Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena aktywacji dopełniacza przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom lub erytrocytom w surowicy pacjenta. Osiąga się to poprzez inkubację czerwonych krwinek z surowicą pacjenta w obecności blokującego przeciwciała anty C 5 w celu indukowania odkładania się C 4 i C3 na powierzchni RBC. Następnie erytrocyty są barwione fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami anty C-4 i anty C3, a ilość osadzania się dopełniacza na krwinkach czerwonych można następnie analizować za pomocą cytometrii przepływowej w alternatywnej metodzie.

Erytrocyty są inkubowane z surowicą pacjenta przy braku anty C 5 w celu wywołania lizy za pośrednictwem dopełniacza. Procent lizowanych erytrocytów można następnie określić, mierząc ilość hemoglobiny uwalnianej przez komórki za pomocą spektrometrii. Główną przewagą tej nowej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak hemoliza lub test antyglobulinowy stosowany w rutynowej diagnostyce, jest to, że ma ona charakter ilościowy i możemy wykryć nieoptymalne różnice w aktywacji dopełniacza.

Elizabeth Brook postdoc w naszym laboratorium zademonstruje procedury Zacznij od trzykrotnego przemycia czerwonych krwinek o zerowym typie PBS, a następnie inkubuj osad w 0,5% roztworze Roma w stosunku jeden do dwóch przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza po trzykrotnym umyciu komórek, przechowuj je jako 3% roztwór w świeżym PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby przeanalizować osadzanie się dopełniacza na krwinkach czerwonych za pomocą cytometrii przepływowej. Najpierw podgrzej dezaktywuj żądaną ilość surowicy pacjenta przez 30 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza, podczas gdy surowica jest poddawana obróbce cieplnej. Po ostatnim przemyciu umyj krwinki czerwone potraktowane brola trzykrotnie w buforze Roal.

Resus zawiesić osad w vbg plus plus w rozcieńczeniu 0,5%. Następnie w szklanej perle 25 mikrolitrów 0,5% erytrocytów, 37,5 mikrolitrów świeżej surowicy AB i 37,5 mikrolitrów 200 mikrogramów na mililitr, anty C pięć do każdej studzienki 96-dołkowej okrągłej płytki dennej. Następnie dodać inaktywowaną termicznie surowicę pacjenta do każdej studzienki o odpowiednim stężeniu, uzupełniając w razie potrzeby inaktywowaną termicznie surowicą AB i uwzględniając również kontrolę ujemną.

Użyj VBG plus plus, aby doprowadzić każdą studzienkę do końcowej objętości 150 mikrolitrów, a następnie inkubować płytkę pokrytą folią E IA przez półtorej do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem po inkubacji. Umyj komórki trzykrotnie PBS uzupełnionym 0,5% BSA, a następnie oznacz komórki jednym mikrogramem na mililitr. Znakowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne anty C3 i anty C 4 inkubują komórki przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem, a następnie po trzykrotnym umyciu płytki ponownie zawiesić erytrocyty w 150 mikrolitrach PBS plus 0,5% BSA na.

Dobrze przenieś zawiesiny komórek na nową 96-dołkową okrągłą płytkę dolną, a następnie załaduj płytkę na cytometr przepływowy, oddziel pojedyncze komórki od dubletów za pomocą wykresu rozrzutu do przodu. Ustaw bramkę na pojedynczych RBC, a następnie wybierz odpowiedni kanał detekcji dla sygnałów fluorescencyjnych. Określ ilościowo wyniki, używając mediany intensywności fluorescencji do ilościowej analizy hemolitycznej, podgrzej i aktywuj surowicę pacjenta, a następnie przemyj erytrocyty poddane działaniu sałaty rzymskiej, jak właśnie pokazano.

Następnie, po inkubacji erytrocytów z dopełniaczem i surowicą pacjenta, jak właśnie pokazano, ale bez piątki anty C, wiruj komórki przez pięć minut przy 664 GS ze zmniejszonym opóźnieniem. Następnie ostrożnie przenieś 90 mikrolitrów supernatantu na nową płytkę do mikromiareczkowania, uważając, aby nie przenieść nienaruszonych komórek i uniknąć tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie zmierz absorpcję przy czterech 14 do 60 90 w ekspresie spektrofotometru. Hemoliza jako procent lizy próbki erytrocytów inkubowanych w czystej wodzie.

Na tym pierwszym rysunku pokazano reprezentatywne wykresy punktowe dla erytrocytów poddanych działaniu broli, odpowiednie bramkowanie dla pojedynczych erytrocytów. Zazwyczaj około 95% erytrocytów mieści się w tej pojedynczej bramce komórkowej. Na tych histogramach reprezentatywne wyniki dla efektu autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej lub aha.

Surowica pacjenta po osadzaniu się C 4 i C3 jest pokazana zgodnie z oczekiwaniami, więcej surowicy pacjenta prowadzi do większego odkładania się dopełniacza. Co ciekawe, osadzanie dopełniacza zachodzi w dwóch odrębnych pikach dodatnich. Prawdopodobnie nie jest to spowodowane niejednorodnością w populacji RBC, ponieważ RBC są pobierane od jednego dawcy, chociaż przyczyna tego zjawiska jest nadal badana, mediana intensywności fluorescencji próbek jest wykreślana na tych wykresach liniowych, aby pokazać odtwarzalność testów osadzania C 4 i C3.

Zwróć uwagę na duże zróżnicowanie w osadzaniu różnych próbek pacjentów z AH H. Wreszcie, na tych wykresach można zaobserwować dane z testu hemolitycznego próbki surowicy pacjenta z ahha zawierającej automatyczne przeciwciała przeciwko erytronom. Miareczkowanie za pomocą próbki surowicy daje wyraźną, odtwarzalną krzywą z odpowiednim inhibitorem dopełniacza, takim jak anty C pięć.

Sygnał hemolityczny można miareczkować, jak pokazano na tym wykresie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć aktywację dopełniacza za pomocą przeciwciał specyficznych dla czerwonych krwinek, albo za pomocą analizy cytometrii przepływowej osadzania C3 lub C4, albo za pomocą ilościowego testu hemolitycznego.