Name: Pomiar receptora dopełniacza erytrocytów 1 za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę pomiaru gęstości receptora CR1 w erytrocytach za pomocą cytometrii przepływowej i immunobarwienia. Technika ta pozwala ocenić ekspresję receptora w chorobach takich jak Alzheimer czy toczeń rumieniowaty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom URCACyt, platformy technicznej cytometrii przepływowej, personelowi Zakładu Immunologii oraz personelowi Oddziału Chorób Wewnętrznych i Geriatrii, którzy przyczynili się do optymalizacji i walidacji protokołu. Praca ta została sfinansowana przez Szpital Uniwersytecki w Reims (grant nr AOL11UF9156).

Protokół pobierania i obchodzenia się z ludzką krwią został sprawdzony i zatwierdzony przez regionalną komisję etyki (CPP Est II), a numer protokołu to 2011-A00594-37. Ponieważ poniższy protokół opisuje postępowanie z ludzką krwią, należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi usuwania materiału niebezpiecznego biologicznie. Należy nosić laboratoryjny sprzęt ochronny, taki jak fartuchy i rękawice laboratoryjne.
1. Mycie erytrocytów
UWAGA: Dzień przed użyciem przygotuj bufor PBS-BSA z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 0,15% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i umieść go w lodówce w temperaturze 4 °C. Bufor ten będzie używany jako bufor do przemywania i jako bufor rozcieńczający.
<ol>
	<li>Odpipetować 20 ml PBS-BSA do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odessać 250 μl antykoagulowanej krwi pełnej z kwasem sodowo-etylenodiaminowym (EDTA) z probówek do przechowywania krwi i dodać do probówki zawierającej 20 ml PBS-BSA. Zamknij rurkę, przykręcając nakrętkę. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę 2x.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Zawiesić osad w resztkowej objętości supernatantu przez delikatne i ostrożne pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 20 ml zimnego PBS-BSA (4 °C) do probówki zawierającej osad. Odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Dodać 20 ml zimnego PBS-BSA (4 °C) do probówki zawierającej osad. Odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Pozostawić probówkę w wirówce w temperaturze 4 °C i przejść do sekcji 2.</li>
</ol>
2. Rozcieńczenie erytrocytów
<ol>
	<li>Odpipetować 3 ml zimnego PBS-BSA do probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C na ruszcie w lodzie.</li>
	<li>Umieścić odwirowaną probówkę zawierającą erytrocyty (krok 1.4) na stojaku umieszczonym w lodzie.</li>
	<li>Za pomocą pipety odpipetować 8 μl granulowanych erytrocytów i dodać do 50 ml probówki zawierającej 3 ml PBS-BSA w celu uzyskania rozcieńczenia erytrocytów. Delikatnie wymieszaj probówkę ręcznie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek erytrocytów.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne erytrocytów
<ol>
	<li>Pobrać pipetą 100 μl rozcieńczenia erytrocytów (otrzymanego w punkcie 4) i dodać do probówek o pojemności 1,4 ml.</li>
	<li>Wirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Podczas wirowania przygotować rozcieńczenie biotynylowanego przeciwciała anty-CR1 J3D3 o stężeniu 0,05 μg/μL w buforze PBS-BSA.</li>
	<li>Po zakończeniu wirowania usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 20 μl biotynylowanego anty-CR1 J3D3 bezpośrednio do granulki. Aby przygotować kontrolę ujemną, należy zamiast tego dodać 20 μl buforu PBS-BSA. Delikatnie wymieszać probówki i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po 45 minutach inkubacji dodać 750 μl PBS-BSA do probówek. Wirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórzyć.</li>
	<li>W międzyczasie należy przygotować rozcieńczenie 1:10 streptawidyny-fikoerytryny rozcieńczonej w buforze PBS-BSA. Odpipetować pipetą 20 μl streptawidyny-fikoerytryny w rozcieńczeniu 1:10 i dodać do probówek. Delikatnie wymieszać probówki i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 750 μl buforu PBS-BSA do probówek. Dobrze wymieszać i wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórzyć.</li>
