Name: Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę inżynierii genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta TALEN. Technika obejmuje projektowanie konstruktów, mikroinjekcję oocytów i transfer do matek zastępczych, umożliwiając precyzyjne modyfikacje genetyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Monice Tarnowskiej, Kornelii Albrecht i Ewie Skoczylas za doskonałą pomoc techniczną. Badanie to zostało sfinansowane z grantu SNF Sinergia CRSI33-125073 dla PP.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li>
<li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses%3A+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+in+rat+and+mouse+embryos+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+production+of+mouse+disease+models+by+embryo+microinjection+of+TALENs+and+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>ZFN, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li>
<li>Reyon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li>
<li>Hermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+OPEN+zinc+finger+nucleases+for+direct+gene+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+disease+mutations+by+gene+targeting+in+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Haueter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vasectomy-overexpression+of+Prm1-EGFP+fusion+protein+in+elongating+spermatids+causes+dominant+male+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice.</a> Genesis. 48, 151-160 (2010).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+to+the+ROSA26+locus+directed+by+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).</li>
<li>Bultmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transcriptional+activation+of+silent+oct4+pluripotency+gene+by+combining+designer+TALEs+and+inhibition+of+epigenetic+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).</li>
<li>Valton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+TALE+DNA+binding+domain+sensitivity+to+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation.</a> J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).</li>
<li>Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN-Site+searches+genomes+for+zinc+finger+nuclease+target+sites+and+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites.</a> BMC Bioinform. 12, (2011).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+%28ARTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22International+Society+for+Transgenic+Technologies.+Advanced+protocols+for+animal+transgenesis+%3A+an+ISTT+manual%22">International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Zaprojektowane podejścia do edycji genomu oparte na nukleazach znacznie rozszerzyły zakres gatunków podatnych na ukierunkowane modyfikacje ich odpowiednich genomów10,12. U myszy celowanie genowe w komórkach ES jest standardową techniką od ponad dwóch dekad; jednak okazało się, że trudno jest przystosować się do komórek ES od gatunków innych niż mysz, chociaż ostatnio odniesiono pewne sukcesy w komórkach ES szczurów. Nawet przy dostępności "gotowych" klonów mysich komórek ES ukierunkowanych na geny, dostarczanych przez konsorcja takie jak EUCOMM, KOMP lub NorCOMM3 , edycja genomu przez ZFN i TALEN zapewnia większą precyzję i elastyczność w zakresie spektrum modyfikacji, które można wprowadzić do genomu myszy. Zwierzęta założycielskie noszące mutacje zależne od nukleazy wydają się być wysoce kompetentne w linii zarodkowej4-6,20,21, co nie zawsze ma miejsce w przypadku chimer pochodzących z wstrzyknięć komórek ES w blastocysty. W związku z tym w niektórych przypadkach mikroiniekcja zaprojektowanych nukleaz może skutkować znacznie szybszym generowaniem nowych linii myszy z ukierunkowanymi modyfikacjami genomu.
Pomyślne wygenerowanie myszy z nokautem przez wstrzyknięcie ZFN i TALEN zależy w dużym stopniu od aktywności wstrzykniętej pary nukleaz. Wykazano, że TALEN-y mają wysoki wskaźnik sukcesu w celowaniu w szeroki zakres genów w wielu organizmach; jednak ostatnie badania sugerują, że wiązanie TALEN jest wrażliwe na metylację cytozyny30,31. W ten sposób nowo wygenerowane pary nukleaz, na przykład TALEN-y sklonowane do wektorów pCAG-T7, mogą być przejściowo transfekowane do linii komórkowej myszy, takiej jak NIH-3T3 lub Neuro-2a, które do pewnego stopnia naśladują stan chromatyny zarodka myszy. W tym przypadku aktywność nukleazy można oszacować za pomocą testu endonukleazy T7 lub trawienia restrykcyjnego produktu PCR, jak opisano w sekcji 5 przed syntezą mRNA i mikroiniekcją. Zalecamy sekwencjonowanie interesującego regionu genomu w odpowiedniej linii komórkowej i szczepie myszy używanym do eksperymentów mikroiniekcyjnych.
