Identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja neuronów aferentnych poprzez wsteczne znakowanie barwnikiem oraz zbadanie kanałów jonowych w tych neuronach za pomocą elektrofizjologii i immunochemii klamry łatowej. Osiąga się to poprzez najpierw wstrzyknięcie DAI do tkanki docelowej w celu oznaczenia unerwiających neuronów doprowadzających. Drugim krokiem jest wyizolowanie neuronów aferentnych ze zwojów korzenia grzbietowego.

Następnie znakowane neurony są zaciskane w celu zarejestrowania bramkowanych kanałów jonowych, ostatnim krokiem jest identyfikacja wyrażonych kanałów jonowych w znakowanych neuronach za pomocą immunochemii. Ostatecznie, korzystając z kombinacji plastra, zacisku i immunochemii, jesteśmy w stanie zidentyfikować wzorzec ekspresji, a także funkcjonalne właściwości kanałów jonowych w neuronach doprowadzających. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest to, że jest to metoda nieinwazyjna, a DAI, którego używamy, DAI I jest znany z szybkiego wchłaniania przez zakończenia neuronalne.

Brak transferu między neuronami i długotrwałe zatrzymywanie w neuronach, które wstrzykujemy. Procedurę zademonstrujemy ja i Stephanie, technik badawczy z naszego laboratorium do wstrzykiwania barwnika. Najpierw ogol włosy na łydce na obu nogach znieczulonego szczura za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.

Następnie napełnij sterylną strzykawkę o pojemności jednego CC 200 mikrolitrami 1,5% roztworu Dai. Powoli włóż igłę równolegle do długiej osi każdego mięśnia żołądkowego i wstrzyknij 100 mikrolitrów dai do mięśnia przed wyjęciem igły z mięśnia. Odciągnąć tłok strzykawki, aby upewnić się, że barwnik nie wypływa z końcówki.

Odczekaj 10 sekund, a następnie wyjmij igłę z mięśnia. Potrzeba od czterech do pięciu dni, aby rozprowadzić barwnik, aby przygotować się do sekcji. Umieść zlewkę z 10 mililitrami HBSS, 35-milimetrową szalkę Petriego i 100-milimetrową szalkę Petriego na lodzie.

Następnie odważ siedem miligramów kolagenazy, jeden miligram DNA i 10 miligramów trypsyny, podgrzej kąpiel wodną do 37 stopni Celsjusza i podgrzej w kąpieli 15-mililitrową probówkę wirówkową zawierającą 10 mililitrów EBSS. Po eutanazji szczura przed sekcją należy szybko rozciąć skórę na grzbiecie zwierzęcia. Następnie usuń tkankę łączną i mięśniową wzdłuż kręgosłupa, aby uzyskać lepszą ekspozycję.

Następnie usuń odcinek lędźwiowy kręgosłupa. Następnie umieść izolowany kręgosłup na 100-milimetrowej szalce Petriego. Schłodzony roztwór HBSS należy nanieść za pomocą sterylnej pipety pastwiskowej, aby preparat był wilgotny i zimny.

Wytnij mięśnie z boków kręgosłupa. Wykonaj laminektomię grzbietową, używając rongeurs lub nożyczek, aby delikatnie usunąć kość i zamknąć wgłębienia zawierające zwoje korzenia grzbietowego. Wielokrotnie. Podczas tej procedury zastosuj lodowaty HBSS.

Pod mikroskopem wyizoluj DRG, przecinając nerwy obwodowe i ośrodkowe, pozostawiając od jednego do dwóch milimetrów nerwu, aby ułatwić obsługę zwojów. Następnie umieścić wyizolowany DRG na 35-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty bufor HBSS. Powtarzaj procedury, aż wszystkie L cztery i L 5 DRG zostaną wyizolowane.

Usuń nadmiar nerwów i naczyń krwionośnych za pomocą mikronożyczek i kleszczy. Rozciąć DRG w celu lepszej ekspozycji na enzymy, ale nie należy go osłaniać w celu dysocjacji neuronów DRG. Dodaj enzymy do ciepłego podłoża EBSS, a następnie wiruj, aby rozpuścić i wysterylizować filtrem.

Następnie umieść cały DRG w roztworze enzymatycznym za pomocą sterylnej głowicy rury pastwiskowej. Następnie bąbelkować kolbę 95% tlenem i 5% CO2 przez 60 sekund, a następnie szczelnie zamknąć kolbę. Następnie inkubować kolbę w łaźni wodnej wytrząsającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut z prędkością 240 obr./min.