	<li>Podczas wirowania należy przygotować rozcieńczenie 1:100 biotynylowanego przeciwciała antystreptawidyny rozcieńczonego w buforze PBS-BSA.</li>
	<li>Po zakończeniu wirowania usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 20 μl biotynylowanej antystreptawidyny w rozcieńczeniu 1:100 do probówek. Delikatnie wymieszaj tubki. Inkubować probówki przez 45 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po 45 minutach inkubacji odpipetować 750 μl buforu PBS-BSA i dodać do probówek. Wirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórzyć.</li>
	<li>Pobrać pipetą 20 μl streptawidyny-fikoerytryny w stosunku 1:10 i dodać do probówek. Delikatnie wymieszaj tubki. Inkubować probówki przez 45 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odpipetować 750 μl buforu PBS-BSA i dodać do probówek. Dobrze wymieszać i odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
</ol>
4. Immunologiczne utrwalenie erytrocytów
<ol>
	<li>Podczas ostatniego wirowania należy przygotować bufor utrwalający, rozcieńczony 37% formaldehydu w stosunku 1:100 za pomocą buforu płuczącego PBS-BSA.</li>
	<li>Odpipetować 450 μl buforu utrwalającego i dodać do probówek erytrocytów wybarwionych immunologicznie (od kroku 3.13), wirując przez 5 s.</li>
	<li>Odpipetować wszystkie stałe komórki do probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 ml i przechowywać w lodówce. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do 48 godzin.</li>
</ol>
5. Analiza cytometrii przepływowej barwionych erytrocytów
UWAGA: Zaleca się zapoznanie się z instrukcją obsługi cytometru (patrz Tabela materiałów), aby dowiedzieć się, jak wykonywać odczyty cytometryczne. Poniższe sugerowane parametry odnoszą się do używanego instrumentu i muszą być zoptymalizowane dla każdego cytometru.
<ol>
	<li>Włącz cytometr przepływowy, a następnie włącz komputer. Poczekaj, aż temperatura układu optycznego ustabilizuje się, pozostawiając go włączonego na 30 minut. Sprawdź okienko cytometru w oprogramowaniu, aby upewnić się, że cytometr jest podłączony do stacji roboczej (wyświetlany jest komunikat Cytometer Connected).</li>
	<li>Sprawdzić, czy zbiornik buforowy jest pełny i czy pojemnik na odpady jest pusty. Usunąć pęcherzyki powietrza z filtra buforowego i przewodu buforowego za pomocą systemu przedmuchiwania. Napełnić układ fluidyczny, naciskając przycisk Prime na konsoli cytometru. Poczekaj, aż kontrolka zmieni kolor z czerwonego na zielony.</li>
	<li>Aby oczyścić fluidykę, zainstaluj probówkę zawierającą 3 ml roztworu czyszczącego w porcie wstrzykiwania próbki i pozwól roztworowi czyszczącemu działać przez 5 minut z dużym natężeniem przepływu próbki. Powtórz to z roztworem do płukania wodą destylowaną. Pozostawić probówkę z wodą w porcie wstrzykiwania próbki.</li>
	<li>Aby przygotować kulki kalibracyjne, należy odpipetować 400 μl PBS na dno probówki z okrągłym dnem. Mocno wymieszaj bulwy z koralików, wirując przez 30 sekund. Dodać kroplę do probówki z okrągłym dnem zawierającej PBS. Dokładnie mieszaj, wirując przez 30 sekund.</li>
	<li>Uruchom test wydajności. Otwórz moduł konfiguracji i śledzenia cytometru w oprogramowaniu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A). Sprawdź, czy konfiguracja cytometru jest prawidłowa dla eksperymentu przy użyciu barwienia immunologicznego PE. Sprawdź, czy partia koralików kalibrujących jest poprawna z konfiguracją.</li>
	<li>Zamontuj rurkę perełkową w porcie wtrysku próbki i pozwól jej pracować z niskim natężeniem przepływu próbki. Uruchom test wydajności, który trwa około 5 minut). Po zakończeniu kontroli działania sprawdź, czy działanie cytometru jest zadowalające (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Zamknij moduł konfiguracji i śledzenia cytometru w oprogramowaniu.</li>
	<li>Aby skonfigurować eksperyment i utworzyć ustawienia aplikacji, kliknij przycisk Nowy eksperyment na pasku narzędzi przeglądarki i otwórz nowy eksperyment. Określ parametry, wybierając odpowiednie ustawienia cytometru: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) i PE z rozwijanego menu eksperymentu (Rysunek 1C). Wybierz Tryb liniowy dla parametru FSC i tryb logarytmu dla parametrów SSC i PE.</li>
