Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie wygenerowanie myszy z niedoborem genów za pomocą zaprojektowanych nukleaz ogonowych lub szponów. Osiąga się to poprzez najpierw zaprojektowanie i złożenie konstruktów DNA kodujących określone pary szponów, które służą jako szablony do transkrypcji in vitro w celu wygenerowania mRNA Talon. Kolejnym etapem zabiegu jest wyizolowanie zapłodnionych cytów myszy, a następnie mikrowstrzyknięcie im T. Ostatnim krokiem jest chirurgiczne przeniesienie wstrzykniętych cytów do pseudociężarnych matek zastępczych.

Powstałe w ten sposób potomstwo F zero często wykazuje specyficzne dla miejsca delecje sekwencji genomowych, które często prowadzą do utraty funkcji genu docelowego. Chociaż przedstawiona tutaj metoda może dostarczyć informacji na temat funkcji genów u myszy, podstawowe podejście można również dostosować do innych organizmów modelowych, takich jak szczury i ryby. Najpierw wejdź na stronę docelową nukleotydów efektorowych TAL na stronie.

Wybierz program celujący TN i wklej sekwencję docelowego genu. Dla tego protokołu. Użyj siedmiu konstruktów ekspresji TALEN P-C-A-G-T oraz zestawu efektorów Golden Gate Talen i T, które są dostępne w ad gene.

Jeśli inne konstrukcje lub zestawy montażowe są używane do montażu Talen, ustawienia mogą być różne dla optymalnej długości dystansu i liczby ogonowych RV, wybierz opcję Miller Etal 2011 w ustawieniu Użyj wstępnie ustawionej architektury. Następnie wybierz NN na karcie Zamiana G. Program generuje plik tekstowy z potencjalnymi witrynami docelowymi wygenerowanymi na podstawie tej listy.

Wybierz wymaganą parę lub pary Talen i kontynuuj montaż Golden gate. Protokół ten działa z najczęściej stosowanymi laboratoryjnymi szczepami myszy, w tym C 57 BL six J i BDF jednym super owulacją 10 dawczyń w wieku czterech tygodni przy użyciu dootrzewnowego wstrzyknięcia pięciu jednostek gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy. 48 godzin później podaj samicom pięć jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, również przez wstrzyknięcie dootrzewnowe natychmiast po wstrzyknięciu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, samice jeden do jednego z samcami w wieku rozrodczym tego samego dnia, przygotowują pseudo ciężarne matki zastępcze. Inni.

Następnego ranka złóż w ofierze samice i odzyskaj zapłodnione oocyty, wycinając guzki. Następnie uwolnij lęgi oocytów do naczynia do hodowli narządów zawierającego mililitr pożywki M2. Usuń wszystkie komórki wzgórka, dodając 10 mikrolitrów 0,1% roztworu hialuronidazy bydlęcej do naczynia zawierającego sprzęgła cytów w pożywce M 2.

Następnie za pomocą pipety doustnej przemyć zarodki przez dwie lub trzy zmiany pożywki M2 w celu usunięcia hialuronidazy. Kontynuować leczenie hialuronidazą w przypadku zarodków, które jeszcze nie oddzieliły się od komórek wzgórka. Wyizolowane zarodki mogą być przechowywane w M 16, podłożu o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do momentu mikroiniekcji.

Przygotować 100 mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań zawierającego 10 nanogramów na mikrolitr każdego ogona. Nukleaza, mRNA, para i wirować przez 30 minut w 30 000 G do osadzania. Wszelkie cząstki, które mogą zatkać igły do wstrzykiwań.

Następnie trzymaj mieszankę na lodzie. Zaplanuj wstrzyknięcie oocytów w stadium przedjądrzowym wczesnym popołudniem. Zanurz około 100 zarodków w pożywce M two pod warstwą oleju mineralnego i pracuj na odwróconym mikroskopie bez marsoidalnej optyki DIC.

W powiększeniu 20x wybierz cyty z wyraźnymi przedjądrzami. Sortowanie oocytów można przeprowadzić za pomocą pustej kapilary iniekcyjnej, załadować kapilarnę iniekcji tuż przed jej użyciem jednym do dwóch mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań. Następnie przymocuj go do głowicy mikroiniekcyjnej.

Następnie odessać wybrany cyt z kapilarą przytrzymującą i wykonać płytkie wstrzyknięcie mRNA nukleazy do cytoplazmy. Unikać kontaktu z przedjądrzami. Objętość wstrzyknięcia powinna być utrzymywana na małym poziomie.

Przy pierwszych oznakach wzdęcia cytoplazmatycznego wycofaj igłę. Zwykle około 80 do 90% zarodków powinno przeżyć bez natychmiastowej choroby. Aby zwiększyć ilość wstrzykniętego mRNA, należy zwiększyć stężenie roztworu po mikrowstrzyknięciu dostępnych cytów.

