Specyficzna dla podtypu komórki analiza proteasomu błony neuronalnej w neuronach somatosensorycznych
10 października 2025
Proteasom błony neuronalnej (NMP) został niedawno zidentyfikowany w podzbiorze neuronów somatosensorycznych jako kluczowy regulator percepcji dotyku, bólu i swędzenia. W tym artykule przedstawiono solidny przepływ pracy do analizy ekspresji i funkcji NMP specyficznej dla typu komórki przy użyciu sortowania komórek, profilowania transkryptomu i analiz immunofluorescencyjnych opartych na hodowlach.
Badamy mechanizmy, w jaki sposób neurony somatosensoryczne komunikują się za pośrednictwem niedawno odkrytego proteasomu błony neuronalnej lub NNP, aby modulować sposób, w jaki odczuwamy dotyk, swędzenie i ból. Niedawno odkryliśmy proteasom błony neuronalnej, wyspecjalizowany kompleks degradacji białek znajdujący się w niektórych neuronach czuciowych, które modulują wrażliwość na dotyk, swędzenie i ból. Dzięki temu protokołowi będziemy w stanie zbadać ekspresję i dynamikę modulacji NMP w sposób specyficzny dla typu komórki w warunkach zdrowotnych i chorobowych.
Nasz protokół umożliwia izolację neuronów wykazujących ekspresję NMP od neuronów niewykazujących ekspresji NMP, aby móc badać ich funkcję ze specyficznością typu komórki. Co ważne, te izolowane populacje neuronów pozostają zdolne do dalszych analiz. Dzięki tym protokołom zaczniemy badać, w jaki sposób różne stany neuropatyczne wpływają na ekspresję i funkcję NMP oraz jak przyczynia się to do zmiany dotyku, swędzenia i odczuwania bólu.
Na początek przenieś zebrane zwoje korzenia grzbietowego do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Za pomocą pipety dodaj do probówki siedem mililitrów roztworu roboczego mieszanki enzymów dysocjacji tkanek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez 20 minut. Umieścić probówkę w wirówce i wirować w dół zwojów jajowych o stężeniu 120 G przez dwie minuty.
Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić zwoje w siedmiu mililitrach enzymu dysocjacji tkanek o niskiej roztarciu zmieszanego z papainą. Po ponownym odwirowaniu probówki, odessać i wyrzucić supernatant.
Następnie ponownie zawiesić zwoje w 500 mikrolitrach roztworu BSA, TI i DMEM. Używając jednomililitrowej, zatkanej, polerowanej ogniowo szklanej pipety pastwiskowej, rozcieraj zwoje od 12 do 16 razy. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby odfiltrować zanieczyszczenia komórkowe.
Umyj sitko jednym mililitrem roztworu BSA, TI i DMEM, aby zebrać pozostałe neurony zwojów korzenia grzbietowego. Przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Przygotuj tacę do barwienia immunofluorescencyjnego, wykładając ją dużym kawałkiem parafilmu.
Za pomocą sterylnych kleszczy 5-45 przenieś szkiełka osłonowe z naczynia do hodowli tkankowej na parafilm, upewniając się, że strona zawierająca neurony zwojów korzenia grzbietowego jest skierowana do góry. Powoli odpipetuj 100 mikrolitrów pożywki ze zwojów korzenia grzbietowego na każde szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec wysychaniu komórek. Następnie rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe go anty PSM alfa dwa w ciepłym podłożu zwojów korzenia grzbietowego, aby uzyskać rozcieńczenie od jednego do 20.
Za pomocą aspiratora wyposażonego w niefiltrowaną końcówkę P10 powoli usuń pożywkę z krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego. Dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciał go anti PSM alfa two do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie ostrożnie odessać roztwór przeciwciała pierwotnego z każdego szkiełka nakrywkowego.
Dodaj 100 mikrolitrów PBS o temperaturze pokojowej do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty w celu umycia. Teraz, aby przygotować drugorzędowe przeciwciało anty go, rozcieńczyć je w ciepłym podłożu zwojów korzenia grzbietowego w rozcieńczeniu od jednego do 250. Po zakończeniu trzeciego płukania dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego szkiełka nakrywkowego.
