Name: Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metody ilościowego wykrywania aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych za pomocą cytometrii przepływowej i spektrometrii. Techniki te umożliwiają precyzyjną analizę depozycji C3 i C4 oraz lizy erytrocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SZ i DW otrzymują nieograniczoną dotację od Viropharma.

1. Przygotowanie czerwonych krwinek traktowanych bromelainą
<ol>
	<li>Przemyć krwinki czerwone typu 0 3x 1x PBS (wirowanie przy 664 x g przez 2-5 min).</li>
	<li>Inkubować 1 objętość upakowanych erytrocytów z dwiema objętościami 0,5% roztworu bromelainy przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj komórki 3x za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Komórki mogą być przechowywane w postaci 3% roztworu w temperaturze 4 °C w 1x PBS przez co najmniej tydzień.</li>
</ol>
2. Analiza osadzania C3 i C4 na krwinkach czerwonych przez FACS
<ol>
	<li>Inaktywować termicznie wymaganą ilość surowicy pacjenta (lub innego źródła przeciwciał anty-RBC) poprzez ogrzewanie próbki przez 30 minut w temperaturze 56 °C.</li>
	<li>Przemyć erytrocyty poddane działaniu bromelainy trzykrotnie w VBG- (5 mM Veronal, 150 mM NaCl, 0,05% żelatyny pH 7,4) i ponownie zawiesić je w VBG++ (VBG-- + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2) do uzyskania 0,5% roztworu.</li>
	<li>Do okrągłej płytki z perłą szklaną (w celu prawidłowego wymieszania) odpipetować następujące składniki: 25 μl 0,5% RBC, 37,5 μl świeżej surowicy AB (źródło dopełniacza) i 37,5 μl 200 μg/ml anty-C5. Anty-C5 jest drogi i może być trudny do zdobycia. Można rozważyć użycie surowicy z niedoborem C5-/C6-/C7- lub C8 zamiast surowicy AB i anty-C5.</li>
	<li>Dodaj surowicę pacjenta na studzienkę do końcowego stężenia 0,1-33%. Skorygować różnice w stężeniu surowicy na studzienkę za pomocą inaktywowanej termicznie surowicy AB. Dodaj VBG++, aby uzyskać końcową objętość 150 μl/studzienkę. Zamknąć płytkę folią ELISA.</li>
	<li>Inkubować 1,5-2 godziny w temperaturze 37 °C, wstrząsając.</li>
	<li>Przemyć erytrocyty trzykrotnie PBS + 0,5% BSA (odwirowanie przy 664 x g przez 2 min).</li>
	<li>Dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne anty-C3 i anty-C4 lub ich fragmenty Fab (w celu zmniejszenia aglutynacji) w PBS + 0,5% BSA do końcowego stężenia 1 μg/ml. Tutaj stosuje się specjalnie opracowane przeciwciała monoklonalne anty-C3-Alexa Fluor 488 i anty-C4-Alexa Fluor 647; wybór tych etykiet fluorescencyjnych pozwala na jednoczesne wykrywanie C3 i C4 przez FACS.</li>
	<li>Inkubować 30-45 minut w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Umyj erytrocyty 3x PBS + 0,5% BSA.</li>
	<li>Ponownie zawiesić erytrocyty 150 μl w PBS +0,5% BSA i odpipetować je do nowej płytki (w celu pozbycia się szklanych pereł przed analizą FACS).</li>
