowanych komórkach, natomiast jądro komórki eukariotycznej barwi się zarówno cytoniną, jak i jodkiem propidyny.Te obrazy neutrofili zainfekowanych rzeżączką zostały wygenerowane z użyciem barwników żywotności cyt talk screen oraz dpi. Barwnika jodku propidyny nie zastosowano, ponieważ fluorescuje on zarówno w kanale czerwonym, jak i ultrafioletowym mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie bakterie rzeżączki barwią się za pomocą dpi, ale tylko bakterie z uszkodzonymi błonami barwią się za pomocą ox green.Nieżywe bakterie wewnątrzkomórkowe wykazują pierścień barwienia dla CD 63 otaczający bakterie. Pierścień ten wskazuje, że ziarnistości pierwotne są wzbogacone w tym fagosomie. Żywa bakteria wewnątrzkomórkowa nie wykazuje barwienia dla CD 63, co oznacza, że ziarnistości pierwotne nie są wzbogacone w jej fagosomie.Łącznie dane te wskazują na korelację między żywotnością rzeżączki a przebywaniem w fagosomie ujemnym pod względem obecności ziarnistości pierwotnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny żywotności bakterii w komórkach gospodarza. Ponadto będą Państwo w stanie określić żywotność bakterii zlokalizowanych w różnych przedziałach komórek gospodarza, wykorzystując przeciwciała skierowane przeciwko tym przedziałom podkomórkowym.

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w związku z komórkami ssaków

Opisujemy alternatywne podejście do enumeracji prątków in vitro, w którym zamiast jednostek tworzących kolonie (CFU) wykorzystuje się prątki oznakowane genem reporterowym. „Przeżywalność” organizmów oraz markery odpowiedzi gospodarza są mierzone jednocześnie, co zapewnia niskokosztowy, wszechstronny i funkcjonalny system do badań interakcji gospodarz-patogen w kontekście gruźlicy.

Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Opisana jest metoda oparta na białku fluorescencyjnym żywych komórek do oświetlania wakuoli komórkowych (inkluzji) zawierających Chlamydię. Strategia ta umożliwia szybkie, zautomatyzowane określenie zakaźności Chlamydii w próbkach i może być wykorzystana do ilościowego badania dynamiki wzrostu inkluzji.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten artykuł przedstawia dwa protokoły: jeden do pomiaru bakterii beztlenowych, które mogą z powodzeniem zaatakować i przetrwać w organizmie gospodarza, a drugi do wizualizacji bakterii beztlenowych oddziałujących z komórkami gospodarza. Badanie to można zastosować do każdego uprawianego beztlenowca i dowolnego typu komórek eukariotycznych.

Porphyromonas gingivalis jako organizm modelowy do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

Opisano tutaj metodę określania międzykrólestwowych asocjacji i konkurencji (bakteryjnej i grzybiczej) o przyleganie do monowarstw komórek HeLa zakażonych wirusem. Protokół ten można rozszerzyć na wiele kombinacji prokariontów, eukariontów i wirusów.

Oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Poznaj metody mikroskopii fluorescencyjnej do oceny żywotności bakterii w komórkach ssaków. Technika ta umożliwia bezpośrednią wizualizację żywych i martwych drobnoustrojów w różnych lokalizacjach subkomórkowych.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Przeglądaj więcej filmów