Pod koniec inkubacji energicznie. Potrząsnąć kolbą 50 razy, aby oddzielić DRG w sterylnych warunkach. Dodaj pięć mililitrów MEM plus do kolby, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.

Przenieść zawartość kolby do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i odwirować w temperaturze 16 razy G przez sześć minut. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Delikatnie dodać pięć mililitrów MEM plus do próbki trytrytanianu za pomocą pipety.

Aby rozbić etap powtórnego wirowania osadów, usuń i wyrzuć supernatant i dodaj 500 mikrolitrów MEM oraz delikatnie trytrytanij, za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety na pipecie, aby uzyskać zawiesinę komórek. Następnie umieść szkiełko pokryte polilizyną w pustym, sterylnym naczyniu o średnicy 35 milimetrów. Następnie dodać kroplę zawiesiny komórek do środka szkiełka nakrywkowego.

Powtarzaj tę procedurę, aż roztwór komórkowy zostanie wyczerpany. Umieść 35-milimetrowe szalki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na godzinę, aby neurony mogły przylgnąć do ust nakrywkowych po godzinie. Dodaj dodatkowe dwa mililitry pożywki do każdej pożywki i włóż je z powrotem do inkubatora w celu nagrania z zaciskiem krosowym.

Najpierw zidentyfikuj neurony DRG oznaczone barwnikiem za pomocą mikroskopu z fluorescencją epi. Następnie napełnij szklaną elektrodę roztworem wewnętrznym. Delikatnie stuknij, aby usunąć wszelkie uwięzione bąbelki.

Następnie umieść elektrodę w uchwycie elektrody. Opuść elektrodę do ogniwa za pomocą mikromanipulatora. Gdy elektroda dotknie ogniwa, delikatnie zasysaj przez rurkę ssącą, aż powstanie szczelne uszczelnienie.

Następnie zaciśnij napięcie membrany na żądanym potencjale podtrzymania. Uzyskaj konfigurację zacisku krosowego całego ogniwa, stosując silniejsze ssanie. Aby usunąć łatkę membrany na końcu elektrody, po ustaleniu konfiguracji zacisku całego ogniwa rozpocznij nagrywanie.

W tej procedurze utrwal neurony na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% para formaldehydu przez jedną godzinę. Następnie przetrzyj neurony za pomocą 2% tween 20 w PBS przez 10 minut. Następnie inkubuj komórki w roztworze blokującym przez godzinę.

Komórki testowe są inkubowane przez noc w roztworze blokującym wraz z przeciwciałem pierwszorzędowym. Kontrolny zestaw neuronów pozostawia się do inkubacji przez noc w roztworze blokującym bez żadnych przeciwciał pierwotnych. Następnego dnia przemyj szkiełka nakrywkowe buforem PBS trzy razy przez pięć minut każde, a następnie dwa przepłuczenia po pięć minut każde 1% tween 20 w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.

Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe testowe i kontrolne z odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym, aby umożliwić wizualizację. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe PB S3 razy przez pięć minut, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych. Następnie zamontuj szkiełka nakrywkowe na czystym szkiełku podstawowym za pomocą nośnika montażowego.

Następnie nałóż przezroczysty lakier do paznokci na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby zamocować go na miejscu. Po wyschnięciu wizualizuj neurony i rejestruj obrazy za pomocą oprogramowania dołączonego do mikroskopu fluorescencyjnego. Jest to reprezentacja wstrzyknięcia Dai do mięśnia żołądkowego i wstecznego transportu z mięśnia do DRG.

L four i L five DRG są oznaczone tutaj. Neurony aferentne są pokazane na obrazie jasnego pola, a ten fluorescencyjny obraz pokazuje jeden neuron aferentny mięśniowy oznaczony barwnikiem. Ten histogram pokazuje intensywność fluorescencji DII neuronów czuciowych.

Duży pik pochodzi z nieznakowanych neuronów i jest wyposażony w równanie Gaussa w celu określenia średniej intensywności i odchylenia standardowego. Przerywana pionowa linia reprezentuje próg dla etykietowania DAI. Histogram zawiera dane z 1047 neuronów, z których 167 jest oznaczonych dai.

Oto reprezentatywny neuron doprowadzający do mięśni z dobrą kontrolą napięcia błonowego. Prądy sodowe o wartości minus 20, minus 10 i zero miliwoltów są pokazane po lewej stronie, a zależność napięcia prądu jest pokazana po prawej stronie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim, ale delikatnym rozwarstwieniu DRG i wielokrotnym utrzymywaniu preparatu w stanie wilgotnym w punkcie ice code hbss.

Po tej procedurze można oznaczyć i zidentyfikować inne neurony odprowadzające, aby zrozumieć ich rolę w fizjologii.