Name: Identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji neuronów czuciowych przez wsteczną barwienie barwnikiem DAI oraz badanie kanałów jonowych za pomocą elektrofizjologii patch clamp i immunochemii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health Grant AR059397 (KSE).

Uwaga: Wszystkie prace ze zwierzętami muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucji i opieki nad zwierzętami.
1. Przygotowanie zwierząt i etykietowanie
<ol>
	<li>Znieczulenie szczurów: Znieczulenie szczura (zwykle 150-400 g) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy (50 mg/kg masy ciała), ksylazyny (5 mg/kg) i acepromazyny (1 mg/kg). Sprawdź odruchy, szczypiąc stopę, poczekaj, aż nie będzie odpowiedzi. Ponieważ reakcja anestezjologiczna różni się u różnych zwierząt, najlepiej jest określić działanie środków znieczulających, testując odruchy bólowe.</li>
	<li>Roztwór DiI: Zważ proszek DiI i rozpuść w sterylnym 100% DMSO, aby uzyskać 1,5% roztwór (15 mg / ml). Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej w suchej atmosferze do czasu użycia.</li>
	<li>Zastrzyki DiI: ogolić włosy w okolicy łydki na obu nogach znieczulonego szczura za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.
	<ol>
		<li>Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml (igła 11/4 cala 27 G) 200 μl 1,5% roztworu DiI. Powoli włóż igłę równolegle do długiej osi każdego mięśnia brzuchatego łydki i wstrzyknij 100 μl DiI do mięśnia, powoli wycofując igłę z mięśnia (~10 sekund) bez wycofywania się z mięśnia.</li>
		<li>Przed wyjęciem igły z mięśnia należy pociągnąć do tyłu tłok strzykawki, aby upewnić się, że barwnik nie wypływa już z końcówki, odczekać 10 sekund, a następnie wyjąć igłę z mięśnia. Ten krok zapobiega wyciekowi DiI z igły na skórę, która mogłaby oznaczać aferenty skórne.</li>
		<li>Powtórz dla drugiej nogi.</li>
		<li>Odczekaj 4-5 dni, aż DiI zostanie przetransportowane z mięśnia do DRG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja i izolacja neuronów
<ol>
	<li>Rozwiązania:
	<ol>
		<li>Przygotować Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (HBSS) i Zrównoważony Roztwór Soli Earle'a (EBSS) zgodnie z instrukcjami producenta, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Pożywki hodowlane (MEM Plus): Wymieszać 89 ml minimalnej ilości pożywek niezbędnych (MEM), 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 ml roztworu penicyliny i streptomycyny, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Roztwór polilizyny: rozpuścić sproszkowany bromowodorek poli-L-lizyny (10 mg/100 ml) w 0,1 M roztworze boranu sodu o pH 8,4, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe (okrągłe 12 mm) w 70% etanolu przez 3-4 godziny i wysusz na powietrzu w sterylnym kapturze hodowlanym.</li>
		<li>Umieścić wysuszone szkiełka nakrywkowe w roztworze polilizyny O/N.</li>
		<li>Wyjąć z roztworu polilizyny i umyć w sterylnej wodzie destylowanej 2x przez 5 minut każdy, aby usunąć nadmiar polilizyny.</li>
		<li>Oddzielić szkiełka nakrywkowe, wysuszyć w kapturze hodowlanym i przechowywać w temperaturze 4 oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do sekcji
	<ol>
		<li>Umieścić na lodzie zlewkę z 10 ml HBSS, szalkę Petriego o średnicy 35 mm i szalkę Petriego o średnicy 100 mm.</li>
		<li>Odważ enzymy: 7 mg kolagenazy, 1 mg DNAzy i 10 mg trypsyny.</li>
		<li>Podgrzej łaźnię wodną z wytrząsaniem do temperatury 37 °C i umieść w łaźni 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 10 ml EBSS do ogrzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie:
	<ol>
		<li>Ofiara ze szczura zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Do eutanazji szczura użyto klasy C<span="s1">dwutlenek arbonu.</li>
		<li>Szybko usuń plecy, rozcinając skórę na plecach, usuń tkankę łączną i mięśniową wzdłuż kręgosłupa dla lepszej ekspozycji i usuń odcinek lędźwiowy kręgosłupa (koniec klatki piersiowej do kości biodrowej; Rysunek 1).</li>
		<li>Umieścić izolowany kręgosłup na szalce Petriego o średnicy 100 mm i za pomocą sterylnej pipety Pasteura nanieść schłodzony roztwór HBSS, aby preparat był wilgotny i zimny.</li>
		<li>Wytnij mięśnie z boków kręgosłupa. Wykonaj laminektomię grzbietową za pomocą rongeurów lub nożyczek i delikatnie usuń kość otaczającą wgłębienia zawierające DRG.</li>
		<li>Podczas tej procedury kilkakrotnie stosuj lodowaty HBSS (~1 ml).</li>
		<li>Odizoluj DRG, przecinając nerwy obwodowe i ośrodkowe (pozostawiając 1-2 mm nerwu, aby ułatwić obsługę zwojów)</li>
		<li>Umieścić wyizolowany DRG na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej lodowaty bufor HBSS.</li>
		<li>Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie L-4 i L-5 DRG zostaną odizolowane. DRG klatki piersiowej można wyizolować i przetworzyć oddzielnie jako kontrolę ujemną do znakowania DiI.</li>
		<li>Umieść naczynie z wyizolowanym DRG pod mikroskopem preparacyjnym i usuń nadmiar nerwów i naczyń krwionośnych za pomocą mikronożyczek i kleszczy.</li>
		<li>Rozciąć DRG, aby uzyskać lepszą ekspozycję na enzymy, ale nie wyjmuj DRG z pochwy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja neuronów DRG:
	<ol>
