Pomiar receptora dopełniacza erytrocytów 1 za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół ten może być wykorzystany do pomiaru liczby miejsc antygenowych na receptorze komórkowym będącym przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona solidne wyniki, nawet w przypadku receptorów wyrażanych przy niskiej gęstości. Metoda ta umożliwia ocenę zmniejszenia ekspresji erytrocytów CR1 w takich przypadkach jak choroba Alzheimera, toczeń rumieniowaty układowy, AIDS i malaria.

Protokół ten jest przydatny do każdej analizy gęstości receptorów komórkowych i może być również stosowany do badania ekspresji receptorów komórkowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zalecamy rozstawienie probówek podczas dystrybucji komórek i przeciwciał oraz, jeśli to możliwe, towarzyszenie specjaliście od cytometrii podczas pierwszej analizy. Wizualna demonstracja barwienia immunologicznego i kwantyfikacji gęstości za pomocą cytometrii przepływowej ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak prawidłowo ustawić parametry analizy.

Przed rozpoczęciem analizy dodaj 250 mikrolitrów krwi pełnej z antykoagulacją EDTA sodu z probówek do przechowywania krwi do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 20 mililitrów PBS-BSA o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wymieszaj zawartość probówki przez delikatne odwrócenie i odwiruj komórki przez odwirowanie. Za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów wyrzucić supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad w pozostałej objętości roztworu.

Dodaj 20 mililitrów zimnego PBS-BSA i ponownie odwiruj komórki. Pod koniec wirowania umieścić probówkę w stojaku, umieszczoną na lodzie i przenieść osiem mikrolitrów umytych erytrocytów do 50-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry PBS-BSA. Następnie delikatnie wymieszaj erytrocyty przez wirowanie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.

W celu barwienia immunologicznego erytrocytów ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów rozcieńczonych erytrocytów do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra i zbierz czerwone krwinki przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantów ostrożnie dodać 20 mikrolitrów biotynylowanego przeciwciała anty-CR1 J3D3 o stężeniu 0,5 mikrograma na mikrolitr w PBS-BSA, bezpośrednio do każdej osadki. Dodać 20 mikrolitrów samego buforu PBS-BSA do komórek kontroli ujemnej z delikatnym mieszaniem i inkubować próbki przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki dwa razy 750 mikrolitrami świeżego PBS-BSA na probówkę na przemycie. Po drugim przemyciu dodać 20 mikrolitrów rozcieńczenia streptawidyny w rozcieńczeniu od 1 do 10 fikoerytryny streptawidyny w PBS-BSA do każdej probówki, delikatnie mieszając, i inkubować próbki przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć próbki dwukrotnie, jak pokazano.

Po drugim myciu utrwalić każdą próbkę komórki za pomocą 450 mikrolitrów buforu utrwalającego podczas wirowania, przed przeniesieniem każdej próbki do pojedynczych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem na okres do 48 godzin przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeanalizować erytrocyty wybarwione immunologicznie pod kątem cytometrii przepływowej, kliknij przycisk nowego eksperymentu w cytometrze przepływowym i zmień nazwę nowego eksperymentu. Wybierz rozproszenie do przodu, rozproszenie boczne i PE w oknie ustawień cytometru.

W otwartym eksperymencie wybierz ustawienia aplikacji ustawień cytometru i utwórz globalny arkusz, używając szarych pól i krzyżyka, aby pokierować optymalizacją. Po ustawieniu wszystkich parametrów załaduj niezabarwioną rurkę kontrolną na cytometr i uruchom akwizycję, optymalizując napięcia rozproszenia przedniego i bocznego w celu wyeliminowania zanieczyszczeń i zapewnienia, że populacja będąca przedmiotem zainteresowania jest na dużą skalę. Następnie narysuj bramkę wokół czerwonych krwinek na wykresie punktowym do przodu i z boku i wyświetl populację czerwonych krwinek na wykresie kropkowym fluorescencji PE.

Jeśli populacje dodatnie są na skali, załaduj poplamioną rurkę kontrolną do cytometru i uruchom akwizycję. Aby zarejestrować i przeanalizować próbki, rozładuj zabarwioną próbkę i utwórz wykres punktowy do przodu a z boku oraz histogram fluorescencji PE w nowym globalnym arkuszu. Załaduj pierwszą próbkę do cytometru, uruchom akwizycję i narysuj bramkę czerwonych krwinek wokół erytrocytów na wykresie rozproszenia do przodu i z boku.

Wyświetl populację czerwonych krwinek na histogramie fluorescencji PE i na karcie statystyki wybierz średnią parametrów fluorescencji PE w populacjach czerwonych krwinek. Na pulpicie nawigacyjnym pobierania wybierz wszystkie zdarzenia w bramie zatrzymującej i 10 000 zdarzeń do zarejestrowania, a następnie kliknij przycisk Rejestruj dane. Po zakończeniu rejestrowania zdarzenia wyjmij probówkę z cytometru.

Wykresy globalnego arkusza powinny wyglądać tak, jak pokazano na ilustracji. Analiza cytometryczna cytometrycznych erytrocytów wybarwionych immunologicznie od trzech osób o znanej gęstości CR1 pozwala na pomiar średniej intensywności fluorescencji znakowania dla każdego badanego. Wykreślenie krzywej przy użyciu wartości obiektu o znanej gęstości erytrocytów CR1 pozwala na przedstawienie tych danych w funkcji średniej intensywności fluorescencji.

Porównanie linii regresji wynikającej z tej krzywej do wartości średniej intensywności fluorescencji pozostałych badanych pozwala na określenie ich gęstości erytrocytów CR1. Należy upewnić się, że erytrocyty i przeciwciała są prawidłowo rozmieszczone, tak aby krzywe kalibracyjne próbek doświadczanych w kontroli ujemnej mieściły się w zakresie ustawień cytometru. Możliwe jest dostosowanie tej procedury do pomiaru receptorów komórkowych o innej gęstości, po prostu poprzez zmianę pierwszorzędowego przeciwciała i/lub dostosowanie warstw amplifikacji.

Zawsze, gdy masz do czynienia z krwią, istnieje ryzyko zanieczyszczenia patogenami. Dlatego należy stosować dobre praktyki laboratoryjne i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.