Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opisanie procedur niezbędnych do skutecznego generowania myszy modyfikowanych genetycznie poprzez mikroiniekcję oocytów. Protokół ten może pomóc badaczom oraz personelowi technicznemu zaangażowanemu zarówno w dziedzinę genezy myszy, jak i w ukierunkowane wprowadzenie genów (gene targeting). Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się ona na bezpośredniej iniekcji oocytów mysich, zarówno w celu losowej integracji, jak i ukierunkowanego wprowadzenia genów, co pozwala na generowanie myszy modyfikowanych genetycznie w czasie tak krótkim jak sześć tygodni.

Aby przygotować pojedyncze przewodnie RNA, po wybraniu dwóch pożądanych sekwencji docelowych i wykonaniu starterów zgodnie z protokołem tekstowym, należy zsyntetyzować liniowy szablon DNA poprzez rozcieńczenie plazmidu PX330 do stężenia 10 ng/µL w wodzie wolnej od nukleaz. Przygotuj mieszaninę główną (master mix), dodając polimerazę na samym końcu, i przechowuj ją w lodzie. Następnie wymieszaj i rozdziel roztwór do ośmiu probówek do PCR.

Do każdej probówki dodaj 1 µL PXR330 i uruchom następujący program. Następnie, używając zestawu do oczyszczania produktów PCR, manifoldu oraz źródła próżni, oczyść produkt PCR. Do jednej objętości próbki PCR dodaj pięć objętości buforu wiążącego i wymieszaj.

Umieść kolumnę wirówkową z membraną krzemową na kolektorze. Aby związać DNA, nanieś wszystkie osiem próbek na kolumnę w warunkach próżni. Aby przemyć próbkę, dodaj do kolumny 0,75 ml buforu do przemywania i zastosuj próżnię.

Następnie odwiruj kolumnę z prędkością 12 000 ×g przez 60 sekund, aby usunąć resztki etanolu. Umieść kolumnę w czystej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, a następnie, aby eluować DNA, dodaj 30 µl wody wolnej od nukleaz do środka membrany. Pozostaw kolumnę na jedną minutę, a następnie odwiruj ją z prędkością 12 000 ×g przez 60 sekund.

Następnie należy użyć spektrofotometru do pomiaru stężenia DNA. Aby przeprowadzić transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu do syntezy RNA T7, należy przygotować master mix i inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Należy dodać 28 µL wody wolnej od nukleaz oraz 2 µL DNazy I, a następnie inkubować reakcję przez kolejne 15 minut.

Aby oczyścić RNA, rozpuścić proszek zawarty w dostarczonej kolumnie wirowej w 650 µL buforu do mikroiniekcji wolnego od nukleaz. Ostrożnie usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza, zakręcić probówkę i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej od 5 do 15 minut. Zdjąć niebieską zatyczkę z dołu i umieścić kolumnę w probówce o pojemności 2 mL.

Następnie odwiruj probówkę z prędkością 750 ×g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Potem umieść kolumnę w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i nanieś kroplami 50 µl roztworu RNA na środek, nie dotykając ścianek kolumny. Następnie wiruj kolumnę z prędkością 750 ×g przez dwie minuty.

Zmierz stężenie RNA i oceń jego jakość zgodnie z protokołem tekstowym. Używając beznukleazowego buforu do mikroiniekcji, rozcieńcz mRNA Cas9 do stężenia 50 ng/µL, a sgRNA do 12,5 ng/µL na potrzeby eksperymentów z wyciszaniem genów. Dodaj matrycę donorową w stężeniu 200 ng/µL w przypadku edycji genomu opartej na bezpośredniej naprawie homologicznej i przechowuj ją w lodzie.

Używając końcówki aspiratora, należy przemyć oocyty czterema świeżymi kroplami kazeinowych aminokwasów, a następnie przenieść je do końcowej kropli pożywki Casome 8, przykrytej olejem mineralnym. Aby przeprowadzić iniekcję pronuklearną w celu integracji losowej, należy pod mikroskopem stereoskopowym, używając końcówki aspiratora, przenieść około 50 jaj do kropli pożywki M2 przykrytej olejem mineralnym, która będzie służyć jako komora do iniekcji.