		<li>Dodaj enzymy do ciepłej pożywki EBSS (przechowywanej w łaźni wodnej). Wstrząśnij krótko do rozpuszczenia i wysterylizuj filtr.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej pipety Pasteura umieść całe DRG w roztworze enzymu. Zminimalizuj objętość HBSS dodawanego za pomocą DRG, ponieważ HBSS rozcieńczy mieszaninę enzymów. Spryskaj kolbę 95%O2 i 5% CO2 przez 60 sekund przed szczelnym zamknięciem kolby.</li>
		<li>Inkubować kolbę w wytrząsającej łaźni wodnej nastawionej na 37 °C przez 60 minut przy 240 obr./min.</li>
		<li>Pod koniec inkubacji energicznie wstrząsnąć kolbą 50 razy, aby oddzielić DRG5.</li>
		<li>W sterylnych warunkach dodać 5 ml MEM Plus do kolby w celu zatrzymania enzymów.</li>
		<li>Przenieść zawartość kolby do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 16 x g przez 6 minut.</li>
		<li>Usunąć i odrzucić sklarowany osad, dodać 5 ml MEM Plus do próbki. Delikatnie rozetrzeć pipetą, aby rozbić osad.</li>
		<li>Powtórzyć etap wirowania, usunąć i wyrzucić supernatant i dodać 500 μl MEM Plus. Delikatnie rozetrzeć końcówką pipety o pojemności 1 ml na pipecie, aby uzyskać zawiesinę komórek.</li>
		<li>Umieść jedno szkiełko nakrywkowe ze szkła pokrytego polilizyną w pustym sterylnym naczyniu o średnicy 35 mm. Dodać kroplę (~50 μl) zawiesiny komórek do środka szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Powtarzaj, aż roztwór komórkowy zostanie wyczerpany.</li>
		<li>Umieścić szalki o średnicy 35 mm w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 1 godzinę, aby neurony mogły przylgnąć do szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Dodaj dodatkowe 2 ml pożywki do każdego naczynia i wróć do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nagrywanie z zaciskiem krosowym
<ol>
	<li>Rozwiązania do nagrywania: te rozwiązania służą do rejestrowania prądów NaV. Przykłady rozwiązań o różnym składzie można znaleźć w tych piśmiennictwie5-7.
	<ol>
		<li>Roztwór zewnętrzny: (w mM) 45 NaCl, 100 N-metylo-d-glukaminy (NMG)•Cl, 4 MnCl2, 10 Na•HEPES i 10 glukozy, o pH = 7,4 i osmolarności = 320 mOsm.</li>
		<li>Roztwór wewnętrzny: (w mM) 104 NMG•Cl, 14 Kreatyna•PO4, 6 MgCl2, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG2•EGTA i 0,3 Tris2•GTP o pH 7,4 i osmolarności = 300 mOsm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar prądów jonowych:
	<ol>
		<li>Wyciągnij elektrody rejestrujące ze szklanych kapilar na ściągacz elektrod i wypoleruj końcówki na gorąco za pomocą mikrokuźni. Rezystancja elektrod wynosi zwykle 2-3 MΩ</li>
		<li>Zidentyfikuj neurony DRG oznaczone DiI za pomocą mikroskopu z epifluorescencją i kostki TRITC. DiI ma długość fali wzbudzenia 550 nm i długość fali emisji 570 nm.</li>
		<li>Napełnij szklaną elektrodę roztworem wewnętrznym (wypełniając tylko ~ 1 cm końcówki elektrody) i delikatnie postukaj, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki. Umieść w uchwycie elektrody i przenieś do ogniwa za pomocą mikromanipulatora.</li>
		<li>Gdy elektroda dotknie ogniwa, zastosuj delikatne ssanie przez rurkę ssącą, aż do uzyskania szczelnego uszczelnienia (określonego przez wzrost rezystancji elektrody).</li>
		<li>Zacisk napięcie membrany na żądanym potencjale podtrzymania (zwykle od -60 do -120 mV).</li>
		<li>Uzyskaj konfigurację zacisku krosowego dla całego ogniwa, stosując silniejsze ssanie w celu usunięcia łaty membranowej na końcu elektrody. Przejście do konfiguracji całoogniwowej obserwuje się elektrycznie jako wzrost prądu pojemnościowego8-10.</li>
		<li>Skompensuj rezystancję szeregową za pomocą obwodu kompensacyjnego wzmacniacza patch clamp (użyj co najmniej 80% kompensacji)8,10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Utrwal neurony na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% paraformaldehydu przez 1 godzinę, a następnie przepuszczaj za pomocą 2% Tween 20 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować utrwalone komórki O/N w roztworze blokującym (normalna surowica lub albumina surowicy bydlęcej) plus przeciwciało pierwszorzędowe, które jest przeciwciałem opracowanym w celu wiązania się ze specyficznym antygenem będącym przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Inkubuj kontrolny zestaw neuronów O / N w roztworze blokującym, który nie ma pierwszorzędowych przeciwciał.</li>
	<li>Przemyć szkiełka nakrywkowe buforem PBS 3x przez 5 minut, a następnie 2 płukania po 5 minut każde 1% Tween 20 w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe, testowe i kontrolne z odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym, aby umożliwić wizualizację.</li>
	<li>Przemyj szkiełka nakrywkowe PBS 3x przez 5 minut, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na czystym szkiełku podstawowym za pomocą nośnika montażowego.</li>
	<li>Nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby go zamocować. Po wyschnięciu zwizualizuj neurony i rejestruj obrazy za pomocą oprogramowania dołączonego do mikroskopu fluorescencyjnego. 
	Uwaga: W tej pracy użyto mikroskopu firmy Nikon z oprogramowaniem NIS ELEMENTS BR 3.2. Czas naświetlania został zoptymalizowany i pozostał taki sam dla szkiełek kontrolnych i testowych.</li>
	<li>Mierz intensywność fluorescencji i wielkość komórek z poszczególnych neuronów za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).</li>
</ol>