	<li>W otwartym eksperymencie wybierz Ustawienia cytometru (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D), a następnie wybierz Ustawienia aplikacji i utwórz globalny arkusz roboczy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E). Użyj szarych pól i krzyżyka, aby poprowadzić optymalizację.</li>
	<li>Załaduj niezabarwioną rurkę kontrolną do cytometru i uruchom akwizycję. Upewnij się, że populacja będąca przedmiotem zainteresowania (tj. RBC) jest na dużą skalę, optymalizując napięcia FSC i SSC. Zoptymalizuj wartość progową FSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia bez zakłócania pracy interesującej populacji.</li>
	<li>Narysuj bramę wokół RBC na wykresie FSC vs. SSC. Wyświetl populację RBC na wykresie kropkowym fluorescencji PE. W razie potrzeby zwiększ fluorescencję napięcia lampy fotopowielacza (PMT), aby umieścić populację ujemną w szarych polach. Rozładować niezabarwioną probówkę kontrolną z cytometru.</li>
	<li>Sprawdź, czy populacje z dodatnim wynikiem są na dużą skalę. Załaduj poplamioną rurkę kontrolną do cytometru i uruchom akwizycję. Obniż napięcie PMT dla populacji dodatniej, jeśli jest poza skalą, dopóki populacja dodatnia nie będzie widoczna w całości na skali. Następnie rozładuj poplamioną próbkę.</li>
	<li>Aby rejestrować i analizować próbki, w nowym arkuszu globalnym utwórz następujące wykresy w celu wyświetlenia podglądu danych: 1) FSC a SSC i 2) histogram fluorescencji PE. Załaduj pierwszą próbkę do cytometru i uruchom akwizycję.</li>
	<li>Narysuj bramkę RBC wokół erytrocytów na wykresie FSC vs. SSC. Wyświetl populację RBC na histogramie fluorescencji PE. W widoku Statystyki wybierz średnią parametrów fluorescencji PE w populacjach GR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Na pulpicie nawigacyjnym Akwizycja wybierz wszystkie zdarzenia w bramce zatrzymującej i 10 000 zdarzeń do zarejestrowania (Rysunek 1G). Kliknij przycisk Nagraj dane. Po zakończeniu rejestrowania zdarzenia wyjmij pierwszą probówkę z cytometru. Wykresy globalnego arkusza powinny wyglądać jak te w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	<li>Załaduj następujące próbki i zapisz je.</li>
</ol>
6. Oznaczanie gęstości erytrocytów CR1
<ol>
	<li>Weźmy wartości średnich intensywności fluorescencji próbek odpowiadających "niskiemu" badanemu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, tabela I, RBC MFI), "średniemu" podmiotowi (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, Tabela D, RBC MFI), "wysokiemu" tematowi (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, Tabela I, RBC MFI) oraz próbie kontroli ujemnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, Tabela I, RBC MIF).</li>
	<li>Na wykresie przedstawiającym średnią intensywność fluorescencji w funkcji gęstości CR1 umieść cztery punkty odpowiadające kontroli negatywnej, "niskiemu" obiektowi, "średniemu" obiektowi i "wysokiemu" obiektowi (niebieskie punkty, <silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Narysuj linię regresji, aby uzyskać linię kalibracji i jej równanie.</li>
	<li>Należy przyjąć wartości średniej intensywności fluorescencji próbek odpowiadających badaniom, których gęstość ma być określona. (<silna klasa="xfig">Rysunek 5, Tabele D i I, RBC MFI).</li>
	<li>Uzyskaj równanie, zastępując "Y" wartościami średnich intensywności fluorescencji i oblicz gęstość CR1/E (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Sprawdź na wykresie, czy średnie wartości intensywności fluorescencji i wyznaczona gęstość CR1/E odpowiadają punktowi na linii kalibracji (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępnych jest kilka technik określania gęstości erytrocytów CR1 (CR1/E). Pierwszymi zastosowanymi technikami była aglutynacja czerwonych krwinek przez przeciwciała anty-CR131 oraz tworzenie rozet w obecności erytrocytów pokrytych C3b32. Te podstawowe techniki zostały szybko zastąpione metodami barwienia immunologicznego z wykorzystaniem znakowanych radioaktywnie przeciwciał anty-CR1 1,33. Możliwe jest również zmie...