	<li>Wykonaj analizę FACS. Oddziel pojedyncze komórki od dubletów na wykresie punktowym FSC-A; ustawić bramkę na pojedynczych RBC; wybrać odpowiedni kanał detekcji dla sygnałów fluorescencyjnych (np. FITC i APC).</li>
	<li>Określ ilościowo wyniki, korzystając z mediany intensywności fluorescencji.</li>
</ol>
Uwaga: Możliwe jest użycie kontroli izotypu (np. fluorescencyjnie znakowanej myszy anty-IL6 IgG1). Zaleca się jednak włączenie prawdziwej kontroli ujemnej, np. poprzez inkubację erytrocytów bez surowicy pacjenta (tylko surowica AB) lub bez źródła dopełniacza (inaktywowana termicznie surowica AB i inaktywowana termicznie surowica pacjenta), a następnie barwienie ich tymi samymi przeciwciałami anty-C3-Alexa Fluor 488 i anty-C4-Alexa Fluor 647. Daje to bardziej wiarygodną kontrolę niż kontrola izotypu w przypadku czerwonych krwinek12, chociaż te różne kontrole zazwyczaj dają ten sam, negatywny wynik.
3. Ilościowy test hemolityczny
<ol>
	<li>Inaktywować termicznie wymaganą ilość surowicy pacjenta (lub innego źródła przeciwciał anty-RBC) poprzez ogrzewanie próbki przez 30 minut w temperaturze 56 °C.</li>
	<li>Umyj RBC 3x za pomocą VBG - i raz za pomocą VBG++.</li>
	<li>Na okrągłodenną płytkę ze szklaną perłą (w celu prawidłowego wymieszania) odpipetować następujące składniki: 35 μl 3% RBC, 25 μl świeżej surowicy AB (źródło dopełniacza) i 1-50% surowicy pacjenta. Skorygować różnice w stężeniu w surowicy za pomocą inaktywowanej termicznie surowicy AB. Dodaj VBG++, aby uzyskać końcową objętość 150 μl/studzienkę. Zamknąć płytkę folią ELISA.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5-2 godziny z wytrząsaniem.</li>
	<li>Płytka wirowa przy 664 x g przez 5 minut ze zmniejszonym opóźnieniem (np. zwalnianie do całkowitego zatrzymania w ciągu 2-3 minut).</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować 90 μl supernatantu na nowej płytce do mikromiareczkowania. Na tym etapie ważne jest, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i zabraniu ze sobą nienaruszonych komórek.</li>
	<li>Zmierzyć A414/690 w odpowiednim spektrofotometrze.</li>
	<li>Wyrazić lizę jako procent lizy próbki krwinek czerwonych czystą wodą.</li>
</ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powyższe testy są powtarzalne i solidne. Są łatwe do wykonania i możliwe jest ich wykonanie z wieloma próbkami jednocześnie (w płytce 96-dołkowej). W związku z tym podejście to byłoby również odpowiednie dla w pełni zautomatyzowanego systemu, np. systemu robota ELISA. W przeciwieństwie do obecnie stosowanych technik, testy te mają charakter ilościowy, co pomoże m.in . w badaniu działania inhibitorów dopełniacza. Co więcej, interpretacja jest obiektywna, co stanowi poprawę w stosunku do obecnie stosowany...

Przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom (RBC) mogą być wywołane przez transfuzję krwinek czerwonych wyrażających antygen, który nie występuje na krwinkach czerwonych biorcy. Te alloprzeciwciała mogą powodować ciężkie ostre reakcje hemolityczne przetoczenia z powodu aktywacji dopełniacza po następnej transfuzji5. W autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej (AIHA) pacjenci mają autoprzeciwciała przeciwko własnym krwinkom czerwonym. Prowadzi to do przyspieszonego klirensu komórek poprzez oddziaływanie IgG związanych z erytrocytami z receptorami Fcγ na fagocytach w śledzionie i/lub w przypadku autoprzeciwciał zdolnych do aktywacji dopełniacza poprzez receptory dopełniacza w wątrobie6,7. Piorunująca aktywacja dopełniacza prowadząca do hemolizy wewnątrznaczyniowej jest rzadka, ale często śmiertelna. Przyspieszone, zależne od dopełniacza niszczenie erytrocytów indukowane przez allo- lub autoprzeciwciała powoduje ostrą niedokrwistość, a tym samym potencjalnie śmiertelne niedotlenienie tkanek. Autoprzeciwciała w AIHA są klasyfikowane jako przeciwciała ciepłe i zimne, w zależności od optymalnej temperatury, w której wiążą się z krwinkami czerwonymi (odpowiednio 37 °C lub niższa). Ciepłe przeciwciała są zwykle izotypem IgG, a zimne przeciwciałami IgM izotypu8,9. AIHA może być wtórna np. do zaburzeń limfoproliferacyjnych, chorób tkanki łącznej, guzów litych, infekcji lub leków, ale w 50% przypadków AIHA jest idiopatyczna9.
Wykrywanie gammaglobulin (np. IgG lub IgM) i dopełniacza związanego z krwinkami czerwonymi pacjenta wykonuje się za pomocą półilościowego bezpośredniego testu antyglobulinowego (Coombs) (DAT). U pacjentów z DAT erytrocyty są inkubowane z anty-IgG lub anty-C3d. Występowanie aglutynacji RBC świadczy o obecności przyłączonych składników dopełniacza lub wiązania IgG. Wykrywanie allo- lub autoprzeciwciał w surowicy pacjenta odbywa się za pomocą pośredniego testu antyglobulinowego (IAT). W IAT testowe krwinki czerwone traktowane bromelainą są inkubowane z surowicą pacjenta, przemywane, a następnie inkubowane z anty-ludzkimi IgG. W przypadku, gdy erytrocyty zostały uczulone na anty-RBC IgG obecne w organizmie pacjenta, nastąpi aglutynacja surowicy. Przeciwciała IgM przeciwko erytrocytom bezpośrednio prowadzą do aglutynacji po inkubacji testowych krwinek czerwonych traktowanych bromelainą z surowicą pacjenta. Aglutynacja RBC w bezpośrednim teście Coombsa lub w IAT jest oceniana wizualnie albo na oko w probówce, albo przez umieszczenie próbki w małej kolumnie Sephadex oddzielającej aglutynowane i pojedyncze RBC według wielkości1.
Inną często używaną techniką pomiaru aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych jest test hemolityczny1, w którym ocenia się zdolność surowicy pacjenta do indukowania (za pośrednictwem dopełniacza) hemolizy krwinek czerwonych10 leczonych bromelainą. Test jest odnotowywany jako pozytywny, gdy supernatant po odwirowaniu jest zabarwiony na czerwono z powodu uwolnionej hemoglobiny i uważany za ujemny, jeśli pozostaje bezbarwny. Zarówno test antyglobulinowy, jak i test hemolityczny są półilościowe, ponieważ oznacza się najwyższe rozcieńczenie surowicy, w którym test jest nadal dodatni.
Test antyglobulinowy i test hemolityczny są solidnymi testami, które są rutynowo używane w diagnostyce. Ponieważ testy te są półilościowe i zależą od doświadczenia technika wykonującego test, nie nadają się do badania subtelnych różnic w aktywacji dopełniacza na erytrocytach, co jest konieczne przy ocenie skuteczności inhibitorów dopełniacza. Dlatego opracowaliśmy dwa testy ilościowe w celu określenia aktywacji dopełniacza przez (auto)przeciwciała przeciwko erytrokomórkom, które opiszemy w tym artykule.