<ol><li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reactions+of+cutaneous+and+muscle+afferent+neurons+to+peripheral+nerve+transection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats.</a> J. Neurosci. 23, 10559-10567 (2003).</li>
<li>Wang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+reactive+oxygen+species+modulates+voltage-gated+sodium+channels+in+dorsal+root+ganglia+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endogenous reactive oxygen species modulates voltage-gated sodium channels in dorsal root ganglia of rats.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1439-1447 (2011).</li>
<li>Köbbert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog. Neurobiol. 62, 327-351 (2000).</li>
<li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 71-81 (2008).</li>
<li>Ikeda, S. R., Schofield, G. G., Weight, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+and+Ca2%2B+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+nodose+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Na+ and Ca2+ currents of acutely isolated adult rat nodose ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 55, 527-539 (1986).</li>
<li>Yarotskyy, V., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roscovitine+Inhibits+CaV3.1+%28T-Type%29+Channels+by+Preferentially+Affecting+Closed-State+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.Ther%22%5BJournal%5D)">Roscovitine Inhibits CaV3.1 (T-Type) Channels by Preferentially Affecting Closed-State Inactivation.</a> J. Pharmacol. Exp.Ther. 340, 463-472 (2012).</li>
<li>Ganapathi, S. B., Kester, M., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+block+of+HERG+potassium+channels+by+R-roscovitine%3A+implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">State-dependent block of HERG potassium channels by R-roscovitine: implications for cancer therapy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, 701-710 (2009).</li>
<li>Jones, S. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+SW+%22Neuromethods+Vol.+14+Neurophysiological+Techniques%3A+Basic+Methods+and+Concepts%22">Neuromethods Vol. 14 Neurophysiological Techniques: Basic Methods and Concepts</a>. Baker, G. B., Vanderwolf, C. H., Boulton, A. A. , The Humann Press, Inc. 143-192 (1990).</li>
<li>Penner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPenner%2C+R+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. rwin 1, Plenum Press. 3-30 (1995).</li>
<li>Marty, A. aN., Erwin, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+AaN+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. rwin 2, Plenum Press. 31-52 (1995).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S. Y., Baxter, J. C., Kiveric, E., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodotoxin-resistant+voltage-dependent+sodium+%28NaV%29+channels+in+identified+muscle+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Tetrodotoxin-resistant voltage-dependent sodium (NaV) channels in identified muscle afferent neurons.</a> J. Neurophysiol. , (2012).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S. Y., Baxter, J. C., Howard, J. R., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaV1.8+channels+are+expressed+in+large%2C+as+well+as+small%2C+diameter+sensory+afferent+neurons.+%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">NaV1.8 channels are expressed in large, as well as small, diameter sensory afferent neurons. </a> Channels. 7, 0-1 (2013).</li>
<li>Smith, S. A., Mitchell, J. H., Garry, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+exercise+pressor+reflex+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mammalian exercise pressor reflex in health and disease.</a> Exp. Physiol. 91, 89-102 (2006).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 12, 333-335 (1989).</li>
<li>von Bartheld, C. S., Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Fuller, B. C., Sumner, A. D., Kutzler, M. A., Ruiz-Velasco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+employing+ultrasound+guidance+for+percutaneous+cardiac+muscle+injection+to+retrograde+label+rat+stellate+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel approach employing ultrasound guidance for percutaneous cardiac muscle injection to retrograde label rat stellate ganglion neurons.</a> Neurosci. Lett. 363, 252-256 (2004).</li>
<li>Takahashi, Y., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermatomes+in+the+rat+limbs+as+determined+by+antidromic+stimulation+of+sensory+C-fibers+in+spinal+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Dermatomes in the rat limbs as determined by antidromic stimulation of sensory C-fibers in spinal nerves.</a> Pain. 67, 197-202 (1996).</li>
<li>Zhou, W., Jones, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+and+calcium+channel+saturation+in+bullfrog+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Surface charge and calcium channel saturation in bullfrog sympathetic neurons.</a> J Gen Physiol. 105, 441-462 (1995).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Margas, W., Mahmoud, S., Ruiz-Velasco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Modulation+of+Mu+%28%7Bmicro%7D%29+Opioid+Receptors+in+Adult+Rat+Sphenopalatine+Ganglion+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic Acetylcholine Receptor Modulation of Mu ({micro}) Opioid Receptors in Adult Rat Sphenopalatine Ganglion Neurons.</a> J. Neurophysiol. 103, 172-182 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Mięśnie aferentne pochodzące z mięśni trójgłowych łydki (np. mięśnia brzuchatego łydki) były wykorzystywane w wielu badaniach w celu zbadania odruchu presyjnego wysiłku fizycznego (EPR)13. Biorąc pod uwagę zainteresowanie badaniem neuronów czuciowych pośredniczących w EPR, mięśnie brzuchatego łydki wybrano do wstrzyknięcia barwnika. DiI został wybrany ze względu na jego lipofilowy charakter i dlatego, że nie jest tracony z neuronu przez dyfuzję przez nienaruszoną błonę plazmatyczną3,14. Kor...