W mysich zygotach różne pary TALEN lub ZFN będą działać optymalnie przy różnych stężeniach mRNA, a zatem może być konieczne eksperymentalne określenie optymalnego stężenia roboczego mRNA mikroiniekowanej nukleazy. W zależności od pary nukleaz, zbyt niskie stężenie spowoduje brak rozszczepienia, podczas gdy zbyt wysokie może spowodować śmiertelność zarodka. W zależności od pary nukleaz odnieśliśmy sukces stosując całkowite stężenia mRNA tak niskie, jak 2 ng/μl i tak wysokie, jak 200 μg/ul. Efekty te są trudne do przewidzenia na podstawie doświadczeń w hodowli komórkowej, a stężenie nukleazy optymalne zarówno dla przeżycia zarodka, jak i tempa modyfikacji locus docelowego musi zostać określone empirycznie.
Wysoce aktywny ZFN lub TALEN może rozszczepić swoją sekwencję docelową poza stadium jednokomórkowe zarodka, któremu wstrzyknięto mikrowstrzyknięcie, a tym samym powodować złożone wzorce mutagenezy i mozaikowości u założycieli. My i inni4 zaobserwowaliśmy trzy lub więcej odrębnych zmutowanych alleli u jednego założyciela (Figura 5C). Tak więc, przy tworzeniu nowej linii myszy od tych założycieli, potomstwo powinno być dokładnie przebadane przez sekwencjonowanie pod kątem obecności korzystnej mutacji, ponieważ testy trawienia dostarczają dowodów tylko na obecność nieokreślonej mutacji.
Jednym z często wysuwanych zarzutów wobec systemów ZFN i TALEN jest możliwość, że nukleazy te są również zdolne do rozszczepiania sekwencji obecnych w innym miejscu genomu, które są podobne do miejsc docelowych. Takie efekty off-target zaobserwowano w przypadku odczynników wczesnej generacji wykorzystujących homodimeryczną domenę FokI, a konstrukty heterodimerów zaprojektowano w celu złagodzenia efektów off-target25. Potencjalne miejsca poza celem można do pewnego stopnia przewidzieć in silico32,33 i poddać je badaniom przesiewowym za pomocą PCR i sekwencjonowania. Oczywistą zaletą stosowania ZFN i TALEN-ów do generowania myszy, a nie linii komórkowych, jest możliwość usunięcia docelowych mutacji niezwiązanych z pożądaną modyfikacją genomu poprzez wykonanie kilku krzyżówek wstecznych z wybranym szczepem typu dzikiego. W przypadku analizy dużej liczby myszy założycieli, głębokie sekwencjonowanie nowej generacji produktów PCR wygenerowanych z locus ukierunkowanego na nukleazę i loci przewidywanych in silico poza celem może stanowić alternatywny odczyt jakościowy i ilościowy dla testów trawienia produktów PCR.
Techniki wspomaganego rozrodu opisane w tym protokole są zoptymalizowane dla standardowych szczepów myszy używanych do eksperymentów mikroiniekcyjnych, takich jak C57Bl/6J lub B6D2F1. Myszy różnego pochodzenia, takie jak szczepy niekrewniacze, mogą być w zasadzie wykorzystywane do metod edycji genomu i mogą stanowić bardziej odpowiednie tło genetyczne dla konkretnych pytań badawczych. Skuteczność technik wspomaganego rozrodu, takich jak superowulacja, można przewidzieć dla wielu szczepów34-36 , ale może wymagać dalszej optymalizacji w przypadku szczepów niestandardowych w celu uzyskania wystarczającej liczby zarodków do mikroiniekcji nukleazy.
Oprócz ZFN i TALEN, wprowadzono nowe nukleazy projektowe, takie jak sterowany RNA system CRISPR/Cas99,37,38 do zastosowań w edycji genomu. Wszystkie opisane tutaj metody mikroiniekcji i analizy zwierząt założycielskich mają również zastosowanie do CRISPR/Cas9 i przyszłych trybów edycji genomu.

Myszy są zdecydowanie najpopularniejszą platformą do generowania transgenicznych modeli zwierząt. Wszechstronny zestaw narzędzi do inżynierii genetycznej zarodkamyszy 1-3 został niedawno rozszerzony o podejścia do edycji genomu oparte na zaprojektowanych nukleazach, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN)4-6, nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN)7,8 oraz system zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9. ZFN i TALEN funkcjonują jako pary dwóch specjalnie zaprojektowanych domen wiążących DNA opartych na białkach (odpowiednio układy białek palca cynkowego i reszt o zmiennej powtarzalności (RVD), z których każda jest sprzężona z endonukleazą FokI10-12. I odwrotnie, specyficzność rozszczepienia DNA za pośrednictwem Cas9 jest zapewniona przez transaktywację RNA CRISPR (crRNA i tracrRNA, które można również połączyć w pojedynczą chimeryczną cząsteczkę RNA zwaną przewodnikiem RNA)11, które działają w kompleksie z białkiem CRISPR.
