Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych
29 stycznia 2014
Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena aktywacji dopełniacza przez przeciwciała przeciwko erytrocytom (RBC) w surowicy pacjenta. Osiąga się to poprzez inkubację erytrocytów z surowicą pacjenta w obecności blokującego przeciwciała anty-C5 w celu indukcji depozycji C4 i C3 na powierzchni erytrocytów. Następnie erytrocyty barwi się przeciwciałami anty-C4 i anty-C3 znakowanymi fluorescencyjnie, a ilość depozycji dopełniacza na erytrocytach może zostać przeanalizowana za pomocą cytometrii przepływowej w metodzie alternatywnej.
Erytrocyty inkubuje się z surowicą pacjenta w obecności przeciwciał przeciwko czynnikowi C5, aby wywołać lizę zależną od dopełniacza. Procent zlizowanych erytrocytów można następnie określić, mierząc spektrometrycznie ilość hemoglobiny uwolnionej z komórek. Główną zaletą tej nowej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test hemolizy lub test antyglobulinowy stosowany w rutynowej diagnostyce, jest jej ilościowy charakter, co pozwala na wykrycie subtelnych różnic w aktywacji dopełniacza.
Elizabeth Brook, stażysta podoktorski w naszym laboratorium, zademonstruje procedury. Rozpocznij od trzykrotnego przemycia erytrocytów grupy 0 w PBS, następnie inkubuj osad w 0,5% roztworze rosalanu w stosunku 1:2 przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po trzykrotnym przemyciu komórek, przechowuj je jako 3% zawiesinę w świeżym PBS w temperaturze 4 °C, aby przeanalizować depozycję dopełniacza na RBC za pomocą cytometrii przepływowej. Najpierw przeprowadź inaktywację termiczną odpowiedniej ilości surowicy pacjenta przez 30 minut w temperaturze 56 °C. Podczas obróbki termicznej surowicy, przemyj trzykrotnie erytrocyty traktowane rosalanem w buforze Roal; czynność tę wykonaj po ostatnim płukaniu.
Resuspend osad w vbg plus plus w rozcieńczeniu 0,5%. Następnie, przy użyciu szklanej kuleczki, dodaj do każdego dołka płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie 25 µL 0,5% RBCs, 37,5 µL świeżego surowicy AB oraz 37,5 µL przeciwciał anti C five w stężeniu 200 µg/mL. Następnie dodaj do każdego dołka inaktywowaną ciepłem surowicę pacjenta w odpowiednim stężeniu, uzupełniając w razie potrzeby inaktywowaną ciepłem surowicą AB i uwzględniając również kontrolę negatywną.
Użyj VBG plus plus, aby doprowadzić każdą studzienkę do objętości końcowej 150 µL, a następnie inkubuj płytkę przykrytą folią EIA przez od półtorej do dwóch godzin w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie PBS uzupełnionym o 0,5% BSA, a następnie oznacz komórki za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-C3 i anty-C4 znakowanych fluorescencyjnie w stężeniu 1 µg/mL. Inkubuj komórki przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym potrząsaniu, a następnie po trzykrotnym przemyciu płytki resuspenduj RBC w 150 µL PBS z 0,5% BSA na studzienkę.
Przenieśmy zawiesiny komórkowe do nowej płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem, a następnie umieśćmy płytkę w cytometrze przepływowym i oddzielmy pojedyncze komórki od dubletów, korzystając z wykresu rozproszenia światła przedniego. Ustawmy bramkę na pojedynczych erytrocytach, a następnie wybierzmy odpowiedni kanał detekcji dla sygnałów fluorescencyjnych. Ilościowe wyniki analizy hemolitycznej wyznaczmy za pomocą mediany intensywności fluorescencji; serum pacjenta poddajmy obróbce termicznej w celu aktywacji, a erytrocyty traktowane romainą przemyjmy w sposób przedstawiony przed chwilą.
Następnie, po inkubacji RBC z dopełniaczem i surowicą pacjenta w sposób właśnie zademonstrowany, ale bez użycia przeciwciała anty-C5, odwirować komórki przez pięć minut przy 664 g z zmniejszonym opóźnieniem hamowania. Następnie ostrożnie przenieść 90 µL supernatantu do nowej płytki mikrotitracyjnej, dbając o to, aby nie przenieść nienaruszonych komórek i uniknąć tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie zmierzyć absorbancję przy 414 do 690 nm w spektrofotometrze. Hemolizę wyrazić jako procent lizy próbki RBC inkubowanej w czystej wodzie.