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) składają się z somy z neuronów doprowadzających unerwiających różne części ciała, a ważne informacje można uzyskać badając neurony czuciowe o różnych celach unerwienia1. Do izolacji i identyfikacji neuronów aferentnych stosuje się różne metody pośrednie lub inwazyjne, np. wstrzyknięcie do nerwu markerów, takich jak fluorogold1, wstrzyknięcie barwnika do mięśni metodą chirurgiczną2. Spośród różnych barwników, które zostały z powodzeniem wykorzystane do znakowania neuronów i dróg neuronalnych, barwniki fluorescencyjne, takie jak DiI, są szeroko stosowane w śledzeniu neuroanatomicznym ze względu na ich szybkie wchłanianie przez zakończenia neuronów, długotrwałe zatrzymywanie w neuronach i brak transferu między neuronami3. Neurony aferentne oznaczone DiI można łatwo zobrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu szczegółowego badania. Jednak jednym z ograniczeń jest to, że markery, takie jak DiI, mogą zostać utracone z komórek podczas przenikania komórek potrzebnego do immunocytochemii z wewnątrzkomórkowymi epitopami4. Tutaj opisujemy metodę, która wykorzystuje DiI wstrzyknięte do mięśni szkieletowych w celu identyfikacji neuronów doprowadzających do mięśni w DRG. Opisujemy również metodę przenikania komórek, która zatrzymuje DiI w neuronie, umożliwiając jednocześnie dostęp przeciwciał do epitopów wewnątrzkomórkowych. Demonstrujemy zastosowanie zarówno elektrofizjologii klamry łatowej, jak i immunocytochemii do badania tych zidentyfikowanych neuronów, a także opisujemy wyraźne zalety każdej techniki w badaniu kanałów jonowych, które kontrolują pobudliwość neuronów. Na koniec opisujemy potencjalne problemy, które mogą utrudniać interpretację danych elektrofizjologicznych. Wykorzystaliśmy te metody do identyfikacji neuronów doprowadzających mięśniowych i skórnych oraz określenia kanałów sodowych bramkowanych napięciem (NaV) wyrażonych w tych zidentyfikowanych neuronach8. Metody te można jednak dostosować do różnych preparatów do badania zidentyfikowanych podzbiorów neuronów unerwiających określoną tkankę docelową lub jądro mózgowe.