CR1 (receptor dopełniacza typu 1, CD35) to transbłonowa glikoproteina o masie 200 kDa obecna na powierzchni wielu typów komórek, takich jak erytrocyty1, limfocyty B2, komórki monocytowe, niektóre limfocyty T, pęcherzykowe komórki dendrytyczne3, astrocyty płodowe4 i podocyty kłębuszkowe 5. CR1 zakłócający swoje ligandy C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, podjednostka pierwszego składnika dopełniacza, C1q10 i MBL (lektyna wiążąca mannan)11 hamuje aktywację dopełniacza i bierze udział w humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej.
U naczelnych, w tym u ludzi, erytrocyty CR1 biorą udział w transporcie kompleksów immunologicznych do wątroby i śledziony, aby oczyścić krew i zapobiec ich gromadzeniu się w wrażliwych tkankach, takich jak skóra czy nerki12,13,14. To zjawisko adhezji immunologicznej między kompleksami immunologicznymi a erytrocytami zależy od liczby cząsteczek CR115. U ludzi średnia gęstość CR1/E wynosi tylko 500 (tj. 500 cząsteczek CR1 na erytrocyt). Gęstość ta różni się w zależności od osobnika (100-1,200 CR1/E) i od jednego erytrocytu do drugiego u tego samego osobnika. Niektóre osobniki o fenotypie "zerowym" wyrażają mniej niż 20 CR1/E16.
Gęstość CR1/E jest regulowana przez dwa współdominujące autosomalne allele połączone z mutacją punktową w intronie 27 genu kodującego CR1*117,18. Ta mutacja wytwarza dodatkowe miejsce restrykcyjne dla enzymu HindIII. Fragmenty restrykcyjne uzyskane po trawieniu z HindIII w tym przypadku wynoszą 7,4 kb dla allelu związanego z silną ekspresją CR1 (H: wysoki allel) i 6,9 kb dla allelu związanego z niską ekspresją CR1 (L: niski allel). Ten link występuje u osób rasy kaukaskiej i azjatyckiej, ale nie u osób pochodzenia afrykańskiego19.
Poziom ekspresji erytrocytów CR1 jest również skorelowany z obecnością punktowych mutacji nukleotydowych w eksonie 13 kodującym SCR 10 (I643T) i w eksonie 19 kodującym SCR16 (Q981H). Jest wysoki u homozygotycznych osobników 643I/981Q i niski u homozygotycznych osobników 643T/981H20. Tak więc osoby "niskie" wyrażają około 150 CR1/E, osoby "średnie" wyrażają około 500 CR1/E, a osoby "wysokie" wyrażają około 1000 CR1/E.
Oprócz tego polimorfizmu gęstości erytrocytów, CR1 charakteryzuje się polimorfizmem długości odpowiadającym czterem allotypom o różnych rozmiarach: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) i CR1*4 (250 kDa)21 oraz polimorfizmem antygenowym odpowiadającym grupie krwi KN22.
Przedstawiamy naszą metodę opartą na cytometrii przepływowej do określenia gęstości CR1/E. Korzystając z trzech osób, których gęstość CR1/E jest znana, wyrażając niski poziom gęstości (180 CR1/E), średni poziom gęstości (646 CR1/E) i wysoki poziom gęstości (966 CR1/E), łatwo jest zmierzyć średnią intensywność fluorescencji (MFI) ich erytrocytów lub czerwonych krwinek (RBC), lub RBC MFI, po barwieniu immunologicznym anty-CR1 za pomocą cytometru przepływowego. Następnie można wykreślić standardową linię reprezentującą MIF w funkcji gęstości CR1/E. Mierząc MFI osób, których gęstość CR1/E nie jest znana i porównując ją z tą linią standardową, możliwe jest określenie gęstości CR1/E u tych osób. Technika ta jest stosowana od wielu lat w laboratorium i umożliwiła nam wykrycie zmniejszenia ekspresji erytrocytów CR1 w wielu patologiach, takich jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE)23, zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS)24, malaria25, a ostatnio choroba Alzheimera (AD)26,27. Opracowanie leków ukierunkowanych na CR1 w celu sprzężenia z erytrocytami, jak w przypadku leków przeciwzakrzepowych28 wymaga oceny gęstości CR1/E oraz dostępności solidnej techniki ilościowego oznaczania CR1.