Po pierwsze, opracowaliśmy test do pomiaru osadzania się fragmentów aktywacji dopełniacza C3 i C4 na krwinkach czerwonych (Rysunek 1A). W tym teście ludzkie erytrocyty typu 0 traktowane bromelainą inkubuje się z inaktywowaną termicznie surowicą pacjenta (źródło przeciwciał anty-RBC), świeżą surowicą AB (źródło dopełniacza) i przeciwciałem monoklonalnym anty-C5 (ekulizumab). Podczas tej inkubacji nastąpi odkładanie C3 i C4, jeśli surowica pacjenta zawiera przeciwciała anty-RBC aktywujące dopełniacz. Aby zapobiec lizie erytrocytów poprzez dalszą aktywację dopełniacza, dodaje się blokujące przeciwciało monoklonalne anty-C5. Następnie odkładanie się C3 i C4 na krwinkach czerwonych jest wykrywane przez FACS przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał monoklonalnych lub fragmentów Fab reagujących odpowiednio z C3 i C4. Bramkowanie na pojedynczych krwinkach czerwonych jest ważne dla zapewnienia wiarygodności wyników. Do zalet tej techniki należy to, że wymagana jest niewielka objętość materiału pacjenta, oceniana jest aktywacja dopełniacza na wczesnym etapie kaskady, a metoda jest powtarzalna i ilościowa. Dodatkową zaletą patrzenia zarówno na C3, jak i C4 jest to, że można dokonać rozróżnienia między aktywacją szlaku klasycznego i lektynowego (zarówno osadzanie C3, jak i C4) a alternatywną aktywacją szlaku (tylko osadzanie C3). Zastosowanie erytrocytów poddanych działaniu bromelainy zamiast nieleczonych erytrocytów zwiększa czułość testu.
Drugi test jest oparty na obecnie używanym teście hemolitycznym (Rysunek 1B). Ludzkie erytrocyty typu 0 traktowane bromelainą inkubuje się z inaktywowaną termicznie surowicą pacjenta (źródło przeciwciał anty-RBC) i świeżą surowicą AB (źródło dopełniacza). Jeśli dopełniacz jest aktywowany przez przeciwciała anty-RBC pacjenta, nastąpi zależna od dawki liza RBC, prowadząca do uwolnienia hemoglobiny. Ilość uwolnionej hemoglobiny określa się ilościowo, mierząc jej absorbancję przy 414 nm w supernatancie po odwirowaniu nienaruszonych i rozdrobnionych krwinek czerwonych. Absorbancja koreluje z ilością zaistniałej hemolizy. W przeciwieństwie do obecnie stosowanego testu, protokół ten pozwala na obiektywną, ilościową wartość hemolizy, która jest bardzo powtarzalna i niezależna od osoby interpretującej test.
Zastosowanie tych metod zostało opisane w 11, gdzie badano potencjalne zastosowanie inhibitora C1 jako inhibitora dopełniacza w AIHA.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>Ta substancja chemiczna podlega regulacji leków.</td></tr><tr><td>Sodium Barbital</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>Ta substancja chemiczna podlega regulacji leków.</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 barwnik reaktywny aminowy</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 aminowo-reaktywny barwnik</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa; C5 (Ekulizumab)</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>Można użyć dowolnego FACS, który ma odpowiednie lasery.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr (np. Multiskan spectrum)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>Można użyć dowolnego spektrofotometru o odpowiednim zakresie długości fali</td></tr><tr><td>Oprogramowanie BD FACSDiva v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>Można użyć dowolnego kompatybilnego oprogramowania do analizy FACS</td></tr><tr><td>Bromelaina&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom (RBC) mogą prowadzić do aktywacji dopełniacza, co skutkuje przyspieszonym klirensem przez receptory dopełniacza w wątrobie (hemoliza pozanaczyniowa) lub prowadzić do wewnątrznaczyniowej lizy krwinek czerwonych. Alloprzeciwciała (np. ABO) lub autoprzeciwciała przeciwko antygenom RBC (obserwowane w autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, AIHA) prowadzące do aktywacji dopełniacza są potencjalnie szkodliwe i mogą być - zwłaszcza gdy prowadzą do lizy wewnątrznaczyniowej - śmiertelne1. Obecnie aktywację dopełniacza spowodowaną (auto)przeciwciałami na krwinkach czerwonych ocenia się in vitro za pomocą testu Coombsa odzwierciedlającego osadzanie się dopełniacza na krwinkach czerwonych lub nieilościowego testu hemolitycznego odzwierciedlającego lizę erytrocytów1-4. Jednak aby ocenić skuteczność inhibitorów dopełniacza, konieczne jest posiadanie technik ilościowych. Tutaj opisujemy dwie takie techniki. Po pierwsze, przedstawiono test do wykrywania odkładania się C3 i C4 na krwinkach czerwonych, które jest indukowane przez przeciwciała w surowicy pacjenta. W tym celu stosuje się analizę FACS z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami anty-C3 lub anty-C4. Następnie opisano ilościowy test hemolityczny. W tym teście mierzy się hemolizę za pośrednictwem dopełniacza indukowaną przez surowicę pacjenta przy użyciu spektrofotometrycznej detekcji uwolnionej hemoglobiny. Oba te testy są bardzo powtarzalne i ilościowe, co ułatwia badania nad aktywacją dopełniacza indukowaną przez przeciwciała.