<table><tbody><tr><td>NaV 1.8</td><td>Abcam</td><td>Ab93616</td><td></td></tr><tr><td>NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 i 1.9</td><td>Alamone Labs, Jerozolima, Izrael</td><td>ASC- 001/ 009 /008 /017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica</td><td></td><td></td><td></td>kozia</tr><tr><td>Fluoro-żelowa</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>17985</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Neurony czuciowe przekazują sygnały z różnych części ciała do ośrodkowego układu nerwowego. Soma dla tych neuronów znajduje się w zwojach korzenia grzbietowego, które wyściełają kręgosłup. Zrozumienie receptorów i kanałów wyrażanych przez te neurony doprowadzające czuciowo może doprowadzić do opracowania nowych terapii chorób. Pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie konkretnego podzbioru neuronów czuciowych będących przedmiotem zainteresowania. Tutaj opisujemy metodę identyfikacji neuronów aferentnych unerwiających mięśnie poprzez znakowanie wsteczne za pomocą barwnika fluorescencyjnego DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny). Zrozumienie udziału kanałów jonowych w pobudzeniu mięśni aferentnych może pomóc w lepszym kontrolowaniu nadmiernej pobudliwości wywołanej niektórymi stanami chorobowymi, takimi jak choroba naczyń obwodowych lub niewydolność serca. Zastosowaliśmy dwa podejścia do identyfikacji zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażanych przez te neurony, elektrofizjologię klamrów łatkowych i immunocytochemię. Podczas gdy elektrofizjologia w połączeniu z farmakologicznymi blokerami może zidentyfikować funkcjonalne typy kanałów jonowych, użyliśmy immunocytochemii w celu zidentyfikowania kanałów, dla których określone blokery były niedostępne i lepszego zrozumienia wzorca dystrybucji kanałów jonowych w populacji komórek. Techniki te można zastosować do innych obszarów układu nerwowego w celu zbadania określonych grup neuronów.