Przedstawiony protokół działa w trybie pojedynczym. Można go dostosować do określania gęstości CR1/E u wielu osób przy użyciu specjalnych dostępnych na rynku płytek 96-dołkowych (patrz Tabela materiałów). W tym celu łatwo jest dostosować naszą metodę do każdej płytki 96-dołkowej. Dla każdej próbki rozprowadza się zawiesinę komórkową erytrocytów (0,5 x 106–1 x 106 erytrocytów) na studzienkę. Do każdego dołka najpierw dodaje się pierwszorzędowe przeciwciało anty-CR1, następnie streptawidynę PE, drugorzędowe przeciwciało anty-streptawidyny i ponownie streptawidynę PE, stosując te same rozcieńczenia, co w naszej metodzie, ale dostosowując objętości i przestrzegając proporcjonalności.
Próbki krwi od osób z tego zakresu i od osób, które mają być określone ilościowo dla CR1, powinny być pobrane w tym samym czasie, przechowywane w lodówce w temperaturze 4 °C i przetwarzane w temperaturze 4 °C (na lodzie i/lub w lodówce).

<table><tbody><tr><td>Końcówka barierowa 1000E</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja</td><td>2079E</td><td>pipetowanie próbek</td></tr><tr><td>1-100 i mikro; L Skośna, końcówka filtra</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Niemcy</td><td>S1120-1840</td><td>pipetowanie próbek</td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało monoklonalne anty-CR1 (J3D3)</td><td>Domowa produkcja niekomercyjnego przeciwciała monoklonalnego, dzięki uprzejmości dr J. Cooka</td><td></td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Ochrona bluzki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy Bovin (7,5%)</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja</td><td>Wirówka</td> do <td>cytometrii</td>15260037</tr><tr><td></td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja</td><td></td><td>11176917 wirowanie</td></tr><tr><td>Czysty roztwór</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francja</td><td>Cytometria</td><td>340345</td></tr><tr><td>Comorack-96</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>944060P</td><td></td></tr><tr><td>Rack Cytometr Konfiguracja i Zestaw kulek śledzących</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francja</td><td>655051</td><td>cytometria</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 36,5 %</td> <td>Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, Francja</td><td>F8775-25ML</td><td>Utrwalenie</td></tr><tr><td>10 &mikro; L Stopniowana, końcówka filtra</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Niemcy</td><td>S1121-3810</td><td>pipetowanie próbek</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSRFORTESSA</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francja</td><td></td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>647788 Microman Tłoki kapilarne</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>067494</td><td>pipetowanie próbek</td></tr><tr><td>Micronic 1,40 ml probówki z okrągłym dnem</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>MP32051</td><td>mix</td></tr><tr><td>Mikropipeta Microman - typ M25 -</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>066379</td><td>pipetowanie próbek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja</td><td>10010031</td><td>cytometria</td></tr><tr><td>Pipeta PS 325 mm, 10 mL</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>391952</td><td>próbkowanie próbki</td></tr><tr><td>bezpudrowe Egzamin na nitryl rękawice</td><td>Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td><td>486802</td><td>ochrona próbki</td></tr><tr><td>Referencyjna pipeta 2, 0,5-10 i mikro; L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja</td><td>4920000024</td><td>pipeta do pipetowania próbek</td></tr><tr><td>Reference 2, 20-100 &mikro; L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja</td><td>4920000059</td><td>pipetowanie próbek</td></tr><tr><td>Referencyjna pipeta 2, 100-1000 i mikro; L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja</td><td>Pipetowanie próbek</td><td>4920000083</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francja</td><td>Cytometria</td><td>340346</td></tr><tr><td>Probówka okrągłodenna</td><td>Sarstedt, F-70150 Marnay, Francja</td><td>Cytometria</td><td>55.1579</td></tr><tr><td>Probówki Safe-Lock, 1,5 ml</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja</td><td>0030120086</td><td>mix</td></tr><tr><td>streptawidyna R-PE</td><td>Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, Francja</td><td>AS-60669</td><td>barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Francja</td><td>10203001</td><td>mix</td></tr><tr><td>Vector anty streptawidyna biotyna</td><td>Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, Francja</td><td>BA-0500</td><td>barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td><td>SI-0236</td><td>mix</td></tr></tbody></table>

pomiar receptora dopełniacza erytrocytów 1 za pomocą cytometrii przepływowej

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1 (CD35, Receptor Dopełniacza typu 1 dla C3b/C4b) to glikoproteina błonowa o wysokiej masie cząsteczkowej o masie około 200 kDa, która kontroluje aktywację dopełniacza, transportuje kompleksy immunologiczne i uczestniczy w humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. CR1 jest obecny na powierzchni wielu typów komórek, w tym erytrocytów, i wykazuje polimorfizmy pod względem długości, struktury (Knops lub KN, grupa krwi) i gęstości. Średnia gęstość CR1 na erytrocyt (CR1/E) wynosi 500 cząsteczek na erytrocyt. Gęstość ta różni się w zależności od osobnika (100-1,200 CR1/E) i od jednego erytrocytu do drugiego u tego samego osobnika. Przedstawiamy tutaj solidną metodę cytometrii przepływowej do pomiaru gęstości CR1/E, w tym u osób wykazujących niską gęstość, za pomocą wzmacniającego systemu barwienia immunologicznego. Metoda ta pozwoliła nam wykazać obniżenie ekspresji erytrocytów CR1 w chorobach takich jak choroba Alzheimera (AD), toczeń rumieniowaty układowy (SLE), AIDS czy malaria.