TALENy z określoną sekwencją RVD mogą być szybko konstruowane przez indywidualnych eksperymentatorów z wieloma strategiami montażu do wyboru od13 do 17. CRISPR/Cas9 obiecuje jeszcze mniej pracochłonne generowanie nukleaz projektowanych, jednak specyficzność wiązania przewodnika RNA-DNA nadal nie została w pełni rozwiązana18,19. Wytwarzanie niestandardowych ZFN było do tej pory ograniczone do wyspecjalizowanych laboratoriów akademickich i dostawców komercyjnych, takich jak Sangamo Biosciences i serwis Sigma CompoZr.
Ogólnie rzecz biorąc, edycja genomu za pomocą nukleaz projektanta ma na celu wprowadzenie pęknięć podwójnej nici (DSB) w określonych loci genomowych, które następnie przyciągają niehomologiczne mechanizmy naprawy DNA do łączenia końców (NHEJ) lub rekombinacji homologicznej (HR)10,12. Naprawa DSB za pośrednictwem NHEJ często skutkuje wprowadzeniem wstawień i usunięć w bliskiej odległości od miejsca naprawy. W ten sposób naprawa NHEJ może być wykorzystana do wyeliminowania funkcji genu docelowego poprzez wprowadzenie mutacji z przesunięciem ramki odczytu w sekwencji genów kodujących białko4,7,9. Alternatywnie, zdefiniowane dodawanie lub zastępowanie informacji genetycznej można osiągnąć poprzez dostarczenie dawcy DNA wraz z zaprojektowanymi nukleazami. Dawca DNA składa się z zaprojektowanych przez badaczy sekwencji DNA otoczonych regionami homologii z locus docelowym, służąc w ten sposób jako matryca do naprawy DSB przez HR. Zarówno plazmidy5,6,20, jak i jednoniciowe oligonukleotydy8,9,21 zostały z powodzeniem wykorzystane jako dawcy. Ani edycja genomu za pośrednictwem NHEJ, ani HR nie wymaga wprowadzenia selektywnego markera do genomu zarodka myszy, co sprawia, że strategie te szczególnie dobrze nadają się do tworzenia niewielkich zmian w sekwencji nukleotydów bez naruszania ogólnej architektury genetycznej.
W tym protokole opisujemy wszystkie niezbędne procedury edycji genomu w embrionie myszy za pomocą TALEN-ów. Obejmują one: 1) identyfikację miejsca docelowego TALEN22, 2) budowę TALEN-ów poprzez klonowanie Golden Gate13, 3) syntezę mRNA TALEN in vitro, 4) mikroiniekcję mRNA TALEN do zapłodnionych oocytów myszy, 5) zabiegi chirurgiczne transferu zarodków oraz 6) analizę mutagenezy indukowanej przez TALEN u zwierząt założycielskich. Koncentrujemy się na mikroiniekcji mRNA TALEN i badaniach przesiewowych założycieli pod kątem insercji/delecji wywołanych przez NHEJ. W tym celu uzyskaliśmy dwufunkcyjne konstrukty TALEN, które umożliwiają zarówno ekspresję w komórkach ssaków po transfekcji w postaci plazmidów, jak i syntezę in vitro mRNA TALEN do mikroiniekcji do zarodków myszy. Konstrukty te składają się ze skróconego szkieletu TALE23 połączonego z heterodimerycznymi domenami FokI24,25 w celu optymalnej edycji genomu w komórkach ssaków. Protokół ten może być również przyjęty do mikroiniekcji innych zaprojektowanych nukleaz lub do skojarzonych iniekcji zaprojektowanych nukleaz i konstruktów dawcy (konstrukcja dawców DNA została opisana w doskonałych publikacjach technicznych przez Wefersa i wsp.26,27).