Stosując opisaną tutaj metodę, zidentyfikowaliśmy neurony aferentne mięśni w zwojach rdzeniowych (DRG), a następnie określiliśmy kanały sodowe sterowane napięciem (NaV) ekspresjonowane przez te neurony. Neurony aferentne mięśni znakowane DiI (Rysunek 1C) stanowiły niewielką część całkowitej populacji neuronów w DRG, przy średniej wartości 16% znakowanych neuronów (167/1047). Ilościowe określenie przeprowadzono, najpierw mierząc fluorescencję za pomocą programu ImageJ i wykreślając histogramy danych o int...

Aferentne neurony czuciowe przekazują informacje sensoryczne z peryferii do ośrodkowego układu nerwowego. Identyfikacja konkretnych neuronów aferentnych pomoże w zrozumieniu ich fizjologii. Opisujemy metodę znakowania wstecznego w celu identyfikacji neuronów aferentnych i badania kanałów jonowych bramkowanych napięciem w tych neuronach za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii.

Identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja neuronów doprowadzających za pomocą wstecznego znakowania barwnikiem oraz badanie kanałów jonowych w tych neuronach z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i immunochemii. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wstrzyknięcie DAI do tkanki docelowej w celu oznakowania unerwiających ją neuronów doprowadzających. Drugim krokiem jest izolacja neuronów doprowadzających z zwojów korzeni grzbietowych.Następnie w oznakowanych neuronach wykonuje się patch-clamp w celu rejestracji bramkowanych kanałów jonowych, a ostatnim krokiem jest identyfikacja ekspresjonowanych kanałów jonowych w oznakowanych neuronach za pomocą immunochemii. Ostatecznie, wykorzystując kombinację metody patch-clamp i immunochemii, jesteśmy w stanie zidentyfikować wzorzec ekspresji oraz właściwości funkcjonalne kanałów jonowych w neuronach doprowadzających. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest to, że jest to metoda nieinwazyjna, a stosowany przez nas DAI, DAI I, jest znany z szybkiego pobierania przez terminale neuronalne.Brak transferu między neuronami oraz długotrwałe utrzymywanie się barwnika wewnątrz wstrzykiwanych neuronów. Procedurę zademonstruję ja oraz Stephanie, technik badawczy z naszego laboratorium. W celu wstrzyknięcia barwnika należy najpierw zgolić sierść nad obszarem łydki w obu nogach znieczuplonego szczura, używając golarki elektrycznej.Następnie napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 CC 200 µL 1,5% roztworu Dai. Powoli wprowadź igłę równolegle do długiej osi każdego mięśnia żołądkowego i wstrzyknij 100 µL Dai do mięśnia przed wycofaniem igły. Cofnij tłok strzykawki, aby upewnić się, że barwnik nie wycieka już z końcówki.Odczekaj 10 sekund, a następnie wyjmij igłę z mięśnia. Rozprzestrzenienie się barwnika przed sekcją wymaga od czterech do pięciu dni. Umieść zlewkę z 10 ml HBSS, szalkę Petriego o średnicy 35 mm oraz szalkę Petriego o średnicy 100 mm w lodzie.Następnie odważ 7 mg kolagenazy, 1 mg DNA oraz 10 mg trypsyny, rozgrzej łaźnię wodną z wytrząsaniem do 37 °C i ogrzej w niej probówkę do wirowania o pojemności 15 ml zawierającą 10 ml EBSS. Po uśpieniu szczura przed sekcją, szybko nacinaj skórę na grzbiecie zwierzęcia. Następnie usuń tkankę łączną i mięśniową wzdłuż kręgosłupa, aby uzyskać lepszy dostęp.Następnie usuń odcinek lędźwiowy kręgosłupa. Potem umieść wyizolowany kręgosłup w 100 mm szalce Petriego. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura nanieś schłodzony roztwór HBSS, aby utrzymać preparat w wilgotnym i zimnym stanie.Odciąć mięśnie z boków kolumny kręgowej. Wykonać laminektomię grzbietową, używając kleszczy kostnych lub nożyczek, aby delikatnie usunąć kość i zamknąć zagłębienia zawierające zwoje korzeni grzbietowych. Czynność powtarzać. Podczas tej procedury stosować lodowaty HBSS.Pod mikroskopem wyizoluj DRG, przecinając nerwy obwodowe i centralne, pozostawiając jeden do dwóch milimetrów nerwu, aby ułatwić manipulację zwojami. Następnie umieść wyizolowane DRG w 35 milimetrowej płytce Petri zawierającej lodowaty bufor HBSS. Powtarzaj procedury, aż do czasu wyizolowania wszystkich DRG z segmentów L4 i L5.Usuń nadmiar nerwów i naczyń krwionośnych za pomocą mikronožyczek i pęsety. Przetnij DRG, aby zapewnić lepszą ekspozycję na enzymy, ale nie usuwaj osłonki DRG podczas dysocjacji neuronów DRG. Dodaj enzymy do podgrzanego medium EBSS, a następnie wymieszaj w wortexie do rozpuszczenia i wysterylizuj przez filtr.Następnie za pomocą sterylnej końcówki do pipety Pasteura przenieś wszystkie DRG do roztworu enzymu. Po tym czasie napowietrz kolbę mieszaniną 95% tlenu i 5% CO2 przez 60 sekund, a następnie szczelnie ją zakorkuj. Kolbę inkubuj w wytrząsowej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 60 minut przy