Na tej pierwszej rycinie przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe dla RBC traktowanych brolą; tutaj widoczne jest odpowiednie bramkowanie dla pojedynczych RBC. Zazwyczaj około 95% RBC mieści się w tej bramce dla pojedynczych komórek. Na tych histogramach przedstawiono reprezentatywne wyniki dotyczące efektu autoimmunologicznej anemii hemolitycznej lub aha.
Osocze pacjenta w kontekście depozycji C4 i C3 prezentuje się zgodnie z oczekiwaniami: większa ilość osocza pacjenta prowadzi do większej depozycji dopełniacza. Co ciekawe, depozycja dopełniacza występuje w dwóch wyraźnych pikiach dodatnich. Prawdopodobnie nie jest to spowodowane heterogenicznością populacji erytrocytów, ponieważ RBC pobrano od jednego dawcy, choć przyczyna tego zjawiska jest wciąż badana. Mediany intensywności fluorescencji próbek przedstawiono na tych wykresach liniowych, aby ukazać powtarzalność testów depozycji C4 i C3.
Należy zwrócić uwagę na znaczną zmienność w osadach różnych próbek pacjentów z AH H. Na koniec, na wykresach można zaobserwować dane z testu hemolitycznego próbki surowicy pacjenta z ahha zawierającej autoprzeciwciała przeciwko RBC. Miareczkowanie próbką surowicy daje wyraźną, powtarzalną krzywą przy zastosowaniu odpowiedniego inhibitora dopełniacza, takiego jak anti C five.
Sygnał hemolityczny można miareczkować, co zostało przedstawione na tym wykresie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru aktywacji dopełniacza przez przeciwciała specyficzne dla erytrocytów, zarówno za pomocą analizy cytometrycznej depozycji C3 lub C4, jak i za pomocą ilościowego testu hemolitycznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje dwa testy służące do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko erytrocytom (RBCs). Testy te są ilościowe i łatwe w interpretacji, co daje im przewagę nad istniejącymi metodami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Hematologia
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Aktywacja dopełniacza ma kluczowe znaczenie w odpowiedziach immunologicznych.
- Przeciwciała przeciwko RBC mogą prowadzić do różnych stanów klinicznych.
- Obecne testy mogą wykazywać brak precyzji ilościowej.
- Nowe metody mają na celu poprawę wykrywania aktywacji dopełniacza.
Cel badania
- Ocena aktywacji dopełniacza przez przeciwciała przeciwko erytrocytom.
- Opracowanie ilościowego testu w celu lepszej interpretacji wyników.
- Porównanie nowych technik z istniejącymi metodami diagnostycznymi.
Zastosowane metody
- Inkubacja erytrocytów z surowicą pacjenta i przeciwciałami blokującymi.
- Barwienie erytrocytów przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie.
- Analiza odkładania dopełniacza za pomocą cytometrii przepływowej.
- Pomiar uwalniania hemoglobiny w celu określenia lizy erytrocytów.
Główne wyniki
- Nowe testy dostarczają ilościowych danych na temat aktywacji dopełniacza.
- Możliwe jest wykrycie niewielkich różnic w stopniu aktywacji.
- Wyniki wykazują zwiększoną czułość w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Analiza cytometrii przepływowej pozwala na szczegółową interpretację.
Wnioski
- Nowe testy pogłębiają zrozumienie aktywacji dopełniacza.