Oświadczenie etyczne
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Kantonalnego Biura Weterynaryjnego Kantonu Zurych.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S lub L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza</td><td>NEB</td><td>M0202S lub L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Epicentrum nukleazy bezpieczne dla plazmidu</td><td></td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Zestaw Midi Plasmid</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Spin Columns</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Load Dye</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Markery Millennium</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE bufor:</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonukleaza</td><td>NEB</td><td>M0302S lub L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Soap Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>klacz ciężarna&#039; s gonadotropina surowicy (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 pożywka do hodowli zarodków</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 pożywka do hodowli zarodków</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny, testowany na zarodkach</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment/Tools</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony z optyką Nomarski DIC (na przykład Nikon Eclipse TE200)</td><td>Mikromanipulatory firmy Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(na przykład Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia włosowate do przechowywania zarodków</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie włosowate do iniekcji zarodków</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do naczyń włosowatych (na przykład Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (na przykład Narishige MF-900)</td>Nożyczki <td>do skóry Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda chirurgiczna</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>System odruchowych klipsów do ran (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Odruchowe klipsy do ran (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze precyzyjne Dumont 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione Moria</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze precyzyjne Moria</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk Dietrich bulldog</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J myszy</td><td>Jackson Labs</td><td>kod szczepu 000664</td><td></td></tr><tr><td>myszy CD-1</td><td>kod szczepu</td> <td>Charles River</td> 000664 <td></td></tr></tbody></table>

inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgeniczne myszy z specyficznymi dla danego miejsca modyfikacjami genomu (knockout, knock-in) mają kluczowe znaczenie dla analizowania złożonych systemów biologicznych, jak również dla modelowania chorób ludzkich i testowania strategii terapeutycznych. Niedawne postępy w stosowaniu zaprojektowanych nukleaz, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) oraz system 9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 do inżynierii genomu specyficznego dla miejsca, otwierają możliwość przeprowadzenia szybkiej, ukierunkowanej modyfikacji genomu u praktycznie każdego gatunku laboratoryjnego bez konieczności polegania na technologii embrionalnych komórek macierzystych (ES). Eksperyment edycji genomu zazwyczaj rozpoczyna się od identyfikacji zaprojektowanych miejsc docelowych nukleazy w genie będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie konstrukcji niestandardowych domen wiążących DNA, aby skierować aktywność nukleazy do zdefiniowanego przez badacza locus genomu. Plazmidy nukleazy projektowanej są transkrybowane in vitro w celu wytworzenia mRNA do mikroiniekcji zapłodnionych oocytów myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół umożliwiający osiągnięcie ukierunkowanej modyfikacji genomu poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie mRNA TALEN do zapłodnionych oocytów myszy.

Skonstruowaliśmy plazmidy docelowe kompatybilne z metodą assembly Golden GateTALEN opublikowaną przez Cermak et al.13 , które umożliwiają ekspresję TALEN w komórkach ssaków, a także syntezę mRNA in vitro z promotora faga T7 (Rysunek 1C). Plazmidy te zawierają heterodimeryczne domeny FokI (mutacje ELD lub KKR), o których wykazano, że redukują efekty poza celowe (off-target) w porównaniu do homodimerów FokI oraz zwiększają aktywność cięcia w porównaniu do heterodimerów FokI pierwszej generacji25,29. Reakcje assembly Golden gate nr 1 i nr 2 są zazwyczaj bardzo wydajne, a każda biała kolonia, po analizie za pomocą PCR kolonii, wykazuje oczekiwany wzór dla konkretnej liczby sklonowanych RVD (Rysunki 1B i 1D).
Analiza żelowa mRNA syntetyzowanego in vitro (Rycina 2) powinna wykazać pojedynczy, wyraźny prążek z niewielkim rozmyciem lub jego brakiem dla każdej analizowanej próbki. Między próbkami L1/R1 a L2/R2 i L3/R3 powinno wystąpić wyraźne przesunięcie wielkości, co wskazuje na pomyślną poliadenylację.
Zwierzęta założycielskie można przesiewać pod kątem alleli zmutowanych w wyniku NHEJ, wykorzystując PCR do genotypowania, a następnie trawienie endonukleazą T7 (Rycina 3) lub trawienie restrykcyjne z użyciem enzymu, który przecina sekwencję typu dzikiego w obrębie regionu łącznika (spacer) pary nukleaz (Rycina 4). Test z endonukleazą T7 jest możliwy do zastosowania przy każdym rodzaju mutacji, niezależnie od konkretnej sekwencji genomowej w regionie łącznika wstrzykniętej pary nukleaz; wykrywa on jednak wyłącznie niedopasowania między niciami DNA w heterodupleksowych produktach PCR. Zatem w rzadkim przypadku, gdy zwierzę założycielskie posiada dwa identycznie zmutowane allele, produkty PCR nie wykażą wzoru trawienia przez T7. Takie rozróżnienie jest jednak zawsze możliwe, gdy w regionie łącznika nukleaz znajduje się specyficzna sekwencja rozpoznawania enzymu restrykcyjnego, która zostanie usunięta w wyniku insercji/delecji wywołanych przez NHEJ (Rycina 5). W tym przypadku prążki nietrawione wskazują na obecność mutacji, a brak jakichkolwiek produktów trawienia silnie sugeruje, że zwierzę założycielskie posiada mutacje w obu allelach genu docelowego (oznaczone gwiazdkami na Rycina 4b).