Inkubować szkiełka okrywkowe w temperaturze pokojowej przez 40 minut, chroniąc komórki przed światłem. Następnie odessać drugorzędowy roztwór przeciwciała ze szkiełek nakrywkowych i trzykrotnie przemyć komórki, używając PBS, jak opisano wcześniej. Po ostatnim płukaniu PBS dodać 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego zawierającego 4% para formaldehydu i 4% sacharozy w PBS.
Po inkubacji komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odessać utrwalacz z każdego szkiełka nakrywkowego. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS, jak opisano wcześniej. Aby przeniknąć komórki, dodaj 100 mikrolitrów 0,1% niejonowego detergentu w PBS.
Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odessać przepuszczalny roztwór ze szkiełek nakrywkowych i trzykrotnie przemyć komórki, używając PBS zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodać 100 mikrolitrów roztworu blokującego składającego się z 5% płodowej surowicy bydlęcej i 5% surowicy osła w PBS do każdego szkiełka nakrywkowego.
Następnie rozcieńczyć królik anty CGRP, selektynę B cztery koniugatyny biotyny i kurczaka anty NFH w roztworze blokującym, aby przygotować mieszaninę przeciwciał pierwotnych specyficznych dla komórek neuronu zwoju korzenia grzbietowego. Odessać roztwór blokujący ze szkiełek nakrywkowych, a następnie dodać 100 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 45 minut, chroniąc je przed światłem.
Następnie usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z szkiełek nakrywkowych i umyj komórki trzy razy, używając PBS, jak opisano wcześniej. Teraz przygotuj mieszaninę przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając streptawidynę, anty królika osła i anty kurczaka osła do jednego do 500 każdy w roztworze blokującym. Odessać końcowe płukanie PBS z każdego szkiełka nakrywkowego, a następnie dodać 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu przeciwciał wtórnych.
Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności. Odessać końcowe płukanie ze szkiełka nakrywkowego. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieś każde szkiełko nakrywkowe z parafilmu i delikatnie zetrzyj nadmiar płynu, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego do niestrzępiącej się chusteczki.
Umieść siedmiomikrolitrową kroplę podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na nośnik montażowy stroną z ogniwem skierowaną w dół, zapewniając pełny kontakt z medium. Umieść przygotowane szkiełka w ciemnej, suchej szufladzie lub pudełku do wyschnięcia przez co najmniej godzinę.
Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego szybkoschnącym lakierem do paznokci i odczekaj 10 do 15 minut przed obrazowaniem. Przeciwciało żerujące na żywych neuronach zwoju korzenia grzbietowego ujawniło subpopulację neuronów z powierzchniowo dostępnymi proteasomami, podczas gdy próbki kontrolne pozbawione przeciwciała pierwotnego nie wykazywały znakowania powierzchniowego. Cytometria przepływowa zidentyfikowała dwie odrębne populacje neuronów zwoju korzenia grzbietowego, w oparciu o intensywność fluorescencji, oddzielając komórki NMP dodatnie od ujemnych NMP z ustalonymi wyraźnymi regionami bramkowania, przy użyciu kontroli.
Kwantyfikacja populacji posortowanych przepływowo wykazała, że około 4% neuronów zwoju korzenia grzbietowego było NMP dodatnich, podczas gdy pozostała większość była NMP ujemna. Posortowane neurony NMP dodatnie i NMP ujemne zachowały żywotność i ekspresję markerów specyficznych dla typu komórki NFH, IB four i CGRP, potwierdzając przydatność przepływu pracy do dalszej analizy molekularnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy proteasomu błony neuronowej (NMP) jako istotnego regulatora percepcji dotyku, bólu i swędzenia w neuronach somatosensorycznych. Opracowano protokół specyficzny dla typu komórki w celu analizy ekspresji i funkcji NMP, wykorzystując sortowanie komórek, profilowanie transkryptomu i analizy immunofluorescencyjne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Neurofizjologia
Tło
- NMP jest nowo rozpoznanym kompleksem degradacji białek.
