Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Ten eksperyment z mikroskopią fluorescencyjną ocenia żywotność poszczególnych bakterii związanych z komórkami gospodarza i określa żywotność bakterii w różnych lokalizacjach subkomórkowych. Po pierwsze, aby zidentyfikować bakterie zewnętrzne, należy wystawić zainfekowane komórki na działanie odczynnika fluorescencyjnego, który jest specyficzny dla perazy bakterii, zakażonego gospodarza w obecności barwników fluorescencyjnych, które odróżniają bakterie żywotne od nieżywotnych na podstawie integralności błony bakteryjnej. Następnie, aby wskazać, gdzie bakterie znajdują się w komórkach gospodarza, inkubuj zakażone komórki za pomocą fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała przeciwko interesującemu go markerowi.

Uzyskane obrazy immunofluorescencyjne mogą określić procent żywych bakterii wewnątrz i na zewnątrz komórek gospodarza oraz subkomórkową lokalizację żywotnych i nieżywotnych bakterii wewnątrzkomórkowych. W przeciwieństwie do testów zliczania kolonii, testów ochrony gentamycyny i mikroskopii elektronowej, metoda ta umożliwia bezpośrednią ocenę żywotności poszczególnych bakterii. Może również ujawnić, czy bakterie w różnych przedziałach subkomórkowych różnią się żywotnością.

Tę procedurę zademonstruje Brittany Johnson, doktorantka z mojego laboratorium, Atory do komórek hodowanych na okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24 dołkach, płytki dołkowe dodają interesujące bakterie i inkubują przez żądany czas. Raz delikatnie spłucz zainfekowane komórki. Następnie dodaj sprzężone przeciwciało Alexa Fluor 6 4 7 lub lektynę specyficzną dla bakterii, aby wykryć bakterie zewnętrzne i inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Po dwóch płukaniach odessać pożywkę i dodać 0,5 mililitra żywego martwego roztworu barwiącego zawierającego cyto dziewięć i jod propidyny. Inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie dwukrotnie spłucz w mopie chlorkiem magnezu. Odwróć okładkę zadrukowaną stroną do dołu na szkiełka podstawowe.

Uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Uzyskaj obrazy w ciągu 30 minut za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów szczegółowo opisanymi w protokole tekstowym do oznaczania bakterii. Dodaj 10 mikrogramów na mililitr DPI w pożywce o określonej rozdzielczości i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Teraz zainfekuj przylegające komórki bakteriami oznaczonymi DPI. Nie mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi. Raz opłucz komórki.

Następnie dodaj sprzężone przeciwciało Alexa Fluor 6, 4, 7 lub lektynę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po dwóch płukaniach buforem do mopów dodaj sprzężone przeciwciało Alexa Fluor 5 5, 5 przeciwko markerowi subkomórkowemu będącemu przedmiotem zainteresowania i inkubuj przez 20 minut Po dwóch, RIN z buforem mopów, przemyj komórki raz chlorkiem magnezu mopów. Następnie odessać pożywkę i dodać 0,4 mikromola cyt zielone komórki inkubacyjne przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, dwukrotnie przepłukać komórki w mopach, chlorek magnezu.

Następnie umyj komórki. Jeszcze raz w mopie chlorek magnezu przez pięć minut. Odwróć szkiełka okładki zadrukowaną stroną w dół na szkiełka podstawowe, uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci, uzyskaj obrazy szkiełek w ciągu 30 minut pod mikroskopem fluorescencyjnym.

W tym eksperymencie ludzkie neutrofile zostały zakażone rzeżączką. Lektyna sojowa sprzężona z Alexa Fluor 6 4 7 wykrywa rzeżączkę zewnątrzkomórkową. Następnie zielona fluorescencyjna żywotność umiera, a czerwony fluorescencyjny jodek propidyny został dodany w obecności saponiny, która sekwestruje cholesterol, aby preferencyjnie przenikać przez błony plazmatyczne komórek gospodarza, ale nie przenika przez błonę rzeżączki w zakażonych komórkach, jądro komórki eukariotycznej barwi się zarówno cyto nine, jak i jodkiem propidyny.

Te obrazy neutrofili zakażonych rzeżączką zostały wygenerowane przy użyciu barwników żywotności, cyt, ekranu rozmowy i dpi. Barwnik jodku propidyny nie został użyty, ponieważ fluoryzuje zarówno w kanale czerwonym, jak i ultrafioletowym pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wszystkie rzeżączki plamią się dpi, ale tylko bakterie z uszkodzonymi błonami plamią się zielenią wołową.

Niezdolne do życia bakterie wewnątrzkomórkowe mają otaczający je pierścień barwienia dla CD 63. Ten pierścień wskazuje, że pierwotne granulki są wzbogacone w tym fagosomie. Żywotna bakteria wewnątrzkomórkowa nie ma barwienia dla CD 63, co wskazuje, że pierwotne granulki nie są wzbogacone w jej fagosom. Podjęte.

Łącznie dane wskazują na korelację między żywotnością rzeżączki a mieszkańcami pierwotnego fagosomu ziarnisto-ujemnego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać żywotność bakterii w komórkach gospodarza. Dodatkowo będziesz w stanie określić żywotność bakterii zlokalizowanych w różnych przedziałach w komórkach gospodarza za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko tym przedziałom subkomórkowym.