<img alt="Rysunek 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> 
Rysunek 1. Klonowanie Golden Gate RVD TALEN do heterodimerycznych wektorów pCAG-T7-Destination. A) Montaż macierzy RVD w wektorach pFUS. Tutaj pokazano przykład dla pary TALEN z poszczególnymi macierzami TALE składającymi się odpowiednio z 15 RVD i 17 RVD (dla macierzy TALE dłuższych niż 21 RVD wymagane są trzy montaże pFUS-RVD, nie pokazano). Strzałki wskazują primery do reakcji PCR kolonii specyficznych dla pFUS. B) Produkty PCR amplifikowane z prawidłowych montaży pFUS zazwyczaj wykazują prążek odpowiadający łącznej długości wszystkich sklonowanych RVD (np. około 1,1 kb dla 10 RVD) oraz „drabinę” mniejszych, mniej wyraźnych prążków ze względu na repetytywny charakter macierzy RVD. C) Końcowy montaż macierzy pFUS-RVD i plazmidu zawierającego ostatnią powtórkę (pLR) do heterodimerycznych wektorów ekspresyjnych TALEN z wariantami FokIELD i FokIKKR, odpowiednio. Szkielet TALEN (oznaczony jako N i C) przypomina architekturę opublikowaną przez Millera et al.23 Promotor CAG (element wzmacniający wczesny CMV/ kurza beta-aktyna) zapewnia wysoki poziom ekspresji w transfekowanych komórkach ssaków, natomiast promotor faga T7 umożliwia syntezę mRNA in vitro (do linearyzacji wektora poniżej kodonu STOP nukleazy należy użyć SacI). D) PCR kolonii z użyciem primerów wskazanych strzałkami w C) pozwala na identyfikację prawidłowo zmontowanych TALEN. Pełnowymiarowe produkty PCR są często mniej wyraźne, podczas gdy „efekt drabiny” stanowi wiarygodny wskaźnik udanego montażu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Rysunek 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> 
Rysunek 2. Kontrola jakości syntezy mRNA nukleazy in vitro z wykorzystaniem elektroforezy w żelu agarozowym. Jako przykład przedstawiono mRNA ZFN (L, lewy ZFN; R, prawy ZFN). Próbki L1/R1 przedstawiają mRNA przed poliadenylacją, próbki L2/R2 przedstawiają mRNA poliadenylowane, a próbki L3/R3 przedstawiają oczyszczone mRNA poliadenylowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Rysunek 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg" width="600" /> 
Rysunek 3. Przykład testu z endonukleazą T7 stosowanego do identyfikacji zwierząt założycieli niosących mutacje w locus docelowym wywołane przez nukleazę. A) Zaprojektowano parę TALEN do cięcia w obrębie regionu kodującego gen białka prionowego myszy (Prnp, sekwencja docelowa TALEN dostępna na życzenie). Produkt PCR generowany jest przy użyciu startera forward (F) znajdującego się 110 bp powyżej oraz startera reverse (R) 250 bp poniżej miejsca cięcia TALEN. B) Produkt PCR jest następnie poddawany tworzeniu heterodupleksów i trawieniu endonukleazą T7. C) Mutageneza indukowana przez TALEN w docelowym regionie genomowym u pojedynczych założycieli objawia się obecnością pełnowymiarowego produktu PCR wraz z produktami trawienia o długości 250 i 110 bps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Rysunek 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> 
Rysunek 4. Przykład trawienia restrykcyjnego produktów PCR wykorzystanego do identyfikacji zwierząt założycieli niosących mutacje w locus docelowym wywołane przez nukleazę. ZFN specyficzne dla locus Rosa26 myszy29 celują w miejsce restrykcyjne XbaI w obrębie intronu 1. A) Zwierzęta założyciele były przesiewane za pomocą PCR genotypującego z użyciem primera forward (F) zlokalizowanego 500 bp powyżej oraz primera reverse (R) 250 bp poniżej miejsca cięcia. B) Trawienie produktów PCR enzymem XbaI ujawnia wzory trawienia wskazujące na myszy z mutacjami biallelicznymi (oznaczone gwiazdkami), mutacjami monoallelicznymi (prążki trawione i nietrawione, np. zwierzę 2) oraz myszy typu dzikiego (całkowite trawienie, np. zwierzę 21). C) Sekwencjonowanie myszy z potencjalnymi modyfikacjami biallelicznymi wykazuje do 3 (zwierzę 24) różnych insercji/delecji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Nazwa startera</td>