- Stanowią one niezawodną alternatywę dla istniejących testów diagnostycznych.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić diagnostykę i leczenie pacjentów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowa ocena aktywacji dopełniacza indukowanej przeciwciałami na erytrocytach ma kluczowe znaczenie dla oceny skuteczności inhibitorów dopełniacza oraz zrozumienia mechanizmów hemolizy w zaburzeniach autoimmunologicznych i alloimmunologicznych. Opisane analizy cytometryczne i spektrofotometryczne dostarczają powtarzalnych, ilościowych wyników, które umożliwiają wykrycie subtelnych różnic w aktywacji dopełniacza, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w rozwoju terapii. Metody te zwiększają pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez przekształcenie obserwacji jakościowych w mierzalne, przekładalne biomarkery służące do podejmowania decyzji na etapie przedklinicznym i klinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie depozycji dopełniacza (C3/C4) na erytrocytach, indukowanej przez autoprzeciwciała lub alloprzeciwciała.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar efektorowej aktywności zależnej od przeciwciał, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera segregację portfela projektów poprzez generowanie ilościowych danych na temat siły aktywacji dopełniacza, co dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji go/no-go w przypadku terapeutyków modulujących dopełniacz.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje ustandaryzowane, ilościowe wyniki (medianowa intensywność fluorescencji, uwalnianie hemoglobiny) odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu inhibitorów dopełniacza lub przeciwciał terapeutycznych.
- Powtarzalność: Wykazuje niską zmienność między próbkami surowicy pacjentów, co umożliwia wiarygodną ocenę związków i standaryzację międzylaboratoryjną.
- Użyteczność platformy: Wykorzystuje ogólnodostępną aparaturę (cytometr przepływowy, spektrofotometr) do tworzenia wielokrotnych analiz służących do pomiaru bioaktywności zależnej od dopełniacza w procesach odkrywania leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje mechanizmy patofizjologiczne w autoimmunologicznej anemii hemolitycznej (AIHA) i hemolizie alloimmunologicznej, łącząc wiązanie z celem z funkcjonalną aktywacją dopełniacza.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez dostarczenie ilościowych biomarkerów (depozycja C3/C4, hemoliza), które korelują z klinicznym potencjałem hemolitycznym.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację lizy zależnej od dopełniacza, co wspiera oceny bezpieczeństwa oraz modelowanie zależności dawka-odpowiedź w badaniach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Testy te integrują się z procesem odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa – oferując ilościowe odczyty aktywacji dopełniacza, które umożliwiają biologiczną redukcję ryzyka oraz ocenę indeksu terapeutycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie szlaków aktywacji dopełniacza indukowanych przez przeciwciała, co pozwala wyjaśnić mechanizm działania kandydatów immunomodulujących.
- Przesiew: Dostarcza gotowe do analizy, ilościowe wyniki (intensywność fluorescencji, hemoliza spektrofotometryczna), które umożliwiają rzetelne porównanie badanych związków lub próbek surowicy.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty (mediana intensywności fluorescencji, uwalnianie hemoglobiny), które ułatwiają analizę statystyczną i porównywanie różnych warunków w badaniach zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki wynikom istotnym dla przebiegu chorób, które odzwierciedlają aktywację dopełniacza obserwowaną w AIHA oraz w warunkach transfuzji.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, zestandaryzowaną platformę do oceny aktywności zależnej od dopełniacza w przypadku terapeutyków przeciwciałowych, biosymilarów oraz inhibitorów dopełniacza.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez przekształcenie jakościowych testów dopełniacza w ilościowe, przesylowalne pomiary.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom przygotowania RBC, inkubacji surowicy oraz detekcji za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrometrii.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrycie wad aktywujących dopełniacz, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późnych etapach programów immunomodulacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka poprzez ilościowe określenie potencjału aktywacji dopełniacza, co umożliwia obiektywne decyzje dotyczące rozwoju terapii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu immunologii, cytometrii przepływowej oraz obsługi testów spektrofotometrycznych w celu dokładnego pomiaru depozycji dopełniacza i hemolizy.
- Metoda jest zależna od dostępu do cytometrów przepływowych z odpowiednimi kanałami fluorescencji oraz spektrofotometrów do ilościowego oznaczania hemoglobiny przy 414/690 nm.
- Niezbędna jest standaryzacja przygotowania RBC (np. typu zero, traktowanych bromeliną) oraz inaktywacja termiczna surowicy, aby zapewnić spójność wyników testów pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Wymagane są rozważania dotyczące adaptacji metody przy zastosowaniu RBC różnych gatunków, różnej gęstości antygenów lub innych źródeł dopełniacza niż ludzka surowica AB.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ostrożnego przenoszenia supernatantu, aby uniknąć przeniesienia komórek oraz powstania pęcherzyków powietrza, co mogłoby wpłynąć na dokładność ilościowego oznaczania hemolizy.