Przenieść je do podłoża M 16 za pomocą pipety doustnej. Wysiaduj zarodki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie przenieś te, które przeżyją, do pseudo ciężarnych matek zastępczych.

Dzień przed mikroiniekcją wywołaj pseudociążę u trzy- do sześciomiesięcznej samicy myszy CD, kojarząc je z samcami z sektorów VA. Następnego ranka wybierz samice z przezroczystą czopem, które zostaną wykorzystane jako biorczynie zarodków. Niewykorzystane samice powrócą do stanu pseudociąży w ciągu trzech tygodni i mogą być ponownie użyte.

Umieść znieczuloną samicę matki zastępczej na ciepłej powierzchni na jej brzuchu. Następnie zdezynfekuj obszar nacięcia, spryskując go 70% etanolem. Mokre włosy odczeszać od planowanego miejsca nacięcia.

Teraz rozetnij jamę otrzewnej nożyczkami i uzewnętrznij róg macicy. Aby to zrobić. Pociągnij za poduszeczkę tłuszczową przyczepioną do jajnika i unieruchamij narządy rozrodcze za pomocą zacisku buldoga.

Pamiętaj również, aby narządy były wilgotne za pomocą podgrzanego 0,9% roztworu chlorku sodu. W tym momencie posortuj od 12 do 20 żywotnych zarodków i załaduj je do cienkiej szklanej kapilary. Za pomocą pipety doustnej najpierw odessaj mały pęcherzyk powietrza, a następnie odessaj zarodki za pomocą cienkich kleszczy.

Delikatnie chwyć UCT tuż przed wzmacniaczem i utwórz mały otwór w ścianie UCT za pomocą igły o rozmiarze 30. Włóż obciążoną kapilę do otworu i delikatnie wydmuchuj zarodki do ampera, aż zobaczysz, że pęcherzyk powietrza został przemieszczony z naczynia włosowatego. Następnie usuń kapilarę.

Natychmiast wymień narządy rozrodcze z powrotem w jamie ciała i zamknij jamę otrzewnej pojedynczym szwem. Następnie zamknij skórę za pomocą jednego lub dwóch dziewięciomilimetrowych klipsów do ran. Wróć zwierzę do jego domowej klatki i opiekuj się nim, dopóki znieczulenie nie ustąpi.

Następnie umieść samice w stabilnych grupach społecznych składających się z dwóch do trzech myszy, aby zminimalizować stres przez pierwsze trzy dni po operacji, pamiętaj o dostarczeniu środka przeciwbólowego, takiego jak DEF Falcon, w wodzie pitnej dla każdej szarańczy w genomie myszy, która jest ukierunkowana na nukleazy projektowane. Test oparty na PCR ma na celu identyfikację zwierząt założycielskich, które są nosicielami pożądanego zmutowanego allelu. W pierwszym przykładzie założyciele pochodzący z mikroiniekcji pary nukleazy ogonowej.

Celując w region powłoki genu białka prionowego myszy, analizowano za pomocą trawienia endonukleazą T seven produktu PCR. Test trawienia endonukleazy T seven opiera się na tworzeniu hetero dupleksów między niciami DNA produktów PCR generowanych ze zmutowanych i dzikich alleli. Mutageneza indukowana przez Talon w docelowym regionie genomowym pojedynczych założycieli została ujawniona przez pojawienie się 250 i 110 sparowanych zasad produktów długiego trawienia oprócz produktu PCR na całej długości.

Alternatywnie, produkty PCR mogą być poddane trawieniu restrykcyjnemu, jeśli odpowiednie diagnostyczne miejsce restrykcyjne znajduje się w regionie dystansowym zaprojektowanej pary nukleaz. W drugim przykładzie ZFN atakuje jedną witrynę ograniczającą XPO znajdującą się w intro, jedną z locus myszy Rosa 26. Tutaj niestrawione prążki wskazują na obecność mutacji.

Gwiazdki oznaczają brak jakichkolwiek strawionych produktów, co silnie sugeruje, że założyciel jest nosicielem mutacji w obu allelach docelowego genu. Klonowanie i sekwencjonowanie tych niestrawionych produktów PCR ujawnia, że myszy założycielskie mogą mieć dwie lub więcej odrębnych modyfikacji docelowego allelu. Brak sekwencji typu dzikiego wskazuje na całkowitą ablację genu docelowego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć konstrukcję nukleazy ogonowej, montaż ogona, konstrukty nukleazy i jak ich używać do generowania zmutowanych myszy przez bezpośrednią mikroiniekcję ozydu. Metodę tę można dostosować do pracy z innymi klasami nukleaz projektowanych, takimi jak, jądra palcowe lub CAS nine crispr. Może również ułatwić modyfikację genomu poprzez rekombinację homologiczną poprzez jednoczesne wstrzyknięcie nukleazy i odpowiedniej matrycy docelowej genu.