prędkości 240 RPM.Po zakończeniu inkubacji energicznie wstrząśnij kolbą 50 razy w warunkach sterylnych, aby rozdzielić DRG. Do kolby dodaj pięć mililitrów pożywki MEM plus, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.Przenieś zawartość kolby do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów i wiruj z prędkością 16 ×g przez sześć minut. Następnie usuń i odrzuć supernatant. Dodaj pięć mililitrów MEM plus do próbki i delikatnie ztitruj za pomocą pipety.Aby rozbić osad, należy powtórzyć etap wirowania, usunąć i odrzucić nadsącz, a następnie dodać 500 µL MEM plus i delikatnie homogenizować zawiesinę komórkową za pomocą końcówki do pipety o objętości 1 mL. Następnie należy umieścić szkiełko podstawowe powlekane polilizyną w pustej, sterylnej szalce 35 mm. Na koniec nanieść kroplę zawiesiny komórkowej na środek szkiełka.Powtarzać tę procedurę do wyczerpania zawiesiny komórek. Umieścić szalki 35 mm w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na jedną godzinę, aby umożliwić neuronom przytwierdzenie się do szkiełek podstawowych. Po upływie jednej godziny dodać do każdej szalki kolejne 2 ml pożywki i przenieść je z powrotem do inkubatora w celu przeprowadzenia rejestracji metodą patch clamp.W pierwszej kolejności zidentyfikuj neurony DRG znakowane barwnikiem, korzystając z mikroskopu z epifluorescencją. Następnie napełnij szklaną elektrodę roztworem wewnętrznym. Delikatnie ostukaj elektrodę, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.Następnie umieść elektrodę w uchwycie do elektrod. Opuść elektrodę do komórki za pomocą mikromanipulatora. Gdy elektroda dotknie komórki, zastosuj delikatne ssanie poprzez rurkę ssącą, aż do utworzenia szczelnego połączenia.Następnie ustabilizuj napięcie błony na pożądanym potencjale podtrzymującym. Uzyskaj konfigurację patch clamp w trybie whole-cell poprzez zastosowanie silniejszego ssania. Aby usunąć fragment błony z końcówki elektrody, po ustanowieniu konfiguracji patch clamp w trybie whole-cell, rozpocznij rejestrację.W tej procedurze należy utrwalić neurony na szkiełkach przedmiotowych za pomocą 4% paraformaldehydu przez jedną godzinę. Następnie należy poddać neurony permeabilizacji, stosując 2% tween 20 w PBS przez 10 minut. Następnie komórki inkubuje się w roztworze blokującym przez jedną godzinę.Komórki testowe inkubuje się w roztworze blokującym z dodatkiem przeciwciała pierwszorzędowego przez noc. Kontrolny zestaw neuronów pozostawia się do inkubacji przez noc w samym roztworze blokującym, bez przeciwciał pierwszorzędowych. Następnego dnia należy trzykrotnie przemyć szkiełka podstawowe buforem PBS przez pięć minut każde płukanie, a następnie dwukrotnie przemyć przez pięć minut roztworem 1% tween 20, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe.Następnie inkubuj szkiełka podstawowe z próby i kontroli z odpowiednim znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem wtórnym przez 30 minut; wiąże się ono z przeciwciałem pierwszorzędowym, umożliwiając wizualizację. Po tym czasie przemyj szkiełka podstawkowe buforem PBS 3 razy po pięć minut, aby usunąć nadmiar przeciwciał wtórnych. Następnie zamocuj szkiełka podstawkowe na czystym szkiełku przedmiotowym, używając medium montażowego.Następnie na brzeg szkiełka nakrywnego nanieś bezbarwny lakier do paznokci, aby go utrwalić. Po wyschnięciu zwizualizuj neurony i wykonaj zdjęcia, korzystając z oprogramowania dołączonego do mikroskopu fluorescencyjnego. Jest to przedstawienie iniekcji Dai w mięsień żołądka oraz transportu wstecznego z mięśnia do zwoju rdzeniowego (DRG).Tutaj zaznaczono zwoje korzeni grzbietowych (DRG) L4 oraz L5. Neurony aferentne widoczne są na obrazie w świetle przechodzącym, natomiast ten obraz fluorescencyjny przedstawia jeden neuron aferentny mięśniowy znakowany barwnikiem. Ten histogram przedstawia intensywność fluorescencji DiI w neuronach sensorycznych.Duży pik pochodzi od nieoznakowanych neuronów i został dopasowany za pomocą równania Gaussa w celu wyznaczenia średniej intensywności oraz odchylenia standardowego. Przerywana pionowa linia reprezentuje próg znakowania DAI. Histogram obejmuje dane z 1047 neuronów, z czego 167 zostało oznakowanych dai.Oto reprezentatywny neuron aferentny mięśniowy z dobrą kontrolą napięcia błony. Prądy sodowe przy minus 20, minus 10 i zero milivoltach przedstawiono po lewej stronie, a zależność prądu od napięcia po prawej stronie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o szybkim, lecz delikatnym wypreparowaniu zwojów tylnych (DRGs) i utrzymywaniu preparatu w wilgotności poprzez częste płukanie schłodzonym do 0°C roztworem HBSS.Po zastosowaniu tej procedury można oznakować i zidentyfikować inne neurony eferentne, aby zrozumieć ich rolę w fizjologii.

identification-specific-sensory-neuron-populations-for-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Identyfikacja określonych populacji neuronów czuciowych do badania wyrażonych kanałów jonowych

Istnieją przeszkody techniczne w jednoczesnym pomiarze przepływu prądu przez wiele kanałów jonowych, a następnie w rozróżnieniu, jaka część prądu transbłonowego wynika z każdego typu kanału. Aby zaspokoić tę potrzebę, niniejsza metoda przedstawia sposób generowania krzywej IV dla poszczególnych typów kanałów z wykorzystaniem specyficznych komponentów częstotliwościowych.

Rekapitulacja krzywej IV kanału jonowego z wykorzystaniem składowych częstotliwościowych

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Neurony czuciowe specyficzne dla narządów są trudne do zidentyfikowania. Szybkie śledzenie niebieskie służy do identyfikacji neuronów bez dawki unerwiających drogi oddechowe w celu sortowania komórek. Posortowane neurony bez dawki są używane do ekstrakcji wysokiej jakości kwasu rybonukleinowego (RNA) do sekwencjonowania. Za pomocą tego protokołu określa się ekspresję genów neuronów specyficznych dla dróg oddechowych.

Metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy

Tutaj opisujemy fizjologiczne podejście, które pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych w ostrych wycinkach tkanki koronalnej mysiego narządu lemieszowo-nosowego za pomocą nagrań z całych komórek.

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Proteasom błony neuronalnej (NMP) został niedawno zidentyfikowany w podzbiorze neuronów somatosensorycznych jako kluczowy regulator percepcji dotyku, bólu i swędzenia. W tym artykule przedstawiono solidny przepływ pracy do analizy ekspresji i funkcji NMP specyficznej dla typu komórki przy użyciu sortowania komórek, profilowania transkryptomu i analiz immunofluorescencyjnych opartych na hodowlach.

Specyficzna dla podtypu komórki analiza proteasomu błony neuronalnej w neuronach somatosensorycznych

Poznaj metodę identyfikacji neuronów czuciowych przez wsteczną barwienie barwnikiem DAI oraz badanie kanałów jonowych za pomocą elektrofizjologii patch clamp i immunochemii.

Identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych

Przeglądaj więcej filmów