Rycina 2A przedstawia reprezentatywny wykres punktowy dla RBC. Odpowiednie bramkowanie dla pojedynczych RBC można zobaczyć na wykresie FSC-W - FSC-A (P1). Zazwyczaj około 95% RBC mieści się w obrębie tej bramki P1 (pojedyncze komórki), jednak przy zastosowaniu wysokiego stężenia surowicy pacjenta wartość ta może spaść do 70-80%, zwłaszcza w przypadku obecności przeciwciał IgM przeciwko RBC w surowicy pacjenta.
Reprezentatywne wyniki wpływu surowicy pacjentów z AIHA nay deposit...

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena aktywacji dopełniacza przez przeciwciała przeciwko erytrocytom (RBC) w surowicy pacjenta. Osiąga się to poprzez inkubację erytrocytów z surowicą pacjenta w obecności blokującego przeciwciała anty-C5 w celu indukcji depozycji C4 i C3 na powierzchni erytrocytów. Następnie erytrocyty barwi się przeciwciałami anty-C4 i anty-C3 znakowanymi fluorescencyjnie, a ilość depozycji dopełniacza na erytrocytach może zostać przeanalizowana za pomocą cytometrii przepływowej w metodzie alternatywnej.Erytrocyty inkubuje się z surowicą pacjenta w obecności przeciwciał przeciwko czynnikowi C5, aby wywołać lizę zależną od dopełniacza. Procent zlizowanych erytrocytów można następnie określić, mierząc spektrometrycznie ilość hemoglobiny uwolnionej z komórek. Główną zaletą tej nowej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test hemolizy lub test antyglobulinowy stosowany w rutynowej diagnostyce, jest jej ilościowy charakter, co pozwala na wykrycie subtelnych różnic w aktywacji dopełniacza.Elizabeth Brook, stażysta podoktorski w naszym laboratorium, zademonstruje procedury. Rozpocznij od trzykrotnego przemycia erytrocytów grupy 0 w PBS, następnie inkubuj osad w 0,5% roztworze rosalanu w stosunku 1:2 przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po trzykrotnym przemyciu komórek, przechowuj je jako 3% zawiesinę w świeżym PBS w temperaturze 4 °C, aby przeanalizować depozycję dopełniacza na RBC za pomocą cytometrii przepływowej. Najpierw przeprowadź inaktywację termiczną odpowiedniej ilości surowicy pacjenta przez 30 minut w temperaturze 56 °C. Podczas obróbki termicznej surowicy, przemyj trzykrotnie erytrocyty traktowane rosalanem w buforze Roal; czynność tę wykonaj po ostatnim płukaniu.Resuspend osad w vbg plus plus w rozcieńczeniu 0,5%. Następnie, przy użyciu szklanej kuleczki, dodaj do każdego dołka płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie 25 µL 0,5% RBCs, 37,5 µL świeżego surowicy AB oraz 37,5 µL przeciwciał anti C five w stężeniu 200 µg/mL. Następnie dodaj do każdego dołka inaktywowaną ciepłem surowicę pacjenta w odpowiednim stężeniu, uzupełniając w razie potrzeby inaktywowaną ciepłem surowicą AB i uwzględniając również kontrolę negatywną.Użyj VBG plus plus, aby doprowadzić każdą studzienkę do objętości końcowej 150 µL, a następnie inkubuj płytkę przykrytą folią EIA przez od półtorej do dwóch godzin w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie PBS uzupełnionym o 0,5% BSA, a następnie oznacz komórki za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-C3 