Erytrocyty trzech osób o znanej gęstości CR1 (osoba z gęstością „niską” [180 CR1/E], „średnią” [646 CR1/E] oraz „wysoką” [966 CR1/E]) oraz dwóch osób, u których gęstość CR1 wymagała oznaczenia, poddano immunobarwieniu przeciwciałem anty-CR1 sprzężonym z systemem amplifikacyjnym z użyciem fluorochromu fikoerytryny. Na początku gęstość CR1 osób z zakresu niskiego-wysokiego określono metodą Scatcharda29 przy użyciu przeciwciał znakowanych izotopowo. Wyznaczone standardy (niski, średni i wysoki) wykor...

Celem tej metody jest określenie gęstości CR1 w erytrocytach dowolnego podmiotu poprzez porównanie z trzema osobami, których gęstość CR1 erytrocytów jest znana. Metoda wykorzystuje cytometrię przepływową po immunobarwieniu erytrocytów badanych przez przeciwciało monoklonalne anty-CR1 sprzężone z amplifikowanym układem za pomocą fikoerytryny (PE).

Pomiar receptora dopełniacza erytrocytów 1 za pomocą cytometrii przepływowej

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Protokół ten może być wykorzystany do pomiaru liczby miejsc antygenowych na receptorze komórkowym będącym przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona solidne wyniki, nawet w przypadku receptorów wyrażanych przy niskiej gęstości. Metoda ta umożliwia ocenę zmniejszenia ekspresji erytrocytów CR1 w takich przypadkach jak choroba Alzheimera, toczeń rumieniowaty układowy, AIDS i malaria.Protokół ten jest przydatny do każdej analizy gęstości receptorów komórkowych i może być również stosowany do badania ekspresji receptorów komórkowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zalecamy rozstawienie probówek podczas dystrybucji komórek i przeciwciał oraz, jeśli to możliwe, towarzyszenie specjaliście od cytometrii podczas pierwszej analizy. Wizualna demonstracja barwienia immunologicznego i kwantyfikacji gęstości za pomocą cytometrii przepływowej ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak prawidłowo ustawić parametry analizy.Przed rozpoczęciem analizy dodaj 250 mikrolitrów krwi pełnej z antykoagulacją EDTA sodu z probówek do przechowywania krwi do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 20 mililitrów PBS-BSA o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wymieszaj zawartość probówki przez delikatne odwrócenie i odwiruj komórki przez odwirowanie. Za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów wyrzucić supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad w pozostałej objętości roztworu.Dodaj 20 mililitrów zimnego PBS-BSA i ponownie odwiruj komórki. Pod koniec wirowania umieścić probówkę w stojaku, umieszczoną na lodzie i przenieść osiem mikrolitrów umytych erytrocytów do 50-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry PBS-BSA. Następnie delikatnie wymieszaj erytrocyty przez wirowanie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.W celu barwienia immunologicznego erytrocytów ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów rozcieńczonych erytrocytów do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra i zbierz czerwone krwinki przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantów ostrożnie dodać 20 mikrolitrów biotynylowanego przeciwciała anty-CR1 J3D3 o stężeniu 0,5 mikrograma na mikrolitr w PBS-BSA, bezpośrednio do każdej osadki. Dodać 20 mikrolitrów samego buforu PBS-BSA do komórek kontroli ujemnej z delikatnym mieszaniem i inkubować próbki przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przemyć próbki dwa razy 750 mikrolitrami świeżego PBS-BSA na probówkę na przemycie. Po drugim przemyciu dodać 20 mikrolitrów rozcieńczenia streptawidyny w rozcieńczeniu od 1 do 10 fikoerytryny streptawidyny w PBS-BSA do każdej probówki, delikatnie mieszając, i inkubować próbki przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć próbki dwukrotnie, jak pokazano.Po drugim myciu utrwalić każdą próbkę komórki za pomocą 450 mikrolitrów buforu utrwalającego podczas wirowania, przed przeniesieniem każdej próbki do pojedynczych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem na okres do 48 godzin przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeanalizować erytrocyty wybarwione immunologicznie pod kątem cytometrii przepływowej, kliknij przycisk nowego eksperymentu w cytometrze przepływowym i zmień nazwę nowego eksperymentu. Wybierz rozproszenie do przodu, rozproszenie boczne i PE w oknie ustawień cytometru.W otwartym eksperymencie wybierz ustawienia aplikacji ustawień cytometru i utwórz globalny arkusz, używając szarych pól i krzyżyka, aby pokierować optymalizacją. Po ustawieniu wszystkich parametrów załaduj niezabarwioną rurkę kontrolną na cytometr i uruchom akwizycję, optymalizując napięcia rozproszenia przedniego i bocznego w celu wyeliminowania zanieczyszczeń i zapewnienia, że populacja będąca przedmiotem zainteresowania jest na dużą skalę. Następnie narysuj bramkę wokół czerwonych krwinek na wykresie punktowym do przodu i z boku i wyświetl populację czerwonych krwinek na wykresie kropkowym fluorescencji PE.Jeśli populacje dodatnie są na skali, załaduj poplamioną rurkę kontrolną do cytometru i uruchom akwizycję. Aby zarejestrować i przeanalizować próbki, rozładuj zabarwioną próbkę i utwórz wykres punktowy do przodu a z boku oraz histogram fluorescencji PE w nowym globalnym arkuszu. Załaduj pierwszą próbkę do cytometru, uruchom akwizycję i narysuj bramkę czerwonych krwinek wokół erytrocytów na wykresie rozproszenia do przodu i z boku.Wyświetl populację czerwonych krwinek na histogramie fluorescencji PE i na karcie statystyki wybierz średnią parametrów fluorescencji PE w populacjach czerwonych krwinek. Na pulpicie nawigacyjnym pobierania wybierz wszystkie zdarzenia w bramie zatrzymującej i 10 000 zdarzeń do zarejestrowania, a następnie kliknij przycisk Rejestruj dane. Po zakończeniu rejestrowania zdarzenia wyjmij probówkę z cytometru.Wykresy globalnego arkusza powinny wyglądać tak, jak pokazano na ilustracji. Analiza cytometryczna cytometrycznych erytrocytów wybarwionych immunologicznie od trzech osób o znanej gęstości CR1 pozwala na pomiar średniej intensywności fluorescencji znakowania dla każdego badanego. Wykreślenie krzywej przy użyciu wartości obiektu o znanej gęstości erytrocytów CR1 pozwala na przedstawienie tych danych w funkcji średniej intensywności fluorescencji.Porównanie linii regresji wynikającej z tej krzywej do wartości średniej intensywności fluorescencji pozostałych badanych pozwala na określenie ich gęstości erytrocytów CR1. Należy upewnić się, że erytrocyty i przeciwciała są prawidłowo rozmieszczone, tak aby krzywe kalibracyjne próbek doświadczanych w kontroli ujemnej mieściły się w zakresie ustawień cytometru. Możliwe jest dostosowanie tej procedury do pomiaru receptorów komórkowych o innej gęstości, po prostu poprzez zmianę pierwszorzędowego przeciwciała i/lub dostosowanie warstw amplifikacji.Zawsze, gdy masz do czynienia z krwią, istnieje ryzyko zanieczyszczenia patogenami. Dlatego należy stosować dobre praktyki laboratoryjne i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

measuring-erythrocyte-complement-receptor-1-using-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę pomiaru gęstości receptora CR1 w erytrocytach za pomocą cytometrii przepływowej i immunobarwienia. Technika ta pozwala ocenić ekspresję receptora w chorobach takich jak Alzheimer czy toczeń rumieniowaty.

Pomiar receptora dopełniacza erytrocytów 1 za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów