Specyficzna dla podtypu komórki analiza proteasomu błony neuronalnej w neuronach somatosensorycznych

Badamy mechanizmy, w jaki sposób neurony somatosensoryczne komunikują się za pośrednictwem niedawno odkrytego proteasomu błony neuronalnej lub NNP, aby modulować sposób, w jaki odczuwamy dotyk, swędzenie i ból. Niedawno odkryliśmy proteasom błony neuronalnej, wyspecjalizowany kompleks degradacji białek znajdujący się w niektórych neuronach czuciowych, które modulują wrażliwość na dotyk, swędzenie i ból. Dzięki temu protokołowi będziemy w stanie zbadać ekspresję i dynamikę modulacji NMP w sposób specyficzny dla typu komórki w warunkach zdrowotnych i chorobowych.

Nasz protokół umożliwia izolację neuronów wykazujących ekspresję NMP od neuronów niewykazujących ekspresji NMP, aby móc badać ich funkcję ze specyficznością typu komórki. Co ważne, te izolowane populacje neuronów pozostają zdolne do dalszych analiz. Dzięki tym protokołom zaczniemy badać, w jaki sposób różne stany neuropatyczne wpływają na ekspresję i funkcję NMP oraz jak przyczynia się to do zmiany dotyku, swędzenia i odczuwania bólu.

Na początek przenieś zebrane zwoje korzenia grzbietowego do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Za pomocą pipety dodaj do probówki siedem mililitrów roztworu roboczego mieszanki enzymów dysocjacji tkanek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez 20 minut. Umieścić probówkę w wirówce i wirować w dół zwojów jajowych o stężeniu 120 G przez dwie minuty.

Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić zwoje w siedmiu mililitrach enzymu dysocjacji tkanek o niskiej roztarciu zmieszanego z papainą. Po ponownym odwirowaniu probówki, odessać i wyrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawiesić zwoje w 500 mikrolitrach roztworu BSA, TI i DMEM. Używając jednomililitrowej, zatkanej, polerowanej ogniowo szklanej pipety pastwiskowej, rozcieraj zwoje od 12 do 16 razy. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby odfiltrować zanieczyszczenia komórkowe.

Umyj sitko jednym mililitrem roztworu BSA, TI i DMEM, aby zebrać pozostałe neurony zwojów korzenia grzbietowego. Przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Przygotuj tacę do barwienia immunofluorescencyjnego, wykładając ją dużym kawałkiem parafilmu.

Za pomocą sterylnych kleszczy 5-45 przenieś szkiełka osłonowe z naczynia do hodowli tkankowej na parafilm, upewniając się, że strona zawierająca neurony zwojów korzenia grzbietowego jest skierowana do góry. Powoli odpipetuj 100 mikrolitrów pożywki ze zwojów korzenia grzbietowego na każde szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec wysychaniu komórek. Następnie rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe go anty PSM alfa dwa w ciepłym podłożu zwojów korzenia grzbietowego, aby uzyskać rozcieńczenie od jednego do 20.

Za pomocą aspiratora wyposażonego w niefiltrowaną końcówkę P10 powoli usuń pożywkę z krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego. Dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciał go anti PSM alfa two do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie ostrożnie odessać roztwór przeciwciała pierwotnego z każdego szkiełka nakrywkowego.

Dodaj 100 mikrolitrów PBS o temperaturze pokojowej do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty w celu umycia. Teraz, aby przygotować drugorzędowe przeciwciało anty go, rozcieńczyć je w ciepłym podłożu zwojów korzenia grzbietowego w rozcieńczeniu od jednego do 250. Po zakończeniu trzeciego płukania dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego szkiełka nakrywkowego.

Inkubować szkiełka okrywkowe w temperaturze pokojowej przez 40 minut, chroniąc komórki przed światłem. Następnie odessać drugorzędowy roztwór przeciwciała ze szkiełek nakrywkowych i trzykrotnie przemyć komórki, używając PBS, jak opisano wcześniej. Po ostatnim płukaniu PBS dodać 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego zawierającego 4% para formaldehydu i 4% sacharozy w PBS.

Po inkubacji komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odessać utrwalacz z każdego szkiełka nakrywkowego. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS, jak opisano wcześniej. Aby przeniknąć komórki, dodaj 100 mikrolitrów 0,1% niejonowego detergentu w PBS.

Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odessać przepuszczalny roztwór ze szkiełek nakrywkowych i trzykrotnie przemyć komórki, używając PBS zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodać 100 mikrolitrów roztworu blokującego składającego się z 5% płodowej surowicy bydlęcej i 5% surowicy osła w PBS do każdego szkiełka nakrywkowego.

Następnie rozcieńczyć królik anty CGRP, selektynę B cztery koniugatyny biotyny i kurczaka anty NFH w roztworze blokującym, aby przygotować mieszaninę przeciwciał pierwotnych specyficznych dla komórek neuronu zwoju korzenia grzbietowego. Odessać roztwór blokujący ze szkiełek nakrywkowych, a następnie dodać 100 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 45 minut, chroniąc je przed światłem.

Następnie usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z szkiełek nakrywkowych i umyj komórki trzy razy, używając PBS, jak opisano wcześniej. Teraz przygotuj mieszaninę przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając streptawidynę, anty królika osła i anty kurczaka osła do jednego do 500 każdy w roztworze blokującym. Odessać końcowe płukanie PBS z każdego szkiełka nakrywkowego, a następnie dodać 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu przeciwciał wtórnych.

Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności. Odessać końcowe płukanie ze szkiełka nakrywkowego. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieś każde szkiełko nakrywkowe z parafilmu i delikatnie zetrzyj nadmiar płynu, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego do niestrzępiącej się chusteczki.

Umieść siedmiomikrolitrową kroplę podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na nośnik montażowy stroną z ogniwem skierowaną w dół, zapewniając pełny kontakt z medium. Umieść przygotowane szkiełka w ciemnej, suchej szufladzie lub pudełku do wyschnięcia przez co najmniej godzinę.

Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego szybkoschnącym lakierem do paznokci i odczekaj 10 do 15 minut przed obrazowaniem. Przeciwciało żerujące na żywych neuronach zwoju korzenia grzbietowego ujawniło subpopulację neuronów z powierzchniowo dostępnymi proteasomami, podczas gdy próbki kontrolne pozbawione przeciwciała pierwotnego nie wykazywały znakowania powierzchniowego. Cytometria przepływowa zidentyfikowała dwie odrębne populacje neuronów zwoju korzenia grzbietowego, w oparciu o intensywność fluorescencji, oddzielając komórki NMP dodatnie od ujemnych NMP z ustalonymi wyraźnymi regionami bramkowania, przy użyciu kontroli.

Kwantyfikacja populacji posortowanych przepływowo wykazała, że około 4% neuronów zwoju korzenia grzbietowego było NMP dodatnich, podczas gdy pozostała większość była NMP ujemna. Posortowane neurony NMP dodatnie i NMP ujemne zachowały żywotność i ekspresję markerów specyficznych dla typu komórki NFH, IB four i CGRP, potwierdzając przydatność przepływu pracy do dalszej analizy molekularnej.