i anty-C4 znakowanych fluorescencyjnie w stężeniu 1 µg/mL. Inkubuj komórki przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym potrząsaniu, a następnie po trzykrotnym przemyciu płytki resuspenduj RBC w 150 µL PBS z 0,5% BSA na studzienkę.Przenieśmy zawiesiny komórkowe do nowej płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem, a następnie umieśćmy płytkę w cytometrze przepływowym i oddzielmy pojedyncze komórki od dubletów, korzystając z wykresu rozproszenia światła przedniego. Ustawmy bramkę na pojedynczych erytrocytach, a następnie wybierzmy odpowiedni kanał detekcji dla sygnałów fluorescencyjnych. Ilościowe wyniki analizy hemolitycznej wyznaczmy za pomocą mediany intensywności fluorescencji; serum pacjenta poddajmy obróbce termicznej w celu aktywacji, a erytrocyty traktowane romainą przemyjmy w sposób przedstawiony przed chwilą.Następnie, po inkubacji RBC z dopełniaczem i surowicą pacjenta w sposób właśnie zademonstrowany, ale bez użycia przeciwciała anty-C5, odwirować komórki przez pięć minut przy 664 g z zmniejszonym opóźnieniem hamowania. Następnie ostrożnie przenieść 90 µL supernatantu do nowej płytki mikrotitracyjnej, dbając o to, aby nie przenieść nienaruszonych komórek i uniknąć tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie zmierzyć absorbancję przy 414 do 690 nm w spektrofotometrze. Hemolizę wyrazić jako procent lizy próbki RBC inkubowanej w czystej wodzie.Na tej pierwszej rycinie przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe dla RBC traktowanych brolą; tutaj widoczne jest odpowiednie bramkowanie dla pojedynczych RBC. Zazwyczaj około 95% RBC mieści się w tej bramce dla pojedynczych komórek. Na tych histogramach przedstawiono reprezentatywne wyniki dotyczące efektu autoimmunologicznej anemii hemolitycznej lub aha.Osocze pacjenta w kontekście depozycji C4 i C3 prezentuje się zgodnie z oczekiwaniami: większa ilość osocza pacjenta prowadzi do większej depozycji dopełniacza. Co ciekawe, depozycja dopełniacza występuje w dwóch wyraźnych pikiach dodatnich. Prawdopodobnie nie jest to spowodowane heterogenicznością populacji erytrocytów, ponieważ RBC pobrano od jednego dawcy, choć przyczyna tego zjawiska jest wciąż badana. Mediany intensywności fluorescencji próbek przedstawiono na tych wykresach liniowych, aby ukazać powtarzalność testów depozycji C4 i C3.Należy zwrócić uwagę na znaczną zmienność w osadach różnych próbek pacjentów z AH H. Na koniec, na wykresach można zaobserwować dane z testu hemolitycznego próbki surowicy pacjenta z ahha zawierającej autoprzeciwciała przeciwko RBC. Miareczkowanie próbką surowicy daje wyraźną, powtarzalną krzywą przy zastosowaniu odpowiedniego inhibitora dopełniacza, takiego jak anti C five.Sygnał hemolityczny można miareczkować, co zostało przedstawione na tym wykresie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru aktywacji dopełniacza przez przeciwciała specyficzne dla erytrocytów, zarówno za pomocą analizy cytometrycznej depozycji C3 lub C4, jak i za pomocą ilościowego testu hemolitycznego.