Przenieś komorę do wstrzykiwania pod mikroskop odwrócony i wstrzyknij do zapłodnionych oocytów kilka pikolitrów mieszaniny do iniekcji. Jeśli wstrzykiwanie przebiegnie pomyślnie, pronukleus spuchnie. W przypadku iniekcji cytoplazmatycznej w celu targetowania genów, użyj pipety z końcówką ustną, aby przenieść około 50 jaj do kropli casome A zawierającej 5 µg/mL cytochalazyny B, a następnie inkubuj jaja w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez pięć minut.

Przenieś jaja do komory do iniekcji, a następnie, przy bardzo niskim ciśnieniu, wstrzyknij kilka pikolitrów mieszaniny iniekcyjnej do cytoplazmy. W miarę możliwości wykorzystaj ciśnienie kompensacyjne automatycznego mikroinjektora. Po iniekcji użyj końcówki pipety, aby przenieść oocyty z powrotem do kropli aminokwasów kazeino-amino.

Przechowywać je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu ich przeniesienia w celu reimplantacji do jajowodu pseudociężarnych samic. Po znieczuleniu samicy myszy z potwierdzoną kopulacją zgodnie z protokołem tekstowym, aby przeprowadzić reimplantację w warunkach sterylnych, odsłonić przewód rodny, wykonując skalpelem nacięcie o długości 1 cm równolegle do linii środkowej grzbietu. Następnie nożyczkami przeciąć mięśnie i za pomocą pincety uchwycić poduszeczkę tłuszczową.

Delikatnie wyciągnij jajnik, aż przymocowany do niego jajowód i macica staną się wyraźnie widoczne. Następnie użyj kleszczyków naczyniowych, aby unieruchomić tkankę tłuszczową. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą mikronożyczek, wykonaj nacięcie w ścianie jajowodu, kilka milimetrów powyżej kątnicy.

Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, załaduj 25 mikroiniekcyjnych jaj do szklanej kapilary połączonej z ustnikiem. Następnie wprowadź szklaną kapilarę do jajowodu i wypchnij jaja, aż wewnątrz ampuły pojawi się pęcherzyk powietrza. Aby upewnić się, że reimplantacja przebiegła pomyślnie, należy sprawdzić obecność pęcherzyka powietrza w ampule, co gwarantuje, że wszystkie jaja zostały wypchnięte we właściwym miejscu i żadne nie pozostały w szklanej kapilarze.

Ostrożnie wyjmij kapilarę szklaną i umieść drogi rodne z powrotem w jamie brzusznej. Następnie użyj nie wchłanialnych szwów chirurgicznych rozmiaru 000, aby zaszyć nacięcie, a potem użyj klipsów do ran, aby zamknąć skórę. Umieść mysz na ciepłej macie, aby zapobiec hipotermii, i wstrzyknij podskórnie lek przeciwbólowy.

Obserwuj mysz aż do pełnego powrotu do zdrowia. Na koniec przeprowadź typowanie i sekwencjonowanie genomu zgodnie z protokołem tekstowym. Rycina ta przedstawia żele analityczne obrazujące jakość oczyszczania transgenu oraz syntezę sgRNA, które są kluczowe dla pomyślnego wygenerowania myszy zmodyfikowanych genetycznie.

Przedstawiony tutaj jest typowy wynik sesji mikroiniekcji w przypadku integracji losowej. Starter do genotypowania powinien być dopasowany do transgenu i zaprojektowany tak, aby generować fragment o długości od 200 do 800 par zasad. W tym wyniku dla celowanego wprowadzenia genu, startery dobrano tak, aby hybrydyzowały z DNA genomicznym poza regionem ostatecznie wyciętym przez dwa llofy.

Strategia ta umożliwia bezpośrednią identyfikację heterozygotycznych i homozygotycznych założycieli z nokautem. Jak tutaj pokazano, gdy każdy etap protokołu jest zoptymalizowany, odsetek szczeniąt transgenicznych powinien wynosić od 10% do 25% w przypadku integracji losowej, co jest wartością stosunkowo niską w porównaniu z możliwościami komponentów CRISPR w zakresie edycji genomu myszy. Przy zastosowaniu CRISPR do celowania genowego liczba założycieli jest zazwyczaj wyższa i mieści się w przedziale od 25% do 100%; nie jest rzadkością uzyskanie całego potomstwa, które jest pomyślnie homozygotyczne po edycji za pomocą CRISPR.

Po opracowaniu technika ta pozwala badaczom w dziedzinach takich jak, na przykład, neuronauka czy onkologia, wykorzystać nowe modele masek do odkrywania mechanizmów patologicznych i ostatecznie przełożyć tę wiedzę na strategie terapeutyczne.