			<td >Sekwencja 5’ do 3’</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >pCR8_F1</td>
			<td >ttgatgcctggcagttccct</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >pCR8_R1</td>
			<td >cgaaccgaacaggcttatgt</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TAL_F1</td>
			<td >ttggcgtcggcaaacagtgg</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TAL_R2</td>
			<td >ggcgacgaggtggtcgttgg</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TAL_Seq_5-1</td>
			<td >catcgcgcaatgcactgac</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Sekwencje starterów użytych do koloniowej reakcji PCR oraz sekwencjonowania w protokole montażu Golden Gate TALEN.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plazmid/Kolekcja</td>
			<td>Współtwórca</td>
			<td>Identyfikator Addgene</td>
			<td>Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zestaw Golden Gate TALEN i TAL Effector Kit 2.0</td>
			<td>Laboratorium Voytasa</td>
			<td>1000000024</td>
			<td>Zawiera wszystkie plazmidy niezbędne do montażu TALEN metodą Golden Gate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wektory docelowe pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD</td>
			<td>Laboratorium Pelczara</td>
			<td>40131, 40132</td>
			<td>Plazmidy pomocnicze do ekspresji TALEN w komórkach ssaków i in vitro synteza mRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Plazmidy i kolekcje plazmidów wymagane do montażu Golden Gate TALEN można pozyskać z Addgene (<a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a>).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zasób internetowy</td>
			<td>Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>http://tale-nt.cac.cornell.edu</td>
			<td>Projektowanie TALEN; przewidywanie efektów off-target dla TALEN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>http://zifit.partners.org/ZiFiT/</td>
			<td>Projektowanie TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>http://www.genome-engineering.org</td>
			<td>Projektowanie TALEN, CRISPR/Cas9; przewidywanie efektów off-target dla CRISPR/Cas9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html</td>
			<td>Składanie sekwencji TALEN w celu potwierdzenia wyników sekwencjonowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html</td>
			<td>Projektowanie modułowego składania ZFN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab/segallabsoftware</td>
			<td>Projektowanie modułowego składania ZFN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Zasoby online do projektowania ZFN, TALEN i CRISPR/Cas9.

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie wygenerowanie myszy z niedoborem genów za pomocą zaprojektowanych nukleaz ogonowych lub szponów. Osiąga się to poprzez najpierw zaprojektowanie i złożenie konstruktów DNA kodujących określone pary szponów, które służą jako szablony do transkrypcji in vitro w celu wygenerowania mRNA Talon. Kolejnym etapem zabiegu jest wyizolowanie zapłodnionych cytów myszy, a następnie mikrowstrzyknięcie im T. Ostatnim krokiem jest chirurgiczne przeniesienie wstrzykniętych cytów do pseudociężarnych matek zastępczych.Powstałe w ten sposób potomstwo F zero często wykazuje specyficzne dla miejsca delecje sekwencji genomowych, które często prowadzą do utraty funkcji genu docelowego. Chociaż przedstawiona tutaj metoda może dostarczyć informacji na temat funkcji genów u myszy, podstawowe podejście można również dostosować do innych organizmów modelowych, takich jak szczury i ryby. Najpierw wejdź na stronę docelową nukleotydów efektorowych TAL na stronie.Wybierz program celujący TN i wklej sekwencję docelowego genu. Dla tego protokołu. Użyj siedmiu konstruktów ekspresji TALEN P-C-A-G-T oraz zestawu efektorów Golden Gate Talen i T, które są dostępne w ad gene.Jeśli inne konstrukcje lub zestawy montażowe są używane do montażu Talen, ustawienia mogą być różne dla optymalnej długości dystansu i liczby ogonowych RV, wybierz opcję Miller Etal 2011 w ustawieniu Użyj wstępnie ustawionej