- Odgrywa kluczową rolę w modulowaniu percepcji zmysłowej.
- Rozumienie dynamiki NMP jest ważne dla poznania warunków neuropatycznych.
- Celem badania jest odizolowanie neuronów ekspresujących NMP w celu dalszej analizy.
Cel badania
- Zbadanie ekspresji i dynamiki modulacji NMP.
- Zbadanie, jak różne warunki neuropatyczne wpływają na funkcjonowanie NMP.
- Ustanowienie metodologii do badania odpowiedzi neuronów.
Zastosowanie metod
- Zastosowano techniki sortowania komórek i immunofluorescencji oparte na hodowli.
- Zebrano zwoje rdzeniowe grzbietowe, oddzielono i przetworzono je do analizy.
- Zastosowano barwienie immunofluorescencyjne do wizualizowania ekspresji NMP w odizolowanych neuronach.
- Zastosowano ostrożne techniki wirowania i manipulacji komórkami w celu utrzymania żywotności komórek.
- Stosowano określone rozcieńczenia przeciwciał i protokoły inkubacji w celu uzyskania dokładnych wyników.
Główne wyniki
- Izolowanie neuronów ekspresujących NMP pozwoliło na szczegółowe badania funkcjonalne.
- Zidentyfikowano odrębne populacje neuronów zwojów rdzeniowych grzbietowych na podstawie ekspresji NMP.
- Dostępność proteasomu na powierzchni została ujawniona poprzez eksperymenty z karmieniem przeciwciałami.
- Wyniki sugerują istotną rolę NMP w modulacji sensorycznej dotyczącej dotyku i bólu.
Wnioski
- To badanie ustanawia ramy dla zrozumienia roli NMP w dynamice neuronów sensorycznych.
- Zastosowane metody umożliwiają badanie mechanizmów neuronalnych w zdrowiu i chorobie.
- Uzyskane wnioski mogą przyczynić się do strategii terapeutycznych w przypadku zaburzeń sensorycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Subtype-specific analysis of the neuronal membrane proteasome (NMP) in somatosensory neurons enables precise interrogation of pain, itch, and touch signaling pathways. This workflow supports predictive confidence in target validation for sensory modulation and pain management portfolios. The ability to isolate and profile NMP-expressing neurons advances mechanistic de-risking at the discovery and preclinical interface.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables cell-type-specific interrogation of NMP function in sensory neuron subpopulations.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing NMP-dependent signaling from global proteasome effects.
- Facilitates identification of novel pain and itch modulation targets with reduced neuropathy risk.
Screening & Assay Development
- Provides validated isolation of NMP-positive and NMP-negative neurons for downstream assays.
- Enables reproducible preparation of viable neuronal populations for quantitative expression profiling.
- Supports development of cell-based assays to evaluate NMP modulation and compound effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling analysis of NMP dynamics in neuropathic conditions.
- Supports translational biomarker discovery through scRNA-seq of sorted neuronal populations.
- Facilitates risk-adjusted advancement of NMP-targeted interventions for pain and sensory disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational continuity for sensory neuron targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of NMP's role in neuron-to-neuron communication and sensory modulation.
- Screening: Delivers reproducible, cell-type-specific populations for quantitative assay development.
- Analytics: Enables measurement of NMP expression and functional outputs via flow cytometry and scRNA-seq.
- Translational Research: Connects molecular profiling to disease-relevant phenotypes in pain and itch models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating and profiling neuronal subtypes across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sensory target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Standardizes isolation and profiling of neuronal subtypes for scalable R&D workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for NMP-targeted pain management programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of novel sensory modulation targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal cell isolation, immunofluorescence, and flow cytometry.
- Demands access to FACS instrumentation and single-cell RNA sequencing platforms.
- Necessitates standardized antibody validation and gating strategies for reproducibility.
- Adaptable to various sensory neuron models and disease conditions with protocol optimization.
- Dependent on viability and marker expression of sorted neuronal populations for downstream analyses.