methods-for-quantitative-detection-antibody-induced-complement

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metody ilościowego wykrywania aktywacji dopełniacza indukowanej przeciwciałami na czerwonych krwinkach

Droga klasyczna jest aktywowana przez przeciwciała i kończy się lizą komórki docelowej. Test CH50 pozwala na pomiar aktywności dopełniacza w próbce surowicy. Niniejsze wideo przedstawia etapy wyznaczania wartości CH50 w próbce surowicy, sposób obliczeń oraz interpretację wyników.

Pomiar 50% aktywności hemolitycznej dopełniacza (CH50) w surowicy

Źródło: Nagre, N. i inni. Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i usuwanie bakterii u myszy. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje ocenę fagocytozy pośredniczonej przez receptory komplementacyjne przy użyciu czerwonych krwinek owiec opsonowanych IgM i dopełniakiem, a następnie ich przyjmowania przez mysie makrofagi. Zakres fagocytozy mierzy się poprzez pomiar niebieskiego produktu chromogenicznego powstałego w wyniku katalyzowanej przez hemoglobinę utleniania diaminofluorenu.

Modelowanie fagocytozy podleganej komplementem za pomocą opsonizowanych czerwonych krwinek in vitro

Ten film demonstruje technikę oceny działania bakteriobójczego przeciwciał obecnych w surowicy, w którym pośredniczy dopełniacz. Podejście to łączy wyizolowaną surowicę z bakteriami chorobotwórczymi i egzogennymi białkami dopełniacza. Podczas inkubacji bakterie są hodowane na płytce agarowej, a wytworzone kolonie są oznaczane ilościowo w celu zmierzenia miana bakteriobójczego surowicy.

Test bakteriobójczy surowicy na działanie bakteriobójcze przeciwciał za pośrednictwem dopełniacza

Film demonstruje test hamowania hemaglutynacji do wykrywania przeciwciał surowicy przeciwko określonym antygenom. Potwierdzenie zahamowania hemaglutynacji w studzience testowej i hemaglutynacji w studzience kontrolnej uzyskuje się za pomocą wyraźnych wzorców wizualnych. Test ten odgrywa kluczową rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej, skuteczności szczepionki i badaniu infekcji wirusowych w wirusologii i immunologii.

Test zahamowania hemaglutynacji w celu wykrycia przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi docelowemu

Ten film demonstruje test mierzący aktywację funkcji efektorowych limfocytów T za pośrednictwem przeciwciał. Dodanie przeciwciała monoklonalnego swoistego dla hemaglutyniny (HA) wirusa grypy do transfekowanych komórek ssaków wykazujących ekspresję HA powoduje powstanie kompleksów immunologicznych z HA. Po wprowadzeniu zmodyfikowanych limfocytów T eksprymujących receptory Fc i reportera lucyferazy, limfocyty T są aktywowane przez kompleksy przeciwciało-HA, a aktywacja ta jest wykrywana przez...

Pomiar aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała HA

Ten film demonstruje test do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP) przez fagocyty mleka matki. Znakowane fluorescencyjnie mikrosfery sprzężone z kompleksem antygen-przeciwciało są łączone z zawiesiną komórkową wyizolowaną z mleka matki w celu wywołania zależnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej przez leukocyty fagocytarne. Po znakowaniu komórek przeciwciałami przeciwko powszechnemu antygenowi leukocytarnemu (CD45), cytometria przepływowa służy do pomiaru intensywności...

Test in vitro do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał za pomocą fagocytów

Test monocytów (MMA) to test in vitro, który wykorzystuje izolowane pierwotne monocyty uzyskane z pełnej krwi obwodowej ssaków do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR).

Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Celem tej metody jest określenie gęstości CR1 w erytrocytach dowolnego podmiotu poprzez porównanie z trzema osobami, których gęstość CR1 erytrocytów jest znana. Metoda wykorzystuje cytometrię przepływową po immunobarwieniu erytrocytów badanych przez przeciwciało monoklonalne anty-CR1 sprzężone z amplifikowanym układem za pomocą fikoerytryny (PE).

Pomiar receptora dopełniacza erytrocytów 1 za pomocą cytometrii przepływowej

Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.

Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Opracowaliśmy ulepszenia i zaktualizowane metody dla istniejącego testu monocytytowo-monowarstwowego (MMA), w którym makrofagi są używane do lepszego przewidywania klinicznego znaczenia alloprzeciwciał krwinek czerwonych w medycynie transfuzjologicznej i immunologii. Ten test nazywa się testem monocytów-makrofagów (M-MA).

Przewidywanie znaczenia przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym za pomocą testu monocytów-makrofagów

Poznaj metody ilościowego wykrywania aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych za pomocą cytometrii przepływowej i spektrometrii. Techniki te umożliwiają precyzyjną analizę depozycji C3 i C4 oraz lizy erytrocytów.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Przeglądaj więcej filmów