architektury. Następnie wybierz NN na karcie Zamiana G. Program generuje plik tekstowy z potencjalnymi witrynami docelowymi wygenerowanymi na podstawie tej listy.Wybierz wymaganą parę lub pary Talen i kontynuuj montaż Golden gate. Protokół ten działa z najczęściej stosowanymi laboratoryjnymi szczepami myszy, w tym C 57 BL six J i BDF jednym super owulacją 10 dawczyń w wieku czterech tygodni przy użyciu dootrzewnowego wstrzyknięcia pięciu jednostek gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy. 48 godzin później podaj samicom pięć jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, również przez wstrzyknięcie dootrzewnowe natychmiast po wstrzyknięciu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, samice jeden do jednego z samcami w wieku rozrodczym tego samego dnia, przygotowują pseudo ciężarne matki zastępcze. Inni.Następnego ranka złóż w ofierze samice i odzyskaj zapłodnione oocyty, wycinając guzki. Następnie uwolnij lęgi oocytów do naczynia do hodowli narządów zawierającego mililitr pożywki M2. Usuń wszystkie komórki wzgórka, dodając 10 mikrolitrów 0,1% roztworu hialuronidazy bydlęcej do naczynia zawierającego sprzęgła cytów w pożywce M 2.Następnie za pomocą pipety doustnej przemyć zarodki przez dwie lub trzy zmiany pożywki M2 w celu usunięcia hialuronidazy. Kontynuować leczenie hialuronidazą w przypadku zarodków, które jeszcze nie oddzieliły się od komórek wzgórka. Wyizolowane zarodki mogą być przechowywane w M 16, podłożu o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do momentu mikroiniekcji.Przygotować 100 mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań zawierającego 10 nanogramów na mikrolitr każdego ogona. Nukleaza, mRNA, para i wirować przez 30 minut w 30 000 G do osadzania. Wszelkie cząstki, które mogą zatkać igły do wstrzykiwań.Następnie trzymaj mieszankę na lodzie. Zaplanuj wstrzyknięcie oocytów w stadium przedjądrzowym wczesnym popołudniem. Zanurz około 100 zarodków w pożywce M two pod warstwą oleju mineralnego i pracuj na odwróconym mikroskopie bez marsoidalnej optyki DIC.W powiększeniu 20x wybierz cyty z wyraźnymi przedjądrzami. Sortowanie oocytów można przeprowadzić za pomocą pustej kapilary iniekcyjnej, załadować kapilarnę iniekcji tuż przed jej użyciem jednym do dwóch mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań. Następnie przymocuj go do głowicy mikroiniekcyjnej.Następnie odessać wybrany cyt z kapilarą przytrzymującą i wykonać płytkie wstrzyknięcie mRNA nukleazy do cytoplazmy. Unikać kontaktu z przedjądrzami. Objętość wstrzyknięcia powinna być utrzymywana na małym poziomie.Przy pierwszych oznakach wzdęcia cytoplazmatycznego wycofaj igłę. Zwykle około 80 do 90% zarodków powinno przeżyć bez natychmiastowej choroby. Aby zwiększyć ilość wstrzykniętego mRNA, należy zwiększyć stężenie roztworu po mikrowstrzyknięciu dostępnych cytów.Przenieść je do podłoża M 16 za pomocą pipety doustnej. Wysiaduj zarodki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie przenieś te, które przeżyją, do pseudo ciężarnych matek zastępczych.Dzień przed mikroiniekcją wywołaj pseudociążę u trzy- do sześciomiesięcznej samicy myszy CD, kojarząc je z samcami z sektorów VA. Następnego ranka wybierz samice z przezroczystą czopem, które zostaną wykorzystane jako biorczynie zarodków. Niewykorzystane samice powrócą do stanu pseudociąży w ciągu trzech tygodni i mogą być ponownie użyte.Umieść znieczuloną samicę matki zastępczej na ciepłej powierzchni na jej brzuchu. Następnie zdezynfekuj obszar nacięcia, spryskując go 70% etanolem. Mokre włosy odczeszać od planowanego miejsca nacięcia.Teraz rozetnij jamę otrzewnej nożyczkami i uzewnętrznij róg macicy. Aby to zrobić. Pociągnij za poduszeczkę tłuszczową przyczepioną do jajnika i unieruchamij narządy rozrodcze za pomocą zacisku buldoga.Pamiętaj również, aby narządy były wilgotne za pomocą podgrzanego 0,9% roztworu chlorku sodu. W tym momencie posortuj od 12 do 20 żywotnych zarodków i załaduj je do cienkiej szklanej kapilary. Za pomocą pipety doustnej najpierw odessaj mały pęcherzyk powietrza, a następnie odessaj zarodki za pomocą cienkich kleszczy.Delikatnie chwyć UCT tuż przed wzmacniaczem i utwórz mały otwór w ścianie UCT za pomocą igły o rozmiarze 30. Włóż obciążoną kapilę do otworu i delikatnie wydmuchuj zarodki do ampera, aż zobaczysz, że pęcherzyk powietrza został przemieszczony z naczynia włosowatego. Następnie usuń kapilarę.Natychmiast wymień narządy rozrodcze z powrotem w jamie ciała i zamknij jamę otrzewnej pojedynczym szwem. Następnie zamknij skórę za pomocą jednego lub dwóch dziewięciomilimetrowych klipsów do ran. Wróć zwierzę do jego domowej klatki i opiekuj się nim, dopóki znieczulenie nie ustąpi.Następnie umieść samice w stabilnych grupach społecznych składających się z dwóch do trzech myszy, aby zminimalizować stres przez pierwsze trzy dni po operacji, pamiętaj o dostarczeniu środka przeciwbólowego, takiego jak DEF Falcon, w wodzie pitnej dla każdej szarańczy w genomie myszy, która jest ukierunkowana na nukleazy projektowane. Test oparty na PCR ma na celu identyfikację zwierząt założycielskich, które są nosicielami pożądanego zmutowanego allelu. W pierwszym przykładzie założyciele pochodzący z mikroiniekcji pary nukleazy ogonowej.Celując w region powłoki genu białka prionowego myszy, analizowano za pomocą trawienia endonukleazą T seven produktu PCR. Test trawienia endonukleazy T seven opiera się na tworzeniu hetero dupleksów między niciami DNA produktów PCR generowanych ze zmutowanych i dzikich alleli. Mutageneza indukowana przez Talon w docelowym regionie genomowym pojedynczych założycieli została ujawniona przez pojawienie się 250 i 110 sparowanych zasad produktów długiego trawienia oprócz produktu PCR na całej długości.Alternatywnie, produkty PCR mogą być poddane trawieniu restrykcyjnemu, jeśli odpowiednie diagnostyczne miejsce restrykcyjne znajduje się w regionie dystansowym zaprojektowanej pary nukleaz. W drugim przykładzie ZFN atakuje jedną witrynę ograniczającą XPO znajdującą się w intro, jedną z locus myszy Rosa 26. Tutaj niestrawione prążki wskazują na obecność mutacji.Gwiazdki oznaczają brak jakichkolwiek strawionych produktów, co silnie sugeruje, że założyciel jest nosicielem mutacji w obu allelach docelowego genu. Klonowanie i sekwencjonowanie tych niestrawionych produktów PCR ujawnia, że myszy założycielskie mogą mieć dwie lub więcej odrębnych modyfikacji docelowego allelu. Brak sekwencji typu dzikiego wskazuje na całkowitą ablację genu docelowego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć konstrukcję nukleazy ogonowej, montaż ogona, konstrukty nukleazy i jak ich używać do generowania zmutowanych myszy przez bezpośrednią mikroiniekcję ozydu. Metodę tę można dostosować do pracy z innymi klasami nukleaz projektowanych, takimi jak, jądra palcowe lub CAS nine crispr. Może również ułatwić modyfikację genomu poprzez rekombinację homologiczną poprzez jednoczesne wstrzyknięcie nukleazy i odpowiedniej matrycy docelowej genu.

mouse-genome-engineering-using-designer-nucleases

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Inżynieria genomu myszy z wykorzystaniem projektowanych nukleaz

Usługa CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) umożliwia precyzyjną edycję genomu w dowolnym organizmie lub linii komórkowej w dowolnym locus zdefiniowanym przez użytkownika. Niniejszy artykuł opisuje proces projektowania, produkcji, walidacji i wdrażania usługi CompoZr Custom ZFN.

Edycja genomu przy użyciu niestandardowych nukleaz z palcami cynkowymi (ZFN) CompoZr

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Metody eksperymentalne w inżynierii tkankowej

Poznaj metodę inżynierii genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta TALEN. Technika obejmuje projektowanie konstruktów, mikroinjekcję oocytów i transfer do matek zastępczych, umożliwiając precyzyjne modyfikacje genetyczne.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Przeglądaj więcej filmów